（分析化学专业论文）vc与苯甲酸钠共存的模拟与实际食品体系化学过程研究.pdf

摘要 摘要 维生素c ( v i t a m i n c ，v c ) 是不少食品中天然存在的抗氧化物质，也常被 作为抗氧剂或维生素强化剂在生产过程被添加至食品之中。苯甲酸钠价格便宜， 是食品工业广泛采用的防腐剂。两者在食品体系内共存时，通过系列反应能生 成苯等有损人体健康的物质。它们存在的安全隐患，一直是国内外关注的焦点。 本文将定性研究过渡金属离子存在下，v c 、苯甲酸钠部分反应产物，分析反应 的动力学过程、影响因素，定量测定部分软饮料样品内v c 、苯甲酸钠含量，并 考察在饮料体系内二者的稳定性。 反应产物定性实验部分，本文主要采用衍生化气相色谱- 质谱法：通过传统 的液液萃取或固相萃取方式将待测物转移至乙醚相，对吹干后所得残渣用三甲 基硅烷化试剂衍生继而进行气相色谱质谱测定。反应过程研究部分，本文将紫 外在线动力学与液相色谱离线动力学测量方法相结合，充分发挥各自优势。而 饮料样品测定部分，则建立了使用简单的液相色谱等度洗脱程序，对基质复杂 的饮料样品中v c 、苯甲酸钠含量进行测定和稳定性研究的方法。 本文从v c 、苯甲酸钠、硫酸铜反应液中检测出苯甲酸钠经羟基取代生成的 邻羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸三种单羟基取代物和2 ，3 一二羟基 苯甲酸、2 ，5 二羟基苯甲酸、3 ，4 二羟基苯甲酸等多羟基取代物及部分羟基 取代物脱去羧基后生成的邻苯二酚、对苯二酚等共八种产物，并根据产物生成 情况推测了反应历程。动力学测定结果表明，苯甲酸钠反应、产物生成规律基 本符合零级动力学模型；硫酸铜在反应初始阶段被迅速还原后又逐渐被氧化， 是反应体系内的催化剂；v c 既能促进羟基自由基生成又能消除羟基自由基，具 有双重作用；苯甲酸钠浓度越大，越有利于其羟基取代反应进行；温度、p h 值 等环境因素能显著影响苯甲酸自由基取代反应速率。 本文检测发现，芬达、美年达等六种软饮料样品均不同时含v e 和苯甲酸 钠。由于开封后饮料贮存过程中两者含量逐渐降低，且有苯甲酸钠存在时v c 稳定性降低，故推测标明含v c 而实际并未检测到的美年达中，v c 因与苯甲酸 钠反应而减少。 摘要 关键词：v c ，苯甲酸钠，衍生化气相色谱法，自由基反应，动力学 i i a b s t r a g t a b s t r a c t a san a t u r a la n t i o x i d a n te x i s t i n gi nm a n yv e g e t a b l e sa n df r u i t s ，a s c o r b i ca c i d ( v i t a m i nc ) i so f i e na d d e dt of o o d si nt h em a n u f a c t u r i n gp r o c e s sa sav i t a m i n s u p p l e m e n to rf o r t i f l e ra n dp r o m o t e da sa l la n t i o x i d a n t w i n lar e l a t i v el o wp r i c e s o d i u mb e n z o a t ei sw i d e l yu s e da sap r e s e r v a t i v ei nt h ef o o di n d u s t r y w h e nb o t ho f t h e ma t ec o n t a i n e di nt h ef o o ds y s t e m , as e r i e so fr e a c t i o n sc a nt a k ep l a c ea n dl e a dt o t h ep r o d u c t i o no f b e n z e n ew h i c hi sc a r c i n o g e n i ca n do t h e rc h e m i c a l s b e c a u s eo f t h e r i s ko fb e i n gh a r m f u lt oh u m a nh e a l t h ，i ti sa l w a y st h ef o c u st os t u d yt h er e a c t i o n s b e t w e e nv ca n ds o d i u mb e n z o a t ea th o m ea n da h r o a d i nt h i sp a p e r , p a r to ft h e f t p r o d u c t su n d e rt h ee x i s t e n c eo ft r a n s i t i o nm e t a l sw e l ed i s t i n g u i s h e d ，t h er e a c t i o n p r o c e s sa n da f f e c t i n gf a c t o r sw e r es t u d i e d ，t h ec o n t e n t so f v ca n ds o d i u mb e n z o a t ei n s e v e r a ls o f td r i n k sw e r ed e t e r m i n e da n dt h es t a b i l i t yo f t h e mw e r ei n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a lp a r ti n v o l v e dt h ed e r i v a t i z a t i o ng a sc h r o m a t o g r a p h y , u v - v i s a n dh p l cm e t h o d t h eq u a l i t a t i v ea n a l y s i so fr e a c t i o np r o d u c t sw a sr e a l i z e db yt h e t r a d i t i o n a ll i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o no rs o l i dp h a s ee x t r a c t i o no ft h et a r g e tc h e m i c a l s w i t i le t h e r f o l l o w e db yt h ed e r i v a t i z a t i o no ft h er e s i d u e sa f t e rd r i e dw i t l lb s t f a ( n ，0 - b i s ( t d m e t h y l s i l y l ) t r i f l u o r o a c e t a m i d e ) + t m c s ( t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e ) r e a g e n t a n dt h e nt h es e p a r a t i o no ft r i m e t h y l s i l y ld e r i v a t i v e su s i n gg c - m s i nt h es e c t i o no f k i n e t i cp r o c e s ss t u d y ，b o t ho l l l i n eu v v i sm e t h o da n do t i l i n eh p l cm e t h o dw e r e t a k e na d v a n t a g eo f as i m p l ea n dq u i c ki s o c r a t i ce l u t i o np r o c e d u r ew a sd e v e l o p e d 、析t hh p l cf o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fv ca n ds o d i u mb e n z o a t ei n b e v e r a g e sw i t i lc o m p l i c a t e dm a t r i x t h r e ei s o m e r i ch y d r o x y b e n z o a t e sa n dt h r e ei s o m e r i cd i h y d r o x y b e n z o a t e s ，w h i c h a ed h y d r o x y h e r t z o i ca c i d ，m h y d r o x y b e n z o i ca c i d , p - h y d r o x y b e n z o i ca c i d 2 , 3 一 d i h y & o x y b e n z o i ca c i d ，2 , 5 - d i h y d r o x y b e n z o i ca c i da n d3 , 4 d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d , w g l em e a s l l r e da s p r o d u c t so fh y d r o x y l r a d i c a la t t a c ko nb e n z o a t e b e s i d e s ， d - d i l l y d r o x y b e n z e n ea n dp - d i h y d r o x y b e n z e n ew e r ed e t e c t e da st h ed c c a t b o x y l a t i o n p r o d u c t s i i 量 a b s t r a c t f r o mt h ek i n e t i cp r o c e s ss t u d y ，t h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n sh a v eb e e nd r a w n ：t h e r e a c t i o np r o c e s so fs o d i u mb e n z o a t ea n df o r m a t i o no ft h ep r o d u c t sc o r r e s p o n dt ot h e k i n e t i cm o d e lo ft h ez e r oo r d e rr e a c t i o n ；c u p r i cs u l f a t ea c t sa sac a t a l y s ti nt h e r e a c t i o ns y s t e m ，w h i c hi sr e d u c e di m m e d i a t e l ya tt h eb e g i n n i n ga n dt h e ng r a d l l a l l y o x i d i z e d ；v ep r o m o t e st h ef o r m a t i o no fh y d r o x y lr a d i c a l sa sw e l la ss c a v e n g e st h e m f r o mt h es y s t e m t h eh i g h e rt h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u mb e n z o a t ei s ，t h ef a s t e rt h e f r e e - r a d i c a ls u b s t i t u t i o no fb e n z o i ca c i dt a k e sp l a c e ；t e m p e r a t u r e sa n dp hv a l u e s i n f l u e n c et h er a t eo f t h er e a c t i o nd r a m a t i c a l l y f a n t aa n dm i r i n d at o g e t h e rw i t ho t h e rf o u rs o f td r i n ks a m p l e sc o n t a i ne i t h e rv c o rs o d i u mb e n z o a t e c o n s i d e r i n gt h ed e c r e a s eo fv co rs o d i u mb e n z o a t ec o n t e n t s a f t e ru n s e a l e dd u r i n gs t o r a g ea n dt h ei n c r e a s eo fi n s t a b i l i t yo fv cw h e ns o d i u m b e n z o a t ew a sa d d e dt ot h eb e v e r a g e s ，i tw a sd e d u c e dt h a ti nm i r i n d a , w h i c hi s m a r k e dt oh a v ev ca sa ni n g r e d i e n t v cd i m i n i s h e db e c a u s eo ft h er e a c t i o nb e t w e e n i ta n ds o d i u mb e n z o a t e k e yw o r d s ：v i t a m i nc ，s o d i u mb e n z o a t e ，d c r i v a t i z a t i o ng a sc h r o m a t o g r a p h y ， r a d i c a lr e a c t i o n , k i n e t i c s 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提 供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国 家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目 的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活 动。 学位论文作者签名：寿鸽 2 0 0 b 年3 月j 7 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 年月日年月日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 签名：寿- 鸽 2 0 0 8 年3 月一日 第1 章引言 第1 章引言 1 1 食品内抗氧剂的种类和作甩机理 维生素中水溶性的v c 和脂溶性的v 一、v e 及种类多样的酚类包括黄酮、黄酮 醇、黄烷醇、黄烷酮、异黄酮、花青素、木酚素等，是广泛分布于天然食品( 蔬 菜、水果、茶叶等) 内的抗氧化物质。特别是酚类化合物，其所含羟基官能团 是食品内最为常见且最有效的自由基清除剂。加工食品除含有由原材料转移而 来的抗氧化物质外，为保持食品的营养成分、口味、颜色以延长保质期，需添 加抗氧剂。我国己列入g b 2 7 6 0 食品添加剂使用卫生标准i j j l 8 种抗氧剂，大 体可分为三类：维生素类，包括抗坏血酸、d 异抗坏血酸及其盐和维生素e ；天 然提取物1 2 1 ，植酸、茶多酚、甘草抗氧剂，竹叶抗氧剂和迷迭香提取物p 】：人工 合成的酚类物质如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、特丁基对苯二酚【4 】、4 一己 基间苯二酚等和酯类物质如抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸丙酯、硫代二丙酸二 月桂酯等。据统计，2 0 0 1 年美国消耗食品抗氧剂7 9 0 0 吨，西欧5 9 5 6 吨，日本3 2 9 1 吨【5 1 。 食品内脂类物质通过自氧化或脂质氧化酶催化逐渐生成次级脂质氧化物 醛、酮、环氧化物等使油脂酸败，此类氧化物又能与蛋白质作用，引起食品变 质【6 】。氧化反应涉及自由基中间体主要是过氧基的生成，清除自由基能有效抑制 氧化反应。过渡金属离子、处于激发态的单线态氧等催化脂氧化反应，降低食 品内金属离子和激发态氧浓度能减慢脂类氧化。基于此，食品内抗氧剂的作用 机制主要有以下三种：过氧基、烷氧基等自由基清除剂，如酚类，可向自由基 提供氢原子，自身生成稳定的酚自由基：金属离子络合剂，如植酸，能稳定金 属离子价态从而抑制其促氧化效应；单线态氧淬灭剂，如胡萝h 素，将氧由激 发态转变至基态【7 , 8 1 。 天然抗氧剂通过消除活性氧对生物大分子的氧化破坏，能防止相关疾病发 病过程。具有降低由人体脂质过氧化引起的心脑血管疾病( 动脉硬化、神经系 统退化等) 和白内障、糖尿病等慢性病发病机率的保健功效，对人体癌细胞增 殖亦有抑制作用1 9 。经由膳食补充适量天然抗氧剂，是延缓或降低人体因氧化受 到的危害的重要途径之一。 第l 章引言 部分人工合成的食品抗氧剂具有低毒、稳定性好的特点，其相对安全性已 获国际社会广泛认可，但也存在部分合成抗氧剂毒性仍受到质疑，如二丁基羟 基甲苯。杨科锋等从急性、遗传和慢性毒性及促癌性等方面综述了动物实验获 得的二丁基羟基甲苯安全性研究成果：较高剂量的二丁基羟基甲苯显示出一定 的急性和慢性毒性，其不具有明显的致突变性和遗传毒性，能改变细胞膜功能 促进肿瘤生长1 1 0 。美国自1 9 9 7 年起禁止向食品内添加二丁基羟基甲苯，而目前 全球范围，仍有约4 0 个国家( 包括中国) 允许将其作为食品添加剂。 食品中的抗氧化物质是一把“双刃剑”，其较强的化学反应活性为食品长期 保存提供了保证，而与其他成分间反应的副产物又极可能对人体健康构成威胁。 随着社会经济的进步与发展，食品供给日益丰富，人类的健康意识也逐渐提高。 对食品中抗氧化物质的化学反应特性与产物的潜在危毒性开展深入广泛研究， 极其紧迫与必要并具有重大的现实意义。 1 2 抗氧剂研究现状概述 1 2 1 蔬菜水果提取物的抗氧化活性 目前常用的抗氧化活性测定方法主要基于两类：样品抑制脂类物质氧化的 能力；或样品对人工生成自由基的清除能力，如利用抗氧剂对r o o 、o h 等自 由基引起的荧光变化的抑制程度进行测定的氧自由基清除力法和对2 ，2 二苯代 苦味肼基( d d p h ) 自由基5 1 7 r i m 处吸收的减弱程度进行测定的d d p h 自由基清 除法【l i j 。 不同种类的蔬菜、水果【1 2 48 】抗氧化能力存在巨大差异：羽衣甘蓝的抗氧化 活性是胡萝h 、豆角的8 9 倍，芹菜、黄瓜的2 9 3 5 倍1 1 9 1 ；草莓的抗氧化活性与羽 衣甘蓝相近，是苹果、香蕉的7 倍，白兰瓜的1 6 倍1 2 0 1 这归因于它们所含抗氧化 物质( 特别是类黄酮) 种类、浓度差异。c h a n g j i a n gg u o 等利用液相色谱库仑电 极阵列检测器从胡萝h 、羽衣甘蓝等样品中分离检测出3 1 1 7 种抗氧化物质，建 立了部分蔬菜、水果的指纹图谱，以表征其总抗氧化能力1 2 i j 。m a o ap k a h k g n e n 等研究显示，花青素是山桑子、笃斯越桔、蔓越莓、醋栗、草莓中主要的酚类 成分，而越橘中类黄醇和原花青素，黄莓、红莓中鞣花单宁，花椒浆果中酚酸 分别是主要的l a 。 2 第1 章引言 抗氧化物质在蔬菜、水果各部位的不均匀分布，导致其抗氧化活性不同。 k e l l y 、o l f b 等发现苹果果皮比果肉的抗氧化活性更强 2 3 1 ，b a g c h id 等发现葡萄籽 的抗氧化活性大大强于葡萄肉阱】。郭长江等对2 8 种水果的皮、肉、籽或仁的抗 氧化活性系统测定后，发现大多数水果皮、籽或仁部分的抗氧化活性均强于肉 质部分【2 5 1 。 1 2 2 抗氧剂稳定性 抗氧剂在自然、酸碱、光照、加热等条件下的稳定性研究。s h e n g m i ns a n g 等指出绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g ) 的不稳定性体现在：自体氧化 形成二聚体和异构化形成没食子儿茶素没食子酸酯( g c g ) 2 6 1 。j i n - w o oj h o o 等 证实红茶茶黄素在酸性条件下的稳定性强于碱性，经由自由基氧化或自氧化， 其最终转变成茶多醌【2 ”。光、热是影响花青素稳定性的最重要的物理、化学因 素，其降解过程符合一级化学反应模型。m a r i a n n ed y r b y 等研究显示，紫甘蓝花 青素( 主要是飞燕草素) 提取液对紫外可见单色光照射的稳定性受辐射波长、 体系酸度影响，其在2 5 8 0 的热稳定性强于黑醋栗、葡萄皮、接骨木果花青素 提取液，口h = 3 0 非碳酸类软饮料体系内存在的糖和维生素c 能加快花青素的热 降解速率 2 s l 。 人体进食后，食品中抗氧剂在胃肠中可能发生的反应。这类研究常控制反 应温度为体温3 7 ，利用缓冲体系调节p i t 值，并加入相应的酶，以模拟人体情 况：用胃蛋白酶，盐酸调p h 值为2 以模拟胃中情况，用胰液素和牛黄胆酸盐来 模拟小肠环境。f e r n a n d ov a l l e j o 等报道了椰菜花中的酚类、v c 、硫配糖体在胃 肠中变化情况：酚类、v c 在胃酸条件下较稳定，在肠液条件下降解损失严重； 硫配糖体则易在胃酸条件下降解【2 9 j 。 1 2 3 抗氧剂与食品成分问反应 食品如蔬菜中含有硝酸盐，人类食用后，在唾液中酶作用下，硝酸盐被还 原成亚硝酸盐。此外，香肠等肉制品中也会添加亚硝酸盐以改善肉类的色泽、 口感。在胃液中强酸作用下，抗氧剂可与亚硝酸盐反应。如v c 会被迅速硝化生 成亚硝酰基抗坏血酸，后氧化生成脱氢抗坏血酸再到二酮古洛糖酸，甚至v c 被 最终氧化至草酸。此外，在中性、弱酸性条件下，v c 与亚硝酸盐亦能发生反应。 第l 章引言 a n a t o l ie m y s h k i n 等以丁三醇盐酸缓冲液调节体系p h 在6 7 ，7 3 之间，研究得 v c 与亚硝酸反应速率与一浓度的平方成正比【刈。 防腐剂山梨酸钾与v c ，与铁盐( 柠檬酸铁，焦磷酸铁、f e e d t a ) 两两单 独存在时较稳定，但三者共存时，一个月内测定，山梨酸钾含量降低显著，a l l i e s t e s t 表明产物具有致突变性。k k i t a n o a 等推测v c 与铁盐作用生成过氧化氢，它 能将山梨酸钾氧化成具有生物毒性的物质l ”j 。 1 2 4 抗氧剂间关系研究 同一体系中，抗氧剂的抗氧化能力强弱比较。m i t s u r um i t s u m o t o 等人在冷 冻保存的生或熟的牛肉、鸡肉馅中分别加入v c 、茶水儿茶类提取物，比较对象 味道、颜色、脂氧化度变化情况，得出抗氧化能力后者大于前者的结论p 羽。文 献涉及的其他体系还有鱼肉i 玎肄。 另一类研究关于抗氧剂共存时相互影响。在白酒体系中，同时存在有抗氧 剂v c 和几茶素c 。c 易被氧化生成氧杂葸，有v c 存在时，能抑制氧杂蒽迸一步 氧化成有色物质。但v c 一旦被完全氧化，它的氧化产物能将氧杂蒽继续氧化， v c 的抗氧化作用转变成促氧化作用 3 4 1 。 食品中抗氧剂的研究具有以下特点：其一，正常条件下，抗氧剂参与的反 应速率慢，反应周期长，需进行长期测定或通过加热、光照、强酸等加速反应 进行；其二，研究多与生命科学相联系。包括模拟生命体系特征设定实验条件， 对反应产物进行生物毒性( d n a 破坏能力和致癌性) 研究；其三，分析方法多 样。既有光谱法，如紫外可见光、红外，又有色谱法，像g c - 1 订s ，l c m s 等。 1 3 过渡金属离子催化的v c 、苯甲酸反应 v c 是许多食品的天然成分，亦经常作为维生素补充剂或抗氧剂而添加至食 品中。苯甲酸( 钠) 是已被食品工业广泛应用多年的防腐剂，我国规定，其能 用于碳酸饮料、果汁( 味) 型饮料、果酒、葡糖酒、酱油、食醋、酱类等食品 的抑菌防护。 2 0 0 6 年3 月，英国食品标准局调查发现，多种软饮料存在苯含量超标问题。 苯是一种高毒性、对人体致癌的化学物质，“部分软饮料可能苯超标”问题引起 4 第1 章引言 社会强烈关注。一些研究机构、媒体纷纷推测：苯超标由同时存在于某些软饮 料中的v c 和苯甲酸( 钠) 反应造成。 事实上，早在1 9 9 3 年，l m i t ak g a r d n e r 和g l e nd l a w r e n c e 就已在美国化学 学会农业与食品化学上报道：v c 、过渡金属离子c u 0 d 、f e 0 i i ) 、f c 0 1 席在 条件下，苯甲酸受羟基自由基进攻而发生脱羧反应生成苯p ”。应用顶空气相色 谱质谱法陈志锋等测定了我国市售1 5 种软饮料中的微量苯：在果汁和含乳饮料 中未检出，而标识含v c 和苯甲酸( 钠) 的碳酸饮料苯检出量在o 3 一1 3 岭，l 1 ，低 于世界卫生组织规定的饮用水苯含量安全标准：l o 斗g l “州。 过渡金属离子催化的v c 与苯甲酸间反应的可能历程包括：v c 和c u ( n ) 或 f e ( 1 1 1 ) 问氧化还原反应，生成脱氢抗坏血酸自由基、c u ( i ) 或f e ( t o ：c u ( i ) 或f e ( i o 同双氧水或溶液内溶解氧间的f e m o n 反应p “，生成羟基自由基、c u ( i i ) 或f e ( ) ： 羟基自由基引发的苯甲酸取代3 8 】和脱羧反应【3 9 4 0 l ，生成羟基苯甲酸、苯酚、联 苯、苯等。如式( 1 1 ) ( 1 7 ) 。 h ，a h a 一+ h + c u “+ h a 一c u + + h a c u 2 + + t a _ c u + + a + h + c u + + o ，呻c u ”+ o ，一 2 0 2 一+ 2 h + 一0 2 + h 2 0 2 c u + + h ，o ，一c u “+ o h 一+ o h o h + c 撑，c o o h 呻自由基取代+ 脱羧产物 ( 1 1 ) ( 1 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 ) ( 1 5 ) ( 1 6 ) ( 1 7 ) 金属离子的氧化还原循环反应在整个历程中起重要作用。关于c u ( i i ) 催化的 v c 氧化反应，至今已提出多种反应机理，如配位反应、链反应、振荡反应等 均建立在c u ( 1 d 与v c 发生配位反应的基础上1 4 1 , 4 2 j 但许金幌研究推测c u ( 1 i ) 不与 v c 形成配合物，当体系内有c l 存在时，可能形成c i c u h a 配合物i 叫。d o r i t s a m o c h ab o n e t 等人发现c u ( n ) 浓度固定，增大v c 浓度至一定程度后，v c 氧化速 率不再增加，并据此假定c u ( i ) 的氧化是反应的决速步畔i 。y 一 壬p e g g yh s i e h 等用 氧化还原滴定方法测定出p h 值2 6 6 0 间，l m o l v c 能还原2 m o lf e ( i i i ) 一”，而同一 时期白令君等通过测定f e ( i i ) d p d 窒l 色络合物在波长5 2 0 7 n m 紫外吸收，认为p h 值4 5 左右。l m o lv c 能还原4 t o o lf e ( i l i ) t 坫j 。 第1 章引言 1 4 衍生化气相色谱法 凭借优异的分离能力，气相色谱法自1 9 5 2 年问世以来，迅速发展成为分析 化学的重要组成部分。但是，几乎在气相色谱法出现的同时，也出现了不适合 直接用气相色谱进行分析的样品，如高沸点的脂肪酸、糖类，热不稳定、化学 活泼性强的化合物及能与色谱柱固定相载体发生强烈吸附致使色谱峰峰形对称 性差的化合物。为解决这些难题，扩大气相色谱的应用范围，衍生化气相色谱 法应运而生。衍生化方法可改变化合物的理化性质从而降低其沸点或熔点、极 性，改善色谱峰的拖尾和吸附，提高检测灵敏度并缩短分析时间。近年来，其 在生物化学、环境【47 , 4 8 1 、医药和临床分析等领域己获得广泛应用。 衍生化气相色谱法所涉及的衍生方法主要有硅烷化、烷基化、酯化、酰基 化、缩合反应和手性衍生等【4 9 】。其中，在色谱分析欲测试样的衍生化处理中， 硅烷化是使用最广泛也是最为成功的方法之一。几乎所有可能因其极性干扰气 相色谱分析的基团都可以采用硅烷化的方法来改进【5 0 j 。本文v c 、苯甲酸钠、硫 酸铜体系反应生成物气相色谱法定性部分，采用硅烷衍生化方法。 衍生反应中，待测物羟基、羧基、巯基、胺基及亚胺基等官能团中的活性 氢原子被硅烷化试剂含有的硅烷基取代，生成硅醚或硅酯。几乎所有含以上官 能团的化合物都能与硅烷化试剂发生衍生反应，反应活性顺序：醇类 酚类 羧 酸类 胺类 酰胺类。含同一官能团的异构体，反应活性也会有所不同，如：伯 醇 仲醇 叔醇。三甲基硅烷( t r i m e t h y l s i l y l a t i o n , t m s ) 衍生物对热稳定、吸附 性小且易于制备，因而三甲基硅烷化在硅烷化方法中应用最广。反应原理如式 ( 1 8 ) 。 + d y s i x l i h 目前常用的三甲基硅烷化试剂可分为四种类型：三甲基氯硅烷( 1 m c s ) 纯 品或添加有酸接受体、催化剂；六甲基二硅胺烷( h d m s ) ，多添加t m c s 催化 剂；甲硅胺，如三甲基硅烷基二乙胺( t m s d e a ) 、三甲基硅烷基咪唑( 1 m s i m ) 等；甲硅烷酰胺，如n ，o 双( 三甲基硅烷基) 乙酰胺( b s a ) 、n ，0 双( 三 6 州 = 荽i 一 一 “ 一 一 净一 一 第1 章引言 甲基硅烷基) 三氟乙酰胺( b s l l l a ) 等。四类试剂中，第二类比较温和，常用 于羟基硅烷化，第四类较强，适用于活性较低的胺基、亚胺基和空间位阻基团 的硅烷化。b s t f a 用于硅烷化，在火焰离子化检测器( f l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t o r ， f 1 d ) 氢火焰中生成挥发性较大的四氟化硅而非二氧化硅气溶胶，不会在电极上 沉积而影响检测器灵敏度，因而特别适用于使用f i d 的衍生化气相色谱法p 。 吡啶是硅烷衍生化中使用最广泛的反应溶剂，其他如二甲基甲酰胺适用于 甾族化合物、二甲亚砜适用于叔醇的衍生化。此外，四氢呋喃、乙腈等也是常 用溶剂 s t l 。通常情况，硅烷化反应可在数分钟内完成，但有些化合物需较长反 应时间，如类黄酮与b s t f a + t m c s 的衍生化反应进行缓慢，需在7 0 反应4 4 , 时【5 2 】。衍生化试剂的种类、用量，溶剂，反应温度与时间等均会对衍生效果产 生影响。以壬基酚聚氧乙烯醚降解产物和卤化衍生物的硅烷衍生化为例，采用 甲酸乙酯或丙酮为溶剂，反应速率要快于正己烷，而使用b s a 同b s t f a 相比，在 更短反应时间内可获得更高产掣”j 。 本课题中将对v c 、苯甲酸钠、硫酸铜反应滚乙醚萃取和固相萃取相氩气吹 干后残渣进行三甲基硅烷化衍生，进而进行气相色谱- 质谱( g c m s ) 检测分析。 1 5 本文研究内容概述 本文将模拟软饮料酸度条件，借助衍生化气相色谱、高效液相色谱、紫外 可见光谱手段，研究过渡金属离子存在下，v c 和苯甲酸钠间反应过程。主要研 究内容可概括为以下四点： 其一，建立v c 、苯甲酸钠、硫酸铜混合反应液的液相色谱分离分析方法。 选择合适的有机溶剂，萃取v c 、苯甲酸钠、硫酸铜反应液或固相萃取后三甲基 硅烷化衍生。建立衍生物的g c m s 分离分析方法。产物定性。利用标准品，对 反应液液相色谱图部分产物色谱峰进行定性。 其二，紫外可见光谱在线监测v c 、苯甲酸钠、硫酸铜反应过程，考察体系 紫外吸收变化、双氧水存在与否对反应快慢的影响。 其三，h p l c 离线测定反应的动力学过程，研究硫酸铜对反应的催化作用、 蔗糖对反应的抑制作用及反应物v c 、苯甲酸钠浓度、温度、酸度等因素对反应 过程的影响，推测可能的反应机理。 其四，液相色谱法建立v c ，苯甲酸钠标准曲线，回收率实验验证可靠性。 7 第1 章引言 测定市售六种软饮料芬达、美年达、康师傅鲜之每日c 、三得利橙汁饮品、麒麟 午后红茶、农夫龙井绿茶饮品中v c 、苯甲酸钠含量，研究饮料样品自然条件下 长期放置的稳定性和v c 、苯甲酸钠对饮料样品稳定性的影响。 8 第2 章实验 第2 章实验 2 1 衍生化气相色谱一质谱法定性v c 、苯甲酸钠、硫酸铜反应产物 2 1 1 仪器和试剂 5 0 1 型超级恒温器( 上海实验仪器厂) ；s p e - c d c l 8 s p e 柱( 1 8 十八烷基， 5 0 0 m g 6 m l 。a p p l i e ds e p a r a t i o n s ) ：固相萃取仪( 环球分析测试仪器有限公司) ； l 1 2 8 型恒温氮吹浓缩仪( 北京来亨科学仪器) ；a g i l e n t6 8 9 0 型气相色谱系统， 配有5 9 7 3 型质谱检测器( 安捷伦科技有限公司) 。 磷酸、磷酸氢二钠、无水硫酸钠、氯化钠、v c 、苯甲酸钠、硫酸铜、乙醚、 n n 二甲基甲酰胺( d m f ) 均为分析纯：甲醇，色谱纯，德国m e r c k 公司； 高纯水；硅烷化试剂：b s t f a + t m c s ( 9 9 ：1 ，s u p e l c o ) 。 2 1 2 反应液制备 p h = 2 4 磷酸缓冲液：移液器取o 8 5 m l 磷酸至2 5 0 m l 容量瓶中，高纯水定容。 称取1 8 2 6 9 9 磷酸氢二钠，高纯水溶解后转移至1 0 0 m l 容量瓶内，定容。将两溶 液在5 0 0 m l 烧杯中混合，搅拌均匀后，以其为溶剂，分别配制0 4 4 7 0 9 l v c 、 o 3 6 3 0 9r i 1 苯甲酸钠和0 0 8 0 0 9 l 1 硫酸铜。除特别说明外，本文反应液配制所用 溶剂均为p h = 2 4 磷酸缓冲液。 控制水浴温度为( 3 0 0 士0 5 ) 。在5 0 0 m l 双层恒温烧杯中加入1 0 0 m l 苯甲 酸钠、硫酸铜，电磁搅拌下恒温5 r a i n 后，加入1 0 0 m l v c ，开始计时。约2 0 4 r a i n 后关闭电磁搅拌和恒温装置，收集反应液。 2 1 3 反应液萃取 液液萃取：量取2 0 m l 反应液于分液漏斗中，先后加1 0 m l 乙醚分两次萃取， 振摇3 m i n 后，静置5 r a i n 分层。合并有机柑，先后加1 5 m l 饱和氯化钠溶液水洗。 将有机相转移至烧杯中加入适量无水硫酸钠除水。静置后用注射器取上层清 9 第2 章实验 液，经o 4 5 1 t m 微孔膜滤器过滤至1 0 n g 量筒中，取8 m l 至1 0 m l 具塞样品瓶中。 室温下氩气吹干，残渣加2 m l 乙醚复溶后，0 4 5 p m 微孔膜滤器过滤至5 m l 具塞 样品瓶l 中，再次吹干。 固相萃取：5 m l 甲醇、5 m l 高纯水活化s p e 柱后，量取1 0 m l 反应液上样， 调节流速使反应液逐滴流出。完毕后，先后两次用2 m l 高纯水洗涤小柱。真空 抽干柱填料，再用2 m l 乙醚洗脱两次，收集洗脱液至5 m l 具塞样品瓶2 中，室 温下氩气吹干。 2 1 4 硅烷衍生及衍生产物气相色谱一质谱分析 移液器取2 0 0 9 l d m f 至样品瓶1 、2 中，振摇，待残渣溶解后，加入1 0 0 m 硅烷衍生化试剂，充分混合。旋紧瓶塞并将样品瓶置于烘箱中，7 0 0 1 2 条件下恒 温3 0 m i n 。取出后冷却至室温，过滤至2 m l 色谱样品瓶中，气相色谱进样分析。 g c m s 条件：色谱柱h p 5 ( j & ws c i e n t i f i c 3 0 m x 0 2 5 m m ，d r = 0 2 5 1 t i n ) ： 载气h e ；流速1 0 m l m i n - ；进样量1 0 1 d ；分流比2 5 ：l ；迸样1 3 温度2 7 0 ： 气质传输线温度2 3 0 ；离子源温度2 3 0 ；四极杆质量检测器温度1 5 0 ： 升温程序：初始柱温7 5 ，保持l m i n ，以1 0 m i l l 1 升至2 3 0 ，保持5 m i n 。 2 2h p l c 定性v c 、苯甲酸钠、硫酸铜部分反应产物 2 2 。1 仪器和试剂 l i p1 1 0 0 液相色谱仪，5 0 0 m lf i n n p i p e t t e 移液器。 邻羟基苯甲酸，分析纯；对羟基苯甲酸、2 ，4 二羟基苯甲酸、3 ，牛- 二羟基 苯甲酸，化学纯；乙腈，色谱纯，德国m e r c k 公司；高纯水。 2 2 2 对照品标准溶液配制与h p l c 分析 分别称取约4 0 m g 邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、2 ，4 - 二羟基苯甲酸、3 ， 4 - 二羟基苯甲酸于烧杯中，加p h = 2 4 磷酸缓冲液溶解后移至2 5 m l 容量瓶中，定 容。除2 ，4 二羟基苯甲酸取1 5 0 m l 外，其他均用移液器取1 0 0 m l 至5 m l 容量 瓶中，定容。0 4 5 9 m 微孔膜滤器过滤后，液相色谱进样分析。 1 0 第2 章实验 h p l c 条件：色谱柱x b p h e n y l ( 5 1 a m ，4 6 1 5 0 m m ，月旭材料科技有限公 司) ；流动相乙腈：0 i h 3 p 0 4 溶液= 2 0 ：8 0 ；流速1 0 m l m i n 1 ；进样量2 0 p 1 ； 检测波长2 1 0 n m ，2 3 0 r i m ，2 4 4 n m 。除特别说明外，本文h p l c 分析均按此条件。 2 3 紫外一可见光谱法研究反应过程 2 3 1 仪器和试剂 a g i l e n t8 4 5 3 紫外一可见分光光度仪( 附带p e l t i e r 控温装置和搅拌装置，安捷 伦科技有限公司) ，5 0 0 m lf i n n p i p e t t e 移液器。 双氧水，分析纯；其余同2 3 1 。 2 3 2 紫外在线动力学测定 v e 、苯甲酸钠、硫酸铜体系：控制池温5 0 0 1 2 ，移液器分别取1 0 0 m l 4 7 2 0 r n g l 1 硫酸铜、3 7 0 0 m g l 苯甲酸钠至l e m 石英比色皿中，电磁搅拌下恒温 2 m i n ，快速加入1 0 0 r i d4 4 0 3 m g l v e ，同时按下“s t a r t ”按钮。在系列反应时 间测定体系紫外吸收光谱。时间参数设定：开始，1 0 s ；测定周期，3 0 s ；周期增 量，9 0 0 s 后递增5 。 v c 、硫酸铜体系：将1 0 0 m l 苯甲酸钠溶液替换成磷酸缓冲液，其余同上。 v c 、苯甲酸钠、硫酸铜、双氧水体系：控制池温为2 5 0 c ，移液器分别取 o 7 5 m l4 7 2 0 r a g l - 硫酸铜、3 7 0 0 m g l 。苯甲酸钠、8 1 6 0 r a g 。l 4 双氧水( 或 o 4 0 8 0 9 l 1 双氧水) 至1 e m 石英比色皿中，恒温2 m i n 后，快速加入o 7 5 m l 4 4 0 3 m g l v e ，开始测定。 v e 、硫酸铜、双氧水体系：将1 0 0 m l 苯甲酸钠溶液替换成磷酸缓冲液，其 余同上。 2 4h p l c 研究v c 、苯甲酸钠、硫酸铜反应过程、影晌因素 2 4 1 仪器和试剂 u 第2 章实验 l i p11 0 0 液相色谱仪；5 0 1 型超级恒温器；5 ，o o m lf i r m p i p e t t e 移液器。 磷酸、磷酸氢二钠、硫酸铜、苯甲酸钠、蔗糖、v c 分析纯；乙腈，色谱纯， 德国m e r c k 公司；高纯水。 2 4 2 恒温s o 0 c 反应过程测定 v e 、苯甲酸钠、硫酸铜体系：控制水浴温度为( 5 0 0 土o 5 ) 1 2 ，在1 0 0 r a l 双层恒温烧杯中加入2 5 m lo 3 6 0 4 9 l - 1 苯甲酸钠溶液、2 5 m l0 0 7 6 2 0 9 l 1 硫酸铜 溶液，电磁搅拌下恒温5 m i n 后，加入2 5 m lo 4 3 8 8 9 l 4 v c 溶液，开始计时。分 别在反应进行2 0 m i n 、1 5 7 m i n 、2 8 0 m i n 、4 1 0 m i n 、5 5 0 m i n 、6 9 0 m i n 、8 5 5 m i n 、 1 0 1 3 m i n 、1 1 7 7 m i