（微生物学专业论文）钝齿棒杆菌l天冬氨酸α脱羧酶基因的克隆与表达.pdf

浙江工业大学2 8 硕士研究生论文 符号与缩略语 l a s p ( l - a s p a r t i ca c i d ) p - 烈a ( p - a l a n i n e ) h p l c ( h i g hp i 。r ：f 0 如啪c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) u v ( u l t r a v i o l e ts p e c u u m ) s d s ( 1 a u r y ls u l f a t e ) a m p ( a m p i c i l l i n ) k a n ( k a n a m y c i n ) t r i s ( t r i s - h y d r o x y m e t h y l - a m i n o m e t h a n e ) e d t a ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t m a c e t i ca c i d ) t e c t a b ( c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ) t a e i p t g ( i s o p r o p y l p - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) x g a l ( 5 - b r o m o - 4 - c h l o m - 3 - i n d o l y l - p - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ) d ( d a y ) h ( h o u r ) m i n ( m i n u t e ) s ( s e e o n d ) r r a i n l 天( 门) 冬氨酸 b 丙氨酸 高效液相色谱 聚合酶链式反应 紫外光谱 十二烷基磺酸钠 氨苄青霉素 卡那霉素 三( 羟甲基) 胺基甲烷 乙二胺四乙酸 t r i s e d t a 缓冲液 溴化十六烷三甲基铵 t r i s 乙酸缓冲液 异丙基硫代b d 半乳糖苷 5 溴4 氯一3 一吲哚- 肛d - 半 乳糖苷 天 小时 分钟 秒 转速 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名：至长豫羔 日期。洚臼日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 誓篙2 ：慰。裂篆6 引昌 翩摊。参石舀聃：年川日 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 钝齿棒杆菌l 天冬氨酸0 【脱羧酶基因的克隆与表达 摘要 本文建立了一种快速有效的泛酸及泛解酸在转化液中的h p l c 检 测方法。其最优条件为：采用色谱柱a g i l e n tz o r b a xs b a q 柱( 5 9 i n ， 4 6 x 2 5 0 m m ) ；流动相为0 0 2 m o l lk i - 1 2 p 0 4 - 乙腈( v ：v - 9 ：1 ) p h 5 5 ； 流速：1 0 m l m i n ；柱温：3 0 ；检测波长2 0 0 r i m ，参比波长6 0 0 r i m ； 进样量：2 0 此。 该条件下，泛酸和泛解酸的保留时间标准偏差分别为0 0 2 7 、 0 0 4 0 ，峰面积标准偏差分别为0 2 9 、o 1 9 。方法的线性范围试验 显示：泛酸的线性方程y = 1 2 5 3 9 3 4 3 x + 1 4 4 2 9 4 3 ，相关系数r 2 = 0 9 9 8 8 ， 线性范围为o 1 0 0 9 l 一2 0 0 0 9 l ；泛解酸的线性方程y = l1 9 7 9 7 x 一1 1 3 8 6 ， 相关系数r 2 卸9 9 9 2 ，线性范围o 1 0 0 9 l 一5 0 0 0 9 l 。泛酸回收率为 8 7 2 2 1 1 1 8 0 ；泛解酸回收率为1 0 2 2 5 9 1 3 2 。 钝齿棒杆菌( cc r e n a t u m ) 中编码l 天冬氨酸0 【脱羧酶的基因p a n d 被克隆，并连接到质粒p e k e x 2 上构建了表达载体p e k e x 2 - p a n d ，随 后电击转化到该菌中，通过抗性平板筛选出重组质粒。提取重组质粒 酶切鉴定发现有外源片段的插入。测序结果显示cc r e n a t u m 的p a n d 序列与n c b ig e n eb a n k 中的同属菌谷氨酸棒杆菌( cg l u t q m i c u m ) 序 列有9 9 的同源率，软件预测的蛋白质序列则与其完全吻合。p a n d 序 4 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 列在cc r e n a t u m 与cg l u t a m i c u m 间高度保守。其中优化了cc r e n a t u m 的电击转化条件，其最佳条件为2 5 k v 、2 0 0 f l 、2 5 心、5 m s ，电击后培 养时间3 h ，抗性筛选平板k a n 浓度3 0 p g l 。最高转化率达1 8 1c f u 岖1 d n ao cc r e n a t u m p e k e x 2 - p a n d 工程菌的p a n d 基因被诱导过量表达产 生有活性的a d c 蛋白，可以l a s p 为底物生成p - a l a ，菌种分离纯化 后p 趟a 产量提高至7 6 4 7 m g l ，稳定性增加。同时研究了工程菌的诱 导表达及生物素的影响。该工程菌在基本培养基中的表达需添加诱导 物，i p t g 效果好于乳糖；完全培养基可使其自诱导，添加诱导物对产 量影响较小。最佳诱导温度为2 8 。c 。生长因子生物素最佳浓度1 0 m g l 。 工程菌以l - a s p 及泛解酸为底物合成泛酸，产量3 6 2 0 1 a m o l l 。抑 制泛酸合成途径，可有效增加i b - a l a 残留量，达到3 9 8 5 7 1 t m o l l 。 关键词：l 天冬氨酸a 一脱羧酶，p 丙氨酸，。i - i p l c ，基因工程，发酵， 转化 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 c l o n ga n de x p r e ss i o no fl a s p ar t a t e q d e c a j 之b o ) ( ，as eg e 套mi ncc r 五m 丁 a b s t r a c t am e t h o do fp a n t o t h e n a t ea c i da n dp a n t o a t eh p l cd e t e c t i o ni n t r a n s f o r m a t i o ns o l u t i o nw a sb u i l t 即1 cb e s tc o n d i t i o nf o rh p l cw a s s h o w e da sb e l o w ：h p l cc o l u m na g i l e n tz o r b a xs b a q ( 5 1 s m ，4 6 x 2 5 0 m m ) w a su s e da n dc o l u m nt e m p e r a t u r ew a s3 0 c m o b i l ep h a s e0 0 2 m o l l k h 2 p 0 4 c h 3 c n ：v = 9 ：1 ) p h 5 5w a sa d o p t e dw i t h f l o wr a t e o f 1 o r a l r a i n d e t e c t i n gw a v e l e n g t hw a s2 0 0 n mw i t hr e f e r e n c ew a v e l e n g t h o f6 0 0 n m a n dt h ei n j e c t i o nv o l u m ew a s2 0 此 t ou s et h i sm e t h o d ，t h er e t e n t i o nt i m er s do fp a n t o t h e n a t ea c i da n d p a n t o a t ew e r e0 0 2 7 ，0 0 4 0 r e s p e c t i v e l ya n dp e a ka r e ar s dw e r e 0 2 9 ，o 19 s t u d yo fl i n e a rr a n g es h o w e d ：t h el i n e a re q u a t i o no f p a n t o t h e n a t ea c i dw a sy - 鼍, 1 2 5 3 9 3 4 3 x + 1 4 4 2 9 4 3w i t hr e - - 0 9 9 8 8a n dl i n e a r r a n g eo fo 1o o g l 一2 0 0 0 9 l ；t h el i n e a re q u a t i o no fp a n t o a t e w a s y = l1 9 7 9 7 x 一11 3 8 6w i t hr 2 = o 9 9 9 2a n dl i n e a rr a n g eo f o 1 0 0 9 l 一5 0 0 0 9 l t h er e c o v e r yr a t eo ft h e s et w os u b s t a n c e sw e r e8 7 2 2 产l11 8 0 a n d 1 0 2 2 5 p9 1 3 2 r e s p e c t i v e l y l - a s p a r t a t ea - d e c a r b o x y l a s ew a sa ni m p o r t a n te n z y m et op r o d u c e 6 浙江工业大学2 8 硕士研究生论文 p - a l a t h ec o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u mp a n dg e n e ，w h i c he n c o d e st h i s e n z y m e ，w a se l o n e di n t op l a s m i dp e k e x 2a n de l e c t r o t r a m s f o r m e di n t ot h e s a m es t r a i nt o o v e r e x p r e s s t h ed n as e q u e n c i n gr e s u l t s h o w e d9 9 h o m o l o g y 丽也c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mw i t h10 0 h o m o l o g yp r o t e i n e l e c t r o p o r a t i o n t r a n s f o r m a t i o nm e t h o dw a si m p r o v e da n dt h eb e s t c o n d i t i o nf o rt r a n s f o r m a t i o nw a s2 5 k v , 2 0 0 f 2 ，2 5 此5 m s 诵也i n c u b a t i o n t i m eo f3 ha n dk a nc o n c e n t r a t i o no f3 0 i j l g l ，l e a d i n gt oa h i g h e r t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo f1 81e f up g - 1d n a 。 p a n do fcc r e n a t u m p e k e x 2 - p a n d w a s o v e r e x p r e s s e da n dl e a dt oa 1 3 - a l ap r o d u c t i o no f7 6 4 7 m g l s t u d yo fi n d u c t i o ns h o wi n d u c e rw a s n e e d e di nm i n i m a lm e d i u m , h o w e v e rl i t t l ee f f e c t i o nw a sf o u n di nc o m p l e t e m e d i u m t h eb e s t i n d u c i n gt e m p e r a t u r ew a s 2 8 。c b e s ta d d i t i o n c o n c e n t r a t i o no fv hw a s10 m g n 。 l a s pa n dp a n t o a t ew e r eu s e db yt h ee n g i n e e r i n gs t r a i nt op r o d u c e p a n t o t h e n a t ea c i dw i t h ay i e l dc o n c e n t r a t i o no f3 6 2 0 m o l l 1 3 - a l a p r o d u c t i o nw a si n c r e a s e dt o3 9 8 5 7 1 a m o l lw h e nt h ep a n t o t h e n a t ea c i d s y n t h e s i z a t i o np a t h w a yw a si n h i b i t e d k e y w o r d s ：l a s p a r t a t ea - d e c a r b o x y l a s e ，p - a i a , h p l c ，g e n e e n g i n e e r i n g ，f e r m e n t a t i o n ，b i o t r a n s f o r m a t i o n 7 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 第一章综述 1 1 天门冬氨酸0 【脱羧酶基因的结构功能和研究进展 p 丙氨酸( p - a i a ) ，即3 氨基丙酸( 3 a m i n o p r o p a u o i ca c i d ) ，又称为p 氨基丙 酸，p 丝析氨酸，争初油氨基酸，是自然界中唯一存在的p 型氨基酸，属于非蛋白 氨基酸。近年来，b 丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟，p 丙氨酸在医药、化工、 食品、环境等领域的作用日渐突起。 在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 等微生物中，b 枷a 是天门冬氨酸( a s p ) 在天 门冬氨酸吨脱羧酶( l - a s p a r t a t e - a l p h a - d e c a r b o x y l a s e ，a d c ) 的作用下脱羧形成。 编码产生a d c 的基因被命名为p a n d 。 p a n d 基因被发现广泛地存在于ec o l i 、谷氨酸棒杆菌( cg l u t a m i c u m ) 、结核 分枝杆菌( 彪t u b e r c u l o s i s ) 、枯草杆菌假s u b a l i s ) 等微生物中。它在各种微生物中 的基因序列已被测出，针对p d n d 基因的研究也日益增多。 1 1 1p a n d 基因与蛋白质结构 1 1 1 1p a n d 基因的发现 1 9 7 5 年，o r t e g amv 等【l 】用二氢尿嘧啶( n n g ) 处理鼠伤寒沙门氏菌( & t y p h i m u r i u mt l 2 ) 得到三株需要泛酸或p - a l a 作为补充营养生长的突变体，基因接 合实验表明，其基因损伤位于& t y p h i m u r i u mt l 2 染色体1 2 8 r a i n 左右处。这种基 因损伤导致了& 必历拥棚无法合成p - a l a ，p - a l a 合成酶基因座被命名为p a n d 。 1 9 7 9 年，w i l l i a m s o n 等从ec o l i 中分离得到a d c ，验证了a s p 到b 枷a 代谢途径 的存在。1 9 9 7 年，r a m j e e m k 掣2 】p c r 扩增了e c o l i d h 5 a p a n e ) 基因，克隆到载 体p b l u e s e r i p tk s 中，形成质粒p d k s l ，使p a r d ) 基因能从l a c z 启动子处表达，该 扩增产物的双链经测序发现与数据库p a n d 序列相同，且该克隆能互补到泛酸缺陷 9 浙江工业大学2 8 硕士研究生论文 型菌种e c o l is j l 6 中。2 0 0 2 年，c h o p i ns 等f 3 】将p a n d 基因进行p c r 扩增，然后 在ec o l i 中高效表达，并用金属亲合层析纯化，进而分析了酶的加工过程及生化 特性。近几年来，p a n d 基因被发现广泛的存在于微生物内。 1 1 1 2 p a n d 基因的结构 cg l u t a m i c u m 中，p a n d 基因位于基因组1 4 7 5 7 1 - 1 4 7 9 8 1 之间，该基因长4 11 b p ，终止密码子为t a g ，编码产生包含1 3 6 个氨基酸的蛋白质。起始密码子上游 1 6 b p 处，有s d 序列( a a c a 3 a ) 。启动子区域包含间隔1 7 个碱基的1 0 区( t a a a a c ) 和3 5 ( t t g t c a ) 区，在终止密码子下游没有发现符合p 因子依赖型终止信号的 回文序列。在启动密码子上游及下游附近分别有e c o ri 及x b ai 酶切位点，终止 密码子上游及下游附近分别有b a m h i 及p s ti 酶切位点【1 7 1 。p a n d 上游3 0b p 处有 一段转座子的特征序列，研究表明，大部分a d c 缺陷型是由于该段转座子调控的 翻译后剪切受到影响，而不是由于p a n d 编码区本身的变异【4 】。 p a n d 在不同种细菌中序列有所差别。比较ec o l i ，cg l u t a m i c u m ，& t y p h i m u r i u m ，es u b t i l i s 序列。雪s u b 矗l i s 与ec o l i 的同源率高，达10 0 ，其次为 & t y p h i m u r i u m 与ec o l i ，同源率为9 6 ，cg l u t a m i c u m 与ec o l i 的同源率为4 2 9 。 它们的不同主要体现在启动密码子上游的启动信号区以及酶的翻译后剪辑调控 区。ec o l ip a n d 起始密码子上游的s d 序列为5 - a a g g t r - 3 ，cg l u t a m i c u mp a n d 起始密码上游的s d 序列为5 - a a g g a 3 。与这两种菌种的1 6 sk n a3 端相符的 s d 序列应为5 - a a g g a - 3 。因为基因高度表达不仅与强启动子有关，也与理想的 核糖体结合位点引起的强转录启动信号有关，所以cg l u t a m i c u m 等菌种的s d 序 列更佳，实例证明cg l u t a m i c u m 的p a n d 基因比五c o l i 中的表达更加高效【4 】。并 且cg l u t a m i c u m 等菌种的a d c 酶的翻译后剪辑也比ec o l i 更加高效，具体的调 控机理有待进一步研究。 1 1 1 3a d c 的结构功能 p a n d 基因的表达产物是a d c 。a d c 的主要功能是立体特异性地脱去l 广a s p 的a 位羧基生成b 一灿a 和c 0 2 ，而对d - 鲫不起作用。p 枷a 在体内毒主要的生理功能是 与泛解酸合成泛酸。在泛解酸代谢途径中，洳乙酰羟酸首先在羟甲基转移酶 ( k e t o p a n t o a t eh y d r o x y m e t h y l t r a n s f e r a s e ，k p h m t ) 作用下生成酮泛解酸，接着酮 l o 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 泛解酸在酮泛解酸还原酶( k e t o p a n t o i ca c i dr e d u c t a s e ，k r ) 作用下还原生成泛解 酸。最后p 枷瘌泛解酸在p s 的作用下合成泛酸【4 】( 图1 ) 。其中编码k p h m t 、k p r 及p s 的基因分别为p a n b 、p a n e 及p a n c 。泛酸经磷酸化并获得巯基乙胺而生成舢磷酸泛 酰巯基乙胺，4 _ 磷酸泛酰巯基乙胺是辅酶a ( c o a ) 及酰基载体蛋白( 屹p ) 的组成部分，由 此可见c o 剐殳a i c p 为泛酸的活性型。c o a 及a c p 构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、 蛋白质代谢及肝的生物转化作用，约有7 0 多种酶需c 创吸a c p 因此泛酸郡- a l a 广泛地存在 于植物和微生物中，具有重要的作用。由于动物不能合成d a l a 、泛酸，因此动物饲料、人的 食品中必须添加泛酸。 c h 2 t h f 僻 n a d p h na d p a 1 p h a - k e t 。o - 3 2 0k 螂t 0 粕厶脾 2 s o v a l m a t e i c d ： h m t l i g r c 0 2 一上柏抵a d c i m m o c h e n m e 图1 i 泛酸代谢途径 f i g i - ip a t h w a yo f p a n t o t h e l l a t ea c i d 1 9 7 9 年，j o a n n e 等【5 】从ec o l i 中分离得到a d c ，验证了a s p 到p - a l a 代谢途 径的存在。随后，a r m a n d o 等嘲克隆并在ec o l i 中过度表达a d c 基因。2 0 0 2 年， c h o p r a 等【3 】利用金属亲合层析纯化a d c ，并分析其加工过程及生化特性。a d c 的 一级结构包含大量完全保守以及半保守残基。7 4 组已知序列中，t y r 2 2 、g 1 y 2 4 、 s e r 2 5 、a r 9 5 4 、t h r 5 7 、t y r 5 8 、g 1 y 7 3 以及a s p 8 3 高度保守。除在3 组序列中缺失， 剩余序列在l y s 9 、h i s ll 以及a s n 7 2 高度保守。这些保守残基除a s p 8 3 外，均位 于a d c 的活性位点附近。 a d c 合成后的最初结构是由4 个单体紧密结合组成的四聚体。包含高 3 5 x 1 0 o m 、直径5 0 x 1 0 以o m 的空腔。四聚体的轴是开放式的，形成直径1 3 2 0 x 1 0 。o m 之间的亲水区域。每个单体由6 条链形成双甲b - 圆筒结构，这与内葡聚糖酶以及 甲酸脱氢酶类似。另外每个原体各提供n 末端和c 末端的2 条p 链构成p 圆筒结 构，多数单体与单体之间的相互作用发生在这个p 圆筒结构内。除此以外4 个单 体之间的作用力很弱，这可能有利于底物与位于各个单体接触面的活性位点结合 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 嘲。 a d c 的一个显著特点是，它的催化能力依赖于自身加工形成的丙酮酰基。a d c 合成时，首先形成一个无活性的酶原( x - 蛋白，1 3 8 如) ，然后在特定的x - s e r 键 上进行蛋白水解，形成c 末端含有x o h 的b 亚基( 2 8k d ) 和n 末端含有丙酮 酰基的洳亚基( 1 1k d ，来自丝氨酸) 。酶经加工后，用荧光素氨基硫脲标记显示， 其四聚体包含三个丙酮酰基。这说明该四聚体的三个亚基发生了剪切并产生了活 性。ec o l i 的a d c 的晶体结构显示：酶的三个亚基含丙酮酰基，另一个是在 g l y 2 4 s e r 2 5 经过重排而没发生剪接的酯基，它是发生自我加工的中介【3 1 。 另外基因及蛋白质序列比对显示：ec o l i 、cg l u t a m i c u m 、肱t u b e r c u l o s i s 、b s u b t i l i s 等菌种的a d c 均存在一个特殊的g l y - s e r 序列，这个序列在ec o l i 中位于 距起始端2 4 - 2 5 氨基酸处。这个特殊序列被认为是a d c 翻译后自我裂解位点【4 】。 这个位点在ec o l ip a n d 基因上体现为启动密码上游3 0 b p 一段显示转座子特征的 序列。 1 1 2 p a n b c d 操纵子 在ec o l i 、丑s u b t i l i s 、& t y p h i m u r i u m 等微生物中，泛酸合成有关的基因p a n b 、 p a n c 、p a n d 以操纵子形式存在。在cg l u t a m i c u m 、粘球菌( m y x o c o c c u sx a n t h u s ) 等细菌中，p a n b p a n c 以同一操纵子形式存在，而朋加与之相距较远，形成独立 的开放阅读框( o r f ) 。 1 9 9 6 年w n h 锄等【4 】通过核苷酸内切酶酶切ec o l i 染色体，得到一段4 5 8 9b p 长的e c o ri c l aid n a 片段( 图2 ) ，d n a 序列分析显示，p a n b c d 在ec o l i 基 因图谱3 1 曲位置处紧密相连，p a n d c b 以顺时针方向排列。但以p a n b c d 逆时 针方向进行转录。各个位置及酶切位点如图2 。w i l l i a m 的工作为研究泛酸合成相 关基因的相互影响提供了理论依据。 1 2 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 yiw了 o 一1p a n d o r f 3 p a n c p a n b ，l j 竺_ j0 磁 图2 - 2 e c o ri - c l aid n a 片段 f i g 2 - 2e c o rl - c i aid n af r a g m e n t 谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 中，p a n b 基因的3 末端位于酶 切位点风fi 和e c o ri 之间，编码区被加以i 切断，该基因长7 9 2b p ，终止密码 子为t 从，编码含2 6 4 个氨基酸的蛋白质。在起始密码子上游6b p 处，有s d 序 列( a g g a ) 。启动子区域包含间隔1 7 个碱基的1 0 区( t a a a a ：r ) 和3 5 ( t t g c c c ) 区忉。 2 0 0 1 年，z h e n g 等嘲克隆了勉t u b e r c u l o s i s 面”c 基因并在ec o l i 中高效表达， 随后其它来源的p a n c 基因也得到了研究。以cg l u t a m i c u m 为例，p a n c 基因长8 4 0 b p ，终止密码子为t a g ，编码产生含2 8 3 个氨基酸的蛋白质。最c o l i 中p a n b 与 p a n c 基因间隔1 1 个b p 的非编码区，而坛t u b e r c u l o s i s 中阳柚的终止密码子t a a 与p a n c 的起始密码子a t g 两者在腺嘌呤核苷酸上重叠【9 】。 位于p a n d 和p a n c 基因之间的o r t 3 可能与转移酶有关，它的末端附近有l o b p 重复序列，可能作为重复插入的靶位点存在，但是具体功能未知。 1 1 3p a n d 基因的应用 1 1 3 1 泛酸的生物转化 1 9 9 9 年n i c o l e 等【1 0 】克隆cg l u t a m i c u mp a n d 基因( p a n d o g ) 及ec o l ip a n d 基因( p a n d 。c ) 并转入ec o l i 或cg l u t a m i c u m 中过量表达，增加了泛酸产量，其 中p a n d c g 优于p a n d e 。p a n d c g 的过量表达能使菌体产生足够的f 3 - a l a 来突破泛酸 合成的限制，而p a n d 。过量表达的菌体中，泛酸的产量仍取决于外部p a l a 的供 应。p a n d c g 在ec o l i 中过量表达使泛酸产量达到1 4 0n g m g ( 干重) h ，且不依赖 外部b 础a 的供应，而泛酸在野生型菌体中含量只有6 2r i g r a g ( 干重) h 左右。进 1 3 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 一步研究表明，扩增p a r d ) ，同时选择性地与p a r d ，和p a n c 基因结合，并扩增i l v b n c 及i l v d 基因( 咖系列基因影响到甜酮异戊酸的合成) ，能获得更好的泛酸增产效 果。 2 0 0 2 年a r l e e n 等【l l 】研究p u r f 泛酸载体蛋白基因缺陷型( s a l m o n e l l ae n t e r i c a s e r o v a rt y p h i m u r i u m d m l6 3 2 ) 的泛酸与硫胺合成相关性时发现，该菌株p a n b c d 操纵子上游插入了1 个c g 碱基对，1 0 区和3 5 区的距离由1 6b p 增加到1 7b p 。 1 0 和3 5 区之间1 个b p 的增或减，会使两者相对旋转产生的超螺旋夹角变化3 6 0 ， 从而改变基因的表达水平。p a n b c d 操纵子的1 0 和3 5 区之间的距离由1 6 b p 增加 到1 7b p ，转录增加了1 0 倍，泛酸的积累相应增加了1 0 倍。 1 1 3 2 相关物质的检测 聚酮化合物是一类具有生物活性的次级代谢物，具有抗菌、抗虫和抗癌以及 免疫抑制活性等，广泛应用于药物生产。酰基c o a 是聚酮化合物生产的重要前体。 由于菌体自然产生的酰基c o a 量比较少，在聚酮化合物的生产中较难检测。在e c o l i 中，d - a l a 是产生酰基c o a 的前体，因此稳定的p a n ) 缺陷型可以用作酰基c o a 否量的检测菌种。2 0 0 4 年，k e n n e d y 等【1 2 改造ec o l i p a n d 基因，用丙氨酸代替 其蛋白质第2 5 位丝氨酸，该蛋白不能进一步加工裂解成具有生物活性的酶，得到 的菌株k o s l 7 3 1 4 5 需要补充1 3 - a l a 或者酰基c o a 才能生长，菌体生长量与酰基 c o a 含量呈紧密正相关。应用层c o l ik o s l 7 3 1 4 5 可检测已知或未知复杂培养基中 酰基c o a 的含量。 1 1 3 3 植物学上的研究 泛酸在植物中的合成途径与细菌或真菌大致相同，p a n b p a n c p a ，店基因缺陷型 植株都能被相应的最c o l i 同源基因功能互补，但是在植物中没有发现p a n d 的同源基 因。对拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 等植物的研究发现，植物中b 赳a 可能是由丙酸 途径合成。泛酸合成在植物中是否存在代替途径，仍存在争议【1 3 】。 2 0 0 6 年，w 址d 等【1 4 】将ec o l i p a n d 基因转入烟草中，该烟草的b 砧a 积累比野生 种增加4 倍，3 5 高温下培养1 周，其耐热能力比野生型更强，说明p a n d 在植物中 的表达产生了有高活性的a d c ，导致1 3 a 1 a 积累，p m a 能解除乳酸脱氢酶( l d h ) 热 1 4 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 失活的敏感性，阻止l d h 的凝聚失活，复活失活的l d h ，增加植物的耐热性，提 高植物对环境变化的适应性。 1 1 3 4 药物靶点 b 灿a 的合成途径只存在于微生物、植物中，而在动物和人类体内不存在，因 此a d c 以作为抗真菌抗细菌或除草的药物靶点，而对动物或人类无害。 例如，世界上彪t u b e r c u l o s i s 感染率不断上升，人类在这个传染病上花费了大 量的人力物力，因此研究控制这种病原菌生长代谢尤为迫切。3 1 t u b e r c u l o s i sh 3 7 r v 的全基因组已被破译。2 0 0 2 年，c h o p r a 等 3 j 首次克隆出必t u b e r c u l o s i sh 3 7 r v p a n d ， 酶切图谱鉴定证明该序列为ec o l i p a n d 基因同源序列。同年，j a c o b s 等【”】构建了一 株膨t u b e r c u l o s i s p a n c d 基因双重缺陷突变体，该缺陷株丧失了合成脂质的能力。 感染该缺陷株的小鼠存活了3 6 周，而感染非缺陷株的小鼠则仅存活了1 4 周。说明 p 赳a 缺乏能抑制膨t u b e r c u l o s i s 的致病力。长链脂肪酸和聚酮化合物在膨 t u b e r c u l o s i s 的致病和生长中起有重要作用，同时膨t u b e r c u l o s i s 细胞壁的脂多糖结 构使其具有抗环境压力及抗杀菌剂的能力，因此与脂质代谢紧密相关的p 州玳谢 能极大地影响mt u b e r c u l o s i s 的生长【1 6 1 。 1 2 泛酸生产及检测 泛酸，p a n t o t h e n i ca c i d ，又称本多生酸、维生素b 5 或b 3 ，是一种重要的食品 添加剂和饲料添加剂，也是一种重要的维生素药物。l - 泛酸不能被人体所利用， 对热、酸和碱均不稳定，因此通常使用的产品为d 泛酸钙。泛酸或其盐在食品中 用作营养增补剂，通常其钙盐与其他b 族维生素一起用于补充营养。d 泛酸钙作 为维生素饲料添加剂大量用于饲料工业，在畜禽养殖中具有重要的作用。泛酸或 其盐作为食品和饲料添加剂的需求量很大。 1 2 1 泛酸的化学法制备 化学法合成d 泛酸钙比较复杂，传统方法是采用s f i l l e r 法( 异丁醛一甲醛一氰化钠 法) 或者乙醛酸一异丁醛法合成泛解酸内酯，再将p - 丙氨酸钙与泛解酸内酯直接缩合 1 5 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 即得到d l 泛酸钙【1 7 1 。 具体步骤是：首先由异丁醛与甲醛缩合，然后与氢氰酸氰醇化，再酸性水解、 脱水内酯化得混旋丫丁内酯，拆分后与p 丙氨酸钙酰胺化制得d 泛酸钙，或不经拆 分酰胺化得混旋泛酸钙，再拆分得d 泛酸钙。其中- a l a 可由丙烯腈路线、丙烯酸 路线或琥珀酰亚胺路线获得。 生产d 泛酸的主要技术是中间体泛解酸内酯或d l 贬酸钙的手性拆分技术。 d l 泛酸钙的拆分大都是采用化学方法拆分，用手性拆分剂( 奎宁化合物、二甲马 钱子碱或氯霉胺等) 拆分泛酸钙合成的中间体泛解酸内酯，化学法拆分缺点是拆分 剂贵，成本高，分离困难，还有严重的环境污染和毒性问题【1 8 】。 1 2 2 泛酸的生物法制备 1 2 2 i 直接发酵法生产d 泛酸钙 由于微生物发酵产泛酸含量极低，长期以来未见到工业应用的报道。1 9 9 0 年， 日本专利报道了m i l dh i r o s h i 等人扩增了e s c h e r i c h i ac o l i 礤0 3 3 0 1 的泛酸合成基因， 该工程菌在d l - 泛解酸和b 丙氨酸存在下培养，得到d 泛酸，光学纯度10 0 ，化 学纯度9 9 。1 9 9 4 年，h i k i c h iy u i c h i 等人又进一步开发了培养能从葡萄糖生物合 成d 泛解酸的基因重组微生物的方法，仅添加p 丙氨酸，直接发酵葡萄糖生产d 泛酸。但由于位于生物合成途径上游的缬氨酸合成途径的活性在培养的后期消失， 泛酸的生成随着缬氨酸的消耗而停止，因此发酵产酸低，生产受到限制【1 9 】。 1 9 9 9 年n i c o l e 等【1 0 】克隆cg l u t a m i c u mp a n d 基因( p a n d c g ) 及ec o l ip a n d 基因( p a n d e c ) 并转入ec o l i 或cg l u t a m i c u m 中过量表达，增加了泛酸产量。进 一步研究表明，扩增p a n d ，同时选择性地与p a n b 和p a n c 基因结合，并扩增i l v b n c 及i l v d 基因( g v 系列基因影响到a 酮异戊酸的合成) ，能获得更好的泛酸增产效 果。 直接发酵法的问题是发酵液组分复杂，特别是大量的单糖和寡糖，较难用离 交、结晶等方法去除，浓缩、结晶时由于粘度大，操作困难，溶剂消耗大，产品 颜色深，提取收率低。需进一步研究离子交换和活性炭吸附等提取d 泛酸工艺。 因此近年来开始研究工程高产菌细胞固定化或者泛酸代谢途径相关酶类固定化的 方法生产泛酸，减少发酵液对产物分离的影响。 1 6 浙江工业大学2 0 0 8 硕士研究生论文 1 2 2 2 酶法转化或拆分 目前酶法生产d 泛酸盐报道较多的是微生物酶法拆分泛解酸内酯，或还原酮 基泛解酸内酯，即将合成的中间体d l 泛解酸内酯，或其类似物酮基泛解酸内酯， 用特异性酶进行不对称生物催化拆分，得到d - 泛解酸内酯，再与p - 丙氨酸钙缩合 生产d 泛酸钙。 1 2 3 泛酸的检测 1 2 3 1 泛酸的直接检测 泛酸的直接检测目前主要有高效液相色谱法( 肿l c ) 、微生物鉴定( m b a ) 、 放射性免疫鉴定0 u a ) 、放射性微生物鉴定( r m a ) ，酶联免疫吸附法鉴定 ( e l i s a ) ，气相色谱法( g l c ) ，反向气相色谱法( g l c m s ) 以及应用于泛酸立体 异构分离的毛细管电泳法【2 0 】。 这些方法虽能在一定程度上检测食品、药品等常规样品中泛酸的含量，但都 存在一定的缺点：m b a 测定步骤繁琐、测定周期长、要求操作者技术水平高，且 相对准确性差；r i a 及r m a 要求使用放射性同位元素及闪烁法测量放射性强度， 在食品的检测中比较困难，且放射性同位元素有一定的危险性；e l i s a 需非商品化 的抗血清；g l c 法需复杂的样品的处理及柱前衍生步骤。目前检测泛酸最简便 的方法是h p l c 法。该方法利用低波长紫外检测( 3 的情况下，其内表面带负电， 与缓冲液接触时形成双电层，在高压电场作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于 带正电而向负极方向移动，从而形成电渗流。同时，在缓冲溶液中，带电粒子在 电场作用下，以各自不同速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳。带电 粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。各种粒子由于所 带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离。 高效毛细管区带电泳法检测泛酸钙。电泳条件为：毛细管：7 5 1 a nx 3 5 c m ( 有效 长度2 6 5 a n ) ，未涂层；缓冲溶液：l o m m o l l 硼砂，用磷酸调节p h 8 0 ；电压：3 0 k v ； 实验温度：3 0 ；检测：2 0 0 n m ；进样：5k p ax 2s ；柱清洗：每次进样前依次用0 1 m o l l 氢氧化钠溶液冲洗1 5 m i n ，重蒸水冲洗l m i n ，缓冲溶液冲洗2 m i n 。 该方法样品回收率达( 9 5 6 士0 4 呦，线性响应范围1 0 1 0 5 1 5 x 1 0 4 m o l l 。 。 1 2 3 4 微生物鉴定泛酸含量嘲 利用l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ( a t c c8 0 1 4 ) 的生长对泛酸的依赖性，通过光密 度法测定细菌生长和繁殖的强度来间接地测定食物或饲料样品中的泛酸含量。该 方法的灵敏度为0 5 炖阻。批内r s |