（微生物学专业论文）影响杜氏盐藻β胡萝卜素合成的因素.pdf

摘要 本文采用无菌藻株a 1 系统研究了盐浓度、碳源、氮源、磷酸赫等对杜氏盐藻生 长和一胡萝卜素合成调控的影响；比较了一次添擞型、分次添加型、不竞垒更换型、 完全更换鍪瑟释培养方式器孛途补绘n a h c 0 3 对盐藻生长和鬃积爵。麓萝b 素静影嫡； 利用u v 辐照处理盐藻研究藻液p ，胡萝b 素含量变化规律。 培养基“老纯”毒利于盐藻生长，餐不翻于藻缨胞积累争翡萝孓素。每两天离心更 换新鳟培养液，在第4 ，6 ，8 ，1 2 ，1 4 天，盐藻缨胞内多勰萝b 素含爨都大予对照组， 在1 4 d 嚣孪，蜜验缀萃个蒸缨戆蠹良胡萝b 豢含量逝对照组离2 7 ，粼。n a c i 浓度0 。5 m o t l 最适宜盐藻生长，3 m o l l 时盐藻单细胞内的p 胡萝b 素含爨最高。秃机碳源n a h c 0 3 在高浓度时氍适合盐藻生长，又京剩予藻缨胞蠹翁。骥萝卜素酶积累，效果毖麟糖和蔼 萄耱好。藕n a n 0 3 、c n t h ) 2 s 0 4 稆琵，k n 0 3 为裁佳氮源；浓度2 m m o l l 时最适合 盐藻生长，而0 5 m m o l l 有利于藻细胞内，胡萝b 索的积累。k h z p 0 4 浓度o 。l m m o l l 对单细照蠹瑟，辅萝b 素含量最离，0 。2 m m o i l 最适盐藻生长。歪交实验结栗诞赘藻缨 胞生长期8 。胡萝b 素蒙积的最佳条件存在晨著差舞。对于熊藻细胞囊长来说，碳源静 影响最大，然屠是氮源、磷源，最逶簸e 、n 、p 浓度分剐舞1 5 、2 。0 、0 ，2m m o i l 。 而盐藻细胞积累p 胡萝卜素最主要受氮源的影响，其次是受磷源、碳源的影响，最遗 蕊e 、n 、p 浓发分裂梵1 5 、1 0 、0 ，lm m o i l 。 比较了一次添加型、分次添加型、不完全更鼷垄和完全更换溅4 种培养方法对 生长和累积。胡萝b 素姻影响，发现完全更换型塔券方式有利予。胡萝 、豢的积累。1 另努，在盐藻生长嚣期( 1 0 d ) 翔入少量0 。5 m o l l 黪n a h c 0 3 浓溶液捉进盐藻生长和 8 胡萝 、素的积累；隧着n a h c 0 3 李 给量的增加，培养液斑舱盐藻浓度持续增加；当 替给壁达到1 0 r r m a o i l 嚣孛，单个藻缀稳蠹的彝。葫萝b 素含量最离，是对照的l 。毒3 倍。 用u v 对赫藻进行辐照处理，在6 0 s 的紫外辐照范围内，随着照射时削的延长， 盐藻藻拣懿存活率显著下降。蕊入小鱼汤焘，接圈鲢紫外辍照时闻，盐藻的绺活率蹒 有所上升；当盐藻存活率约为1 0 时，辐照时间为4 0 s ，加入小鱼汤后，辐照可延长 至5 0 s 。经过紫外辐照处理后，前几小时盐藻细飚感的多。胡萝b 素含量郝有所上升， 嚣螽又缓慢下辫。紫外强光辐妻童可以诱导赫藻增勰多胡萝卜素含量，并且藻缨胞。 胡萝b 素含量提高的幢魔及持续的时闻显著受紫外辐照裁量影响。在4 0 s 辎照时剃 瘫，照射时阚短，盐藻纲胞蠹多。胡萝 素含量提离麓幅度小，弗豆持续鹩时蒯短；辐 照6 h 后p 胡萝卜素含量达最大值后缓慢下降；但照射6 0 s 的藻细胞胡萝卜素含量 提高持续戆霹测最长，在辐鬃l 瑟1 4 h 透峰值才开始下降。 关键词：投氏摭藻，嘏萝 素，营养因子，培葬方式，u v 嚣 a b s t r a c t t h i sp a p e rs y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h ei n f l u e n c eo fn a c l ，c a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ， p h o s p h a t es o u r c et ot h et h eg r o w t ha n d1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o no fd u n a l i e l l as a l i n a ；f o u r c u l t i v a t em e t h o d s - 一- - t r a d i t i o n a lb a t c hm e t h o d ，f r a c t i o n a la d d i n g ，c o m p l e t er e p l a c e m e n ta n d i n c o m p l e t er e p l a c e m e n t - w e r ec o m p a i e dw i t ht h ei n f l u e n c eo fn a h c 0 3t ot h eg r o w t ho f ns a l i n aa n d1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n ；a n dt h er u l e so ft h ec h a n g eo f1 3 一c a r o t e n ec o n t e n ti n d s a l i n ab yu s i n gu vi r r a d i a t i o nw e r ef o u n d t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tn u t r i t i o nf a c t o r s ，l i k en a c lc o n c e n t r a t i o n ，c a r b o ns o u r c e ， n i t r o g e ns o u r c e ，p h o s p h a t es o u r c et o t h et h eg r o w t ho fds a l i n aa n d1 3 - c a r o t e n e a c c u m u l a t i o nw e r es t u d i e du s i n gt h ea s e p t i ca1s t r a i ni s o l a t e db yo u rl a b a g e dm e d i u m w a sp r o p i t i o u st ot h eg r o w t ho fd s a l i n a 、w h i l ei tw e n ta g a i n s t1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n 。 c e n t r i f u g a t i n ga n dc h a n g i n gw i t hf r e s hm e d i u me v e r yo t h e rd a y , i - c a r o t e n ec o n t e n ti nd s a l i n aw a sh i g h e rt h a nt h ec o m p a r e dg r o u p ，e s p e c i a l l ya td a y14 ，1 3 - c a r o t e n ec o n t e n ti n s i n g l ed s a l i n aw a s2 7 2 h i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o ls a m p l e t h eb e s tc o n c e n t r a t i o n o fn a c lf o rt h et h eg r o w t ho fd s a l i n aw a so 5 m o l l ，a n dt h eb e s tc o n c e n t r a t i o no fn a c l f o rt h et h e1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o nw a s3 m o l l a m o n gc a r b o ns o u r c e ，t h eh i g h c o n c e n t r a t i o no fn a h c 0 3w a sn o to n l ys u i t a b l ef o rt h eg r o w t ho fd s a l i n ab u ta l s of o rt h e a c c u m u l a t i o no f1 3 - c a r o t e n e t h ee f f e c to fn a h c 0 3w a sb e t t e rt h a nt h o s eo fs u c r o s ea n d g l u c o s e w h i l ef o rn i t r o g e ns o u r c e ，2 m m o l lo fk n 0 3w a st h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o nf o r t h eg r o w t ho fd s a l i n a ，a n do 5 m m o l lf o r1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n k n 0 3w a st h e s u i t a b l en i t r o g e ns o u r c ec o m p a r e dw i t hn a n 0 3a n d ( n h 4 ) 2 s 0 4 o 1m m o l lk h 2 p 0 4w a s t h eo p t i m u mt ot h ea c c u m u l a t i o no f1 3 一c a r o t e n e ，a n d0 2m m o l lw a ss u i t a b l et ot h eg r o w t h o fc e l l s b yt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw ef o u n dt h a tt h eb e s tc o n d i t i o n sf o r t h eg r o w t ha n d 。 1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o no fd s a l i n ac e l l sw e r ed i f f e r e n t t ot h eg r o w t ho fd s a l i n at h e i m p o r t a n tf a c t o rw a sc a r b o ns o u r c e ，f o l l o w e db yn i t r o g e na n dp h o s p h o r u ss o u r c e s t h e o p t i m u mc ，n ，pc o n c e n t r a t i o n sw e r e 15 ，2 0 ，0 2m m o l l ，r e s p e c t i v e l y w h i l et ot h e a c c u m u l a t i o no f1 3 - c a r o t e n et h eb i g g e s ti n f l u e n c ef a c t o rw a sn i t r o g e ns o u r c e ，f o l l o w e db y p h o s p h o r u sa n dc a r b o ns o u r c e s t h eo p t i m u mc ，n ，pc o n c e n t r a t i o n sw e r e15 ，1 0 ，o 1 m m o l l ，r e s p e c t i v e l y f o u rc u l t i v a t em e t h o d s ，t r a d i t i o n a lb a t c hm e t h o d ，f r a c t i o n a l a d d i n g ，c o m p l e t e r e p l a c e m e n ta n di n c o m p l e t er e p l a c e m e n t ，w e r ec o m p a r e dw i t h t h ec e l ln u m b e ra n d 1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o na sp a r a m e t e r s t h ed a t as h o w e dt h a tc o m p l e t er e p l a c e m e n t m e t h o dw a sb e n e f i c i a lt ot h e1 3 - c a r o t e n ea c c u m u l a t i o n i na d d i t i o n ，a d d i n gw i t h0 5m o l l i i i n a h c 0 1w 救e db e s tt oi n c r e a s et h ec e l ln u m b e ra n d1 3 - c a r o t e n ec o n t e n ti nt h el a t t e r p e r i o do f t h eg r o w t h ( ro d ) ，ns a l i n ad e n s i t yi n c r e a s e da st h en a h c 0 3p r o v i s i o ni n c r e a s e d 1 3 - c a r o t e n ec o n t e n ti ns i n g l ec e l lw a sh i g h e s tw h e nlo m m o l ln a h c 0 3 w a sa d d e d ，w h i c h w a sa s1 4 3t i m e sa st h a to ft h ec o n t r o ls a m p l e t h es u r v i v a lr a t eo fd s a l i n ac e l l sw a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yb yu v r a d i a t i o ni nt h e _ p e r i o do f6 0 s d a s h ic o u l dp r o t e c t e dn s a l i n ac e l l sw i t ht h es u r v i v a lr a t er a i s i n gs l i g h t l y f i x i n gt h es u r v i v a lr a t ea t10 ，t h eu v r a d i a t i o nt i m ew a s4 0 s ，b u tc e l l sw i t hd a s h ic o u l d s u s t a i 珏f o r5 0 sr a d i a t i o n 。w i t hu vt r e a t m e n t ，i 沁a r o t e n ec o n t e n ti nc e l l sr a i s e di nf e w h o u r st h e nd e c l i n e ds l o w l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tu vr a d i a t i o nc o u l di n d u c e 扮s a l i n a t oi n c r e a s et h eb - c a r o t e n ec o n t e n ta n du vr a d i a t i o nh a dg r e a ti m p a c to ne i t h e rt h er a t eo f i n c r e a s ei n1 3 - c a r o t e n ec o n t e n to rt h es u s t a i n i n gt i m e ，w i t hr a d i a t i o nt i m es h o r t e rt h a n4 0 s ， t h es h o r t e rt h ee x p o s u r et i m e ，t h es l o w l yi n c r e a s i n ga n ds h o r t e rk e e p i n gp e r i o dt h e b - c a r o t e n ec o n t e n ti nd s a l i n a ，w i t ht h em a x i m u mv a l u ea t6 ha f t e rr a d i a t i o nt r e a t m e n t a n dd e c l i n i n gs l o w l yl a t e r b u ti ft r e a t e dw i t hu vr a d i a t i o nf o r6 0 s ，t h ec e l l sw o u l dk e e p h i g hc o n t e n to f1 3 - c a r o t e n ef o rl o n g e rt i m e ，a n dw o u l dh a v et h em a x i m u m v a l u ea t14 h b e f o r ed e c l i n e k e y w o r d s ：d u n a t i e l l as a l i n a ， 5 - c a r o t e n e ，n u t r i t i o nf a c t o r s ，c u l t i v a t em e t h o d ，u v 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安 徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名：吕笾董 签字日期：o g 年月i o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 。 学位论文作者签名：吕蕴蒸 签字日期：d g 年易月；口日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名： “的 签字目期：口孑年6 月徊 电话： 邮编： 综述 1 国内外研究动态 1 1 盐藻简介 盐藻即杜氏盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 是一种单细胞绿藻，是迄今为止发现的最耐 盐的真核生物之一，可在高达5 5 m o l l n a c l 【i 】的极端环境中生存，广泛分布于海洋、 盐湖等盐度较高地区。1 8 3 7 年，法国人d u n a l 首次在地中海沿岸盐池中发现了盐藻。 盐藻分类上属绿藻门、绿藻纲、团藻目、杜氏藻科、杜氏藻属【2 】，细胞形态与衣藻 ( c h l a m yd o m o n a s ) 十分相似，但无细胞壁，原生质外仅有一层糖蛋白和神经氨酸组 成的外膜【3 1 。盐藻属于光合自养生物，藻个体通常呈卵圆形，但当外界渗透压发生改 变时，其形状可变为球形至纺锤形，具有一杯状j 大型的叶绿体，体积约占细胞的一 半，内含一淀粉核，前端有一红色眼点。藻体具2 条等长的鞭毛，可自由游动。营养 繁殖为纵裂，有性生殖为同配生殖1 4 】，形成红色或绿色接合子。 1 2 研究价值 1 2 1b 一胡萝l 、素的生理功能及应用前景 ， 盐藻区别于其他藻类的一个典型特征就是其叶绿体内的中性脂质小体中积累p 胡萝卜素，并且b 胡萝b 素最后分布在内囊体片层之间【5 ，6 j 。作为天然类胡萝b 素的 一种，b 胡萝卜素不仅是人体内v a 的重要来源，而且本身对人体也具有很多重要的生 理功能。 ( 1 ) p 胡萝卜素是人体v a 的前体 1 9 1 9 年s t e e n k b o c k 发现b 胡萝b 素可能具有v a 活性【7 1 。1 9 2 8 年发现一分子的1 3 胡 萝b 素在体内酶的作用下可转变为二分子的v a ，是人体v a 的主要来源。而v a 是合成 糖蛋白的载体，糖蛋白是细胞的重要结构物质，尤其是上皮细胞。免疫球蛋白也是一 种糖蛋白，v a 缺乏将会影响抗体的形成。因此，v a 对保证正常的生长和发育及抗感 染都具有重要作用。 ( 2 ) 3 - 胡萝卜素具抗氧化作用 在人体正常的新陈代谢过程中或受到强烈的紫外线照射后会产生活性氧，活性氧 具有不稳定性和高能水平的特征，可将能量迅速传递给其它分子而产生自由基。自由 基含有不成对的电子而异常活跃，可损伤核酸、蛋白质、细胞膜、细胞，导致细胞突 变或死亡【8 】。大量实验证明，p 胡萝b 素能消除活性氧和自由基，因为p 胡萝卜素具 有多个双键，能传递高能量从而使活性氧变成稳定的氧分子。现已知1 分子d 胡萝b 素可抑制1 0 0 0 个分子的活性氧【9 】，同时还可作为一种弱氧化剂直接与自由基反应，阻 止自由基的连锁反应，从而减少它对细胞的损伤。另外，有新的证据表明与衰老过程 相关联的多穗缺陷是缨胞走的多位点氧化损伤积累的直接羼果。例如心盘管疾患的发 病视理之一是低密度脂蛋自鲢氧化损伤面导致鲍。两。胡萝b 素是一种有效酶抗氧化 剂，例如马爱国( 1 0 1 在探讨抗氧化营养对d n a 氧化损伤的保护作用时，幽实验发现涟 续服用p 胡萝b 素、v e 和v c ，可显著降低凼过氧化氢诱发d n a 的损伤。 ( 3 ) 参。翡萝b 素在细胞通讯中麴促进 乍雳 绷胞通讯是攒个细胞发蹴的信息通过介质传递到另个细胞产生相应的反应。 细胞间的通讯对于多细胞生物体的发生和组织的构建、协调细胞的功能、控制细胞的 生长和分裂都是必须的。闻隙连接( g a pj u n c t i o n ) 是细胞通讯的重要方式之一，其基本 单位是连接子。它允许小的代落物、缨胞态信息及离孑童出出入，徨蛋自震、m r n a 等大分子则被排除在外，以保持各细胞的遗传一致性。b e r t r a m 等【悛现d 胡萝b 素 和其它类胡萝b 素可加强细胞间隙连接的交流能力，从而抑制或降低癞症的发生和发 震。 强前，有关胡萝卜素抗癌机理有以下几种解释：转化为类视黄醇作用机制、抗 氧化机制、提高机体免疫力等。但在二十世纪八十年代末九十年代初，p u n g 等首次提 出并涯明有关1 3 。胡萝b 素与转纯爻类视黄醇及抗氧纯掇制无关蕊抗癌 乍用机制，即转。 稿萝 、素艉增强细胞阉隙连接遣讯，搦铡缨脆煞恶性转化 搬，段】。研究袭翳s 葫萝b 豢 是细胞间通讯的诱导剂，它能增强转化的癌起始细胞与健康细胞之间的交流作用。 ( 3 ) 8 胡萝b 素能增强机体免疫力 人体免疫系统的两个主要功能是抵鬻细菌或病毒的侵染帮茨止癌症的发生。8 胡萝b 索在增强人体的免疫能力等方面具有明盛的作用 z 3 】。目前，已经有很多关于服 用类胡萝b 素对免疫活性变化的影响的报道。在8 0 年代初s e i f i e r 和他的工作组就已发 表了增补类胡萝b 素可敬增强免疫漂缝翦报道1 1 4 t 。流行瘸学研究发现：吃富含1 3 ，胡萝 b 素盼食物可增强生物机体酶特异性及非特舜性免疫功能，降低肺癌发病率。另外， s i o n gt e e 也发现6 胡萝b 素具有定的抗癌作用【”j 。 ( 4 ) 8 一胡萝b 素的其它功能 一嘏萝b 素还可作为营养和着色添麓裁h 鲥翼。1 3 - 旗萝b 素是联合圄粮农缝织和毽 界卫生组织食品添加荆联合委员认可的无毒、安全、有营养的食品添加荆，目前世界 上已有5 2 个国家和地区批准。在口红、胭脂等化妆品中添加b 胡萝b 素，不但能使化 羧品色泽邕然丰满，还能营养皮肤、保护皮肤，所鞋采用。胡萝卜素的护获磊也菲常 受欢迹。 最近还有研究证明，p 胡萝卜素添加到动物食品中作为饲料添加剂对动物也具有 一定的特异功能。例如，在用不含t 3 。麓萝b 豢饲料喂养母牛时，经常观察到母孛“无 症状”的发热、延期摊黪、舞泡囊肿、拖延和减少黄体的形成等症状，这些症状都可 通过在饲料中添加讳。胡萝b 素两好转【1 8 】。 2 基于以上这些特殊的生理功能，d 胡萝卜素己被广泛应用于食品工业、饲料工业、 医药及化妆品工业上。而盐藻具有较强的1 3 胡萝卜素合成能力，其1 3 胡萝卜素的含量 可高达1 0 左右【1 9 】，比植物中的含量要大1 0 0 倍以上。所以盐藻是最具开发潜力的1 3 胡萝i - 素天然资源。 1 2 2 甘油的生理功能及应用前景 甘油作为一种小分子的多元醇，除了具有多元醇的共性以外，又具有它自身的特 性：在高浓度下表现出较低的粘度，可以保持细胞内环境合适的流动性，对细胞内酶 类有着明显的保护作用。当生境中盐浓度升高时，盐藻细胞内即开始进行甘油的合成； 盐浓度降低则促进甘油的转化，使细胞快速适应新的环境。陈志等人研究亦表明盐藻 是通过甘油的合成与转化来调节渗透压，恢复其原来的形状和大小的【2 0 1 。在饱和的盐 水中，盐藻细胞内甘油积累可达其干重的5 0 以上。 甘油是优质的化妆品原料，同时也是化工和医药工业中广泛应用的有机化合物。 作为一种重要的基本轻化工原料和国防工业物资，甘油由于具有吸湿性好，粘度高， 冰点低等特点，被广泛应用到医药、国防、油漆、化妆品、食品、造纸和纺织印染等 行业的1 7 0 0 多种产品中【2 1 1 。 2 盐藻p 胡萝i 、素的相关研究 2 1 盐藻中b 胡萝i 、素的代谢途径 p 胡萝卜素是类胡萝卜素的一种，属四萜类化合物。它是光合作用的捕光辅助色 素【2 2 】，并能保护光合作用的反应器不受光抑制。这种光抑制是由于叶绿素被高光强辐 射过度激活所产生的【2 3 1 。当盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 处于某种不利生长的条件( 即胁迫 条件) 下，就会出现乙酰辅酶a 的积累并导致d 胡萝卜素的合成和积累【2 4 1 。乙酰辅酶a 是最初的底物前体，再经过几个阶段的反应合成1 3 胡萝卜素。 s n 0 一p 。峥q rt t 专b c 占e 夺- - - - - - 、f - - - - - g h i 公乡k 迫二生m 人一b 哼c 专d 一h 峥专j 一l 专m o 3 小。， 图1 类胡萝l 、素的生物合成途径 f i g 1p a t h w a y f o rc a r o t e n o i db i o s y n t h e s i s 注：a ：g g p p ；b ，一v - - 簧；c ：六氢番茄红素；d ：争胡萝卜素；e ：链孢红素；f ：番茄红素；g ：卜胡萝卜素；h ：1 3 - 胡萝卜 素；i ：p - 隐黄质：j ：玉米黄素；k ：环氧玉米黄质；l ：堇菜黄素；m ：新黄质；n ：a - q ；米胡萝卜素；o ：8 - 胡萝卜素；p ：a 胡萝 卜素；q ：f r l 黄索；r ：p 一柠乌素；s ：辣椒红；t ：辣椒玉红素t ) p s y ；p d s ；z d s ；番茄红素8 环化酶；b c h ；番茄 红索p 环化酶；c c s ；t 歪) z e p ；v d e 。 在绿色植物和藻类中，类胡萝卜素一般通过类异戊二烯途径合成，该途径是一个 十分庞大的次生代谢途径。首先由葡萄糖_ 磷酸丙糖一乙酰辅酶a _ 3 一羟3 甲基戊二 3 酰辅酶a ( h m g c o a ) 砷甲羟戊酸( m v a ) 一异戊烯焦磷酸( i p p ) 。i p p 在i p p 弊构酶馕 佬下异构成d m a p p ，然后d m a p p 在g g p s 催纯下先瑶与3 个猿p 分子缩合两成 g g p p ，这是类胡萝卜索合成途径中第一种类胡萝卜素( 即八氢番茄红素) 的直接前 体。图l 显示了所有类胡萝 、素的合成途径f 2 5 4 。 多鲷萝卜素异梅纯发生在分子合成过程中的草麓，酃形成夕氢番茄红素( p h y t o e n e ) 时或在这之前，在随后的去饱和及环化作用阶段不发生异构化【酬。6 一胡萝卜素具有许 多种分子爨构体，在结构上，处于两湍$ 环之闻鹣碳链含有9 个共轭双键，理论上可 有2 7 2 种异构体，但由于甲基的阻碍作用，仅有4 个不受阻碍的双键，其异构体有2 0 静左右。z e c h e i s t e r 3 2 】在1 9 6 2 年分橱帮报道了1 2 种顺式异擒俸。在植物串，生物合成 的p 胡萝卜素是全反式和顺式异构体的混和物p 引。p 胡萝卜素顺式昴构体能猝灭生物 体内化学活性缀高的自巍基，从褥降低因窦由基诱发敌过氧化作用，具有延缓衰老的 功能强懿。混和物中其顺式异梅体含量越多，英| j 功效越强。 2 2b 胡萝l 、素代谢途径中的主要酶及其基因 2 2 1g g p s g g p s 催化g g p p 生成，是类胡萝b 素合成途径中较早褥到磷究靛一种酶。d o g b o 耱c a m a r a t 3 霹子1 9 8 7 年从辣椒中纯化了该酶，随薏在1 9 9 2 年刹餐了其抗体，并焉来筛 选c d n a 文库得到g g 雕c d n a 3 6 j 。不同槭物的g g p s 蛋白具有可能与催化中心相对应 熬保守区，基于傈守区提供觞信息，s e o l 疑汰和b 硼e y 吲分离惠搬南芥。雠因。拟 南芥g g p s 嘲多基因家族编码( 至少5 个成员瑟司) ，该基因家旗的不同成员可能负责不同 支流的类舄戊二烯产物台成f 3 9 1 。 2 2 2p s y p s y 罐化g g p p 转化戚夕氢番茄红素，其基因在1 9 8 7 年即恶获得，僵直至1 9 9 2 年 才得到证实。r a y 等豳】予1 9 8 7 年获襻一个功能未知的番茄果实成熟期间专表达的 c d n a 克隆p t o m 5 ；a r m s t r o n g - 等 4 l j 发现p t o m 5 编码的氨基酸序列与草生欧文氏菌 ( e r w m i ah e r b i c o l a ) 及荚膜红细菌( r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s ) 熨瑾黧霹源2 0 以上。这些 事实表明p t o m 5 是胚璃因。另外，b a r t l e y 幂n s c o l n i k a 2 】还从番茄中分离到另种雕】， 基因( p s y 2 ) 。番燕嚣y l 基因有5 个魂含子和6 个外显子，长3 。6 k b ，p s y 2 对应予殿y l 第 一个外显予的序列中存在两个内含子娜】。 2 。2 3p d s 帮z d s 达革灭( n o r f l u r a z o n ) 是一种除草剂，其作用机理是抑制p d s 活性从而抑制有色类 胡萝卜素合成，进而使得叶绿素被强光氧化破坏因而导致植株白化死亡。c h a m o v i t z 等躐于l 辨年从抗达摹灭筋缰囊藻fa n a c y s t i sn i d u l a n sr 2 ) 突变髂中分离到发生了点 突变的纠基因，继而从非突变体中获得正常爿粥基因。p d s 催化八氢番茄红素向 胡萝 、素转纯，丽胡萝卜素赢番茄红素的转化则是由z d s 催傀戆。尹嬲和放漆基因 4 大小相近，氨基酸同源性为2 9 - - 3 1 。 2 2 。4l y c 植物中存在两种l y c ，即番茄红素b 环化酶和环化酶。番茄红素分子的两个末端 若均在p 环化酶催化下形成p 环，即为p 胡萝卜素；若只有其中一个末端在环化酶催 化下形成环，而另一个末端不环化，即为6 胡萝卜素；而若分子的两个末端分别被b 及环化酶催化，形成p 环和环，即为0 l 胡萝b 素( 图1 ) 。c u n n i n g h a m 等【2 5 】从拟南芥 中获得p 及环化酶基因。它们编码的蛋白在大d ( 5 0 1 并n 5 2 4 个氨基酸) 及等电点( 均为 5 7 ) 等性质方面均较为相近，氨基酸序列同源性达3 6 ，均以单拷贝形式存在【2 5 1 。两 者在起源上十分接近，可能是两拷贝p 环化酶基因的适应性变型2 5 1 。 3 盐藻诱变的研究 变异是选择优良品系的基础，自发突变的频率较低，所以人工诱发突变在育种中 具有重要作用。e m s 作为一种强烈的化学诱变剂，在藻类诱变育种中经常使用，早 在8 0 年代r i c c r o d i 等 4 5 1 就利用e m s 处理螺旋藻获得了抗氨基酸类似物的突变株；9 0 年代张学成等【4 6 】利用e m s 处理螺旋藻选出了两株耐低温的突变株；崔海瑞等【4 7 】发现， 经过e m s 处理的钝顶螺旋藻在生长和形态方面等受到了很大影响；汪志平等【4 8 】采用 0 6 的e m s 和2 4 k g y 的6 0c o r 射线处理钝顶螺旋藻，并在7 0 k g y 左右的r 射线为 筛选压力，得到了4 株高多糖含量突变株；由此可见e m s 用于螺旋藻诱变育种方面 的报道较多。也有人【4 9 j 利用e m s 和u v 相结合的方法，筛选到一株雨生红球藻突变 株，突变株的虾青素含量是出发株的2 1 1 倍，达到细胞干重的2 4 9 。 在藻类的诱变育种中，有关盐藻诱变育种的报道并不多见，盐藻诱变研究采用的 诱变剂一般都是紫外线。姜建国等【5 0 】通过紫外线诱变盐藻也获得一株突变株，突变株 的胡萝卜素含量提高6 9 。刘光发等【5 i j 通过紫外线诱变获得一株突变株，突变株的 胡萝卜含量为原种的6 2 1 5 5 倍。因为在盐藻中，存在一种c b r 基因( 一种与胡萝卜素 生物合成相关的基因) ，c b r 的表达与高等植物的早期光诱导基n ( e a r l yl i g h t i n d u c e d g e n e s ，e l i p ) 的表达密切相关【5 z j ，c b r 蛋白后被认为是一种玉米黄质结合蛋白，后者与 c b r 蛋白结合后形成的复合物对盐藻的光合作用系统起一种保护作用1 5 3 】，但是c b r 基因是一种诱导表达的基因，诱导条件包括强光、硫酸盐$ 【l n o r t l u r a z o n ( 一种除草剂) 处理等【5 引。e o n s e o n 等【5 4 j 还利用e m s 处理盐藻获得了高玉米黄素突变株，突变株的玉 米黄素含量是出发藻株的3 0 倍，且藻细胞的生长没有受到影响。 4 盐藻生理学的相关研究 4 1 盐藻耐盐机制的相关研究 盐藻具有广泛的盐适应度，能耐受生存环境中0 0 6 - 5 5 m o l 1 的n a c i 盐浓度【1 1 。 b e n a m o t z 及b e l m a n s 等分别对盐藻的渗透压调节机理研究后表明，其细胞内能进行 渗透调节的物矮是甘油 5 5 , 5 6 。陈恚等亦研究表明盐藻是通过甘油的合成与转化来调节 渗透嚣，恢复奠藤来羲辫状帮大小麓器瓣。苗洼蕊转化是发生在嚣溜与淀粉之鲻。当辨 界低渗时，细胞内的甘油转化为淀粉，所需能量幽正常呼吸链和交替氧化酶提供；当 努雾离渗爨寸，淀粉剽降麟戈营漓，毙爨下能量枣光合遣子提供，黑绪中受毒菱豢野吸 链提供骚钳。黄益群等认为在甘漓代谢途径中，二疑丙酮还原酶催化甘油与二羟丙酮之 闻的转化，隽甘油合成域转化的一个关键酶【5 。g e e 等( 1 9 9 3 ) 通过改变培养条件，从 桂氏盐藻细胞中分离到了三种g p d 阉功酶，其中种起渗透调节律用，称为“调渗型” 同功酶静引。自含林等研究发现在外界渗透压骤增时，该溺功酶酶活有显著增加，并据 就谈为渗逶嚣调节功麓瓣窟动，稷可麓与酶蛋密艨的激活有关甏。s a d a k a 等赣究表 明盐藻对高盐的适应与细胞内某缝鬣白袭达量有关，并于1 9 9 1 年鉴定了与盐适应相 关羲i s o k d 蛋盏，发现该蛋岛麓予缨戆表蓖，与簿盐下缨魅努裂生长毒美 6 0 t 。m o r l y 等( 1 9 9 4 ) 发现并鉴定与盐适应相关的勇一种6 0 k d 蛋自玲。f i s h e r 等通过c d n a 序 捌分柝袭骥1 5 0 k d 蛋岛是一种转铁蛋自暇l ，6 0 k d 蛋自是一种碳酸酹酶，链子缀飚 膜上，与离子的运输有关翻。徐坤等研究亦证明遮毖蛋自含量变化可能和桎氏盐藻的 盐适应有定的联系【矧。从整个渗透调节过程来番，渗透骤变簌离子效应和其它生理 活动也是裢氏盐藻渗透调节酶重簧缀减部分。豫思学等认为渗透震扰信号可通过蛋自 质磷酸化进一步放大，谳2 4 k d 蟹囱是桂氏盐藻细胞内蛋白激酶最有潜力的底物f 6 5 1 。 4 。2 壳、瀑、p h 筹生态嚣手煞臻究 。 校鼹靛藻营自养生溉，必须依靠光合作用来合成有机物康。因此，光照对予杜氏 盐藻的生长发育至关重要。孝主氏盐藻麓耐强光照，对塞然光靛翻嗣攀酉达3 1 1 ，嵩 于般离等植物，这可熊与大细胞藻类的细胞生璎机制有关】。申俊江等( 2 0 0 0 ) 研 究柱氏盐藻缨脆光合特褴随指出杜氏盐藻其畜正鬻游光系统缝构，并且藻缨熬霹诱导 可逆的光状态转换群】。s c h r e i b e r 等亦指渤杜氏盐藻具有如商等植物叶绿体光系统i i 楣近的结构和功能【6 引。陈敏等认为光系统l i 中的摅光复合物i i ( l h c i i ) 蠡4 6 矜 2 7 31 k d 多簸擒或辩l 。汪莠玲等研究蛋巍修豫裁对柱氏盐藻巍合速率及蔽波光谱特 性的影响后指出舆多酶体系和复杂蛋白结构的完熬细胞的缀囟构象与光合功能存在 一定豹关联l 獭。夏藤等磷究低温条件下光搦锱佟麓，缝果发现糕漫提高柱氏盐藻对巍 抑制的敏感是由于低温抑制了光合放氧，是光系统h 反应中心多余的激发能增加| 以 及竞系统l | 鲣复循环受到爨褥鲶瑟果骖瓣。彭长连等磷究指盛在1 0 4 c 一3 5 8 c 的条簧下， 杜氏盐藻的光饱和点2 2 0 t m o l ( m 2 s ) p 甜。夏丽等应用叶绿素荧光技术检测杜溅盐藻产 生非荧光淬灭的条件和鉴别非光化学荧光淬灭的缎分惹，结果表明通过增加麓量耗教 霹蔹避熊光酸坏光合器富的保护飘制鬟。彭长连等透过研究强毙下5 0 3 2 - 和h c 0 3 - 对 杜氏赫藻叶绿素荧光的影响指出低s 0 3 2 浓度下强光的光抑制在随后的低光条件下放 黄2 囊惹戆宪全恢复，离浓度雩l 起鹣光赫割不链完全逆转，低巍- fh c 0 3 魏德进竞掷 蓐 制的恢复7 4 1 。林植芳等研究结果表明单细胞盐藻在强光前后5 0 5 n m 光暗差示吸收变 化的值a 5 0 5 可作为强光下植物光保护机制运行状况的检测指标【7 5 】。此外，杨震等比 较海洋单细胞藻对紫外吸收差异后发现盐藻的吸收峰最大【7 6 1 。h e m a n a n n 等认为杜氏 盐藻的光化学效率在全模拟太阳光下比在滤除u v - b 的情况下显著下斛7 。7 1 。 在适宜的温度条件下，盐藻分裂旺盛，生长快速。古玉环等实验研究表明杜氏盐 藻的温度范围在5 - 3 5 c ，最适生长温度为2 5 3 0 ，低于5 c 藻生长缓慢，细胞几乎 不增殖，当温度超过3 5 后，藻细胞会逐渐死亡1 7 引。 盐藻能抵御碱性环境，其细胞内的酸性液泡是一个大容量的胺缓冲系统，可以防 止细胞质碱化和光合过程解偶联。研究表明杜氏盐藻的最适生长p h 为9 0 左右【7 9 1 。 影响和制约杜氏盐藻生长发育的气体主要有c 0 2 ，培养液中如果缺乏c 0 2 。则会限制 藻细胞的生长。 4 3 营养元素的研究 杜氏盐藻生长发育所必需的矿质元素有：c 、h 、o 、n 、p 、k 、c a 、m g 、s 、 f e 等l o 余种，除此之外，还需要一些如b 、i 、z n 、w 等微量元素。 杜氏盐藻是一种光合自养生物，需要无机碳作为其碳源。无机碳的溶解量与培养 液中的盐度和温度有关。对于高盐环境下生长的杜氏盐藻而言，无机碳的供给可能是 其生长的最大限制因素。2 5 、2 5 盐浓度、p h 9 0 的条件下，9 9 9 的无机碳是以 c 0 3 2 - 的形式存在，其次是h c 0 3 ，几乎无c 0 2 的存在【8 0 1 。盐藻细胞表面存在碳酸酐 酶 8 1 , 8 2 】，并具耐盐性，可使杜氏盐藻在高盐条件卞能很好地吸收c 0 2 【8 3 j 。杨雪梅等认 为盐藻若以n a h c 0 3 为碳源，其浓度为l g l ，若以c 0 2 为碳源，其培养液的p h 值应 f ： 在7 _ 9 8 4 】。 在杜氏盐藻的培养中，硝酸盐是最常用的氮源。m i l k o 和g r a n t 等认为n a n 0 3 是 杜氏盐藻最好的氮源【8 5 , 8 6 】。但盐藻对硝酸盐和亚硝酸盐的吸收利用是需要光照的。铵 态氮一般不能被盐藻吸收利用【87 。有机碳源如尿素、谷氨酰胺一般不如无机氮有效 8 8 , 8 9 】。李建宏等实验发现使用低浓度脲比硝酸盐对杜氏盐藻的生长更有效【9 0 】。王富平 等认为在盐藻培养中投入0 2 m m o l 1 一- 1 o m m o l 1 的尿素，可以得到适宜的细胞生长速 率和较高的类胡萝卜素含量【9 1 1 。陈