体内药物分析重点

第一章 绪论1体内药物分析（pharmacetical analysis in biological sample）:一门研究生物体内中药物及其代谢产物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学科。2、任务：（1）进行分析技术、分析方法学研究，提供最佳分析条件。（2）为药物体内研究提供数据（3）服务于临床治疗药物监测，参与指导临床科学用药。（4）内源性物质的测定和研究（5）滥用药物的检测。3、特点：（1）生物样品中干扰物质多；（2）生物样品量少，不易重新获得；（3）分析方法要求高；（4）、实验室仪器设备要求高；（5）、测定目标与数据处理复杂；（6）、工作量大：个体差异；数据量大。4、热点问题；（1）游离型血药浓度测定方法的研究（2）代谢物的监测与研究（3）对映体药物的检测与研究（4）体内微量元素的测定与研究（5）中药药物代谢动力学研究（6）方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究（7）分析新方法、新技术的联用研究（8）体内药物分析方法的质量控制研究（9）单克隆抗体类药物的体内过程研究。第二章体内药物分析相关的理论基础概述 第一节 药物的体内过程一、药物的吸收（Absorption）：药物由给药部位未经化学结构变化而直接进入血液循环系统的过程。1、吸收速率：药物理化性质（脂溶性、解离度）、药物转运类型、给药途径、药物剂型、吸收部位的血流状况 、药物浓度2、药物的吸收部位：胃肠道吸收胃吸收（1）非离子扩散方式吸收与分子状态的脂溶性相关（2）pKa相近时，脂溶性大者吸收快（3）酸性药物易吸收（4）滞留时间短(5)吸收量有限。小肠吸收(1)停留时间长(2)吸收面积大(3)主要部位碱性药物。影响胃肠道吸收的因素: 剂型及理化特性、 食物、胃肠道的功能状态、药物的首过效应 、药物相互作用。剂型与理化特性:相同药物不同剂型，吸收速度和程度不同。普通片、缓释片、分散片。食物：一般可延缓药物的吸收，但不影响吸收总量不同食物的pH值、脂溶性、纤维含量以及对胃肠道的刺激程度，都将使药物的吸收增加或减少。胃肠道功能状态：胃肠道血流量、粘膜分泌物量、胃排空速率：一般胃排空慢，吸收速率下降、溶解度差的药物，蠕动减慢有利于吸收n 药物的首过效应（First Pass Effect） 药物在经肠道吸收首次进入肝脏时，药物可被肠液或肠壁上的肠菌酶或在肝内受到微粒体混合功能氧化酶的影响，使进入体循环的药量减少，这种现象称为首过效应。如：二氢吡啶类药n 药物相互作用 含二价或三价金属离子（钙、镁、铁、铋、铝）的药物若与四环素类、喹诺酮抗生素等同服胃肠道内形成难溶解性络合物吸收减少二、药物的分布（Distribution） 药物从给药部位吸收进入血液后，再由血液透过各种生理屏障向机体各部位可逆转运的过程称为分布 。为了得到药物分布的资料，必须测定其在不同组织中的浓度，这些数据往往只能从动物试验获得。主要探讨影响药物在组织的分布速度和程度的因素，包括以下四方面。1、药物的结构与性质1）药物血液循环分布于组织间质液或细胞内液由于细胞内pH（一般为7.0）稍低于细胞外液（一般为7.4）1）弱酸性药物不易扩散进入内液，在细胞外液的浓度稍高2）同理，有机弱碱性药物在细胞内液中浓度稍高2）由于水溶性及解离型药物必须依靠特异性主动转运机制才能跨膜进入细胞，故多数药物大部分分布在细胞外液3）与血浆蛋白或组织蛋白结合的药物更不能进入细胞，而游离型、未解离的脂溶性药物或能与细胞内组分结合的药物，可分布于细胞内D + PDP D: 药物 P: 蛋白 DP：药物-蛋白结合物结合特性：可逆性、 非共价键 、非特异性 药物进入体内后，大多数能与生物大分子，特别是血浆蛋白（主要是白蛋白、a1-酸性糖蛋白和脂蛋白）存在不同程度结合。由于只有游离型药物才能透过细胞膜屏障，所以与血浆蛋白的结合直接影响药物在体内的分布。 药物的血浆蛋白结合率（Plasma Protein Binding Ratio，PPBR ）Cb/Ct=PPBRPPBR在01之间，比值大于0.9，表示高度结合；小于0.2者，则与血浆蛋白结合很低。 意义：是临床合理用药依据的药物体内重要参数之一，为新药审批必须申报的研究资料。三、药物的生物转化-药物代谢药物的生物转化（biotransformation）又称为药物代谢(metabolism)，是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程。药物代谢是机体对药物（视为外来异物）进行化学处置的一个不可缺少的重要环节，是机体的自我保障功能。药物多为亲脂性有机化合物，难以从肾小球滤过、滤过的药物易于被肾小管重吸收。机体通过生物转化将亲脂性的药物变成极性较强、更易于由肾脏排泄的产物代谢物。（一）药物代谢的反应类型及过程1药物代谢的化学途径及部位2药物代谢的反应类型及特性1）相反应（phase I reactions）氧化还原水解2）相反应结合反应（Conjugation）药物代谢的化学途径及部位：药物代谢主要在肝内进行，也发生在血浆、胃肠道、肺、皮肤、肾脏或其他组织细胞。绝大多数药物代谢均是细胞内特异的酶催化反应。（ 肝微粒体混合功能氧化酶）药物代谢的反应类型及特性：药物代谢反应包括： 相代谢和相代谢反应。相代谢反应（phase reactions）在药物结构中引入羟基、羧基极性基团，增加水溶性，以利于药物经泌尿和消化系统排泄。相代谢反应（phase reactions）：相代谢产物再与体内的一些内源性化合物结合，生成极性更大的新的代谢物从尿液中排出体外。相反应（phase I reactions） ：相代谢反应主要包括：1）氧化：碳原子氧化（甲苯磺丁脲）、羟基化（苯妥英）、脱烷基氧化（丙咪嗪）、N-和S-氧化（氯丙嗪）2）还原：华法林的酮基被还原成醇基 3）水解：普鲁卡因水解生成对氨基苯甲酸 相反应结合反应（Conjugation）：相代谢反应包括：1）葡萄糖醛酸2）硫酸3）甘氨酸4）谷胱甘肽5）S-腺苷甲硫氨酸 6）乙酰CoA 主要反应：葡萄糖醛酸结合和硫酸结合（非那西丁）乙酰化反应乙酰CoA（类似结合反应）注意：乙酰化极性降低，不利于排泄（异烟肼）（二）药物代谢产物的药理活性药物通过生物转化环节可以产生四个方面的药理结果：1有药理活性的药物转化成无活性物质2无药理活性的（前体）药物（Pro-Drug）转变为有活性的代谢产物3药物的药理作用类型发生改变4产生有毒物质（三）影响药物代谢的因素影响药物代谢的因素主要是：生理、病理及药物相互作用三个方面具体体现：1药物代谢的个体差异性2年龄和性别对药物代谢的影响3药物相互作用对药物代谢的影响4疾病对药物代谢的影响 四、药物的排泄（Elimination）：药物的排泄：药物及其代谢物从体内被清除的过程。 排泄器官肾、肝、胆、肠、肺及外分泌腺等。 最主要肾排泄和肝胆排泄途径五、药物体内过程研究方法与体内药物分析的关系一）生物效应法研究药代动力学：1.药物累积法2.药理效应法3.微生物指标法。（二）体内药物浓度法研究药代动力学。（三）体内和体外相结合的模式研究药代动力学。 第二节 血药浓度与临床效应 一、 药物临床效应的个体差异性时效曲线与药时曲线的关系游离型药物浓度与药效的关系：血药浓度作为间接反应受体部位药物浓度的指标。只有游离药物才能达到受体部位，游离药物浓度才真正与药物的药理效应乃至毒副反应关系密切。3. 影响血药浓度的因素 药代学因素（吸收、分步、代谢、排泄）、机体因素（年龄、性别、肥胖、肾功能损害、心脏疾患、药物的相互作用）、药物间相互作用 第三节 血药浓度与治疗药物监测一、血药浓度的临床意义：1、根据血药浓度可间接推测药物的药理作用强度；2、血药浓度可用于推算药物代谢动力学参数；治疗药物监测的临床意义：诊断和处理药物过量中毒，指导临床合理用药二、血药浓度的临床应用 （一）根据血药浓度选择适当的药物（二）根据血药浓度选择适当的给药途径（三）根据血药浓度指导药物剂量的选择（四）根据血药浓度的半衰期确定给药次数三、 治疗药物监测与临床给药方案个体化1 治疗药物监测（TDM）1.1、定义：是通过测定血液或其他体液中的药物浓度，在临床药代动力学原理的指导下，使临床给药方案个体化，以提高疗效、避免或减少毒副反应。1.2、治疗药物监测的目的：治疗药物监测的核心目的是实现合理的给药方案个体化协助诊断和处理药物过量中毒，及进行其临床药理学研究了解患者是否遵医嘱用药，提高用药依从性1.3、治疗药物监测有别于临床药代动力学的研究 特点：血药浓度结果用于调整剂量，设计个体化给药方案一般只监测一次血药浓度，不测药物经时变化浓度监测方法要求快速、简便、准确，以适应临床需求 2、进行治疗药物监测的原则与监测的药物种类2.1.进行治疗药物监测的原则（1）药物有效血药浓度范围狭窄代表药物地高辛、奎尼丁等。（2）药物剂量小、毒性大代表性药物有利多卡因、地高辛等。（3）药物体内过程个体差异大，具有非线性药代动力学特性代表性药物有苯妥英钠、茶碱、水杨酸等。（4）处于某些病理状况（如胃肠道、肝脏、肾脏疾病），应用上述药物治疗时。（5）合并用药有相互作用而影响疗效或有中毒危险时。（6）某些药物的毒副作用表现与某些疾病本身的症状相似，不能明确辩别时代表性药物如地高辛、速尿等。（7）长期用药的患者，依从性差；或产生耐药性；或诱导和抑制肝药酶的活性；以及原因不明的药效变化时。（ 8）常规剂量下出现严重毒性反应时；诊断和处理药物过量中毒；为药物引起的医疗事故提供法律依据时 。2.2.监测的药物种类 ：（1）有强心苷类（地高辛）（2）抗心律失常药（奎尼丁）（3）抗癫痫药（苯妥英）（4）三环类抗抑郁药、抗狂躁药（丙咪嗪）（5）抗哮喘药（茶碱）（6）氨基糖苷类及其他抗生素、抗肿瘤药（庆大, 万古）（7）免疫抑制剂及抗风湿药等（环孢素A）需要指出的是，滥用TDM无疑将造成不必要的浪费，要根据监测的原则和临床指征，确定有无必要进行常规化监测 第三章生物样品与样品制备一、生物样品的种类和存储1、血样:(1）血样的采集 采集部位：静脉（人，动物），动脉或心脏（动物）注意事项：取血后，取下针头，缓慢推出血液。（防止血球破裂使血浆或血清带有颜色）2）血样的制备 全血(whole blood) ：血浆与血细胞混合在一起，往往加有抗凝剂。血浆(plasma) ：全血加入抗凝剂（最常用的为肝素），离心（25003000r/min, 5-10min)得到的上层清液。血清(serum) ：取血后，不加入抗凝剂，待血液静置0.51h后，除去血饼，残余液体离心后得到的上层清液。（3）血样的使用与保存 采取血样后，应及时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能立即测定时，应完全密塞后保存，短期冷藏（4），长期冷冻（-20）保存。切忌反复冻存！（4）注意事项：测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。2、尿液（1）取样（一段时间内的排尿总量）：（2）尿样的使用与保存：采集的尿样应立即侧定。若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯和氯仿，短时冷藏；长时冷冻。（3）目的与用途：用于药物剂量回收，药物肾清除率，药物体内代谢等。4）优缺点： 优点： 1）容易获得，样品量大。 2）健康人尿液中不含蛋白质，不需进行去除蛋白质处理。 缺点： 1）尿液中药物浓度的改变不能直接反应血药浓度，即与血药浓度相关性差。 2）受试者的肾功能正常与否直接影响药物的排泄，因而肾功能不良者不宜采用尿样。 3）婴儿的排尿时间难于掌握。4）尿液不易采集完全。 3、唾液1）唾液的采集：唾液的采集应尽可能在刺激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集。采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后离心分离，取上清液作为药物浓度测定的样品。（2）目的与用途：临床药物监测（与血药浓度相关性好）（3）优缺点 优点：1）可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集，采集时无痛苦无危险；2）有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。缺点：1）唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值只有少数药物是恒定值；2）有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度的分析方法才能检测。4、其它样品：组织：均浆化法，沉淀蛋白质。头发：甲醇提取，酸水解（0.1M HCl），碱水解（1M NaOH）。呼出气体。2.1、生物样品预处理的目的（1） 测定药物的总浓度2） 生物样品介质组成复杂，干扰多，而药物组分是微量的，必须先经过预处理，使纯化、富集。（3）为了适应和符合分析方法的要求。（4）为了防止仪器被污染，提高测定准确度。2.2、生物样品预处理的方法：（1）去除蛋白质：方法一： 调整蛋白质的溶解度使之沉淀 （1）加入与水相混溶的有机溶剂。如乙腈、甲醛、乙醇、丙酮、四氢呋喃等。（2）盐析，加入中性盐，改变溶液离子强度。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠等。3）加入强酸。蛋白质与强酸形成不容性的盐，进而析出。常用酸有：6%高氯酸、10%三氯醋酸、5%偏磷酸等。（4）加入含锌盐和铜盐的沉淀剂。当pH大于pI时，金属阳离子与蛋白质形成不溶性盐沉淀。常用的沉淀剂有：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等。方法二：（5）超滤法（膜过滤法）方法三（6）酶水解法 （最常用的酶：蛋白质水解酶中的枯草菌溶素（pH7.011.0，5060oC）。优点：操作简单，回收率高！缺点：？方法四：（7）加热法（膜过滤法）溶解度（沉淀法）、生物大分子(超滤法)、聚合物：肽键（酶水解法 ）有活性、易变性（加热法 ）2.2、生物样品预处理的方法：（1）去除蛋白质（2）缀合物水解（3）分离纯化与浓缩：（液液萃取法（liquid-liquid extraction, LLE）、固相萃取法（solid phase extraction, SPE）（4） 样品衍生化方法：柱前衍生化、柱后衍生化萃取剂的选择：1、依据相似相容进行选择 不溶于水2、沸点低3、毒性小4、不易乳化5、化学稳定性好6、不影响紫外检测1. 衍生化的目的：便与检测、利于分离2. 衍生化方法的选择：根据分析物结构、分析方法的需要、实验室现有实验设备三、生物样品预处理应考虑的问题：1 药物的理化性质和存在形式 2 待测药物的浓度范围3 药物测定的目的4 选用的生物样品类型5 样品预处理与分析技术的关系。 第四章 体内药物分析方法的设计与评价一、体内药物分析方法汇总1.1光谱分析法荧光分光光度法、紫外-可见分光光度法（导数分光光度法、差示分光光度法、多波长分光光度法） 优点：方法简便、仪器要求低、适用范