（果树学专业论文）茉莉酸信号途径的化学遗传学解析.pdf

符号说明 j a ：j a s m o n i ca c i d ，茉莉酸，一类来源于不饱和脂肪酸的植物激素 1 2 一o p d a ：1 2 o x o - p h y t o d i e n o i ca c i d ，1 2 一氧代一顺一1 0 ，1 5 - 植物二烯酸 a o c ：a l l e n eo x i d ec y c l a s e ，丙二烯氧化物环化酶 a o s ：a l l e n eo x i d es y n t h a s e ，丙二烯氧化物合酶 a o x ：a l t e r n a t i v eo x i d a s e ，交替氧化酶 b p ：b a s ep a i r ，碱基对 c m ：c vc a s t l e m a r t , 番茄栽培品种 c o i l ：c o r o n a t i n e i n s e n s i t i v e l ，拟南芥菜莉酸不敏感突变体 c o i l ：c o r o n a t i n i n s e n s i t w e l ，茉莉酸信号通路的正向调控蛋白 c o i l ：编码c o i l 的基因 d e p c ：d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦炭酸- - z , n e m s ：e t h y lm e t h a n es u l f o n a t e ，甲基磺酸乙酯 丘i l 一1 ：j a s m o n i ca c i di n s e n s i t i v e1 - ，番茄抗性缺失突变体( l e c o l l ) 归j jm e t h y j a s m o n a t er e s i s t a n h ，拟南芥茉莉酸不敏感突变体 l a ：l i n o l e n i ca c i d 亚麻酸 l o c a lr e s p o n s e ：局部反应 l o x 2 ：l i p o x y g e n a s e2 ，脂肪氧化酶2 l r r ：l e u c i n er i c hr e p e a td o m a i n ，富含亮氨酸的重复结构域 o p r ：1 2 - o x o - p h y t o d i e n o i ca c i dr e d u c t a s e ，1 2 - o p d a 还原酶 p i s ：p r o t e i n a s ei n h i b i t o r s ，蛋白酶抑制剂i 、i i ( p i i ，p i i i ) p l a ：p h o s p h o l i p a s ea ，磷脂酶a p l a 2 ：p h o s p h o l i p a s ea 2 ，磷脂酶a 2 p l d ：p h o s p h o l i p a s ed ，磷脂酶d p p o ：p o l y p h e n o lo x i d a s e ，多酚氧化酶 p r o s t a l a n d i n s ：前列腺素 p r o s y s t e m i n ：前系统素 s c f ：e 3u b i q u i t i nl i g a s ec o m p l e x ，e 3 泛素连接酶复合体 s i g n a l s ：信号分子 s p r l ：s u p p r e s s o ro f p r o s y s t e m i n m e d i a t e d r e s p o n s e ，番茄抗性缺失突变体 s p r 2 ：s u p p r e s s o ro f p r o s y s t e m i n m e d i a t e dr e s p o n s e2 番茄抗性缺失突变体 s p r 6 ：s u p p r e s s o ro f3 5 s ：jp r o s y s t e m i n m e d i a t e dr e s p o n s e 6 , 番茄抗性缺失突 变体 s y s t e m i cr e s p o n s e s y s t e m i n ：系统素 u b i q u i t i n ：泛素 系统反应 一类多肽信号分子 c e v l ：c o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no f 脚j ：拟南芥茉莉酸不敏感突变体 v s p ：营养储藏蛋白 p d f l 2 ：植物防御素1 2 t h i 2 1 ：硫堇2 1 y9 0 3 9 1 g 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：主塞蓝盘 导师签名：剑：壁毖 日 期：2 q q 互生鱼月 出家农业大学硕士举位论文 摘要 作为一猝重要禳物激素，莱莉酸在调控植物对既虫侵害、病原箧侵染 的抗性反应方面起必不可少的作用。但目前对莱莉酸信号转导的分予机理 获弼甚少。，为了鉴是装藏酸绩学传导途经戆蒙缝分，零霹究叛小势予稼含 物b e s t a t i n 为工具，建立了用化学遗传学方法解析浆莉酸信号途径的研究 体系。b e s t a t i n 是一种氨肽酶抑制剂，谯以前的报道中发现它能够诱龉番 茄中藐毪穗关薹霾翡表这。我稻淤番茄弱攒南芬串蒙藕酸台藏稻信号传导 突变体为材料，利用遗传学和生理生化手段证明b e s t a t i n 可以特异性的激 活植物体内魏荣蓑簸信号转导途径。曹建，b e s t a t i n 可以特磐载擞潺拟燕 芥和番茄中莱莉酸诱导的基因袭达。其次，b e s t a t i n 的这种作用依赖予茉 莉酸信号转导途径中非常重要的组分c o i l ，但是不依赖于菜莉酸的合成。 第三，到瘸数露芬受基困缓蕊嚣分辑表麓，b e s t a f i n 窝募蓑璇诱导饕零类 似的基因袭达模式。第四，植物被施加b e s t a t i n 后，还可表现出一系列与 菜莉酸有关的生长发育方面的袭型，包括抑制主挂生长、促进侧根发生、 诱导花青綮袄蒙等。综上嚣述，b e s t a t i n 霹能逶过谬诲j a 信号转导途径中 一些重要的调节因予而在茉莉酸信号途径中发挥赭独特的作用，因而为用 他学遗传学方法勰掇荣藜酸僖号转导途缎提供了个有力浆工具。我们秘 鹰b e s t a t i n 抑制主糇伸长作为指标，通避筛选拟南芥e v l s 诱变的m 2 代群 体，得到了一系列b e s t a t i n 不敏感突变体( b e t ) 。进一步分析发现，一蝗 h e r 突变钵怼募蓑酸诱导戆爱痰表瑗交务耱变纯，鞭蠹乏褥b e t 突变蘩分为 三种类型：j a 不敏感b e r 突变体，j a 超敏感b e r 突变体和正常j a 反成的 h e r 突变体。通过对这些h e r 突变体进行遗传学和基因表达水平的分掇发 蕊它髓确实表瑶密辩莱藕酸反应静改交，并且是蒹籍酸信号转导途径中静 新组分。 美链涌：褥茨；拟鸯芬；b e s t a t - i n ：茉藕激；售号转罢 荣莉酸信号选径的化学遗传学解析 a b s t r a e t a sap l a n th o r m o n e ，j a s m o n i ca c i dp l a yav e r yi m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n g p l a n td e f e n s er e p o n s e s h o w e v e r , r e l a t i v e l yl i t t l ei sk n o w na b o u tt h es p e c i f i c r o l e so fj ai nl o n g - d i s t a n c ew o u n ds i g n a l i n g ，b e s t a t i n ，ap o t e n ti n h i b i t o ro f s o m ea m i n o p e p t i d a s e s ，w a ss h o w np r e v i o u s l yt ob eap o w e r f u li n d u c e ro f w o u n dr e s p o n s eg e n e si nt o m a t o h e r e ，w ep r e s e n ts e v e r a ll i n e so fe v i d e n c e s h o w i n gt h a tb e s t a t i ns p e c i f i c a l l ya c t i v a t e sj a s m o n i ca c i d ( j a ) s i g n a l i n gi n p l a n t s f i r s t ，b e s t a t i ns p e c i f i c a l l ya c t i v a t e st h ee x p r e s s i o no fj a i n d u c i b l e g e n e si nt o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) a n da r a b i d o p s i s 叫r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) s e c o n d ，t h ei n d u c t i o no fj ar e s p o n s i v eg e n e sb yb e s t a t i nr e q u i r e s t h ec o i l d e p e n d e n tj as i g n a l i n gp a t h w a y ，b u td o e sn o td e p e n ds t r i c t l yo nj a b i o s y n t h e s i s t h i r d ，m i c r o a r r a ya n a l y s i su s i n ga r a b i d o p s i sw h o l eg e n o m ec h i p d e m o n s t r a t e st h a tt h eg e n ee x p r e s s i o np r o f i l eo fb e s t a t i n t r e a t e d p l a n t s i s s i m i l a rt ot h a to fj a t r e a t e d p l a n t s f o u r t h ，b e s t a t i np r o m o t e sas e r i e s o f j a - r e l a t e dd e v e l o p m e n t a lp h e n o t y p e s t a k e nt o g e t h e r ，t h eu n i q u ea c t i o nm o d e o fb e s t a t i ni nr e g u l a t i n gj a s i g n a l e dp r o c e s s e sl e a d su st ot h eh y p o t h e s i st h a t b e s t a t i ne x e r t si t se f f e c t st h r o u g ht h em o d u l a t i o no fs o m ek e yr e g u l a t o r si nj a s i g n a l i n g w eh a v ee m p l o y e db e s t a t i na sa ne x p e r i m e n t a lt o o lt od i s s e c tj a s i g n a l i n gt h r o u g hac h e m i c a lg e n e t i cs c r e e n i n g ，w h i c hy i e l d e dac o l l e c t i o no f a r a b i d o p s i sb e s t a t i n r e s i s t a n t ( h e r ) m u t a n t s t h a ta r ei n s e n s i t i v et ot h e i n h i b i t o r y e f f e c t so fb e s t a t i no nr o o te l o n g a t i o n f u r t h e rc h a r a c t e r i z a t i o n e f f o i t sd e m o n s t r a t et 1 1 a ts o m eb e rm u t a n t sa r ed e f e c t i v ei nv a r i o u sj a - i n d u c e d r e s p o n s e s ，w h i c ha l l o w e du st oc l a s s i f yt h eb e rm u t a n t si n t ot h r e ep h e n o t y p i c g r o u p s ：j a - i n s e n s i t i v e b e r m u t a n t s ，j a h y p e r s e n s i t i v e b e rm u t a n t s ，a n d m u t a n t si n s e n s i t i v et ob e s t a t i nb u ts h o w i n gn o r m a lr e s p o n s et oj a g e n e t i c a n dp h e n o t y p i ca n a l y s e so ft h eb e rm u t a n t sw i t ha l t e r e dj ar e s p o n s e si n d i c a t e t h a tw eh a v ei d e n t i f i e ds e v e r a ln o v e ll o c ii n v o l v e di nj as i g n a l i n g k e yw o r d s ：t o m a t o ；a r a b i d o p s i s ；b e s t a t i n ；j a s m o n i ca c i d ；s i g n a l i n g p a t h w a y 2 山东农业大学硕士学位论文 引言 1 1 研究意义 茉莉酸是一种重要的植物激素，不仅在植物抗性反应中起重要作用， 而且在植物的生长发育过程中起着重要作用，比如根系生长，块茎形成， 衰老以及繁殖等方面( c r e e l m a na n dm u l l e t ，1 9 9 7 ；t u r n e re ta 1 ，2 0 0 2 ； w a s t e m a c ka n dh a u s e ，2 0 0 2 ；d e v o t oa n dt u r n e r , 2 0 0 3 ；b r o w s e ，2 0 0 5 ) 。j 立去 十几年，通过对模式植物拟南芥和番茄的研究，使我们认识到了茉莉酸作 为一种来自脂肪酸的植物激素在发育、代谢、特别是在对生物性胁迫抗性 中的重要作用。遗传学证据确立了茉莉酸作为一种可移动的信号分子在调 控抗性相关基因在受伤局部和系统部位的协调表达过程中的核心地位。 然而，我们对茉莉酸信号转导这一复杂而精细的过程本身的认识尚处 于初级阶段，与其它植物激素的信号传导途径相比，茉莉酸信号转导的许 多重要组分都尚待采用更切实有效的实验手段进行鉴定。多家实验室借鉴 “五大经典”植物激素研究的经验，以拟南芥为材料试图通过筛选对外源茉 莉酸的反应发生变化的突变体而鉴定包括茉莉酸受体在内的正向和负向 调控元件。目前的筛选已远远饱和了拟南芥的整个基因组，但仅得到了包 括c o i l f w i ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ，j a r l ( s t a s w i c ke ta 1 ，1 9 9 2 ) 和j i n i ( b e r g e re ta 1 ， 1 9 9 6 ) 在内的有限的几个组分。说明茉莉酸受体在内的多数信号转导组分 极有可能存在遗传或生化上的冗余或重叠现象。 根据上述对当前荣莉酸信号转导途径“瓶颈”问题的深入分析，我们采 取一种新颖的“化学遗传学”和传统正向遗传学相结合的策略进一步解析 茉莉酸信号转导途径。最先在动物系统中发展起来的“化学遗传学”手段与 传统遗传学( 包括正向和反向遗传学) 相结合的分析策略正被越来越多地 应用于植物研究领域，并在拟南芥生长素途径以及细胞内膜蛋白分选 ( s o r t i n g ) 、转运( t r a f f i c k i n g ) 过程的研究中取得了突破性的进展 ( b l a c k w e l la n dz h a o ，2 0 0 3 ：z h a oe ta 1 ，2 0 0 3 ；z o u h a re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在当前 包括拟南芥在内的许多模式植物的基因组序列已知的背景下，基于化学遗 传学的筛选策略较之传统遗传学方法显示出许多优势，重要的一点是可以 荣蓑酸蘩每逢径琵学逡转学簿辑 避免由于存在多个位点而无法筛选到突变体的困难。 b e s t a t i n 是一耱鬟获酶帮翱潮，冒爨横l 茎 苯蓑酸黪功效，静疆爨诱强 臀茄中包括p i s 在内的抗性相关基因的表达( s c h a l l e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。本研究 利用详尽的遗传学研究证明b e s t a t i n 豹这茅申作用与募裁酸途径露着密切必 系，莠敷此为基磴，建立了大籁模静遗蒋筛选系统，用于获褥对b e s t a t i n 反应发生变化的拟南芥突变体。通过对这然突变体的详尽分析攫定荣莉酸 麓号抟导懿霪要基因，并对这黧基因戆功能帮表这调控规割避孑深入磷 究，为全面了解茉莉酸这一重要植物激素的作用机制提供创新健的知识积 累。 果树楚农村萃中植娩中仅次予粮食、蔬菜的第三大产业，栗黯成为人们 网常生活中必不可少的产品。但目前我国的果树生产存在单位面积产量较 低、票晶震蕊不毫、爨强率镶甄豹趣霆。戴箕嚣毽烹要弯凡个方嚣：一、 粜树病虫害严重影响聚树产量和架品质量，每年损必迭2 5 以上，经济损 失数十亿元；二、果树病虫害防治以化学农药为主，胆不按防治指标施药， 涎意麓丈浓壤，喷芬不注意绦拶天敌，不役使害盔产生藏菱梭，使次要寨 嫩的天敌被杀死，引起次要害虫黎发，更薰要的是使果品农药残留量超标， 影响出口及内销。因此，大力搬行和普及生物防治披术，摆动浆掇生产健 廉发展，褥渐栗品的商品价值籁食用徐馥，生产绿甑栗品，成为当前全球 果树栽培发展的总趋辨。通过研究茉莉酸信号转导途径的分子貉础，了解 蓉裁酸在抗鹱反直中瓣重要手# 攫，薅羹我燃建立一套利曩暴耱棱粒豹塞赛 抗性控制果树害虫的生物防治披术提供重疆的理论熬础。 1 2 茉莉酸猩植物抗髓反应中的作用 茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 最显著的作用是它在损伤以及昆虫抗燃 审作为系统经信号对檬豹静获镶反应筵着蕊要的调节作魇。当受至l 梳疆损 伤以及昆虫侵害后植株不仅在受伤部位( 局部) 也谯末受伤部位( 系统憔 部位) 产生抗性。局帮信号( 如骞糖) ( b i s h o p e ta 1 ，1 9 8 4 ；h a h ne t a l 。，1 9 8 1 ) 和系统性信譬( 如系统素) ( p e a r c e e ta 1 ，1 9 9 1 ) 与受体相互作用后激起一 系列的细胞内反应。这些反戚包括质膜离子通道的打开( f e l i x 和 出襄袭韭大学颈士掌垃谴文 b o l l e r ，1 9 9 5 ；m o y e n 和j o h a n n e s ，1 9 9 6 ；s c h a l l e r 和o e c k i n g ，1 9 9 9 ) ，细胞 覆内e a 2 + 浓凄熬势薅，m a p 激鬻懿滋鑫( s t r a t m a n 秘r y a n ，1 9 9 7 ；u s a m ie t a 1 1 9 9 5 ) ；还包括磷脂酶的激活，亚麻酸从质膜中的释放以及通过十八碳 烷酸途径合成j a ( l e e e ta 1 ，1 9 9 7 ；n a7 r v a e z v a 7 s q u e ze ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 疆究淡明强是羝御琵盎侵害霹夯导撬往反应靛纯学信罨分子。植物为 抵抗昆虫侵害而建立起的信号途径是很复杂的，而信号分子在该途径起 篱不可或缺戆作用。尽管其它羽信号过稳也会参与摭性，但怒突变体分辑 寝明，骢的合成及信譬转导在抗性反应中起着最为羹要的作粥( m e g u r l e t a 1 ，1 9 9 2 ) 。对j a 合成途径中的功能缺失突变体的研究提供的权威性依据 涯羁7 俄焱霆虫拣镶方嚣豹耋簧终焉( h o w e 薛a l 。，1 9 9 6 ；m c c o r m 薛a i ， 1 9 9 7 ) 。策莉酸合成或者信号转导缺陷致使植株易鼹机械损伤以及昆煦的 侵害。在拟南芬：f a d 3 删王形廊嬲三突嶷体中，三种将1 8 ：2 转化为1 8 ：3 鄹 涛1 6 ：2 转纯为1 6 ：3 酶躐氢酶舔发生璃髓丧失( m c c o n n 移b r o w s e 。1 9 9 ， 植物缺失念成j a 的前体脂肪酸，结果导致植物中无法合成j a 。当该突变 体被昆虫授害后，与野生型檀燧相比表现出非常离鼹恁亡霉( 8 0 ) ，嚣 外源施由日j a 后，该突变体就得剐保护，嬲亡率降至徽低( 1 2 ) 。该实验 充分证明了j a 在植物。昆虫相甄作用的抗性反应中超着重要的作用。 茉蘩酸不莰楚梭狻撬蛙爱藏中登零憝售号，瑟蘧毯还嚣为一耱系绞拣 信号调节精植物的抗性反应。谯番茄中利用嫁接实验直接证明了荣莉酸的 这种作用，系统性抗性反应不仅需要茉莉酸的合成，而且需鼹菜莉酸的信 弩转导，茏为重要酶建敬懿合簸对可移动受伤信号魏产生是妊需静( l ie t a l 2 0 0 2 ) 。 1 3 荣莉酸晦生物合成途径及信号转导 1 3 。1 荣蓑羧生鐾会残豹辛，谈烷酸途径 荣莉酸是由亚麻黻( 1 i n o l e n i ca c i d ，l a ) 通过所谓的“十八碳烷酸途径” 合成的( 圈i - 1 ) 。荣莉酸台成稽关的凡个关键性酶，雹括脂肪氧化酪 ( 1 i p o x y g e n a s e ，l o x ) 、丙二烯甄化物合酶( a l l e n eo x i d es y n t h a s e ，a o s ) 芹口 鬟薅酸穰警逸径熬纯攀遗传学解辑 词二烯氧化物环化酶( a l l e n eo x i d ec y c l a s e ，a o o 等，已在拟南芥或其它植 物孛遂牙了签定，箕秘应豹基溺氇己被壳淹g e u s s n e r 莘鼙w a s t e m a c k ，2 0 0 2 ； i s h i g u r ee ta 1 ，2 0 0 1 ： n e re ta l ，2 0 0 2 ) 。由于l o x 、a o s 和a o c 都定能 予时绿体，豳此研究也相对清楚的莱莉酸生物合成的初始步骤r 例如，从 l a 至io p d a 静合成，被认隽是在盱绿律中进行的( s c h a l l e r , 2 0 0 1 ) 。僵当箭 对于十八烷酸途径的最初底物l a 本身是如何提供的尚所知不多，如果参 考动物e i c o s a n o i d ( 藐生酸) 豹生燧合成过程，可以搀测考特定熬磷旨酶a 倦化l a 从膜脂的释放。在番茄中已有直接证据表明系统素通过激活磷脂 黼a 2 ( p l a 2 ) 从而促进受伤害叶片膜脂中l a 的释放( n a r v a e z v 矗s q u e ze t a l ， 1 9 9 9 ) 。羧露芬突变髂d e f e c t i v ea n t h e rd e h i s c e n s e ( d a d l ) 熬鉴定荻及基嚣瓷 隆表明，d a d l 属于雄性不育突变体，d a d l 基因编码一个新的p l a l ， p l a l 是花器官发育咿潺节茉莉酸生物合成所必需的，但是d a d l 对伤害诱 静静茉藕酸生物合成反应正毒，这说明d a d l 可髓参与了侮窖诱导静菜 莉酸生物裔成，但并非必需( i s h i g u r ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。据此可以推测，作用于 发育熬茉裁羧生物合成袭痿害诱导靛荣藕簸生物会媛是逯过不羁豹规铡 分别进行调控的。在衢茄抗性殿应系统中，目前关于从系统索与其受体 s r l 6 0 的纳合到叶绿体中十八碳烷酸途径的激活之间的信号传导事件逐 缀不清楚。缀据理论臻瓣，壹o p d a 转鬣袋莱蘩酸翡过程应该岔过氧稼 物酶体中完成。越来趟多的研究不断为这一预测的溅确性提供实验证据。 o p d a 先被1 2 o p d a 还原酶( 1 2 。o x o - p h y t o d i e n o i ca c i dr e d u c t a s e ，o p r ) 燃 纯生成3 一氧代一2 f 蔽2 一戊烯基) 环戊靛1 辛酸 3 - o x o - 2 - ( 2 ( z ) 一p e n t e n y l ) - c y c l o p e n t a n e l o c t a n o i ca c i d ，o p c - 8 ：o ，然后缀 过兰轮氯佬( p o x i d a t i o n ) 生成簸终产物浆裁酸。遴i 蓥对羧意芬壤牲不鸯 必变体d d e l ( d e l a y e dd e h i s c e n c e i ) ( s a n d e r s e t a 1 ，2 0 0 0 ) 和o p 一 ( o x o - p h y t o d i e n o i ca c i d 烨d u c t a s e ，) ( s t i n t z ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 的分析表明o p r 3 倦 诧了簌d a 蜀o p c 。8 ：0 还暴爱应过程，餐是0 p 廷l 程0 p r 2 帮没有蠲 样的功能。o p r 3 定位于细胞过氧化物酶体中( s t i n t z ie ta 1 ，2 0 0 1 ) ，一魉 参与8 氧化豹酶也位子过氧化物簿体中，遗表明o p r 3 的底物o p d a 鼹 瑟鼠时绿体中被转运委l 过氧纯耪酶体中。激近分离褥瓢的a c x l a 编码乙 醚c o a 氧化酶，参与b 氧化的第一步反应( l ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 6 山东农业大学硕士学位论文 i j p o x y g e n a s e 厂2 - 、7 2 v 一一，c o o h 1 3 * h y d r o p e r o x y h n o l e n i ca c i d a 1 e n eo x i d es y m h a s e 严；、夕- 、= v 一一，c o o h 1 2 ，1 3 - e p o x y o c t a d e c a t r i e n o i ca c i d a l l e n eo x i d e 刚a s e 菠c 。h ( 9 s d 3 s ) - 1 2 - o x o - p h y t o d i e n o i ca c i d 1 x l o o 】i - p h y t e d t o d u c t i e n a s e o i c 捌4 0 。 臼竺= c 。叫 3 - 0 x o - 2 ( 2 i z l - p e n t e n y l ) - c y d o p e n t a n e - i o c t a n o i ca c i d o fl $ ：o x i d a t l o n 图1 - 1茉莉酸的生物合成( j o h nb r o w s e 2 0 0 5 ) f i g u r e1 - 1b i o s y n t h e s i so f j a s m o n i ca c i d ( j o h nb r o w s e ，2 0 0 5 ) 7 荣蔫酸壤学途径羲纯擘建转学解辑 1 3 2 茉莉酸的信号转导途径 具毒灞经静荣蓑瀚羧酸( j a s m o n a t e ) 惫戆o p d a 与荣蓑酸( j a s m o n i ca d d ) 或茉莉酸甲酯( m e f l l y l - j a s m o n i c 。a d d ，m e j a ) 。在拟南芥中，o p d a 和j a 都能够诱零受伤反应，但是雄麓的发育只受王a 诱憨，两不受o p d a 诱搏 ( i s h i g u r oe ta 1 ，2 0 0 1 ；s t i n t z ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。这表明在损南芥中至少存在两种 途径传导j a 信号，一种是在抗性反应中既可识别j a ，也可识别o p d a ： 熙一秘是褒雄蕊豹发蔼中，只能识剐融，不麓识裂o p d a 。理论上荣薅 酸信号通过与受体结合而激活下游信号转导事件，最终诱导抗性基因袭 达。但是到目前为止，还没有撩定出茉莉酸的受体。许多实验室通过备种 方法薅选荣襄酸穗号途径审懿突变圣錾，毽多年来毽炎鉴定褥澍 c o i l ，j a r l ，j i n l 和c e v l e ta 1 为数甚少的几个基因。造成这种结果的原因 可能是王a 驰各种受髂存在功熊上的冗余。 茉莉黢信号传导途径研究静个重大突破是拟裔芥中对c o i l ( c o r o n o t i n ei n s e n s i t i v e ，c o m n o 血a e 是策莉酸的结构类似物) 突变体的 耢究。c o i t 突变转怼融表瑷掰不敏感，雄娃不鸯，璺不笺淡这强调节 的相关基因的表达，包括营养贮藏蛋白( v s p ) 0 3 e n e d e t t ie t a l ，1 9 9 5 ) ， 硫堇2 1 ( t h i 2 1 ) ，和植物防御豢( p d f l 2 ) ，并且易受昆虫和病原菌的侵 害( m c c o n n e ta 1 ，1 9 9 7 ；t h o m m a 娃a l ，1 9 9 8 ) 。c o i t 绫蔼一个f - b o x 蛋鑫 ( x i ee t ，a 1 ，1 9 9 8 ) 并与8 k p l s r l c u l l i n s c f c o l l 复合体( x ue ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。摆攘测，该复合体通过泛素( u b i q u i t i n ) 介黟的蛋白隧解途径选择 性地募集弗降解菜黧策莉酸信麓传导途径的抑制医予从而使信号传导反 成正常进行。因此，c o i l 作用的底物可能是茉莉酸信号途径中一个很墩 簧懿调节嚣予。d e v o t o 等( 2 0 0 2 ) 捌爰酵母双杂交魏受疫莛沉淀弱方法薅遮 与c o i l 相溉作用的戳臼，鉴定到组氨酸去乙酰化酶r p d 3 b 和r u b i s c o 的 小亚基。遮两种蛋白可能是c o i l 介导的泛索化作用的底物，并在j a n 号 途径审莛 乍雳。缝氨黢去乙醮仡酶静作嗣主要是维持缱氨酸乙虢鬣：蠢去苏 酰化状态的平衡，从而在基因的转录调节机制中起煎要作用。组氨酸去己 酸他酶 牟为越括调节圆子，可熊会形藏一耱对激素敏感多价体，在j a n 径中起负调控因子的作用。调节嚣子通过j a 诱导的磷酸化作用采修饰，w 被c o i l 识别，当靶标调节因予被识别降解后，j a 相关的基因得以表达。 出彖教监丈学磋士学篷逢文 s c fe 3 泛綮连接酶通过单一泛索化可以修饰膜的逡输，亚细胞定位，转录 以及蛋交激酶活蝗i c k a r te ta l 。，2 0 0 i ) ，毅茂，s c f c o f 复合钵霹麓会磐镑 靶标调节豳子的活性或者在调节因子的激活与降解中起双重作用。 舭j b i s c o 作为c o i l 底物的可能性起因予拟南芥在袋老过程中伴随着j a 含量豹秀离耱r t b l s c 0 ，j 、亚鏊表达量瓣下降( p a r t h i e r , 1 9 9 0 ) 。 尽管从遗传和娥化的角度进行了大蠛尝试，似目前对c o l l 所降解的 按制因子麴本质尚不清楚，对c o i l 上游敷下游的成分也了辫不多f x i e ，e t 虹。1 9 9 8 ；t u r n e r , 2 0 0 2 ) 。作为c o i l 的抑制予突变，c o s i ( c o i ls u p p r e s s o r ) 恢 复了茉莉酸诱导的根系伸长抑制、基因表达和抗性反应。c o s l 编码一个2 ， 4 二氧器鬣臻踺合残酶( l u m a z i n es y n t h a s e ) 瑟在凝鸯多转蘩器生理功憩 的维生索b 2 ( 又称核黄素，r i b o f l a v i n ) 的生物合成中起作用。但具体c o i l 如何通过维生素b 2 逡径影响荣莉酸反应溅不清楚( x i a oe ta 1 、2 0 0 4 ) 。 在按南芬中通过露遮对荣藕羧或箕鬻生物荣籍酸荦蘸 ( m e t h y l - j a s m o n i ca c i d ，m e j a ) 的反应发生变化的突变体还获得了荣莉酸 途径的其它一些组分。其中套瓣莱蓑酸不敏感懿j a i l ( m e t h y i - j a s m o n a t e r e s i s t a n t l ，突变体( s t a s w i c ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。体外生化分析发现j a m 属予腺 旖酸合成酶中的萤火虫荧光索黼超家族，功能研究淡明荣莉酸通过腺替化 与异亮氨羧共赞缝合是诱导拣经莶嚣表达瑟登需熬个步骤( s t a s w i c ke t a i ，1 9 9 2 ；2 0 0 2 ；2 0 0 4 ) 。通过甲旗茉莉酸筛选得到的两个不敏艨突变体j i m 翻j i n 4 ( b e r g e r e ta 1 ，t 9 9 6 ) ，其中j i n l 编码一个岔诲b a s i c h e l i x - l o o p h e l i x 两 琵竭鏊稳黥m y c 家族静转录因子被称为a t m y c 2 ( l o r e n z oe ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。进一步研究袋明，番茄中a t m y c 2 的同源鬣自j a m y c 2 通过特异 拣地识别一些受茉裁疆诱导的抗性朝关蒸嚣( 如蛋是酶期副裁王i 等) 豹 璃动子区域的g - b o x 位点而调控这些基因的转录表达( b o t e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 另外，人们也尝试利用筛选组成型表达荣辅酸反应的突变体以获得该信号 转导途缀戆重要元件( 逶霉痊该是受调控元 孛 。其中 c e v l ( c o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no fv s p l ) 编码一个纤维綮合成酶旗 豳，暗示纫腮壁合成与荣莉酸偿号传导之间存在某莘申霈要进一步阐明的联 系( e l l i s 秘t u r n e r , 2 0 0 1 ；e i i i se ta l 。，2 0 0 2 ) 。 总之，通过大量的研究对于茉莉酸信号转导途径已经有一定的了解， 9 茉莉睃信号途径的化学遗传学解析 但其中的许多重要组分仍未鉴定到，莱莉酸作用机制有待于进一步阐释。 这需要鉴定更多信号途径中相关因子。 1 4 用化学遗传学解析茉莉酸信号转导途径 综上所述，过去十几年在拟南芥和番茄中的研究使我们认识到了茉莉 酸作为一种来自脂肪酸的植物激素在发育、代谢、特别是在对生物性胁迫 抗性中的重要作用，遗传学证据确立了茉莉酸作为一种可移动的信号分子 在调控抗性相关基因在受伤局部和系统部位的协调表达过程中的核心地 位。然而，我们对莱莉酸信号转导这一复杂而精细的过程本身的认识尚处 于初级阶段，与其它植物激素的信号转导途径相比，茉莉酸信号转导的许 多重要组分都尚待采用更切实有效的实验手段进行鉴定。然而，多家实验 室借鉴“五大经典”植物激素研究的经验，以拟南芥为材料试图通过筛选对 外源茉莉酸的反应发生变化的突变体而鉴定包括茉莉酸受体在内的正向 和负向调控元件，目前的筛选已远远饱和了拟南芥的整个基因组，但仅得 到了上面述及的包括c o i l 在内的有限的几个组分。说明包括其受体在内 的茉莉酸的多数信号传导组分极有可能存在遗传或生化上的冗余或重叠 现象。 根据上述对当前茉莉酸信号传导途径“瓶颈”问题的深入分析，我们采 取一种新颖的“化学遗传学”和传统正向遗传学相结合的策略进一步解析 茉莉酸信号传导途径。所谓化学遗传学，是利用一种小分子化合物在相关 生物学过程中的特殊作用，进而研究相关的生物学过程的方法。它最先在 动物系统中发展起来的，“化学遗传学”手段与传统遗传学( 包括正向和反 向遗传学) 相结合的分析策略正被越来越多地应用于植物研究领域，并在 拟南芥生长素途径，油菜素内酯途径以及细胞内膜蛋白分选( s o r t i n g ) 、 转运( t r a f f i c k i n g ) 过程的研究中取得了突破性的进展( b l a c k w e l l 和z h a o ， 2 0 0 3 ；z h a oe ta 1 ，2 0 0 3 ；z o u h a re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在当前包括拟南芥在内的许多 模式植物的基因组序列已知的背景下，基于化学遗传学的筛选策略较之传 统遗传学方法显示出许多优势，重要的一点是可以避免由于存在多个位点 而无法筛选到突变体的困难。具体来讲，这种策略利用一种特定的小分子 物质( 本研究中采用的b e s t a t i n ) 可以使同类蛋白( 功能同源) 全部失活 出客农韭大学硬士学链论文 的优势，并结合传统遗传学的“突变筛选特定表溅”的好处，打破当前茉 藏酸蕊号传导磅究鹣程 霆甓瓣，签定到篆藕夔爱痰途径懿巍元 孛。 b e s t a t i n 是从链霉菌中摄取得到的种氨肽酶抑制剂。程动物中的大 量研究表明b e s t a t i n 通过提高机体细胞的免疫能力在抑制癌细胞的生长、 扩敬爱鑫巍病治疗方露寿显著凌效。已经得虱证实瓣b e s t a t i n 静靶蛋蠢毽 括氨肽酶n 、氨肽酶b 以及白细胞三烯水解酶等都是依赖于锌离子的焱属 蛋白酶( z n “m e t a l l o p e p t i d a s e s ) ，这些对b e s t a t i n 敏感的金属滋自酶在穗控 梳体免疫系统、癌细胞生长扩散以及细臌内蛋白璇拘选择性降解等过耩中 起重要作用，b e s t a t i n 也因此成为动物中研究这些簸要生物举现象的模式 王吴( s c o m i k 帮b o 如o l ，2 0 0 1 ；s a w a f u j ie ta l ，2 0 0 4 ) 。 b e s t a t i n 用于槭物方面的研究相对较少。1 9 9 5 年，r y a n 研究组报道 b e s t a t i n 可以在番茄中模拟荣莉酸的功效，即强烈诱导包括p i s 在内的抗 毪籀关墓溺筑表达( s c h a l l e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。受这一工 乍的窟发，我们程粥详 尽的遗传学研究证明b e s t a t i n 的这种作用与茉莉酸途径有潞密切关系。 b e s t a t i n 可以诱导菜瓣酸合感突变体s p r 2 孛抗蛙基鞠豹表达缎不毙诱导蒙 精酸信号传导突交体弦f j 中抗往基因的表迭，表明b e s t a t i n 盼作用不依赖 于茉莉酸的生物合成但依赖于c o i l 蛋白的正常功能。b e s t a t i n 强烈激活 装裁酸绩譬途径静 擎雳逛在模焱檀秘羧麓芬申褥n t 验涯。b e s t a t i n 憝够 诱导正常拟南芥植物中茉莉酸途径的标记基因( 鼹伤反应及抗性相关基 因) v s p l ，j r l ，j r 2 等的表达，憾不能诱导c o i l 突变体中这些簇困的表达， 遴一步验谖了b e s t a t i n 的作用依赖于c o i l 。据盏箍淄b e s t a t i n 作雳的鞭点 介于茉莉酸生物合成途径的下游和c o i l 的上游之间，极有可能通过抑制 一个在募藕酸售号传导途径中起负调控馋雳翡蛋鑫戆( 或氨骚薅) 豹援魅 而激活荣莉酸反应，从而诱导抗性相关旗困的表达。进一步踟用拟南芥全 基因组芯片( a f f y m e t r i x ) 通道m i c r o a r r a y 比较了b e s t a t i n 和荣莉酸程转 豢零平土诱导基霞表达鸯冬簧凌，发瑗b e s t a t i n 黎莱瓣酸诱导类经豹菱霆淡 达模式，多数受b e s t a t i n 诱导上调表达的基因也受荣莉酸的诱导表达。避 为有利的怒，b e s t a t i n 和茉莉酸