（生物化学与分子生物学专业论文）dna凝聚态的研究——从结构到功能.pdf

研 的 作 体 由 摘要 摘要 在过去的十几年中，各种各样的脂质体和聚合物与d n a 相互作用后用于基 因转染，已经成为了很热门的研究科目。尽管我们了解的还少，在d n a 传递过 程中我们遇到了特殊的物理和化学的障碍。作为基因转染的一个重要的前 提，d n a 凝聚态受到越来越广泛的关注。d n a 凝聚态特别是d n a 与转染试剂相 互作用的状态对于转染的效率具有很大的影响。 经过适当的热变性后，质粒d n a 的活性会有所增强。琼脂糖凝胶电泳实验 发现热变性后的质粒d n a 会有三种拓扑结构组份共存：共价闭合d n a ；开环 d n a 和热变性d n a 。d n a 凝聚态实验表明热变性质粒d n a 比其它两种组份的 d n a 对亚精胺和p e i 的敏感度更强。用p e i 做载体的基因转染实验证明了热变 性质粒d n a 比未热变性的基因转染效率要高。对热变性d n a 的研究不仅展示 了一种有效增加质粒生物活性的方法，而且还提供了一条通过物理手段提高 d n a 生物活性的一种简便方法。 设计了一种特殊的新型阳离子聚合物p o l y ( p e g m a ) 4 n ，探讨其与d n a 相 互作用及其诱导d n a 凝聚态的相关机制。琼脂糖凝胶电泳检测到 p o l y ( p e g m a ) - 4 n 诱导d n a 发生凝聚态；原子力显微镜( a f m ) 观测到 p o l y ( p e g m a ) 4 n 导致的d n a 凝聚体的微观结构形态。我们推测：聚合物和d n a 的相互作用主要是由于缠绕作用和静电吸引作用。p o l y ( p e g m a ) - 4 n 上的正电荷 通过静电吸引作用和d n a 发生相互作用。由于p o l y ( p e g m a ) 4 n 是一个柔性的 聚合物，所以它可以通过缠绕作用和d n a 发生相互作用。对比这两个作用在 d n a 凝聚过程的贡献，我们认为在p o l y ( p e g m a ) - 4 n 所诱导的d n a 凝聚态中， 缠绕作用比静电作用发挥了至关重要的作用。 模拟酶( 人造锌指蛋白) 的研究具有重要的科学意义，其相应的应用前景 也十分地广阔，是未来人类基因治疗的重要性工具之一，我们利用超分子化学相 关方法合成了仿锌脂蛋白。通过核磁，圆二色光谱，质谱等手段表征了它的结 构，进一步用琼脂糖凝胶电泳实验研究了模拟化合物与质粒d n a 的相互作用， 证明了化学模拟的锌指结构具有结合d n a 的能力，探讨了生物大分子间的相互 作用。 摘要 关键词：热变性d n a 阳离子聚合物d n a 凝聚态基因转 i i a b s t r a e r t a b s t r a c r t t h eu s eo fv a r i o u ss y n t h e t i cl i p i d sa n dp o l y m e r st od e l i v e rd n af o rg e n et r a n s f e c t i o n a p p l i c a t i o n sh a sb e e nt h es u b j e c to fi n t e n s ee x a m i n a t i o nf o rt h el a s t15y e a r s o u r u n d e r s t a n d i n go ft h ep r o c e s s e si n v o l v e di nt h ed e l i v e r yo fd n a ，a l t h o u g hs t i l ll i m i t e d ， c a l lb ed e s c r i b e di nt e r m so fs p e c i f i cp h y s i c a la n dc h e m i c a lb a r r i e r se n c o u n t e r e d a l o n gt h ed e l i v e r yp a t h w a y a st h er e q u i s i t i v e f o r g e n et r a n s f e c t i o n , d n a c o n d e n s a t i o nr e c e i v e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s d n ac o n d e n s a t i o n s t a t u s ，e s p e c i a l l y t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n d g e n et r a n s f e c t i o nr e a g e n t s ， i n f l u e n c e st h eg e n et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y am e t h o dt oi n c r e a s et h eb i o a c t i v i t yo fp l a s m i dd n a b yh e a tt r e a t m e n th a sb e e n d e v e l o p e d e l e c t r o p h o r e s i sa s s a ys h o w e dt h a tt h eh e a tt r e a t e dd n a c o n s i s t e do ft h r e e c o m p o n e n t s ：t h es u p e r c o i l e dd n a ( c o m p o n e n ti ) ，t h eo p e nc i r c u l a rd n a ( c o m p o n e n t i i ) a n dt h eh e a td e n a t u r e dd n ac o m p o n e n t d n ac o n d e n s a t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e d t h a tt h eh e a td e n a t u r e dd n a c o m p o n e n to w n e dh i g h e rs e n s i t i v i t yt o s p e r m i d i n ea n d p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e i ) t h a nc o m p o n e n tia n dc o m p o n e n ti id n a g e n et r a n s f e c t i o n e x p e r i m e n t 谢t 1 1p e ii n d i c a t e dt h a tt h eh e a t t r e a t e dd n a h a dh i g h e rg e n et r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c yt h a nu n t r e a t e dd n a o u re x p e r i m e n tn o to n l ys h o w sa ne f f e c t i v ea p p r o a c h t oi n c r e a s et h e b i o a c t i v i t yo fp l a s m i dd n ab u ta l s ol e a d saw a yt oi m p r o v et h e b i o a c t i v i t yo fd n ab yp h y s i c a l l ym o d i f y i n gt h e i rs t r u c t u r e w es y n t h e s i z e dac a t i o n i cp o l y m e r , p o l y ( p e g m a ) - 4 n d n ac o n d e n s a t i o ni n d u c e d b yp o l y ( p e g m a ) 一4 nw a si n v e s t i g a t e dt h r o u g he l e c t r o p h o r e s i sa s s a yb yi t sa b i l i t yt o r e t a r dd n a m o b i l i t ya n dt oi n h i b i th i n d l i ie n z y m ec l e a v a g e t h ed e t a i l e ds t r u c t u r e s o fd n ac o n d e n s a t e si n d u c e db yp o l y ( p e g m a ) - 4 nw e r eo b s e r v e dt h r o u g ha t o m i c f o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) i n t e r a c t i o n sb e t w e e np o l y m e r sa n dd n aa r e m a i n l y a t t r i b u t e di n t od e p l e t i o ne f f e c ta n de l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n p o s i t i v e l yc h a r g e da n l i n o g r o u p si np o l y ( p e g m a ) - 4 ni n t e r a c tw i t hd n at h r o u g he l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n , a n d a b s t r a c r t d e p l e t i o ne f f e c ta l s ot a k e se f f e c tb e c a u s ep o l y ( p e g m a ) 一4 ni saf l e x i b l ep o l y m e r c o m p a r i n gt h ec o n t r i b u t i o n st h a tt h et w oi n t e r a c t i o n sg a v ei nd n ac o n d e n s a t i o n p r o c e s s ，w ef o u n d t h a t d e p l e t i o ne f f e c tp l a y e dam a j o rr o l ec o m p a r e d 、析m e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n a c c o r d i n g l y , a r t i f i c i a lz i n cf i n g e rp r o t e i ni sb r o a d l yu s e da n dh i g h l yv a l u e df o r s c i e n c er e s e a r c h ，b i o m e d i c i n ea n dc l i n i ct h e r a p y , e x p e c i a l l yf o rg e n et h e r a p y , w h i c h m a yb e c o m et h er e v o l u t i o n a lt o o li nf u t u r e w es y n t h e s i z ea r t i f i c i a lz i n cf i n g e rp r o t e i n b ym e t h o d so fs u p r a m o l e c u l a rc h e m i s t r y f u r t h e r m o r e ，t h es t r u c t u r ew a sv a l i d a t e db y s o m em e t h o d ss u c ha s ：m 砒、c d 、m a s ss p e c t r u m ，e t c t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n a r t i f i c i a lz i n cf i n g e rp r o t e i na n dd n aw a ss t u d i e db ya g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s a s s a y t h i sr e s e a r c hp r o v e dt h a tt h ea r t i f i c i a lz i n cf i n g e rp r o t e i nw a sa b l et oc o m b i n e w “hd n a k e yw o r d s ：h e a td e n a t u r e dd n a ；c a t i o np o l y m e r ；d n ac o n d e n s a t i o n ；g e n e t r a n s f e c t i o n ；a r t i f i c i a lz i n cf i n g e rp r o t e i n i v 1 2 1 病毒载体转移体系研究现状4 1 2 1 1 逆转录病毒载体5 1 2 1 2 腺病毒载体5 1 2 1 3 腺相关病毒载体5 11 2 1 4 慢病毒载体一5 1 2 1 5 单纯疱疹病毒载体6 1 2 2 非病毒转移体系研究现状6 1 2 _ 2 1 常用载体6 1 - 2 2 2 非病毒基因载体转染过程中常见的障碍1 0 第三节研究课题的提出1 7 1 3 1 目的和意义1 7 1 3 2 研究方法1 7 第二章热变性后d n a 对基因转染的影响1 8 第一节主要试剂、材料与仪器1 8 v 目录 ：1 l i ：! o ：! c i ：1 1 。：1 1 ：! ：! ：2 ￥l 2 2 4 热变性d n a 退火实验和电泳检测箱 2 2 5 热变性d n a 的a f m 观测2 5 2 2 6 对亚精胺诱导热变性d n a 的凝聚态进行琼脂糖凝胶电泳分析2 5 2 2 7 对p e i 诱导热变性d n a 的凝聚态进行琼脂糖凝胶电泳分析2 5 2 2 8 热变性d n a 的2 9 3 t 细胞转染实验2 6 2 - 2 9 转染结果的检测2 6 第三节实验结果与讨论2 7 2 3 1 热变性质粒d n a 的琼脂糖凝胶电泳分析2 7 2 3 2 利用琼脂糖凝胶电泳分析热变性质粒d n a 的复性实验2 8 2 3 3 对热变性质粒d n a 原予力显微镜的观测2 9 2 3 4 亚精胺和p e i 所诱导热变性质粒d n a 的凝聚态 2 3 5 基因转染实验结果分析3 3 第四节结论3 4 第三章p o l y ( p e g m a ) - 4 n ( p 4 n ) 所诱导的d n a 凝聚态的研究。3 6 第一节实验材料和实验仪器3 6 3 1 1 试剂和材料3 6 3 1 2 主要仪器 3 1 3 常规溶液3 8 第二节实验方法3 9 3 2 1 聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯( 1 ，p o l y ( p e g m a ) ) 的合成3 9 3 2 2p 4 n ( p o l y ( p e g m a ) - 4 n ) ( 2 ) 的合成3 9 v i 目录 3 2 3 质粒的提取柏 3 2 4p 4 n 诱导质粒d n a p e g f p - c 2 和入- d n a 凝聚态和抗酶切的琼脂糖凝聚电泳舵 3 2 5p 4 n 与三种d n a 结合的紫外可见光谱与圆二色谱分析试验4 2 3 2 6 原子力显微镜( a f m ) 观测“ 3 2 7n i h 3 t 3 细胞转染实验“ 第三节实验结果与讨论4 6 3 3 1d n a 载体合成舶 3 3 2p 4 n 诱导质粒d n a p e g f p c 2 和入d n a 凝聚态和抗酶切的琼脂糖凝聚电泳舶 3 3 3p 4 n 与三种d n a 复合物的紫外可见光谱结果5 1 3 3 4p 4 n 与质粒d n a 和入d n a 复合物的圆二色谱分析结果5 5 3 3 5a f m 观测d n a 凝聚5 7 3 3 6 基因转染结果弱 第四节结论5 9 第四章基于伊环糊精包合物的锌指模型化合物合成及其与d n a 的 作用研究 6 0 第一节主要试剂、材料与仪器6 1 4 1 1 试剂与纯化6 1 4 1 2 实验仪器6 2 第二节实验方法6 3 4 2 1 单- ( 6 一对甲苯磺酰基) 一p 环糊精( 简称6 - o t s - p c d ) 的合成6 3 4 2 27 , - - 胺6 一位单取代的d 一环糊精( 简称6 - e n - p c d ) 的合成6 3 4 2 3 苄氧羰基保护胱氨酸( 简称z - l - c y s ) 的合成6 5 4 2 4 苄氧羰基保护胱氨酸桥联d - 环糊精( 简称z - l - c y s - b i s - ( 6 一e n - p c d ) s ) ( b 1 ) 合成6 5 4 2 5 甲氧基保护组氨酰- 1 - 金刚烷( 简称h i s o m e - a d ) ( b 2 ) 的合成6 5 4 2 6 包合物b 3 的制备( 简称h i s a d c y s b i s e n c d ) 6 6 4 2 7 配合物b 4 的制备( 简称z n h i s c y s c d ) 6 6 4 2 8b 4 与质粒d n a 的相互作用以及琼脂糖凝胶电泳检测6 6 第三节实验结果与讨论6 7 v l i 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果。 v i i i 存在状态也是生存所必须的。最经典的生物是t 4 噬菌体，其d n a 被包裹在噬 菌体的头部，这时候d n a 的外半径进为5 0 n m ，是伸展状态下半径的二十分之 一，体积缩小了近1 0 0 0 0 倍。这就是生物进化出来的高效d n a 凝聚状态，对这 种令人惊讶现象的研究有助于我们进一步克服基因转染和进一步对病人进行基 因治疗中所遇到的困难。我们已经能够直观的观察到了噬菌体d n a 的凝聚现象， 这样的现象不仅仅发生在病毒中，在原核和真核生物中也是很常见的。遗传物 质凝聚态可以有效保持d n a 的稳定性，其中参与凝聚的细胞内物质有很多，例 如：多价阳离子、蛋白质等因子，它们对生物体中遗传物质的凝聚起到至关重 要的作用1 1 。 现在对d n a 凝聚态的研究主要目的是为了设计出更好的促进d n a 凝聚的 转染试剂。由于病毒基因载体的安全性问题导致了很多科学家开始进行人工合 成基因载体的研究。我们可以通过对d n a 凝聚后状态和对导致凝聚现象出现的 物质进行研究，进而使d n a 凝聚现象得到进一步应用。 1 1 2d n a 凝聚态的观测 d n a 凝聚态虽然微小，但是还在我们人类可以观测的物理尺度内。人们已 经可以用很多种技术来观测和研究d n a 凝聚态了，其中包括：电子显微镜 ( e l e c t r o nm i c r o s c o p y ) 、动态光散射( d y n a m i cl a s e rl i g h ts c a t t e r i n g ) 、粘度测定法 径一般为8 0 一l o o n m 左右，绕直径l o o n m 的环形d n a 一圈需要9 3 0 个碱基对。 环形状态是最常见的d n a 凝聚态，但是在其他的溶液环境下，d n a 也可以凝 聚成非环形，例如：棒状( r o d ) 、球形( s p h e r o i d ) 、花型( f l o w e r - s h a p e d ) 和蝶形 ( d i s k l i k e d ) t 8 1 等。在醇类溶液中，六氨合钴阳离子可以诱导d n a 形成棒状结构【9 1 。 1 1 4 常用诱导d n a 凝聚的试剂 凝聚试剂作用的方法是不同的。有的凝聚试剂是通过中和d n a 分子骨架上 磷酸盐的复电荷来降低d n a 片段间的排斥力；有的则是通过改善d n a 表面水 分子的极性；有的使d n a 局部弯曲或扭曲；有的通过降低d n a 和溶剂之间的 相互作用来达到凝聚的效果。 1 1 4 1 多价阳离子 对于高分子量的d n a ，加入多价阳离子以后会导致d n a 凝聚成为高度有 序和致密的环形结构。在阳离子水溶液中，通常正三价或者更高价态的阳离子 可以顺利的诱导d n a 凝聚。常用的高价阳离子凝聚试剂包括亚精胺、精胺【1 0 1 、 【1 1 1 和c o ( n h 3 ) 6 3 + 1 1 2 1 、1 1 3 1 。人们利用光散射实验研究了不同价态的阳离子对d n a 2 第一章引言 凝聚态的影响，例如钠离子、镁离子等，发现不同的阳离子对d n a 骨架上磷酸 根的负电荷中和能力有所不同，高价的阳离子更容易诱导d n a 发生凝聚【1 4 】。在 室温下，二价金属离子的水溶液不能诱导d n a 凝聚。除非在特殊的环境下才可 以，比如在水和醇类混合物中二价金属离子可以完成d n a 的凝聚5 。18 1 。在体外 环境中，溶液中离子强度的改变将导致d n a 表面电荷密度或溶液的介电常数发 生变化。上述两点与d n a 分子中各部分之间所存在的排斥力有很大的关系。不 同的阳离子可以通过对电荷密度和介电常数的影响产生静电屏蔽作用，进而减 少d n a 分子间的排斥力，促进d n a 凝聚态的产生【1 9 】。 1 1 4 2 醇类 高浓度的乙醇通常可以用于沉淀d n a ，但是通过控制凝聚的条件，我们可 以得到其他形态的d n a 凝聚态【2 0 1 。例如：加入c o ( n h 3 ) 6 3 + 时候，1 5 2 0 的乙 醇也可以引起d n a 聚合，同样条件下甲醇和异丙醇也有同样的效果2 。 1 1 4 3 碱性蛋白 很多种碱性蛋白可以诱导d n a 形成环形或者棒状凝聚态。西班牙科研人员 的研究表明海胆组蛋白h 1 、海参组蛋白f 0 、鸡血红细胞组蛋白h 5 以及鲱精蛋 白对于各种长度的d n a 片段有一定的凝聚效果口2 1 。 1 1 4 4 中性试剂 在高浓度和适当的盐强度共同作用下，中性的聚合物可以诱导d n a 发生凝 聚，典型例子是p e g 。p e g 对d n a 的凝聚作用与体积排斥和静电排斥作用有关 1 2 3 】。科研人员使用荧光显微镜已经观察到了p e g 诱导t 4 d n a 分子产生的凝聚 态【2 4 1 。 1 1 5d n a 凝聚态的生物学意义 越来越多的人开始关注d n a 凝聚态的生物学机制和意义。尤其是在真核生 物中，d n a 凝聚态的程度和重要性都要高于原核生物。在体内多胺参与的d n a 凝聚可以诱导d n a 二级结构发生改变，从而形成特殊的结构。这些结构可能使 空间上不相邻的d n a 序列有相互靠近的机会，为执行特定的生物学功能带来可 能。d n a 凝聚态还是阳离子聚合物基因转染过程中一个重要的步骤，可以使得 3 第一章引言 d n a 在体外免于被核酸酶降解和减少体积促进细胞吸收d n a 。因此d n a 的有 效凝聚可以在一定程度上减少d n a 的降解进一步增加转染效率。 第二节基因治疗( g e n et h e r a p y ) 研究现状 1 2 1 病毒载体转移体系研究现状 基因治疗是从根本上消除各种基因遗传缺陷，治疗疑难病症的重大技术突 破。其具体定义是通过载体将外源基因，基因片断或者寡聚核苷酸引入受感染 的细胞内进行适当的表达，以纠正或改善致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾 病的目的【2 5 1 。随着生命科学迅猛的发展以及人类基因组计划的顺利完成，基因 这个重要的领域被人们发现了。人类的疾病种类很多，其中部分是由后天环境 导致的，也有很多与人类自身基因有千丝万缕的关系。诸如：遗传疾病如血友 病【2 6 】、囊性纤维化鲫、心血管病【2 8 】、神经性【2 9 】、感染性疾病例、创伤【3 1 1 及癌症 【3 2 】等等都与体内基因调控和表达有一定的关系。 因此人们开始进行基因治疗方面的深入研究，以改善人类的健康水平。广 义的基因治疗不仅指单纯的基因修饰，还包括基因阻断、d n a 疫苗、反义药物、 d n a 修饰酶和基于d n a 的免疫调节剂掣3 3 】。d n a 上每个碱基带有两个负电荷， 这样的多的负电荷和细胞膜上的负电荷相互排斥，使得d n a 不能靠近细胞膜， 更阻止了d n a 的进入。对于裸d n a ，它们容易被存在于细胞膜之外的核酸酶 降解，使得它们单独进入细胞膜的可能很小。科学家们想到了通过化学和物理 等方法对d n a 进行修饰和包装，使得它们能靠近和顺利的穿过细胞膜，同时有 抗核酸酶酶切的效果。近年来，很多基因药物被合成出来，它们已经是药物制 剂领域的热点研究方向。目前已经有的基因药物传递方法较多。基因枪、细胞 穿刺、电穿孔、冻融等为物理转染方法。磷酸钙沉淀、高分子聚合物、脂质体 等是通过化学方法来进行基因转染的。病毒和细菌感染属于生物转染法。科学 家最大的愿望是开发无毒和高效的转染系统。目前应用的基因转移体系可分为 4 第一章引言 两大类：病毒载体转移体系和非病毒转移体系。病毒载体转移体系( v i r a ld e l i v e r y s y s t e m ) 是将治疗基因重组进复制缺陷型的病毒载体中，利用病毒对人体细胞的 感染性，将治疗基因导入细胞内的一类方法【3 4 1 。此体系主要包括：逆转录病毒 载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和单纯疱疹病毒载体等f 3 5 1 。 1 2 1 1 逆转录病毒载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结 构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组d n a 中整合了逆转录 病毒结构基因。其优点为对细胞的感染率高；插入的外源基因可以完整地整合； 转染谱广，可同时感染大量细胞并长期停留。 1 2 1 2 腺病毒载体 腺病毒载体是一种无包膜的双链d n a 病毒，长约3 6 k b 。优点：插入d n a 链较长；不需要正在分裂的靶细胞即可原位感染；滴度高，可达1 0 1l 一1 0 1 2 p f u m l ； 可导入各种组织细胞，一般不会整合到宿主的基因组中而大大减少了插入突变 的危险。缺点：缺乏特异性；对造血细胞导入率低；腺病毒不能在细胞内长期 存在，往往需要反复“给药；重复给予时机体可能产生免疫反应3 6 1 。 1 2 1 3 腺相关病毒载体 腺病毒相关病毒( w ) 是一种缺陷型的单链d n a 病毒，只有在辅助病毒 如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等存在的情况下，才能进行最佳复制，产 生新的病毒颗粒，否则只能进行潜伏感染【3 6 1 。其优点是无致病性，不会引起免 疫反应；宿主范围广，既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞，在宿主体 内以定向整合的方式存在；对各种理化处理稳定；载体构建简单易行。主要的 缺点是感染效率低；所携带的外源基因容量小等1 3 7 , 3 8 】。 1 2 1 4 慢病毒载体 目前研究较多的是来源于h i v - 1 的慢病毒载体。h i v 载体具有诸多优点： 能感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、基因持续表达、免疫反应 小等特点。而且h i v 载体可以感染一些用其他载体较难进行转基因的组织，并且 5 第一章引言 不会引起明显的免疫反应【3 6 1 。 1 2 1 5 单纯疱疹病毒载体 此种载体是一种双链d n a 病毒，长达15 2 k b 。优点：容纳外源基因的长度 达4 0 5 0 k b ，是目前容量最大的病毒载体；具嗜神经性，可在神经元中建立终生 潜伏性感染，非常适用于神经系统疾病如帕金森氏病等；滴度高；可感染分裂 期和非分裂期细胞。缺点在于其细胞毒性、安全性有待确认【3 8 1 。 1 2 2 非病毒转移体系研究现状 非病毒基因转移体系( n o n v i r a ld e l i v e r ys y s t e m ) 是应用物理和化学的方法，将 质粒d n a 导入人体细胞，使其表达出蛋白质，而达到治疗目的的一类方法。它 可容的基因长度大；质粒构建简单，不易引起插入突变和免疫应答，比较安全； 但其基因转移效率低。理想的非病毒型基因载体必须具备以下特点：安全、低 毒、具有良好的生物相容性，在体内可被降解；具有靶向功能；可与d n a 紧 密结合，保护其免受核酸酶降解；可促进细胞对d n a 的吸收，并辅助d n a 逃离溶酶体；载体还应具有核定位功能，可促进d n a 进入细胞核。 1 2 2 1 常用载体： 目前，非病毒型载体主要有脂质体( 1 i p o s o m e ) 和阳离子聚合物( c a t i o n i c p o l y m e r ) 。它们自身的电荷都有所不同，但都是通过静电相互作用与d n a 发生 结合反应，可保护d n a 免受核酸酶降解。它们的种类繁多，在自身组成、性质 和转染机制等方面的特点各不相同。 1 2 2 1 1 脂质体和d n a 的复合物 脂质体( 1 i p o s o m e ) 是具有双层膜的封闭式粒子，其介导d n a 进入细胞主要 是利用脂质体能促进极性大分子穿透细胞膜的原理。脂质体d n a 复合体形成的 过程受多种类型的弱分子力所控制，除了占主要地位的静电作用外，还包括离 子键、氢键、疏水性作用和溶剂排除力等。利用磷脂具有亲水头疏水尾可在水 溶液中形成双分子层球体( 脂质体) 的特点，将d n a 用脂质体包裹起来，它们 6 第一章引言 可以通过与细胞膜的融合进入细胞核并使d n a 免受核酸酶的降解。脂质体的主 要优点如下：1 ) 脂质体与基因的复合过程容易；2 ) 易于大量生产；3 ) 脂质体 与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒，无免疫原性；4 ) d n a 或r n a 可得到保护，不被灭活或被核酸酶降解；5 ) 体外和体内试验都表 明，接近染色体大小的d n a 片段也能被转运至宿主基因组中并增长；6 ) 转染过 程方便易行，重现性好。根据脂质体包裹d n a 的方式不同可将脂质体分为阳离子 脂质体、阴离子脂质体、p h 敏感脂质体等。 1 2 2 1 1 1 阳离子脂质体 阳离子脂质体( c l s ，又称c y t o f e c t i o n s ) 中的正电荷分子由三个基本部分构 成：带正电荷的极性头部、疏水锚着区和连接极性与非极性区域的连接键。极 性头部是脂质体与d n a ，细胞膜和细胞内其他组份相互结合的关键部位。大部 分阳离子极性头部都包含胺类基团。阳离子脂质体的疏水锚着区域不仅对转染 有显著影响，且与阳离子脂质体的细胞毒性有关，阳离子脂质体疏水锚着链长 度对转染率的影响很大程度上取决于另外两个区域的物化特征【3 9 1 。连接键决定 了阳离子脂质体的化学稳定性及被生物降解的能力【4 0 1 。大多数阳离子脂质体中 都应用了中性脂d o p e 。d o p e 是形成稳定单脂双层阳离子脂质体所必需的，同 时具有促膜融合作用，可以增加脂质膜的不稳定性，促进复合物被释放入胞浆。 虽然阳离子脂质体的转染效率较高，但是它仍然有缺陷。主要有：1 ) 脂质 体和d n a 的包装效率并不是完美的，还是有部分d n a 在外界核酸酶的作用下 降解。2 ) 脂质体的外表面电荷的非均一性可能造成与d n a 的复合物体积过大， 在高浓度下发生聚合。3 ) 带有大量正电荷的复合物会对细胞引起一定的毒副作 用，而且会被血红蛋白和巨噬细胞降解【3 3 1 。 1 2 2 1 1 2 阴离子脂质体 可以将磷脂酰丝氨酸( d p p s ) 或含5 0 - - 棕榈磷脂酰甘油( d p p g ) 的脂 质制成阴离子脂质体。此种脂质体可以将寡聚核苷酸转运至细胞中。由于磷脂 和寡聚核苷酸均带负电荷，必须在脂质体中加入钙离子才能提高包装效率，而 7 第一章引言 且对所包d n a 分子的大小有严格的限制【4 1 1 。 1 2 2 1 1 3p h 敏感脂质体 p h 敏感脂质体是一种具有细胞内靶向和控制药物释放的功能性脂质体。其 可由二油酰胆碱( d o p e ) 、胆固醇、油酸以4 ：4 ：2 ( 摩尔比) 组成。作用原理 是当p h 较低时，它可以导致脂肪酯羧基的质子化并引起六角晶相的形成，从而 导致膜融合的发生。在酸性条件下，内涵体形成后和进入溶酶体之前，p h 从7 4 降到至5 3 6 3 ，这个时候p h 敏感脂质体膜发生结构改变，脂质体膜与内涵体 膜融合，将内含物导入胞浆3 2 1 。 1 2 2 1 2 阳离子聚合物和d n a 的复合物 阳离子聚合物是通过电荷相互作用与带负电荷的d n a 分子形成聚电解质复 合体( p o l y p l e x ) 。复合物通过内吞或者内噬作用进入细胞，而且由于阳离子聚 合物与d n a 紧密结合导致d n a 具有部分的抗酶切作用，有利于进一步的基因 转染。阳离子聚合物带正电荷的部分，包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺，以及其 它带正电荷的基团如脒基等可位于聚合物骨架、侧链低聚物等位置，在生理条 件下与d n a 分子通过静电作用形成复合物【3 3 1 。聚合物有直线型、分支型、枝状 等结构。由于聚合物化学性质的灵活性，聚合物基因载体可包含高效基因转移 所需要的多种功能，同时具有生物相容性好、制备简单、组成稳定等特点。因 此阳离子聚合物在应用于人类基因治疗中具有很大的潜力。近年来各种天然和 合成的阳离子高分 近年来各种天然和合成的阳离子聚合物用作基因传递系统m 】，包括p e i t 4 5 1 、 聚酰胺胺树形高分子( d e n “r n e r ) 【4 6 】、脱乙酰壳多糖( c h i t o s a n ) 4 7 1 、明胶4 引、阳离 子多肽【4 9 】、阳离子聚酯5 0 1 、阳离子聚磷酸酯【5 i 】、聚乙烯基吡啶盐、聚( - - e p 氨基) 乙基甲基丙烯酸酯等。 1 2 2 1 2 1 聚乙烯亚胺( p e i ) 聚乙烯亚胺( p e i ) 是目前研究最广泛的阳离子，而且是转移效率最高的聚合 物之一，1 9 9 5 年由b e h r 等第一次用于基因载体的研究【5 2 】。当溶酶体内的p h 下 8 第一章引言 降时，p e i 通过质子海绵效应大量地捕获质子，引起氯离子内流，导致溶酶体渗 透性增强，即使无其他因子的辅助作用，也可以使溶酶体破裂，促进d n a 释放 到胞质。 p e l 分子的高电荷密度，虽然可以更有效的与d n a 分子复合，但是大量正 电荷给细胞带来了较高的细胞毒性。高细胞毒性和生物不可降解性限制了这类 p e i 聚合物用于体内基因转移【5 3 】。 由于p e i 的毒性和无靶向性，人们开始通过各种方法对p e i 进行改进和修 饰。p e i 和聚乙二醇( p e g ) 接枝后，可以减少其毒性，但是转染的效率变化不 大【列。p e g 相对分子质量大于5 0 0 0 时，修饰后的p e i 与d n a 复合物的毒性显 著降低，当小于5 5 0 时，复合物的毒性改善不明显。将低分子量p e i ( 1 8 0 0 ) 用可 降解的交联剂连接后，可以得到易于降解的p e i 聚合物。它们的毒性比单体低， 转染效率介于p e i ( 1 8 0 0 ) 和p e i ( 2 5 0 0 0 ) 之i h - 5 5 1 。p e i 上还可以连接靶向物质进行 转染。例如：叶酸( f a ) 接枝p e g p e i 共聚物( f a p e g p e i ) 可有效复合d n a ，当 f a p e g p e i 与d n a 的重量比达1 时，复合物的传染效率率最甜5 6 1 。 1 2 2 1 2 2 聚左旋赖氨酸( p o l y - l l y s i n e ，p l l ) 聚左旋赖氨酸( p l l ) 中的伯胺基有较强的质子化能力，可通过静电作用与带 负电的d n a 结合 5 7 1 。由于低分子量的p l l 电荷密度小，但是高分子量p l l 的 细胞毒性大，所以对p l l 进行表面修饰和连接靶向性配体可以提高其转染效率。 p l l ( 相对分子质量为2 8 5 0 0 ) 与p e g 共聚得到的p l l p e g 可以有效降低细胞毒 性【5 8 】。p l l 也可以接上靶向性单元进行基因转染。将动脉壁结合肽与用p e g 修 饰过的p l l 连接，得到靶向动脉壁细胞的基因治疗载体。该载体与p l l 和p e g 修饰过的p l l 相比，对牛动脉内皮细胞和平滑肌细胞的转染效率均可提高1 5 0 - 1 8 0 倍【5 9 1 。 1 2 2 1 2 3p a m a m 树状大分子 聚酰胺- 胺型( p o l y a m i d o a m i n e ，p a m a m ) 树状大分子是目前研究最广泛的树 状大分子之一，具有分子量确切、分子内空穴广阔、反应活性良好等优点 6 0 】。 9 第一章引言 p a m a m 的末端为氨基，使其在生理p h 条件下为聚阳离子，能有对各种细胞进 行基因转染，而不会给细胞带来较大的毒性。由于有大量的仲胺和叔胺，p a m a m 转染的机制和质子海绵类似。h a e n s l e r 和s z o k a 最先用p a m a m 作为基因载体， 发现第6 代的p a m a m 比其他代数的基因转移效率高出约1 0 倍【6 。 1 2 2 2 非病毒基因载体转染过程中常见的障碍 在d n a 传递过程中我们遇到了特殊的物理和化学的障碍。成功的d n a 传 递包括避免物质在细胞外失活和最初的细胞表面的相互作用。通过内吞作用使 得d n a 传递系统在细胞内化，这样的内化将导致非传统意义上的内涵体通行路 径。如果d n a 不能从内涵体中逃出，那么这种路径将使治疗性的d n a 在溶酶 体中降解。小片段可以从小泡的通行路径中逃脱，细胞胞液给d n a 进入细胞核 带来了更多的物理和代谢障碍。最终，细胞核的障碍是基因传递过程中最重要 的一个障碍。 对于有效的非病毒载体系统来说，这些障碍主要是：1 ) d n a 和它的载体在 细胞外的物理和化学的稳定性。2 ) 细胞内吞作用导致的吸收。3 )