（分析化学专业论文）药物、染料及表面活性剂分子与蛋白质的相互作用研究.pdf

i n v e s t i g a t i o no f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i na n dd r u g 、 d y e 、s u r f a c t a n tm o l e c u l e s at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：p e n gm a o s u p e r v i s o r ：p r o f s o n gg o n g w u h u b e iu n i v e r s i t y w u h a n ，c h i n a 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：岛秒 日期：咖年石月【日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名 指导教师 日期：加d 、占、s 日期：z , o l0 、6 、r u - 、 摘要 蛋白质是生物体内最重要的物质之一，它在生命活动中扮演着多种角色，能与许多 其他物质接触并相互作用，行使着重要的生理机能。对蛋白质的研究也一直都是科研工 作者们专注的课题，许多小分子与蛋白都有着密切的联系，例如新药的研发，用于检测 蛋白的染料探针，与人们生活相关的日用品中的表面活性剂组分的改进等，因此小分子 与生物大分子相互作用的研究不仅对从分子水平上揭示生命的奥秘具有重要的意义，并 有助于人们在开发新的产品时提供一定的基础理论支持。 本论文采用荧光光谱法研究了药物小分子与蛋白质相互作用的作用机理；紫外可 见光谱法及光谱修正技术研究了染料分子在蛋白质上的聚集结合反应；荧光探针技术研 究新型g e m i n i 表面活性剂g 1 2 3 1 2 和g 1 2 4 1 2 与蛋白质的相互作用以及体系微环境的 变化等。本文的研究内容主要包括以下三个部分： 一、采用荧光光谱和紫外吸收光谱法研究了牛血清白蛋白( b s a ) 与加替沙星( g t f ) 的相互作用机制。由荧光光谱可知加入g t f 溶液后，b s a 的荧光强度降低，猝灭类型 属于静态猝灭；用s t e m v o l m e r 方程求得不同温度( 1 7 c 和2 5 c ) 下它们的结合常数k a 和结合位点数n ；用热力学方程处理实验数据得到了结合反应的相关热力学参数( a o 、 日和两，判断二者之间主要作用为静电作用；并用三维荧光光谱和同步荧光光谱探 讨了g t f 对b s a 构象的影响。 二、应用微相吸附光谱修正技术研究了曙红y ( e y ) 与牛血清白蛋i 刍( b s a ) 的相互作 用，讨论了离子强度和温度的影响，以及金属离子干扰情况等。结果表明，e y 与b s a 之间的作用符合l a n g m u i r 单分子层吸附，结合产物最大结合数比；- j n e y ：n b s = 5 ：1 ； 计算了不同温度下反应的结合常数k ，发现k 随温度的升高而减小；并测定了蛋白质的 工作曲线，该方法的检出限为2 0m g l 。 三、应用荧光光谱法研究了g e m i n i 表面活性剂g 1 2 3 1 2 、g 1 2 4 1 2 与牛血清白蛋白 ( b s a ) 的相互作用及体系微环境的变化等。g 1 2 3 1 2 和g 1 2 - 4 1 2 均能显著猝灭b s a 的内 源荧光；在不同温度下通过s t e r n v o l m e r 方程和热力学方程处理实验数据，求得了反应 的猝灭常黼，以及相关热力学参数，并初步判断二者主要是通过疏水力相互作用的： 同时采用同步荧光技术考察了g 1 2 3 1 2 和g 1 2 4 1 2 对b s a 构象的影响。以芘为荧光探 针，二苯甲酮为猝灭剂，用稳态荧光探针法，辅以电导率法测定了g 1 2 3 1 2 与g 1 2 - 4 1 2 、强_砰nm馨矿 的临界胶束浓度c m c 观察t g l 2 3 1 2 及g 1 2 4 1 2 溶液中加入b s a 后微极性的变化，并 测定了不同表面活性剂浓度下的胶团聚集数口鲳以及b s a 对口嚣的影响。 关键词：血清白蛋白；加替沙星；曙红y ；g e m i n i 表面活性剂；荧光光度法；紫外可见 分光光度法 a bs t r a c t p r o t e i ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts u b s t a n c e si nl i v i n go r g a n i s m s ；i tc a np l a ym a n y r o l e si nt h el i f ea c t i v i t i e sa n di n t e r a c tw i t hm o u n t so fo t h e rm o l e c u l e s l o t so fm o l e c u l e sh a v e t i g h tc o n n e c t i o n sw i t hp r o t e i n ，f o re x a m p l e ，t h en e wd r u g s d e s i g n ，t h em o l e c u l e sf o rt h e p r o t e i nd e t e r m i n a t i o na n dt h es u r f a c t a n t sw h i c ha r ec o m m o nc o m p o n e n t si no u rd a i l yu s e d g o o d s t h es t u d i e so fp r o t e i nh a v en e v e rb e e n 。s t o p p e d , e s p e c i a l l yf o rt h er e s e a r c ho ft h e i n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sw i t hp r o t e i n ，w h i c hi s v e r ym e a n i n g f u l f o rt h e u n d e r s t a n d i n go fl i f e i nt h i sp a p e r , w eu s e df l u o r e s c e n c es p e c t r at o s t u d yt h em e c h a n i s mo ft h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nd r u ga n dp r o t e i n ；a p p l i e du v - v i ss p e c t r aa n dm i c r o p h a s e a d s o r p t i o n - s p e c t r a l c o r r e c t i o n ( m p a s c ) t e c h n i q u et oi n v e s t i g a t et h ea g g r e g a t i o no fd y em o l e c u l ei np r o t e i n m a c r o m o l e c u l e ；u s e df l u o r e s c e n c ep r o b et os t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng e m i n is u r f a c t a n t a n dp r o t e i n ，a n dt h em i c r o - e n v i r o n m e n tc h a n g eo ft h es y s t e m t h em a i nc o n t e n t so ft h i sp a p e r a r ed i v i d e di n t ot h r e ep a r t s ： 1 、t h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nb e t w e e ng a t i f l o x a c i n ( g t f ) a n db o v i n es e r u m a b u l m i n ( b s a ) w a si n v e s t i g a t e dw i t hu l t r a v i o l e ta b s o r b a n c es p e c t r aa n df l u o r e s c e n c es p e c t r a t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r as h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fb s aw a sq u e n c h e db y g t f ，a n dt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mb e l o n g e dt os t a t i cf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g a c c o r d i n gt o s t e m v o l m e re q u a t i o n ，t h e i rb i n d i n gc o n s t a n t sk aa n dt h en u m b e r so fb i n d i n gs i t e snw e r e c a l c u l a t e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ( 17 ca n d2 5 c ) a f t e ra n a l y z i n ga n dd i s p o s i n gt h ed a t a o ft h ee x p e r i m e n tb yt h e r m o d y n a m i ce q u a t i o n ，t h ec o r r e s p o n d i n gt h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ( a g 、a ha n d 回w e r ea l s oo b t a i n e d t h e - m a i nd o m i n a n ts o r to fb i n d i n gf o r c ei s e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n a tt h es a m et i m e ，t h ee f f e c to fg t fo nt h ec o n f o r m a t i o no fb s aw a s a n a l y z e du s i n gt h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ya n ds y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y 2 、t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ne o s i ny ( e y ) a n db o v i n es e r t l ma l b u m i n ( b s a ) h a sb e e n i n v e s t i g a t e db ym i c r o p h a s ea d s o r p t i o n s p e c t r a lc o r r e c t i o n ( m p a s c ) t e c h n i q u e e yc a nb e i i i a b s o r e do i lt h ep r o t e i nb ye l e c t r o s t a t i cf o r c ea n dt h ea g g r e g a t i o no b e y st h el a n g m u i ri s o t h e m r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea d s o r p t i o nr a t i o n o fe yt ob s aw a sa b o u t5 ：1 ，t h ea d s o r p t i o n c o n s t a n t ( 0w a s2 3 4 x10 5 ( 3 0 ) ，a n dt h ev a l u eo fk d e c r e a s e dw h e nt h et e m p e r a t u r e i n c r e a s e d t h ee f f e c t so fi o n i cs t r e n g t ha n dm e t a li o n so nt h ei n t e r a c t i o nw e r ea l s od i s c u s s e d i nt h i sp a p e r j 氟_ 。：_ t 3 、t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng e m i n is u r f a c t a n t ( g 1 2 3 1 2a n dg 1 2 - 4 - 1 2 ) a n db o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) h a sb e e ni n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y p y r e n ep r o b ew a s u s e dt oi n v e s t i g a t et h em i c r o e n v i r o n m e n to ft h ei n t e r a c t i o n ，a n do b t a i nt h ec r i t i c a lm i c e l l e c o n c e n t r a t i o n ( c m c ) o fg 1 2 3 - 1 2 ( g 1 2 4 1 2 ) a no b v i o u sq u e n c h i n go fb s ab yg 1 2 3 - 1 2 ( g 12 - 4 12 ) w a so b s e r v e d ，a n dt h e q u e n c h i n gm e c h a n i s mw a ss u g g e s t e d a sd y n a m i c q u e n c h i n gp r o c e d u r e t h eb a s i ct h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s ( s u c ha sa g ，ea n da s ) w e r e a l s oc a l c u l a t e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nw a sm a i n l yd r i v e nb yh y d r o p h o b i c f o r c e t h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g ei nb s aw a ss t u d i e db ys y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e a n dt h e c m cv a l u ef r o mu s i n gp y r e n em e t h o dw a sb a s i c a l l yc o n s i s t s n tw i t ht h er e s u l to b t a i n e db y c o n d u c t i v i t ym e t h o d t h ea g g r e g a t i o nn u m b e r 蚴o fg 1 2 - 3 - 1 2 ( g 1 2 - 4 - 1 2 ) d e c r e a s e di n t h ep r e s e n c eo fb s a k e yw o r d s ：s e r u ma l b u m i n ；g a t i f l o x a c i n ；e o s i ny ；g e m i n is u r f a c t a n t ；f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t r y ；u v - v i ss p e c t r o p h o t o m e t r y i v lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll_l 目录 第一章绪论1 1 1 引言：1 1 2 血清白蛋白的结构与功能1 1 2 1 人血清白蛋i 刍( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 1 1 2 2 牛血清白蛋e l ( b o v i ns e r u ma l b u m i n ，b s a ) 2 。 1 2 3 血清白蛋白的功能2 1 3 喹诺酮类药物简介。3 1 3 1 喹诺酮类药物的结构3 1 3 2 喹诺酮类药物的作用机理3 1 4 药物小分子与蛋白质相互作用4 1 5 染料分子在蛋白质上的吸附聚集反应研究5 1 5 1 染料与蛋白质的结合反应5 1 5 2 微相吸附一光谱修正技术( m p a s c ) 7 1 6 表面活性剂与蛋白质的相互作用。9 1 6 1g e m i n i 表面活性剂9 1 6 2 表面活性剂及其与蛋白质相互作用的研究概况1 0 1 7 小分子与血清白蛋白相互作用的研究技术1 1 1 7 2 荧光光谱1 2 1 7 3 三维荧光光谱1 2 。1 7 4 圆二色光谱1 3 1 7 5 傅里叶变换红外吸收光谱。1 3 1 7 6 其它研究方法1 4 1 8 本论文的指导思想及主要工作1 4 参考文献t 15 第二章光谱法研究加替沙星与牛血清白蛋白的相互作用2 2 2 1 引言2 2 2 2 实验部分2 2 2 2 1 仪器和试剂2 2 v 2 2 2 实验方法2 2 2 3 结果与讨论2 3 2 3 1 荧光光谱研究2 3 2 3 2 紫外吸收光谱。2 3 2 3 3 荧光猝灭类型的确定2 4 2 3 4 结合常数及结合位点数的计算2 5 2 3 5 作用力类型的确定2 6 2 3 6 同步荧光光谱2 7 2 3 7 三维荧光光谱- 2 8 2 4 结论2 9 参考文献：2 9 第三章曙红y 在牛血清白蛋白上的l a n g m u i r 吸附反应研究。j 3 l 3 1 引言3 1 3 2 实验部分31 3 2 1 仪器与试剂3 1 。 3 2 2 实验方法3 2 3 2 3 基本原理3 2 3 曼结果与讨论3 3 3 3 1 吸收光谱分析3 3 3 3 2 反应条件的研究3 4 3 3 2 1 反应时间的影响3 4 3 3 2 2 离子强度的影响3 4 3 3 2 3 温度的影响3 5 3 3 3 结合常数的测定3 6 3 3 4 蛋白质溶液的工作曲线。3 7 3 3 5 金属离子的干扰。3 7 3 4 结论3 7 参考文献：。3 7 第四章光谱法研究g e m i n i 表面活性剂与牛血清白蛋白的相互作用3 9 v i 4 1 引言3 9 4 2 实验部分4 0 4 2 1 仪器与试剂4 0 4 2 2 实验方法4 0 4 3 结果与讨论4 l 4 3 1 荧光光谱4 1 4 3 2 荧光猝灭机理研究4 1 4 3 3 结合作用力类型的判断4 3 4 3 4 同步荧光光谱。4 4 4 - 3 5 芘荧光光谱特征4 5 4 3 6 体系微环境的变化4 6 4 3 7 临界胶束浓度的测定。4 8 4 3 8b s a 对g 1 2 3 1 2 胶束聚集数的影响4 9 4 4 结论5 2 参考文献：一5 2 附录。5 5 硕士期间己发表和待发表的学术论文5 5 致谢。5 6 v 第一章绪论 1 1 引言： 第一章绪论弟一早殖比 蛋白质是一类重要的生物大分子，是生物功能的载体，是各种生命活动的具体表现。 事实上，每种细胞活性都依赖于一种或几种特定的蛋白质。蛋白质的基本结构单位是氨 基酸，蛋白质分子是由一条或多条肽链组成，也不是无规则的聚集体，而是具有特定空 间和特定的构象与排布，由2 0 多种氨基酸在肽链中的排列组合、序列异构现象以及空 间结构的复杂性形成了种类繁多、功能各异的蛋白质，并在生命活动中发挥着各种各样 的生物学功能，如催化、调节、贮存、运动、支架作用，防御和进攻等。蛋白质可与许 多外源性物质结合形成复合物，如药物小分子，金属离子，多肽等，从而行使它们的生 命功能，而一些大分子聚合物或表面活性剂也参与到生命活动中，与蛋白质结合或作用， 改变其构象，影响其功能的发挥等等。通过这些相互作用，蛋白质调节机体的各类生命 活动，在生命过程中扮演着重要的角色。 1 2 血清白蛋白的结构与功能 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白质，约占总量的6 0 ，等电点在4 7 4 9 之间，属于球蛋白类，其多肽链折叠紧密，疏水的氨基酸侧链位于分子内部，亲水侧链 位于外部暴露于水溶剂中，因此易溶于水。血清白蛋白也易分离和提纯，是一种典型的 和理想的蛋白质研究对象，其中，人血清白蛋白( h s a ) 和牛血清白蛋白( b s a ) 是研究得最 早和最为广泛的。 1 2 1 人血清白蛋 刍( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 人血清白蛋白( h s a ) 是一条由。5 8 5 个氨基酸组成的单链多肽，分子量6 6 5k d ，分子 呈心形【1 1 。它由一系列的a 螺旋组成，每个0 【螺旋包含3 个相似的结构域，每个结构域又 分别由2 个由4 - 6 个0 【螺旋组成的亚结构域a 、b 组成，以高度不对称的方式装配成分子【2 】。 在结构域i i a 和a 中，部分疏水区域与螺旋a - h 5 和a h 6 形成口袋结构，是水杨酸、胆 红素、磺胺药物及其他许多药物的结合位点，即结合位点i 。它所结合的配体分子均为 大分子，所以这一口袋结构相对较大，并具有极好的弹性，可以同时结合2 个不同的配 体；而结合色氨酸、甲状腺素及一些药物的结合位点i i ，及a 的口袋结构【3 】，大小比 湖北大学硕士学位论文 结合位点i 更小、更窄，因而只结合一些小分子。该位点对所结合配体的空间结构要求 严格，因此这一结构的弹性较小【4 】。 1 2 2 牛血清白蛋白( b o v i l ls e r u ma l b u m i n ，b s a ) 牛血清白蛋白( b s a ) 为一条c n 键的肽链，一共含有5 8 2 个氨基酸，肽链里有1 7 对 s s 键，分子量为6 6 2 9 6 ，这条弯曲肽链的c 端为丙氨酸，n 端为天冬氨酸【5 】。b s a 不含 糖，不是糖蛋白，是一个纯蛋白，也没有任何酶的活性，又叫惰性蛋白【6 】。b s a 氨基酸 序列及其三维结构与h s a 非常类似，三维晶体结构都有三个类似的结构域i 、i i 、， 每个结构域又有两个亚域结构a 和b ，它们以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所 有疏水性氨基酸都包含在圆筒腔内部，通过疏水作用聚集在一起构成疏水腔【7 1 。与b s a 不同的是，h s a 在i i a 亚域只有一个色氨酸残基t r p2 1 4 ，而b s a 在1 3 4 及2 1 2 位上都含 有一个色氨酸残基( 分别位于亚域ia 和i ia ) 【8 】 因此二者的荧光性质比较类似但又略有 差别。 1 2 3 血清白蛋白的功能 与其他血清蛋白一样，血清白蛋白主要由肝细胞合成，每克肝脏每小时约合成0 7 m g 的白蛋白【9 1 ，分泌进入血液循环系统，行使着重要的生理功能。 ( 1 ) 血清白蛋白能与许多内源性及外源性物质结合，起存贮和运输作用等。血浆蛋 白与多种物质结合成复合物，以携带机体所需要的蛋白、糖类、脂肪、氧、维生素等， 便于在血液中运输；其中白蛋白可与脂肪酸、有机阴离子和二价离子结合，还能和一些 小分子物质可逆结合，通过结合态和游离态之间的动态平衡，维持血液中这些物质浓度 的相对稳定。 ( 2 ) 血清蛋白可维持血液的正常渗透压。它的分子量大，所产生的渗透压小，不超 过2 5m m h g ，成为血清胶体渗透压，可维持血管内外渗透压平衡，而血清胶体渗透压的 维持主要来自白蛋白【1 0 1 。 ( 3 ) 清除自由基作用。 ( 4 ) 抗凝作用。 ( 5 ) 其他作用。临床上的白蛋白主要用于输血、补充体液、治疗外伤休克、白血病 等；另外也应用于生物产品的制备上，用作乙肝疫苗的稳定剂及许多药物的辅料等。血 清白蛋白在临床和生物产品的广泛使用，在国内外有很大的市场【1 l 】。 2 第一章绪论 1 3 喹诺酮类药物简介 1 9 6 2 年，人们在研究抗疟药氯喹诺酮类药物时，无意中发现了具有中等抗革兰阴性 菌活性的中间产物萘啶酸，至此，诞生了第一代喹诺酮类药物【1 2 1 。但当时它仅用于 治疗由革兰阴性菌引起的尿路感染，为窄谱抗菌药。至2 0 世纪8 0 年代，喹诺酮类药物的 发展突飞猛进，相继开发出被称为第三代的5 种喹诺酮类药物，分别是环丙沙星、诺氟 沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星【1 3 】。从2 0 世纪9 0 年代至今，人们又相继开发了第 四代及超广谱喹诺酮类药物，和前三代相比，第四代还有个特殊的名称“呼吸道喹诺酮 类药物，这是因其对目前耐药性最严重的肺炎链球菌有非常好的疗效而得名【1 4 ，1 5 】。 1 3 1 喹诺酮类药物的结构 喹诺酮类抗生素是一种人工合成的抗菌药物，具有抗菌谱广、良好生物利用度、半 衰期长、高效低毒、大多可口服方便等特点，己广泛应用于兽医临床，药物预防等的抗 感染化疗药物【1 6 】。目前，这类药物也是合成抗菌药中最具有开发前途的一类。 喹诺酮类的母核是4 喹诺酮，在其第1 ，3 ，6 ，7 等位引入不同基团即形成本类的 各种药物。3 位处为抗菌作用必需的基本结构；对l 位处进行结构改造可增强抗菌作用； 6 位上引入氟则增强抗阴性菌作用、增强抗阳性球菌菌谱；7 位引进哌嗪环为抗绿脓杆 菌的有效部位【1 7 1 。 1 3 2 喹诺酮类药物的作用机理 喹诺酮类药物其抗菌作用的主要机制是抑制d n a 旋转酶的活性，分别为拓扑异构酶 i i 和拓扑异构酶i v 1 8 ，1 9 1 。抑制这两个酶的活性就是药物与这两个酶形成喹诺酮类药物 d n a 旋转酶d n a 复合体，使d n a 形成高度螺旋，不能进行正常的d n a 复制，从而可 用于杀菌。由于这两个酶在细菌d n a 的复制、修复和转录中发挥着重要的作用，是细菌 生存所必需的酶，但在人体中没有，因此对细菌具有选择性【2 0 1 。 如今喹诺酮类药物以其突出的疗效、抗菌谱广、抗菌力强、与其他药物无交叉耐药 性及较少的不良反应在感染性疾病的治疗中被广泛使用；与此同时，喹诺酮在抗结核抗 肿瘤和抗病毒等发面的研究也取得了长足的进展2 ，但是它们的滥用使其耐药菌迅速增 加，新的具有更强耐药菌活性的喹诺酮类抗菌药急需探索和研发。 3 湖北大学硕士学位论文 1 4 药物小分子与蛋白质相互作用 如今，在不断摸索新技术和优化条件的新药研制开发过程中，药物在体内的吸收、 分布、新陈代谢以及消除等的研究都是极为重要的考虑因素和复杂的问题。白蛋白是一 种酸性的，非常易溶于水的蛋白质，它具有很强的活力，在p h 4 9 的范围内都能稳定存 在；可溶于4 0 的乙醇，在6 0 下加热1 个小时也不会产生有毒的效应。它的这些特 性，以及广泛的实用性，生物可降解性，无毒性和不产生免疫性的特点都使它经常作为 药物靶蛋白和研究药物代谢动力学模式的理想蛋白质模型2 2 1 ，血清白蛋白能可逆的结合 许多药物小分子，影响药物的运送、代谢及清除。 血清白蛋白有3 个类似的结构域，其中位点i 和位点i i ( 分别位于亚域ia 和i i a ) 是药物分子的主要结合部位。与位点i 结合的有二羧酸及分子中带有负电荷的体积较大 的杂环分子，如水杨酸盐、青霉素等；与位点i i 结合的有分子中带有负电荷的酸性基团 的芳香性羧酸，如l 氨基酸，甲状腺素等【2 3 】。除了这两个首要的结合位点外，血清白蛋 白分子上还存在几个极低的或较低的不连续的亲和位点，配体可能竞争某一个结合位 点，也可能通过构象的改变来适应血清白蛋白分子的空间结构，从而改变对较远位点的 亲和力。与同一位点结合的药物有可能互相竞争，也可能互相替代，在血浆中与血清白 蛋白高度结合于不同结合位点的药物则不会发生相互取代作用【2 4 】。 可用荧光探针法确定药物分子的结合部位，有些荧光探针对蛋白质不同区域有特异 性结合，根据药物加入后对荧光探针的影响可以确定药物结合部位。已知s i t ei 的探针 有：华法令( w a r f a r i n ) ，苯基保泰松( p l m y l b u t a z o n e ) ，丹磺酰胺( d a n s y ls u l f o n a m i d e ) 等：s i t e i i 的探针有：布洛芬( i b u p r o f e n ) ，氯灭酸( f l u f e n a m i ca c i d ) 等【2 5 2 6 1 。 药物分子与血清白蛋白的结合作用影响着药物的吸收代谢等，许多科学家们对新药 的吸收及代谢的研究大多选择血清白蛋白为主要对象。p n n a i k 等人运用荧光光谱法、 紫外可见光谱法和傅里叶红外光谱法等技术研究了磺胺甲恶唑与牛血清白蛋白的相互 作用，确定了猝灭类型和猝灭原因，计算了结合常数，热力学常数，结合距离以及能量 转移效率，探讨了药物对蛋白质构构象的影响等【2 7 】；h l i a m a t e i 等人运用荧光和圆二色谱 研究了山奈酚和人血清白蛋白的相互作用【2 8 1 ；陈兴国等使用流动注射毛细管电泳联用 技术研究了一系列药物与人血清白蛋白的相互作用【2 9 1 。这些研究工作对新药的设计合成 及药物作用机制方面的研究都有着重要的意义。 4 第一章绪论 1 5 染料分子在蛋白质上的吸附聚集反应研究 蛋白质是生物体生命活动中重要的组成成分，与营养、免疫、新陈代谢、生命的起 源和进化等息息相关，蛋白质在体液中的含量可作为营养健康、疾病诊断的重要指标。 染料与蛋白质作用主要是用于蛋白质的定量检测，蛋白质与染料反应及结合模型的研究 主要是从蛋白质的检测深化而来的。染料结合法是用于蛋白质检测的最为广泛的方法之 一。现在研究较多的可作为探针的染料分子中，大部分都含有带正电荷的亲水性基团如 羟基、磺酸基、酚羟基及不带电荷的疏水性基团，如苯环。当溶液p h 小于蛋白质的等电 点时，蛋白质亚胺键和n 端氨基质子化成阳离子，它和带负电荷的有机小分子通过静电 作用相互吸引到蛋白质的表面，同时由于一些非静电作用如疏水作用、范德华力的协同 作用，使两者结合的更加紧密【3 0 ，3 1 1 。同时，研究小分子在生物大分子上的聚集形式，帮 助人们弄清污染物、毒物等在生物大分子的结合机理，不仅在病理分析、临床检测以及 基因变异上有应用价值，而且对揭示和阐明生物大分子配体相互作用的化学本质、促进 生命科学的发展有着重要意义【3 2 】。 研究小分子在生物大分子上的聚集机理，常用的光谱法有紫外可见分光光度法、 荧光法、共振光散射技术等，但是大分子与小分子探针间的结合仍存在一些尚未解决的 问题。谢增鸿，林旭聪等人【3 3 】应用同步荧光法研究吲哚基二聚体菁类探针测定蛋白质及 其结合情况，采用新的水溶性吲哚类双嵌探针i ，探究该探针的特征光谱性能，考察酸 度、离子强度等因素的影响，发现在酸性条件下，蛋白质与探针发生结合作用，且同步 荧光强度与蛋白质浓度呈良好的线性关系；赵长容，刘保生等人【3 4 1 采用分光光度法对酸 性棕染料与蛋白质的结合反应进行了研究，酸性棕存在着两种平衡结构，在酸性水溶液 中能与血清白蛋白结合生成沉淀，并且结合产物随染料浓度的变化而变化，并考察了表 面活性剂的影响，酸性棕可用于蛋白质的定量测定；k u m a r a nr a j e n d r a n 和r a m a m u r t h y p e r u m a l 3 5 】应用吸收光谱法、稳态荧光光谱法和时间分辨荧光法等，研究了吖啶二酮类 染料与牛血清白蛋白之间的的光诱电子转移及结合作用，荧光各向异性研究表明染料分 子的运动受到蛋白质分子的微环境的严格约束，时间分辨荧光研究表明染料分子结合于 蛋白质的疏水部位。 1 5 1 染料与蛋白质的结合反应 研究者对不同情况提出了多种染料和蛋白质的结合模型，并计算相关结合参数。现 5 湖北大学硕士学位论文 在提出的结合模型主要有以下几种【3 6 1 。 t a i m t 3 7 1 提出了专一性和非专一性模型( s n s 模型) ，它们的不同在于是高亲和还是低 亲和性，以及有无最大结合数，两种作用不是协同的，计算的也是平均结合数，为两种 结合数的加和。 s c a t c h a r d 模型3 8 】是假设对于每一种配体，蛋白质上每个结合部位都是完全一致的， 并且这些结合部位与配体的作用是相互独立的，不互相影响。其方程为n l = k n k n ( n ： 每一分子蛋白质上所结合的配体数；k ：结合常数；n ：最大结合数；【l 】：溶液中游离的 配体浓度) ，n 对n l 作图为一直线。 p e s a v e n t o 3 9 】提出了相分配模型，认为牛血清白蛋i 刍( b s a ) 与配体的结合是不特定的， 非专一性的，可把b s a 当作不溶于水的微相配体在微相和水相中分配，其分配常数除 n l 为一恒定值。 郜洪文 3 2 , 4 0 】等人认为生物大分子由于拥有复杂的立体构象，折叠、螺旋、盘绕等使 大分子产生大量的沟壑和空穴，而且由于支持大分子立体结构的多种次级极性键极为接 近，同性电荷相互靠近使大分子局部形成很多微弱静电场谷。由于电场力作用带有电荷 的小分子探针被单层排列吸附在电场表面，符合朗格缪尔( l a n g m u i r ) 吸附。 但是许多报告中结合模型不符合s c a t c h a r d 模型，童沈阳等进行了研究，主要原因是 在这些情况下，n 对n 显得很小，以至于n n 烈，n l 表现为一常数。从结构上看，是因 为牛血清白蛋白含有约5 5 0 个氨基酸残基，其中赖氨酸与精氨酸残基分别为6 0 和2 6 个， 即使有一部分氨基酸残基被包藏在蛋白质内部，n 也应当是一个很大的数值。至于众多 的蛋白质结合部分上只结合了少量的配体分子，原因有二：一是配体与牛血清白蛋白之 间作用力较弱：一是配体在蛋白质上的结合实际是配体与溶液中共存离子，对蛋白质结 合部位的竞争结合过程【4 1 1 。 蛋白质上的氨基在酸性条件下带正电，与带负电荷的有机分子的络合，使有机小分 子如染料通过静电作用吸附到蛋白质的表面；同时某些非静电作用如范德华力、疏水作 用力等使之与蛋白质结合更加紧密。由于标记物与结合产物吸收光谱间迁移不大( 几纳 米至几十纳米) ，分辨率低，彼此互相干扰严重，难以用普通吸收光谱法准确测量和定 量分析，使用光谱修正技术能够测定结合体系中自由探针和结合物各自响应信号，可以 较好的解决这一问剐3 2 1 。将l a n g m u i r 单分子层吸附理论和分子光谱修正技术结合起来研 究，测定吸附反应的结合比、结合( 平衡) 常数、结合物吸光性能等，该方法称微相吸附 光谱修正技术( m p a s c l 【4 2 】。 6 第一章绪论 1 5 2 微相吸附一光谱修正技术( m p a s c ) 3 2 , 4 2 舢】 在蛋白质分子中，许多相似的质子化了的亚胺基团( n h ) 倾向于排列在一面，形成一 个带微正电荷的静电膜，而带有负电荷的羰基( c o ) 极性基团则倾向于在其相对的一面形 成微负电荷静电膜。蛋白质具有复杂而特殊的立体构象，比如线圈、折叠和螺旋结构等 等，这些复杂的盘绕使双静电层互相交错形成许多微静电场。微静电场可以吸引正负离 子等直至达到动态平衡。 图1 1 是带相反电荷的小分子配体与蛋白质的静电吸附作用模型。蛋白质事实上是 一个大的静电体，在静电场力的作用下带有异性电荷的小分子l 被单分子层吸附在其表 ， 面，由于微电场空间狭窄，小分子只能以单分子层排列在相界面，而与溶液本体中小分 子达到动态平衡，因此用l a n g m u i r 单分子层等温吸附理论来解释蛋白质与小分子间的 相互作用是可以尝试使用的。由于是静电吸引力的附着作用较弱，吸附容易受环境的影 响( 如离子强度、温度等) 而脱附。 图1 1 小分子在蛋白质表面的吸附 利用光谱修正技术进行结合物性质表征，该方法在原理和操作上与其他双波长法不 同，它能消除过量配体的吸收干扰，准确计算混合体系中结合产物和过剩自由配体的各 响应信号值。 l a n g m u i r 从动力学观点出发，提出了具有理论意义的固体