（分析化学专业论文）蛋白质与受体相互作用的电化学研究.pdf

摘要 蛋白质是重要的生命物质，同很多生命现象密切相关。蛋白质的定量测定是 生命科学中经常涉及的内容，也是临床检验中诊断疾病和检验治疗效果的重要指 标。近年来电化学分析方法在生物分析化学中得到了广泛的应用，已成为生命科 学研究中最基础的手段之一。蛋白质的极谱波主要包括还原波、平行催化波和催 化氢波等。最近，我们又发现蛋白质的催化氢波能被氧化剂如0 3 、k 2 s 2 0 8 和 h 2 0 2 等进一步催化，产生新的动力波平行催化氢波，它比相应的催化氢波灵敏。 本论文研究了溶血素的极谱平行催化氢波，进一步提高了分析灵敏度。同时 把蛋白质这一灵敏的极谱平行催化氢波和免疫反应相结合，分别用直接法和伏安 免疫法测定了人白蛋白抗血清，进一步提高了蛋白质分析的灵敏度。还研究了人 血清白蛋白与小分子有机染料铬天青s 之间的反应，求出了结合常数并对反应机 理进行了讨论。该方法用于尿样中人血清白蛋白的测定，结果满意。 关键词：人血清白蛋白；人白蛋白抗血清；溶血素；铬天青s ；碘酸钾；均相免 疫分析法；平行催化氢波：相互结合作用 a - b s t r a c t n l eq u a n t i t a t i v ed e t e m l i m 血o no fp r o t e i ni sac o n s i d e r a b l ef a c t o ri nb i o c h e m i c a l a i l dc l i l l i c a la s s a y s o v e rr c c e n ty e a r s ，e l e c 仃o c h e m i c a lm e m o d sh a v eb e e nw i d e l y u s e di nb i o a i l a l y t i c a lc h e l i l i s 订y t h ep o l a m g r a p l l i cw a v eo fp m t e i nm a i n l ym c l u d e s t h er e d u c t i o nw a v e ，t h ec a t a l 州ch y d r o g e nw 斟ea n dt h ep a r a i l e lc a t a l y t i cw a v e r e c e n n y ，an e wh n e t i cw a v eo fc a t a l 如ch y d r o g e nw a v en 锄e da s t h ep a r a l l e l c a t a l ”i ch y d r o g e n 、v a v eo fp r o t e i ni so b s e r v e di na m m 0 1 1 i a cm e d i 唧c o n t a i n i n ga s u i t a b l eo x i d 趾t ，w h i c hi sm o r es e n s “i v et h a nt h a to fm ec o r r e s p o n d i n gc a t a l y t i c h y d r o g e n w a v e t l l i s p a p e rs t l l d i e s t l l e p a r “l e lc a t a l y t i ch y d r o g e nw a v eo fh e m o l y s i n ad i r e c t e v a l l l a t i o na 1 1 dh o m o g e n e o u sv o l t a r 砌e 斑ci 栅u n o a s s a yo fa 1 1 t i - h s aa r ep m p o s e d t 0 d e v e l o pm o r es e n s m v e m e t l l o d sf o rq u i c ke v a l u a t i n ga 1 1 曲o d y ，r e s p e c t i v e l y as m d y o n 血ei n t e r a c t i o no fc h r o m e a z l l r o ls ( c a s ) 州n lh 啪a ns e n l ma l b 啪i i l ( h s a ) i s a l s o i r e s t i g a t e d t h ep r o p o s e dm e t l l o di s 印p l i e dt o m ed e t e m l i n a t i o no fl l r i n e s 锄p l e s 诫t l ls a t i s f a c t o r yr e s u h s t h eb i n d i n gm l n l b e ra i l d 也eb i n d i n gi n t e r a c t i o n m e c h 捌s ma r ea l s od i s c u s s e d l i u y a l i l g q i n ( a n a l y t i c “c h e m i c a i ) d i r e c t e db y p r o f s o n gj 1 】i 】如n g k e y 、v o m s ： h u f n a ns e n l m a l b u m i n ；a m i _ h u m a ns e r 哪a l b u m i n ；h e m o l y s i n ； c l l r o m e 一姗o l s ；i o d a t e ；h o m o g e n e o u si m m u n o a s s a y ； p a r a l l e l c a t a l y t i ch y d r o g e nw a v e ；b i n d i n g i n t e r a c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的成果， 也不包含为获得西北大学或其他教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究工作所做的任何贡献均 已在论文中做了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字：到养勤签字日期：2 0 0 3 年0 5 月1 2 日 第一部分引言 第一章小分子与蛋白质相互作用及在蛋白质分析中的应用 l 引言 蛋白质是人体中重要的一类生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要和 必不可少的，同时，它对于生命遗传密码的翻译、信息的转录、d n a 的复制等 都有密切关系。有关生物大分子与小分子相互作用的研究，不仅对改进和发展检 测蛋白质的方法有促进作用，而且对研究生物大分子和有机小分子相互结合作用 的配位本质，促进生命科学的发展有着重要的意义。 2 小分子与蛋白质相互作用机理 有机小分子( 除药物外) 与蛋白质反应的研究主要是从蛋白质的检测深化而 来的。利用有机小分子( 如甲基橙f 1 】、考马斯亮蓝( c b b ) g 2 5 0 c 2 】、溴甲酚绿吲、 溴甲酚紫【4 】、溴酚蓝( b p b ) 5 1 等作为光谱探针与蛋白质生色，再用光度法来检测， 是蛋白质测定的主要方法。b r a d f o r d 【2 】在研究用考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c b b g 2 5 0 ) 测定蛋白质时发现，不同蛋白质对c b b g 2 5 0 的响应程度不同。这种现象就促使 人们想进一步弄清楚染料与蛋白质的反应机理，对实验现象作出合理的解释。 有机小分子与蛋白质相互作用的研究主要集中在以下2 个方面：1 有机小 分子与蛋白质的作用位点、相互作用力类型和有机小分子结合形态：2 有机小 分子与蛋白质的作用模型及结合参数( 结合个数、结合常数) 的测定。 2 1 有机小分子与蛋白质的作用位点、相互作用力类型和有机小分子 结合形态 f a z e k a s 【6 j 在研究普施安亮蓝r s 和考马斯亮蓝r 2 5 0 ( c b b r 2 5 0 ) 时提出， 染料离子是与蛋白质上的n h 3 + 依靠静电引力相结合的。s e d m a r k 【7 1 也持上述观 点，他在解释不同的蛋白质对c b b g 2 5 0 响应不同时认为，这是由于不同的蛋白 质含有- n h 3 + 数目不同，从而导致了对染料不同的响应。与此相对应，许多作者 认为有机小分子是与蛋白质上的碱性氨基酸残基相结合的 9 1 ，这些碱性氨基酸 残基包括赖氨酸、组氨酸、精氨酸和n 端氨基。m o s h e f 9 1 在研究c b b r 与蛋白质 反应时发现，c b b r 在不同蛋白质上的结合数与蛋白质所带正电荷数成正比，染 料结合数目和电荷数目比为1 5 3 o ：1 。c b b r 上存在着一s 0 3 ，它就是依靠 s 0 3 。与蛋白质上的碱性氨基酸残基作用的。l i n d 【1 0 1 曾对蛋白质上的碱性基团进 行修饰，他将碱性基团乙酰化、乙二醛和羧甲基化。结果发现，蛋白质对溴酚蓝 的亲和性降低，亲和性降低的程度正比于被修饰的带正电的基团。 陆a g h - h a i l s e n 【l l l 通过实验详细地研究了静电力在有机小分子酚红与血清白 蛋白间所起的作用。他发现，蛋白质总体上带正电时，二价的酚红( 带两个负电 荷) 比一价的酚红( 带个负电荷) 更易与血清白蛋白结合；在蛋白质总体上带 负电时，一价的酚红比二价的酚红易于与血清白蛋白结合。无论对一价还是二价 的酚红，随着蛋白质p h 值增加，结合常数都将降低，作者认为这是由于静电力 相斥的缘故。静电力在有机小分子与蛋白质的结合中起着重要的作用。可见，利 用静电力与蛋白质上的碱性基团相结合是小分子与蛋白质相互作用的一种方式。 除上述情况外，利用疏水作用力和蛋白质的疏水部位相结合也被广泛认为是 有机小分子和蛋白质相互作用的一种方式。 l a l ( i n 【8 】曾指出c b b g 2 5 0 可以与蛋白质的疏水部位依靠疏水作用力相互作 用。f l 锄g a n l l 2 l 在研究芳香类阴离子与b s a 作用时，认为阴离子可以被质子化 的蛋白质分子中的非极性部位接收。m o s h e f 9 j 认为虽然蛋白质所带正电荷决定了 所结合的染料数目，但仅仅依靠静电力是不能紧密结合的。c o m p t o n 【1 3 1 用聚氨基 酸与c b b g - 2 5 0 反应时发现，不带电荷的聚芳香族氨基酸与c b b g 2 5 0 有反应。 这都表明非静电力起了很大作用。 在许多情况下，有机小分子与蛋白质的反应不仅是某一种力的单独作用，而 是多种力协同作用的结果，这些力包括静电力、疏水作用力、范德华力等。 k r a g h h 趾s e n 【1 4 i 在研究了十二烷基硫酸盐和十六烷酸与血清白蛋白的作用 后指出，它们与蛋白质的作用不仅仅是疏水作甩，配体的离子部分的作用也需要 考虑，这实际上就是要考虑到疏水作用力和静电引力。m o s h e 【9 1 和f a z e k a s 【6 1 提出 c b b r _ 2 5 0 与蛋白质的作用首先是依靠静电引力相互吸引，疏水键再起加固作 用。有文献【l 5 1 指出，疏水环境和蛋白质上的正电荷是疏水阴离子与蛋白质作用 的必须条件。 有机小分子与蛋白质的结合方式是多种多样的。蛋白质上的主要结合位点可 以结合多个有机小分子【1 6 1 ，一个有机小分子可以结合在另一个已被结合的有机 小分子上【8 1 一个有机小分子还可以同时结合在两个蛋白质分子上【1 7 】。 2 2 有机小分子与蛋白质的作用模型及结合参数( 结合个数、结合常 数) 的测定 许多有机小分子都能和蛋白质结合，尤其是阴离子配体。人们为了定量地研 究有机小分子与蛋白质的作用，提出了不同的结合模型和结合参数的计算方法。 2 2 1s c a t c h a r d 模型1 1 8 】 该模型的基本假设是：对于一种配体，假设蛋白质上每个结合部位完全一样 ( 即配体和每一个结合部位作用的自由能相等) ，并且这些结合部位与配体的作 用是独立的，不存在相互作用。他推导出了s c a t c h a r d 方程： 仃【l 】2 删一砌 其中，h ：每一分子蛋白质上所结合的配体数； l ：溶液中游离的配体浓度；k ： 结合常数：最大结合部位数。 2 2 2 专一性和非专一性模型 按照s c a t c h a r d 模型，蛋白质分子中的结合部位是一定的，当配体浓度足够 大时，平均结合数达到一个定值，不再增加。但是，在应用此模型时，当配体浓 度过量，有时会出现胛 l 】为一常数的现象。此时，仃随 l 的增加而增加，不 出现最大值。t 缸r a 掣1 9 1 提出在蛋白质和配体之间存在专一性( s p e c 硪c ) 结合和 非专一性( n o n - s p e c i f i c ) 结合两种作用，专一性结合遵循s c a c c h a r d 模型，其特 点是高亲和性以及结合容量小( 即最大结合数小) ；非专一性结合就好象在水相 和有机相中分配，其特点是低亲和性，对配体的容量是无限的( 即不存在最大结 合数) 。两种作用之间不存在协同作用，因而平均结合数”是这两种结合部位数 的加和。 疗= ，知+ 甩肿 其中门i = k 【l 】( 1 + 墨【l 】) ；疗肿= k 0 l 】 i 习此n = | 恐 l 】( 1 + 疋 l 】+ l 】) 这一模型被称为“专一性结合和非专一性结合模型( 简称s n s 模型) ”。 陆a 等比较了用s c a t c h a r d 模型和s - n s 模型分别处理了华法令( 一种药物) 以及水杨酸与白蛋白结合的数据，认为两种模型的处理方法所得到的结果是一致 的。 2 2 3 相分配模型 p l sa _ v e m o 【2 0 1 抛开了s c a _ 曲a r d 模型的假设，提出了相分配模型。他认为牛血 清白蛋白对阴离子染料的吸收光谱和质子化常数的影响类似于表面活性胶柬的 作用，没有明显的专一性结合点。p l s a v e n t o 提出假设：血清白蛋白可以被认为 是一个不同于水的微相。微相分散在水相中，当一种物质x 在这两相中分配， 便有如下平衡式：x - - 一x 则分配常数硒= a 。u 。= p ( 】丫。 ) ( y 。 其中，、y 分别表示x 的活度及活度系数，晓。、y 分别表示x 。的活度及活 度系数，x 。表示与蛋白质结合的小分子( 即在蛋白质微相中的小分子) ，x 表示 游离态的小分子。以这个模型为基础，p l s a v e m o 研究了1 四唑基偶氮2 萘酚3 ， 6 二磺酸与牛血清白蛋白的作用，得到了满意的结果。 3 定量分析方法 3 1 浊度法 磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂，利用沉淀剂与蛋白质相互作 用产生的浊度与标准溶液浊度相比，就可以定量检测未知蛋白质浓度。该法操作 简单、快速，为临床常规检查所用。但由于操作过程没有标准化，因此结果的准 确度和精密度较差。 3 2 吸光光度法 测定蛋白质含量常用的吸光光度法包括经典的双缩脲法、l o w r y 【2 ”、染料结 合法、金属离子染料结合法。 3 2 1 双缩脲法( b i u r e ta s s a y ) 当含有两个或两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应后，形成紫色的络合 物，其最大吸收峰在5 4 0n m ，形成络合物的量，取决于蛋白质的浓度。本法的 缺点是灵敏度低，干扰较大，且操作复杂。 3 2 2 l o w r y 法 此法是将双缩脲试剂和f o l i n - c i o c a l t e a u 试剂一起加入蛋白质溶液中，反应产 物在7 5 0 衄处有最大吸收。一定条件下，吸光度与蛋白质浓度成正比。此方法 的线性范围宽，检出下限为o 1 l ，灵敏度比双缩脲法高1 0 0 倍。但它基于酸 4 试剂与蛋白质反应是非特效反应，抗干扰能力较差。 3 2 3 染料结合法 基于染料与蛋白质的结合用于蛋白质的检测是最为广泛的分析方法。它具有 简便、快速、经济等特点，越来越受到人们的普遍关注。 早在1 9 7 6 年b a r d f b r d 【2 】提出以考马斯亮蓝g 2 5 0 和蛋白质相互结合，在5 9 5 m 处有最大吸收，在一定条件下，蛋白质浓度和吸光度成正比。该法灵敏度高， 操作简单，显色稳定，但是染料的吸附比较严重，线性范围窄，反应特异性不好。 近年来童沈阳等【2 2 3 0 】人研究了一系列有机染料同蛋白质的相互作用。如茜素 红s ，溴甲酚绿，酸性铬蓝k 等，取得了较好的结果。张华山等【3 1 1 人研究了十 种变色酸偶氮染料与蛋白质的作用，及所引起的光谱性能变化，详细探讨了染料 结构、实验条件对染料与蛋白质相互作用的影响。 3 2 4 金属离子染料结合法 金属离子和有机染料易于形成配合物体系，这些体系在合适的条件下能和蛋 白质分子相结合形成新配合物大分子，从而改变了原体系的光谱特点，进而可用 于蛋白质的定量检测。 在p h3 7 的醋酸缓冲介质中，铬天青s 与a l ( i i i ) 及人血清白蛋白能够形成 三元络合物，最大吸收峰为6 3 0n m ，此方法的线性范围宽口2 1 。 3 3 荧光法 以荧光法测定蛋白质通常比光度法灵敏。由于大多数蛋白质在2 8 0n r n 紫外 区有强烈的光吸收而导致荧光。当和某些具有荧光特性的染料结合后，能引起荧 光强度的增强或猝灭，并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于 蛋白质的测定。 现已报道的有8 一羟氨基- 1 一萘磺酸、曙红y 、藻红、铬天青、耐尔红、四( 4 羧基苯基) 卟啉等【3 3 讲】。用于蛋白质的测定均有较好的结果，灵敏度较高，但仅 适用于具有荧光的体系，使应用范围受到了限制。 3 4 光散射技术 光散射是指一束光通过介质时，在入射光方向以外的各方向观察到的一种光 辐射现象。有机染料是最常用的光散射探针，近几年此技术广泛应用于蛋白质、 核酸和金属离子的测定中。由于蛋白质多肽链上各部分的非极性侧链在酸性条件 下带正电荷，强烈吸引带负电荷的有机染料与之结合，因此在蛋白质表面形成一 个有机染料的覆盖层，这种以蛋白质为支撑核心的染料聚集体远大于染料自身聚 集体的体积，因此两者结合后，光散射强度急剧增加，并与加入的蛋白质浓度成 正比。 常用的测定蛋白质的光散射法所用的试剂有卟啉类试剂、酸性三苯甲烷类染 料和酸性偶氮染料等，用于蛋白质的测定【3 8 m 1 具有很好的结果。 3 5 电化学分析法 人们多采用光谱方法研究蛋白质与有机小分子的作用，但任何检测方法都有 其局限性，如一些小分子吸收太弱或者由于其电子转移能级与蛋白质重叠而不适 于光谱测定，电化学方法就成为这一研究领域对于光谱方法的有效补充。近年来 电化学分析方法在生物分析化学中得到了较为广泛的应用，已成为生命科学研究 中最基础的手段之一。其理论基础和实验方法与谱学方法联用可以使我们在分子 及细胞水平上来认识和研究生命现象中的化学本质。随着生命科学的发展，电化 学日益显示出其重要作用。 电化学方法主要是基于蛋白质存在与否时，体系伏安特性的差别，包括由于 结合反应引起的体系电位的移动和结合反应后其扩散系数的下降导致扩散电流 的减小等电化学行为的差别来进行研究。当具有电化学活性的小分子与蛋白质相 互作用后，小分子的特征氧化还原峰电流会发生变化，同时峰电位也有所移动。 电化学分析法能够作为其他方法的有益补充，同时能够获得其他方法得不到的信 息。李南强等【4 3 4 8 】用电化学方法研究了蛋白质同有机小分子9 ，l o 蒽醌、卟啉之 间的反应。焦奎等【4 9 5 0 1 用线性扫描极谱法研究了茜素红s ( a r s ) 与蛋白质之间 的相互作用。 用电化学方法研究蛋白质与有机小分子还处于起步阶段，本文在此基础上研 究了蛋白质和小分子染料之间的相互作用，进一步获得生物大分子与小分子探针 反应方面的有关数据及信息。这些研究对进一步探索和认识生物大分子的性质、 结构、行为、形态、作用机理等是非常有意义的，也为进一步揭示生命科学中的 奥秘奠定一定的科学研究基础及理论依据。 参考文献 1 b r 扯k e njs o t s i m j ：c f 汛砌m ，1 9 5 3 ，2 3 ：1 0 5 5 2 b r a d f b r dmm 4 n n b i d c h e m ，1 9 7 6 ，7 2 ：2 4 8 3 d o m 鹊bt ，w 缸s o nw a ，b i g g shg ( y 加c h p m 爿c 以，1 9 7 l ，3 l ：8 7 4 l o u d e r b a c k a ，删c n 玎e 珊，1 9 6 8 ，1 4 ：7 9 3 5 j i l l l gk ，n i c k e le ，p e r g a i l d em c f 栩c 妇m 4 c 胁，1 9 9 0 ，1 8 7 ：1 6 3 6 f a z e k a sd es tsg ，w b b s t e rrgd a t y n e ra b f d c 而j 肌b f 印，驴爿c m ，1 9 6 3 ， 7 l ：3 7 7 7 s e d m a kjj ，g r o s s b e 玛se 4 ”n f 占f o c p m ，1 9 7 7 ，7 9 ：5 4 4 8 l a k i n k a 伽p ，0 把f 瑚加胁卅d 珊 r “护i 肋n 1 7 9 9 m o s h e t a l ，s i l b e r s t e i na ，n l l s s e re 口f 0 正硎，1 9 8 0 ，2 6 0 ：9 9 7 6 1 0 l i n dk e ，融a g h h a n s e nu ，m o l l e r jv b f d 曲f m b j d p 砂女4 c 纽，1 9 7 4 ，3 7 1 ：4 5 1 1 1 k m 曲一h a n s e nu ，m o l l e r jv b f 0 拍概b 卸矗坶4 c 触，1 9 7 3 ，2 9 5 ：4 4 7 1 2 f l a n a g a l lmt ，a j n s w o r n ls b f d 砌拥占卸枷4 c 胁，1 9 6 8 ，1 6 8 ：1 6 1 3 c o m p t o n sj ，j o n e sc g a n a l b i o c h e m ，1 9 8 5 ，1 5 1 ：3 6 9 1 4 k m 曲一h a l l s e nu ，m o l l e rjv l i n dke b f d c f m b f 印矗 4 c 埘，1 9 7 4 ，3 6 5 ：3 6 0 1 5 j o r l a s a ，w 曲e rgb f 。c 矗p m ，1 9 7 1 ，1 0 ：1 3 3 5 16 w i l s o ncm 爿朋正b f d c 口肌，1 9 7 9 ，9 6 ：2 6 3 1 7 r a y a ，r e y n o d sj a ，p o l e t h b f d c 向e 川，1 9 6 6 ，5 ：2 6 0 6 1 8 s c a t c h a r dg s c h e i b e 玛ih ，a n n s 们n gsh j ：一脚硎& d ，1 9 5 0 ，7 2 ：5 3 5 1 9 t a 湘z ，t e r a d ah b f 0 拍p 肌p 口册们d 正，1 9 8 5 ，3 4 ：1 9 9 9 2 0 p 1 s a v e m om 。p r o m m o a 豫肠h 幻，1 9 9 1 ，3 8 ：1 0 9 9 2 1 l o w r y0h r o s e b r o u 出nj ，f a r ral ，r a n d a l lrj jb mc h 绷，1 9 5 1 ， 1 9 3 ：2 6 5 2 2 l in ，l ik a ，t b n gs y 一九口正三p f ，1 9 9 5 ，2 8 ( 1o ) ：1 7 6 3 2 3 朱铿，童沈阳纪学学攒，1 9 9 6 ，5 4 ( 6 ) ：6 2 0 2 4 魏永巨，李克安，童沈阳分笏纪毒薯1 9 9 6 ，2 4 ( 4 ) ：3 8 7 2 5 庄稼，迟燕华，李克安，李娜，童沈阳纪学学掼，1 9 9 8 ，5 6 ( 8 ) ：8 2 7 2 6 迟燕华，李娜，庄稼，李克安，童沈阳高等学挖纪学学掼，1 9 9 8 ，1 9 ( 6 ) ：8 7 9 7 2 7 李娜，李克安，童沈阳分撕j 2 邑1 9 9 6 ，2 4 ( 1 ) ：1 0 2 8 迟燕华，庄稼，李娜，李克安，童沈阳高等学橙纪学学掼，1 9 9 9 ，2 0 ( 11 ) ：1 6 9 7 2 9 胡秋娈，李娜，赵风林，李克安，童沈阳分析纪 邑1 9 9 9 ，2 7 ( 2 ) ：1 6 6 3 0 李娜，李克安，童沈阳分獬f 学学担，1 9 9 7 ，1 3 ( 4 ) ：2 6 5 3 1 李进，王红，曹启花，张华山，化学诧瓤2 0 0 0 ，2 2 ( 3 ) ：1 2 9 3 2 s a i t ok ，k 锄e t s l l n aa ，o k u d ah 绷j p 口m b 材髓，1 9 8 6 ，3 4 ( 2 ) ：7 4 6 3 3 c i y x ，c h e nl 爿瑚咖f ，1 9 8 8 ，1 1 3 ：6 7 9 3 4 l in ，l ik a ，i b n gs y 4 ，披正上p f f ，1 9 9 5 ，2 2 8 ：3 4 3 3 5 f a n n e rh ，y u a i lz y 彳刀口正b f 0 如p 所，1 9 9 1 ，1 9 7 ：6 7 9 3 6 m ac q ，l ik a ，t o n g sya 口fc h i m 4 c 胁，1 9 9 6 ，3 3 3 ( 1 - 2 ) ：8 3 3 7 s a c k e td l ，w o l f f j 爿船口正b i d c 向e m ，1 9 8 7 ，1 6 7 ：2 2 8 3 8 m a cq ，l i k a ，t o n gsy b 以绷c 扫n ，1 9 9 7 ，7 0 ：1 2 9 3 9 m ac q ，l ik a ，1 o n gsy4 刀口 b f o c 厅p 脚，1 9 9 6 2 3 9 ( 1 ) ：8 6 4 0 y 幻g l ik a ，t b n gs y 豫，鲫把，1 9 9 9 ，5 0 ( 3 ) ：5 8 5 4 1 m a c q ，l i k a ，t o n gs y 4 门口咖1 9 9 7 ，1 2 2 ：3 6 1 4 2 h u a i l g c z ，l i xf ，l i k a 4 ”d 咖f ，1 9 9 8 ，1 2 3 ：1 0 4 1 4 3 z h uz w ，l inq 肋c 阳c 矗p m j ：，1 9 9 8 ，5 9 ( 2 ) ：2 9 4 - 3 0 6 4 4 z h u z w l i n q 施c r d c 8 m j ：，1 9 9 8 ，5 9 ( 2 ) ：3 0 7 4 5 z h a i l g h m ，z h u zw l i n q 肌j 口丹f 埘，一舶，p 聊，1 9 9 9 ，3 6 3 ：4 0 8 4 6 q uf l i n q ，j i a n g y y 彳甩以c 厅咖爿c 胁，1 9 9 7 ，3 4 4 ：9 7 4 7 q uf ，l i n q ，j i a n g y y 脚咖c p m ，1 9 9 8 ，5 8 ：3 9 4 8 q uf t 肪c 打。口九咖括，1 9 9 7 ，9 ：1 3 4 8 4 9 s u i lw ，j i a ok 强胁缸，2 0 0 2 ，5 6 ( 6 ) ：1 0 7 3 5 0 孙伟，焦奎，刘晓云分析纪学，2 0 0 2 ，3 0 ( 3 ) ：3 1 2 8 第二章伏安免疫分析法研究进展 1 引言 免疫分析法是以抗原( a m i 蹦l ，a g ) 或半抗原和抗体( a n t i b o d y ，a b ) 特异 性结合生成抗原抗体复合物( a g - a b ) 的免疫反应为基础的生物医学测试技术， 它的提出及发展是生物分析化学最伟大的成就之一。免疫分析法具有特异性好和 检测限低等特点，是医学研究和临床检验的有利工具之一，在医学临床的诊治和 癌症研究等方面起着非常重要的作用。免疫分析中发展快、应用广的首推放射免 疫分析法( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r j a ) 【1 ，2 1 。r j a 的主要优点是仪器自动化，操作简便， 灵敏度高，样品制备简单。同时，由于临床样品中不存在放射活性物质，因而干 扰少。但是由于使用了放射性同位素，测定时需特殊的防护设备，仪器价格又贵， 同时伴有废物处理等问题。上述这些缺点限制了r j a 的发展和普及。这便激发 了人们探索非放射形标记的免疫分析方法。继4 0 年代出现了荧光免疫法 ( f 1 u o r e s c e n c e ，f i a ) 之后，5 0 年代出现了电化学免疫分析法( e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a y ，e c i a ) 口5 1 ，6 0 年代又出现了酶联吸附免疫分析法( e i l z y m el i i l k e d i o s o r b e n t 髂s a y ，e l i s a ) ，7 0 年代后期，发光免疫分析法( l 啪i n e s c e m i m m u n o a s s a y ，l i a ) 和伏安免疫分析法( v o l t a m m e t r i ci m m l l l l o a s s a y v i a ) 相 继问世，这些给免疫检测技术带来了生机。 v i a 把电化学的伏安分析法与免疫学中抗原抗体的免疫化学反应相联结，可 提供多种途径的检测抗原或抗体的方法，且具有仪器设备简单价廉、方法快速等 特点。 2 标记物 2 1 无标记 当a g 在一定底液中有氧化还原作用时，可直接用电化学法检测a g 浓度。 在一定条件( 酸度、温度、离子强度) 下，a b 可与a g 发生免疫结合反应： a g + a b4 。a g a b 大分子复合物a g - a b 一般是非电活性的。因此，通常毋需分离，测量降低的a g 峰电流，即可检测a b 浓度。免疫学中，一种抗原通常只与特定的抗体发生免疫 结合反应，有很高的结合常数( 1 0 5 一l o ) 。所以这种由抗体引起抗原峰电流值降 9 低的检测方法简便、快速、选择性好、灵敏度高。 胡荫华等f 9 】发现在o 1 m 氯化铵缓冲溶液( p h9 4 ) 中，白喉类毒素有极谱 还原峰和氧化峰，峰电流随白喉类毒素浓度增大而增大，检测最低浓度为0 3 0 p i i l l 。利用免疫化学反应，峰电流降低与白喉抗毒素的浓度关系，可测定低至 2 5 1 0 击i u ，m l 的白喉抗毒素。又发现在含碘乙酸的氯化铵介质中，半抗原地高 辛提前在一1 5 4v 处还原，用单扫示波极谱法测得峰电流与地高辛浓度在2 o 6 0 n m l 范围内有良好的线性关系【1 0 1 。在含地高辛的溶液中加入由第四军医大学研 制的八种抗地高辛单克隆抗体【l l 】进行伏安免疫研究，在3 7 温育1 5m i n 后测 定地高辛峰电流，证明有七种地高辛单克隆抗体均使地高辛峰电流下降呈免疫结 合反应，有较高的抗体效价。 2 2 电化学活性物质标记 如果抗原( 或抗体) 本身无电活性，则需要连接一个电活性物质( m ) ，用作 标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还原性质的金属离子和电活性的有 机功能团。标记过程可简单表示为： a g + m 2 4 。a g - m 在伏安法中，标记的结合物a g m 与标记物m 有不同的氧化还原电位，不需分 离未结合的m ，可由a g - m 的氧化还原电流测定a g 浓度。若在溶液中加入特异 性抗体，则发生下式免疫反应： a b + a g m 。a b a g m a b 浓度可根据a g 。m 峰电流的变化来测定。 标记v i a 也可采用竞争反应原理。它是将定量结合物a g m ( 可事先合成制 得a g m ) 加入待测a g 溶液中，再加入定量a b ，则溶液中a 卧a g m 与a b 的 免疫结合反应均处于竞争状态，如同r j a 的竞争反应，可表示为： a 掣+ 处宁a 夏m 伏安检测a g m 的电信号，当待测a g 浓度为零时，a g m 完全与ab - 结合，a g m 的电信号最小；当a g 浓度较大时，大量a b 与a g 结合，溶液中有较多量未结 合的a 分m ，a 哥m 的电信号较大，因而有a g 浓度正比于a 哥m 电信号的关系。 胡荫华等【1 6 1 将白喉类毒素( d t ) 加入2 0 1 0 5m o l l c d 2 + 0 0 6m o l l n a c l - o 0 0 6m o l l n a 2 8 4 0 7 ( p h 9 0 ) 溶液中，发现结合物【d t _ c d 】2 + 在c d 2 + 波( 一o 5 6v ) 0 后面一0 6 7v ( w s c e ) 处有一还原波，可测定低至5 “m l 的d t 。在上述溶液 中加入固定量d t ，可用均相免疫法测定低至l 1 0 。4i u m l 的白喉抗毒素。 用金属离子通过螯合剂标记抗原【”。1 卅也是一种可行的方法。二乙三胺五乙酸 ( d r ，a ) 络合剂既容易与人血清白蛋白( h s a ) 连接，又容易与金属离子i n ” 络合，可以用异相竞争法测定h s a 。直接检测标记的金属离子限制了这些方法 灵敏度的提高，前文2 3 1 提出了一种基于标记金属离子催化放大底物转化和极谱 检测生成产物的极谱免疫分析新体系。在该体系中，用铜离予代替天然酶作底物 转化的催化剂，通过双功能螯合剂d t p a 将其标记于模型抗原d t 。在竞争免疫 反应后，标记铜离子催化底物d 临苯二胺( 0 p d ) 的氧化反应，生成电活性产物2 ，3 二氨基吩嗪( d a p ) ，然后用单扫描极谱法测定d a p 。灵敏度比直接检测标记金属 离子的方法提高了两个数量级。 可作为伏安免疫分析标记物的某些金属离子和有机功能团见表l 。 表lv 认中用作标记物的某些金属离子和有机电活性功能团 2 3 生物酶标记 酶标记v i a 是基于酶催化底物s 产生电活性产物p ，然后用伏安法进行测定。 可用作电化学免疫分析的生物酶及反应体系必须满足以下条件：( 1 1 酶具有高活 性，可在短时间内将大量底物分子转化为产物：( 2 ) 容易与抗原或抗体结合，且 不降低活性；( 3 ) 在检测过程中和保存条件下稳定；( 4 ) 在测定条件下体系底物 非活性；( 5 ) 酶催化反应产物具有电化学活性。v m 中常用的酶见表2 。 表2 v i a 中常用的酶标记物 在这些酶中，最常用的是碱性磷酸酶( a p ) 和辣根过氧化物酶( h r p ) 。当标记 酶为a p 时，a p 可以催化非电活性的底物磷酸苯酯水解生成电活性的产物苯酚。 通过测定苯酚的量可得a p 活性，从而测定抗原或抗体的含量。临苯二胺、邻联 茴香胺等可以用作h r p 的底物，在h 2 0 2 存在下酶催化氧化产生电活性的偶氮产 物。 3 免疫方法 免疫方法分为异相免疫和均相免疫两大类。 3 1 异相免疫分析法 异相免疫分析法是以物理方法将抗原抗体复合物与未结合的抗原、抗体相 分离，然后检测与复合物相结合的标记物，经过分离可以除去基体中的干扰物质。 异相免疫分析可以标记抗原，也可以标记抗体。 异相免疫分析主要可分为竞争法和夹心法两种类型。 竞争法是用未标记分析物( 抗原) 部分饱和抗体，未标记抗原和标记抗原同 时存在于免疫反应板( 管) 中使抗原与抗体间达到质量平衡，称为平衡饱和法。 如果饱和分两步，先用未标记抗原再用标记抗原完成的话，则称之为非平衡分析 法。竞争法检测总是在抗体过剩的条件下进行。 异性竞争法可以用金属离子标记，也可以用生物酶标记。i n ( i ) 7 】是在伏 安免疫分析中第一个被用作标记物的金属离子，用于以竞争法测定人血清白蛋白 1 2 ( h s a ) 。标记物的制备，是将螯合物d t p a 与h s a 共价结合，然后在p h4 5 使1 i l ( ) 与d 矸l a 螯合，标记h s a 与未标记h s a 以平和饱和法竞争抗h s a 提 供的有限的结合点。结合的h s a 与自由的h s a 分离后，螯合物在p h1 5 时释 放出i n ( ) ，用悬汞电极以微分脉冲阳极溶出伏安法检测。测定h s a 的线性范 围为5 0 4 0 o “m l ，检测限为5 op g ，m l 。如果选用电位溶出分析法测定，溶解 氧不产生干扰，操作更为简便。 免疫吸附砗竺+ 畿一山。+ 车盒：墓盒。吼山，钆 等时+ 车竺塞盒。一，。盟+ t n 3 + ( d p a 删劫 夹心法是基于被包被抗体吸附于固相载体，加入含有抗原的待测样品与抗体 结合，加入特异性标记抗体使形成抗体、抗原酶标记抗体复合物，然后加入底物， 再终止反应，并测定结果。这种方法因需同时与两个抗体分子反应，常用于测定 大分子。文献有【3 9 ，4 0 】。 异相电化学酶联免疫分析法有如下突出的优点。( 1 ) 检测限低，一般可达到 p g m l ；( 2 ) 由于加入底物之前已将待测样品洗涤出去，这便大大减少了样品中 电活性物质的干扰，也减少了被吸附蛋白质膜对电极的污染；( 3 ) 测定的过程及 数据的处理易于实现自动化，对常规分析非常有利。 3 2 均相伏安免疫分析 均相伏安免疫分析不必对自由抗原和结合抗原进行分离。几乎所有的均相 伏安免疫分析均用竞争法检测，可以用平衡饱和法，也可以用分布饱和法。均相 伏安免疫分析费用低，样品处理简单，节约时间。从临床应用的观点看，这可能 是最适用的一种方法。在均相伏安免疫分析中所要克服的最大困难是需在结合抗 原的存在下检测自由抗原。 胡荫华等1 4 1 】用抗原或抗体于悬汞电极上在b r d i c l ( a 溶液中产生的一种灵敏的 “活化钴”催化电流，均相地检测了破伤风类毒素和破伤风抗毒素，白喉类毒素 和白喉抗毒素，人心脏肌凝蛋白和抗人心脏肌凝蛋白单克隆抗体。 当以酶作标记物时，抗体与酶标抗原结合形成的a g a b 相比较，催化活性 有所降低。所以，a g a b + 与a 矿不必分离便可进行均相免疫分析。这种技术已 用于测定苯妥英钠和地高辛【3 1 ，3 9 】。苯妥英钠是一种抗癫痫病药，药物用葡萄糖6 - 磷酸脱氢酶标记，此酶可以使氧化型的辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d + ) 转变 为还原型的n a d h ，生成的n a d h 可以通过电化学氧化电流进行测定。在o 1 m o l l 磷酸盐缓冲液中( p h6 5 ) ，以玻碳电极为工作电极，n a d h 在+ 0 8 5v ( w a 幽g c l ) 有一氧化峰。电极污染蛋白质和电活性干扰物质如尿酸可以由高压液相 色谱法除去。测定苯妥英钠的标准曲线范围为2 5 3 0p g m l ，地高辛为o 5 5 7 5 n m l 。两者的治疗浓度范围分别为1 0 2 0 “g m l 和0 9 2 on g ，m l ，因而这种方 法可以临床应用。对于病人血清样品，苯妥英钠分别用本方法和光度免疫法测定， 两者的相关系数为o 9 9 。地高辛分别用本方法和放射免疫分析法测定，两者的相 关系数为0 9 4 2 。本方法的酶孵化时间只须5m i n ，而光度免疫法的孵化时间为 3 0 m i n 。 4 伏安分析测定方法 伏安免疫分析法是用伏安分析技术测定抗原、抗体本身，或用作标记物的金 属离子或有机功能团，或酶标记物的催化反应产物。因而，原则上各种伏安分析 技术均可以作为伏安免疫法的检测手段。检测电活性物的伏安技术，不象r j a 、 f i a 、e l i s a 和l i a 检测信号时那样单调，现有各种极谱技术可用于电化学检测。 常用的技术有线性扫描伏安法( l s v ) 、微分脉冲极谱法( d p p ) 、循环伏安法 ( c v ) 、阳极溶出伏安法( a d s v ) 等。许多灵敏的催化波、溶出伏安法的检测 限可达l o 。1 0m o l l 或更低浓度【4 2 4 3 1 。因此，v i a 的检测限受抗原抗体结合常数的 限制，而不受伏安技术的制约。具体的方法主要根据所选用的标记物及分析对象 来选择。用i i l ( ) 标记人血清白蛋白，以微分脉冲阳极溶出伏安法测定【1 7 】。国内 胡荫华等曾报道用电化学酶联免疫单扫描示波极谱法测定单纯疱疹病毒抗原 【3 3 】，甲胎蛋白口4 1 和y 重组干扰素抗体h 4 】。焦奎等提出了h r p 邻联茴香胺h 2 0 2 【3 6 】， h r p - 邻联甲苯胺1 4 5 1 ，h r p n ，n 二氯二甲基对苯二胺h 2 0 2 【4 5 。5 0 1 等伏安免疫分析 新体系并应用线性扫描伏安法，循环伏安法等多种伏安技术进行了详细的研究。 这些体系测定m 己p 的检测限分别可达1 5 1 0 1 2 和1 0 l o 川咖l ，高于光