（植物学专业论文）dfr基因的单碱基突变导致拟南芥对低磷胁迫响应的变化.pdf

中文摘要 磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，在植物的生长发育过程中起着重要作用。 关于植物适应低磷胁迫的分子遗传及生理生化机制己有一些报道，但是人们对于这方面的了解 还很有限，尚待更深入的研究。 本项研究工作以本实验室筛选的拟南芥隐性单基因耐低磷突变体t p t 3 为研究对象，通过图 位法克隆目的基因，并对其在磷代谢中的调节作用进行了初步研究。利用拟南芥数据库提供的 拟南芥遗传图谱上己知的分子标记以及根据s n p 数据库的信息新设计的s s l p 及c a p s 分子标 记，将突变基因定位在b a c 克隆m j b 2 1 的4 0 8 k b 的区域内。然后通过对定位区间内的基因进 行测序，确定在何j 突变体中基因a t 5 9 4 2 8 0 0 发生了单碱基突变。该基因编码二氢黄酮醇还原 酶( d i h y d r o f l a v o n o l 4 - r e d u c t a s e ，d f r ) ，共有6 个外显子，突变位点位于第3 个外显子上。o r f 的第5 1 1 位碱基( 即组d n a 的第7 6 0 位碱基) 所发生的由g 到a 的置换导致基因所编码的第 1 7 1 位氨基酸由酸性的谷氨酸突变为碱性的赖氨酸。加打与d f r 敲除突变体( x 射线诱变) c s 8 4 的杂交实验结果表明杂交后代与突变体的性状表现一致，在低磷培养基上均表现生长点不变紫。 对t p t 3 突变体和野生型的表型观察分析表明，在低磷条件下，l p t 3 的生物量明显高于野生 型；磷的耗竭实验分析结果表明突变体在低磷条件下对磷的吸收速率快于野生型，说明d f r 基因可能对磷的吸收具有调控作用。突变体加打的3 - 4 天幼苗在低磷培养基上与对照相比无明 显生长优势：1 0 天的幼苗移至低磷培养基上，1 5 天后能正常抽薹开花，而野生型不能抽薹开花， 说明d f r 的调控作用具有时间性。 r n a 杂交结果表明，7 - 8 天的拟南芥幼苗在正常m s 条件下d f r 的表达水平较低，在受到低磷 诱导6 小时后，d f r 的表达量明显提高，说明d f r 对低磷信号的响应比较迅速。低磷诱导1 8 & f 1 y d f r 的表达量达到展高，然后又下降，说明d 职对低磷的响应存在着节律性。在正常及低磷诱导 条件下加打中d 职的转录水平均高于野生型，其意义何在有待于进一步研究。 g u s 染色结果表明6 天龄拟南芥幼苗的地上和地下部分均有g u s 活性，说明d f r 基因是组成 型表达的，可能与大多数类型细胞的代谢活动相关；维管组织中的g u s 活性较高，推测d f r 除了 在花青素的合成途径中起关键作用外，可能对植物体内的物质运输以及通过物质运输而进行的信 号传递起调控作用。 综合论文试验结果认为，拟南芥l p t 3 突变体r 书d f r 基因一个碱基的突变导致了d 职基因的表 达水平提高，同时可能导致突变体耐低磷能力的提高。d f r 可能对磷的吸收或信号转导过程有调 控作用。 a b s t r a c t p h o s p h o r u si so n eo ft h et h r e ee s s e n t i a lm a c r o n u t r i e n t so fp l a n t sa n di tp l a y si m p o r t a n tr o l e si n p l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t a l t h o u g han u m b e ro fm e c h a n i s m si n v o l v e di nt h em o l e c u l a ra n d p h y s i o l o g i c a lr e s p o n s e so fp l a n t st ol o w - p h o s p h a t es t r e s sh a v eb e e nr e p o s e d m o r ew o r kn e e dt ob e d o n et ou n d e r s t a n dt h e m i nt h i sw o r k , l p t 3 ( 1 0 w - p h o s p h a t e t o r l e r a n t ) ，an o v e lr e s e s s i v em o n o g e n i cm u t a n to f a r a b i d o p s i s ， w a su s e dt oc l o n et h ed f r g e n et h r o u n l am a p b a s e dm e t h o da n dt oc h a r a c t e r i z et h ef u n c t i o no f d f r i n p h o s p h a t em e t a b o l i s m t h em u t a n tl o c u sw a sl o c a l i z e dt o a4 0 8k br e g i o ni nt h eb a cc l o n e m j b 2 1o nc h r o m o s o m ev b ys c o r i n gt h e r e c o m b i n a n te v e n t sw i t h s i m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m ( s s l p ) o rc l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ( c a p s ) m a r k e r s b ys e q u e n c i n g t h e10 g e n e sc o v e r i n gt h ei n t e r v a l ，as i n g l eb a s em u t a t i o nw a si d e n t i f i e d i na t 5 9 4 2 8 0 0 ，w h i c h e n c o d i n gak n o w nd i h 3 ，d r o f l a v o n o l4 - r e d u c t a s e ( d f r ) t h ea t ogm u t a t i o ni nt h et h i r de x o no f d f r g e n er e s u l t si nac h a n g ef r o mg l u t a m i ca c i d t ol y s i n ei ni t sp r o t e i np r o d u c t t h ec r o s st e s ts h o w e dt h a t t h ec r o s s - l i n eo f 酗t 3w i t he s 8 4 ，ad f rk n o c k - o u th o m o z y g o u sm u t a n t ，h a dt h es a m ep h e n o t y p ew i t h t h e i rp a r a n t st h a tt h e i rm e r i s t e m sd i d n ts h o w p u r p l eu n d e rl o w p h o s p h m es t r e s s i ti ss u g g e s t e d t h a t t h ef u n t i o no f d f ri na n t h o c y a n i n b i o s y n t h e s i si sl o s t p h e n o t y p et e s tr e s u l t ss h o w e d t h a tt h eb i o m a s sa n d p h o s p h a t eu p t a k er a t eo ft v t 3w e r es u p e r i o r t ow i l dt y p eu n d e r p h o s p h a t ed e f i c i e n c y , s u g g e s t i n g t h er e g u l a t i o no fd f ri np h o s p h a t em a t a b o l i s m t e n d a y - o l dl p t 3s e e d l i n g ss h o w e ds i g n i f i c a n tg r o w t hp r e d o m i n a n c e ，s t r o n g e rb o l t i n ga n db l o s s o m t e n d e n c yc o m p a r i n gt ow i l dt y p ec o u n t e r p a r tw h i l e3 - t o4 - d a y - o l ds e e d l i n g sd i d n t ，s u g g e s t i n gt h e t e m p o r a lr e g u l a t i o nb y d f r r n ab l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tm r n aa c c u m u l a t i o ni n7 - t o8 - d a y o l ds e e d l i n g sw a sn e a r l y u n d e t e c t a b l eu n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，w h i l ei tw a si n d u c e du n d e rl o w - p h o s p h a t ec o n d i t i o n t h e i n d u c t i o nw a so b v i o u sa f t e r6h o u ro ft r e a t m e n t ，i m p l y i n gt h a td f r r e s p o n de a r l yt ol o w - p h o s p h a t e s t r e s s ，r e a c h e dm a x i m u m1 8h o u r sa f t e ri n d u c t i o n t h e nd e c l i n e d t r a n s c r i p t i o n a ll e v eo f d f r i nl p t 3 w a sh i g h e rt h a ni nw i l dt y p eu n d e rp h o s p h a t es u f f i c i e n c yo rd e f i c i m c y t h eu n d e r l y i n gm e a n i n g r e m a i n st ob es t u d l e d h i s t o e h e m i c a ls t a i n i n gf o ro u si nt r a n s g e n i es e e d l i n g ss h o w e dt h a tg u s a c t i v i t yo c c u r r e di nb o t h s h o o ta n dr o o t ，s u g g e s t i n gt h a tt h ee x p r e s s i o no f d f rw a sc o n s t i t u t i v ea n dw a sr e l a t e dt om e t a b o l i s mi n m o s tk i n d so f c e i l s al a r g e ra m o u n to f g u s a c t i v i t yw a sd e t e c t e di nv a s c u l a rs y s t e m ，i m p l y i n ga sw e l l a si t sk e yr o l ei na n t h o e y a n i nb i o s y t h e s i s ，d f rm a ya l s or e g u l a t et h et r a n s p o r t i o no rt r a n s l o c a t i o no f m e t a b o l i t e sa n dt h ea c c o m p a n i e ds i g n a lt r a n s d u c t i o n ， i nc o n c l u s i o n ，a s i n g l eb a s ep a i rm u t a t i o no f d f rg e n er e s u l t si nt h e l o s s - o f - f u n c t i o np h e n o t y p eo f l p t 3m u t a n ti nt h ea n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i sp a t h w a y ，a n dm a y e n h a n c et h el o w p h o s p h a t e t o r l e r a n c e a b i l i t yo ft h em u t a n t d f rm a yb ei n v o v e di nt h er e g u l a t i o no fp h o s p h a t eu p t a k eo rr e l a t i v es i g n a l t r a n s d u c t i o np r o c e s s 4 a t p b a b o c a m p c a p s c d n a c d p k c h i c k 2 c o l d e p c d f r d h k d h q d n a ec o l l e b e d t a f 3 h ： f l s f 3 h c h s i p l l g l b k a n l o t m m m o p s 英文缩写表 a b b r e v i a t i o n s a d e n o s i n e5 - t r i p h o s p h a t e 6 - b e n z y la m i n o p u r i n e b a s ep a i r a d e n o s i n e3 5 - c y c l i cm o n o p h o s p h a t e c l e a v e da m p l i f i e d p o l y m o r p h i cs e q u e n c e c o m p l e m e n t a r yd n a c t a b c a l s i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e c h a l c o n ei s o m e r a s e ； c a s i nk i n a s e2 c e n t i m e t e r c o l u m b i a d i e t h y lp y r o c a s b o n a i e d i h y d r o f l a v o n o l4 - r e d u c t a s e d i h y d r o k a e m p f e r o l d i h y d r o q u e r c e t i n d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e j c h e r i c h i ac o l i e t h i d u mb r o m i d e e t h y l a n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d f l a v a n o n e3 - h y d r o x y l a s e f l a v o n o ls y n t h a s e ， f l a s o n o i d3 i 埘d r o x y l a s e e h a l c o n es y n t h a s e h o u r i s o p r o p y l t h i o - b - o - g a l a c t o p y r a n o s i d e l u r i a - b e r t a n im e d i a k a n a m y c i n l a n d s b e r g e r a c t a l o v ep h o s p h a t et o l e r a n c e m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r m i l l i m e t e r m i l l i m o l e 3 - n m o r p h o l i n o 一p r o p a n e s u l f o n i ca c i d 5 m r n a m s n a d o d o l i g o ( d t ) p c r p k c r i f r n a r p m s s d s s n p s s l p t r i s 玎 册 p t k v c x g a l m g u l v g t t m c m n l e s s e n g e rr n a m u m s h i g e & s k o o g s a l tm i x t u r e n i c o t i n a m i d ea d c h i n ed i n u c l e i o t i d e n a n o m e t e r o p t i c a ld e n s i t y o l i g o d e o x y t h y m i d y l i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r o t e i nk i n a s ec r i f a m p i c i n r i i b o n u c l e i ca c i d r o u n d sp e rm i n u t e s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s i m p l es e q u e e ap o l y m o r p h y s i m s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m 2 - a m i n o - 2 ( h y d r o x y m e t h y l ) 一1 ，3 一p r o p a n e d i o l t r a n s p a r e n tt e s t a t r a n s p a r e n tt e s t ag l a b r a p r o t e i nt y r o s l n ek i n a s e ( t y r o s i n ep r o t e i nk i n a s e ) v i t a m i nc 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 - i n d o l y l - b - d - g a l a c t o s i d a m i l l i g r a m m i c r o l i t r e m i c r o m e t e r m i c r o g r a m m i c r o m o l e c e n t i m o r g a n 6 第一章引言 1 1 植物适应磷胁迫机制的研究进展 1 1 1 植物磷营养性状的遗传特性与磷营养效率 植物对磷的吸收利用与遗传因子有关( a n d o r t o r a ，1 9 8 3 ) 。通过对玉米、小麦、番茄、水稻 等作物的研究表明，不同作物或同种作物的不同品系在低磷条件下表现出磷宙量、生物量、相 对分蘖力等耐低磷性状的显著差异，并且这些差异是可以稳定遗传的。这说明植物的磷营养性 状确实具有遗传特性，即是由基因控制的。 在表述植物营养性状的基因型差异时常用养分效率这一概念。在植物营养学上，磷效率指 植物利用生长介质中单位有效磷营养所产生的生物量( 张福锁等，1 9 9 2 ) 。而植物磷营养的高效 基因型即指该基因型能利用生长介质中单位有效养分生产出高于对照基因型的生物量。有研究 者认为。磷营养的高效基因型应是某个基因型比标准基因型在受到养分胁迫时获得更高产量 或生物量的能力。近年来也有一些报道，以植物在低磷胁迫时的生物产量或籽粒产量占在正常 供磷条件下生物产量或籽粒产量的百分率，即植物减产的程度，或称之为相对生物学产量或籽 粒产量来描述植物营养效率( f o h s e 等，1 9 8 8 ) 。以上定义包含两个方面的含义：是当植物生 长介质中养分的有效浓度较低，不能满足一般植物正常生长发育的需要时，某一高效基因型能 正常生长的能力；二是指当植物生长介质中养分有效浓度较高或不断提高时，某一高效基因型 植物的产量随该养分浓度的增加而不断提高的遗传潜力。磷效率的遗传控制是相当复杂的，一 般表现为连续变异，具有数量遗传的性质。 1 1 2 植物吸收磷的特点及体内磷的平衡 植物本身具有适应土壤浓度变化的吸收机制；在低浓度下通过高亲和性转运体吸收，而在 高浓度下通过低亲和性转运体吸收。高亲和性吸收过程是由质膜上a t p a s e 所产生的质子驱动 的需要能量的共运输过程。磷的吸收伴随着h + 的内流，化学当量是每运输一个h 2 p 0 4 2 需要2 到4 个h + 。 维持磷的稳态对维持植物的正常代谢是非常关键的。植物可能至少有两种不同的维持磷的 动态平衡的信号机制，一个是在细胞水平起作用，另一个涉及到多个器官，可能起源于茎尖。 在细胞水平上，磷进出液泡，以及对质膜的内向和外向流动的调节，是维持磷的动态平衡的基 本机制( m i m u r a ，1 9 9 0 ) 。植物在整体水平上的应答机制的协作要复杂得多。在缺磷条件f ， 当由根向茎供给的磷受到限制时，就会动员贮存在较老的叶片中的磷向正在生长的较幼嫩的叶 片或其他的活性库运输( 1 4 ，1 0 7 ) 。当植物处在生长发育过程中以及在磷胁迫的条件下，不同的 器官会改变它们的作用，从源变成库，或者反之，从库变成源。一般认为根是其他器官的磷源， 在磷饥饿条件下，会变成库。这似乎是植物的一种主动的适应机制，以促进根的生 炙，增加对 十壤养分的搜索和吸收。在缺磷的条件下，更高比例的磷会保留在根中，以促进根的生长和对 土壤养分的搜索( r a g h o t h a m a k g ，1 9 9 9 ) 。 7 1 1 3 植物适应磷胁迫的机制 一般在缺磷的+ 壤环境中，植物会产生形态、生理生化以及分子水平的变化以提高吸收和 利用磷的能力。植物对磷的吸收能力取决于根系的大小和分布、磷的吸收动力学和对磷的活化 能力等。在低磷营养胁迫条件下，植物通过一些生理生化适应机制米提高土壤磷的有效性，满 足自身对磷素的需求。植物对磷的适应机制主要有以下几方面： 1131 形态学适应反应 低磷逆境中，植物最先感受养分胁迫信号的器官是根系，对这一信号进行加工、处理、传 递的也是根系。地上部接受来自根部的胁迫信号后，整个植物对低磷胁追做出反应。这些反应 最终又部分地通过根系来表达和实现。在高等植物中，缺磷会导致根的生长和构型发生很大改 变，包括：根冠比的增加( l y n c h ，1 9 9 5 ) ，侧根、根毛的数量及长度增加( b a t e s 和l y n c h ， 2 0 0 1 ；j u n g k ，2 0 0 1 ) ，根与菌根真菌的互作增强( h a r r i s o n ，1 9 9 9 ) ，根系形态与结构的变化， 如形成排根( d i n k e l a k e r 等，1 9 8 9 ) ，以提高磷的利用率。 1 132 生理生化适应反应 在低磷胁迫条件下，植物为了适应缺磷环境，不仅根系形态发生变化，而且还可产生一系 列的生理生化变化以改变根际的物理、化学和生物学性状，活化根际养分，促进根系对养分的 吸收。主要的变化有：根际p h 变化；根都向外界分泌有机酸、螯合物( l i p t o n 等，1 9 8 7 ；h o l f o r d ， 1 9 9 7 ；r a g h o t h a r n a ，1 9 9 9 ；l o p e z - b u c i o 等，2 0 0 0 ，m a s a o k ay u 等，1 9 9 3 ) ：诱导产生酸性 磷酸酶( d u f f s m g ，1 9 9 4 ) ：调整呼吸作用( r y c h t e r a m 等，1 9 9 0 ) ；耱酵解途径的激活等( d u f f s m t 3 等，1 9 8 9 ) 。 1133 分子适应反应 在低磷胁迫条件下，生物的基因表达也发生适应性改变，如大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 中由多基因组成的p h o ，调节系统，在低磷条件f 受到诱 导而被激活使细胞得以从周围的介质中获得微量的磷( t o r r i a n i ，1 9 9 0 ；l e n b u r g 和o s h e a ， 1 9 9 6 ) 。g o l d s t e i n 等基于对番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 的研究提出在高等植物中也存在着类 似的低磷诱导系统( g o l d s t e i n 等，1 9 8 9 ) 。植物中一些磷饥饿诱导基因的启动子具有与酵母磷 饥饿诱导基因类似的顺式作用元件( b u r l e i g h 等，1 9 9 8 ，l i u 等，1 9 9 8 ) 。油菜细胞培养物在磷 饥饿条件下一些特定的肽磷酸化化程度增加( c “s w e l l 等，1 9 9 7 ) 。然而，植物形态和生理生 化反应的复杂性说明在植物中除了存在着一些与微生物类似的机帝i 外，还存在着一些其它的调 节机制。 随着拟南芥基因组测序的完成以及基因芯片技术的成熟，使得从整个基因组水平上研究植物 的磷胁迫反应成为可能。吴平等的研究表明：在芯片上的6 1 7 2 个基因中，有1 8 0 0 个基因在磷饥饿 诱导7 2 小时后其表达量的变化高于2 0 。分析表明它们的功能范围很广；很多与光合及氮同化有 关的基因受到下调，表明在磷饥饿过程中发生了一整套复杂的代谢适应反应。有1 0 0 多个转录因 子和细胞信号蛋白基因对磷饥饿发生了应答反应，暗示着细胞的生长和发育过程发生了较大范围 的调节变化：这些调节基因在根和叶中对磷饥饿的反应差异很大、甚至是相反的，说明不同的植 物器官对生长介质中缺磷的应答策略是不同的( w u 等，2 0 0 3 ) 。 8 1 1 4 磷胁迫相关基因 通过与酵母的p h o 一调节基因的同源性比较以及植物在磷充足与磷胁迫条件下的差异显示 的方法，已克隆到一些受低磷诱导的单基因并对其功能进行了研究。例如：在拟南芥中克隆到 两个与衰老有关的r n a s e 基因( r n s l 和r n s 2 ) ( b a r i o l ap a 等，1 9 9 4 ：g r e e np j ，1 9 9 4 ) ；在 番茄中和烟草中也克隆到类似的基因( d o d d sp n 等，1 9 9 6 ；k o c km 等，t 9 9 5 ) 。这些r n a s e 的作用可能是将胞内或胞夕 有机分子中的磷释放出来。m a l b o o b im a 等从油菜( b r a s s i c an i g r a ) 克隆到p r s 3 基因，该基因编码的多肽与0 葡糖苷酶具有同源性( m a l b o o b im a e ta l ，1 9 9 5 ) ， 随后又从拟南芥中克隆到p r s 32 ( m a l b o o b im a ，1 9 9 7 ) 。b 葡糖苷酶可能在磷胁迫期间起到 去糖基化和调节酸性磷酸酯酶的作用。b u r l e i g h 等从苜蓿( m e d i c a g ot r u n c a t u l a ) 中克隆到m t 4 基因。该基因含有类似于酵母p h o - 调节基因启动子序列的顺式作用元件，有多个翻译起始密 码子，并都能编码几个短肽链。当供给磷的时候或有菌根菌共生时，m t 4 的表达受到抑制 ( b u r l e i g hs h 等，1 9 9 7 ，1 9 9 8 ，1 9 9 9 ) 。 通过筛选突变体的方法，克隆到与磷载入木质部有关的基因p h 0 1 ( p o i r i e r 等，1 9 9 1 ； h a r a b u r g e r 等，2 0 0 2 ) ；r u b i o 等构建了由a t l p s l 的启动子与报告基因g u s 组成的融台基因 表达载体( a t l p s l 的启动子受磷饥饿专一性诱导) 。用于鉴定磷饥饿启动的信号级联系统中的 基因，结果克隆到一个编码m y b 转录园子的基因p h r l ：该转录因子直接参与p ；，饥饿诱导 基因如a t l p s l ，a t l p s 3 以及r n s l 的表达调控( r u b i o 等，2 0 0 1 ) 。 利用拟南芥的表达序列标签克隆到6 个高亲和性磷转运体基因p h t l p h t 6 ( m u c h h a l 等， 1 9 9 6 ：o k u m u r a 等1 9 9 8 ；s m i t h 等，1 9 9 7 ) 。p h t l 2 ，35 位于第五染色体上，p h t 4 ，6 位于 第二染色体上。 11 5 拟南芥的磷转运体 11 ，51 拟南芥磷转运体家族及其成员 拟南芥的磷转运体主要包括p i ：h + 共运无机磷转运体家族、p i ：n a + 共运无机磷转运家族和 磷通透酶家族( 表1 3 ) 。 11 52 植物磷转运体的结构 p i ：h + 共运体和p i ：n a + 共运体是是主要促进子超级家族( m a j o r f a c i l i t a t o rs u p e r f a m i l y ，m f s ) 的成员。p i ：h + 共运体均是膜结合蛋白，由1 2 个跨膜区组成，并被一个大的亲水性的带电荷区 分成两组，每组有6 个跨膜区：肽的两部分中有几个保守的结构域和序列相同，可能是由于串 联式基因内部复制造成的( r a g h o t h a m a ，1 9 9 9 ) 。 9 表1 无机磷转运体家族 t a b l e li n o r g a n i cp h o s p h a t e t r a n s p o r t e rf a m i l y a c c e s s i o ng e r l el o c u st l g ra n n o t a t i o n t 5 n 2 36 0 t 4 7 6 2 9 p h o s p h a t et r a n s p o r tp r o t e i n a t 3 9 5 4 7 0 0 t 7 f 6 1 l c 8 4 8 1 1 p h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 2 9 3 8 9 4 0 、v f 2 03 b a a 3 4 3 9 0 i n o r g a n i cp h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 5 9 4 3 3 4 0 w f 2 0 4 b a a 9 7 4 1 4 p h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 5 9 4 3 3 5 0 w f 2 05 b a a 2 4 2 8 1 i n o r g a n i cp h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 5 9 4 3 3 6 0 w f 2 06 b a a 2 4 2 8 2i n o r g a n i cp h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 5 9 4 3 3 7 0 r t 4 9 6 - 3 a a f 2 0 2 4 2p u t a t i v ep h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t l 9 7 6 4 3 0 t 2 l l l 4 2 3 a a b 9 1 9 8 2p u t a t i v ep h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 2 9 3 2 8 3 0 f 9 h 1 6 1 6 p u t a t i , oi n o r g a n i cp h o s p h a t e t r a n s p o r t e r a t l 9 2 0 8 6 0 表2n a + 一依耪的无机共运体类似蛋白家族 a c c e s s i o ng e n el o e u s t i g ra n n o t a t i o n t 2 7 a 1 62 5 a a c 3 5 2 3 0p u t a t i v en a + - d e p e n d e n ti n o r g a n i cp h o s p h a t ec o t r a n s p o n e r a t 2 9 2 9 6 5 0 t 8 p 2 13 a a d 3 2 7 6 6p u t a t i v en a + - d e p e n d e n ti n o r g a n i cp h o s p h a t ec o t r a n s p o r t e r a t 2 9 3 8 0 6 0 f 1 3 1 1 2 - 3 0 c a b 6 1 9 4 4p u t a t i v ep r o t e i n a g 9 4 6 9 8 0 a 1 9 0 0 5 1 1 0 - n n t 0 1 5 3 4n o tf c l u n d a t 4 9 0 0 3 7 0 b a b l o l 2 2 k 9 l 2 1 6n a + - d e p e n d e n ti n o r g a n i cp h o s p h m ec o t r a n s p o r t e r - l i k ep r o t e i n a t 5 9 4 4 3 7 0 1 0 表3 可能的磷通透酶 t a b l e3p u t a t i v ep h o s p h a t e p e r m e a s e 【a c c c s s i o r lg e n ei o c u st l g ra n r l o t a t i o n m f e l 6 9 lb a b 0 1 8 3 9 p u t a l i v ep h o s p h a t et r a n s p o r t e r a t 3 9 2 6 5 7 0 115 3 磷转运体的表达和调节 当植物根际的可获得磷的水平不同时，磷转运体可能会受到时空调节，在磷饥饿植物的根 中优先表达。磷转运体主要是在转录水平上受到调节。磷吸收能力是由增加转运体分子的数目 来调节的。磷转运体的基因表达的诱导不仅对磷饥饿的反应非常迅速，而且在补充磷的条件下， 又是可逆的。 1 1 6 磷饥饿的细胞信号转导 植物体内可能至少存在两种不同的信号机制以维持磷的平衡，一种是细胞水平的调控，另一 种是在多器官之间起作用( r a g h o t h a m a ，1 9 9 9 ) 。拟南芥的根可能会直接感受到外界磷的供应水 平并将感受到的信号传递出去以获得全基因组的协调表达( p i n g 、u 等，2 0 0 3 ) 。在磷饥饿过程 中，乙烯应答蛋白、生长素调节蛋白和赤霉素调节蛋白的表达受到上调或下调，叶中的类r a cg t p 结合蛋白及m a p k k k 基因的表达受到上调，钙调素和m a p k k 级联蛋白基因的表达受到下调， 异三聚体g 蛋白d 一亚基基因的表达量降低到原来的1 1 0 水平( w u 等，2 0 0 3 ) 。尽管缺少c a ”参与 磷饥饿诱导信号传递的直接证据，但是有证据表明磷饥饿条件下番茄根中的c e + - a t p 酶的转录水 平提高( m u c h h a l ，1 9 9 7 ) 。c a ”a t p 酶通过调节胞内c a 2 + 以及c d p k 的浓度和酶参与t c e + 信号的 传递。c d p k ； l l c d r k 的转录水平也受低磷的诱导( w u 等，2 0 0 3 ) 。 最近对拟南芥突变体砷0 2 的研究表明植物体内磷浓度的变化启动了基因的诱导表达( d o n g 等，1 9 9 8 ) 。细胞磷浓度的变化伴随着碳水化合物向根的再分配( t r a n s l o c a t i o n ) 。有可能磷饥 饿的信号是通过某些碳同化产物或磷流动的变化来传递的。葡萄糖转运体、碳水化合物代谢以及 细胞壁合成基因的表达上调，丽叶片中藏糖台成及转运体基因的表达下调，支持了碳的代谢和分 配与磷饥饿的信号转导相关这一观点。 综上所述，植物对磷胁迫的应答反应涉及到基因的调节、信息的传递以及一系列复杂的生 理生化及形态学适应过程，对这方面的研究己取得了一些进展，也克隆了一些与磷代谢相关的 基因。但是人们对于植物磷代谢这个复杂网络系统的了解还很有限，尚需进行更深入的研究。 还有许多新的基因有待人们去认识。 1 2 本论文的立论依据及意义 磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一。它在土壤中以正磷酸盐( h 3 p 0 4 ，h ：p 0 4 或 h p o 。2 1 ) 的形式存在( b o h n 等，1 9 7 9 ) 。植物对磷的主要吸收形式是h 2 p 0 4 。( u l l r i c h - e b e r i u s 等， 1 9 8 4 ；s c h a c h t m a n 等，1 9 9 8 ) 。磷被吸收进入根系、并经术质部被运送到地上部的组织或器官 后，大部分被用于合成有机物。另一部分仍以无机态形式存在，参与a t p 和a d p 之间的转换 平衡。磷不仅是a t p 、核酸、蛋白质、磷脂等细胞的关键分子的组分，而且也是许多代谢活动， 包括能量转移、蛋白激活、碳代谢、氨基酸代谢过程的重要调节因子( m a r s c h n e r ，1 9 9 5 ) ，它 在植物的物质代谢、能量代谢、遗传信息传递、细胞信号转导、基因表达调控等生命活动中起 着重要作用。植物缺磷时，各种代谢过程受到抑制，首先表现为植株生长迟缓、矮小、瘦弱、 直立、根系不发达、成熟延迟、籽实细小。由于细胞发育不良，致使叶绿素密度相对较高叶 子较小，且叶色呈暗绿皇筻灰绿色。缺磷的同时，铁的吸收利用率升高，间接促进叶绿素的合成， 使叶色变得深暗。植物缺磷较为严重时，植株体内糖类化合物相对积累，形成较多的花青素， 致使茎叶上出现紫红色。更严重时，叶片枯死脱落，症状由基部老叶开始逐渐向上部发展。由 此可见，磷是农作物生长发育的重要物质保障。然而，作物赖以生存的土壤中有效磷严重缺乏。 据报道，全世界1 3 1 9 亿公顷的耕地中约有4 3 缺磷( 刘建中，1 9 9 4 ) ，我国1 0 7 亿公顷农田 中有2 3 严重缺磷( 沈善敏，1 9 8 5 ) 。在农业生产中常通过施用磷肥来满足农作物获得一定产量 对磷的需求。由于磷是不可再生的自然资源，大量使用磷肥必将使磷矿资源趋于耗竭。据估算， 世界上的磷矿资源将在未来的6 0 一9 0 年内被消耗殆尽( r u n g e - m e t z g e r ，1 9 9 5 ) 。大量施用磷肥 还会带来其它一些不利效应，如破坏土壤中各种营养元素的平衡；对环境造成一定的污染，威 胁生态平衡；使农业的成本提高，降低农业经济效益，不利于农业长期稳定高效地发展。此外， 由于磷肥施入土壤中后很快就被碱性土壤中的钙盐及酸性土壤中的铁、铝等的氢氧化物所固定 或被土壤胶体所吸附，成为难以为植物所吸收利用的形态，导致磷素的利用率较低，多数作物 对磷肥的当季利用率一般为5 2 0 。磷在土壤中的移动性很小，其扩散距离仅l 2 毫米( b a r b e r 和m a c k a y ，1 9 8 6 ) ，扩散速度也较慢，在高肥力土壤中为3 0 p m h ，缺磷土壤中仪为l o u m h ， 其扩散系数为1 1 0 “o 1 1 0 1 c n l 2 s ( s t a n l e y ，1 9 8 4 ) 。植物只能吸收根系附近的少量磷。这些 因素都极大限制了植物对土壤磷和肥料磷的有效利用。因此，只有通过生物学方法，提高农作 物在低磷水平下对对磷的吸收和利用效率，培育耐低磷品种，才能保证农业的高效、持续发展。 为实现这一目标，首先应该建立遗传背景简单清楚的实验材料系统，对植物适应低磷胁迫性状 的分子遗传及生理生化机制进行深入研究。利用突变体进行这方面的研究被证明是一种较为理 想的途径。 拟南芥具有许多生物学、遗传学及分子遗传学等方面的特性。与其它大多数高等植物相比， 拟南芥具有个体小，植株生活史短，可以自交和人工杂交、种子结实量大、易于被诱变、基因 组小，遗传背景简单、易被转化等优点，己成为植物科学研究的模式植