（物理化学专业论文）纳米材料基黄嘌呤氧化酶电极.pdf

中文摘要 一、基于类水滑石第一代黄嘌呤高分析性能生物电极及别嘌呤醇的抑 制作用研究 黄嘌呤的检测在临床和食品质量控制上都具有非常重要的意义。因此，使用 新颖的无机材料类水滑石( l d h s ) 固定黄嘌呤氧化酶( x n o x ) ，开发了种新的 黄嘌呤生物传感器。计时安培法检测黄嘌呤时，修饰电极采用的电位是0 5 5v ( 相 对于s c e ) 。由于l d h s 的特殊性能，例如化学惰性、机械和热稳定性、阴离子交 换能力、高孔隙率和溶胀性能等等，使得x n o x l d h s 修饰电极表现出优异的分析 特性。当s n = 3 时，生物传感器对黄嘌呤浓度响应的线性范围为1 1 0 击m 到2 1 0 4 m ，灵敏度为2 2 0n 认m 。1 啪，检测下限为1 1 0 。m 。此外，固定了黄嘌呤氧化 酶的l d h s 膜用原子力显微镜观察时，在空气环境和液体环境下，l d h s 都显示了 有趣的膨胀现象。在本章中，x n o x l d h s 修饰电极还用来研究别嘌呤醇对黄嘌呤 氧化酶的抑制作用，实验结果表明，别嘌呤醇的抑制效果属于准可逆的竞争类型。 二、基于纳米碳酸钙第二代黄嘌呤高灵敏度高选择性生物电极 用纳米碳酸钙作为酶的固定载体，研究了一种新型的黄嘌呤生物传感器，得 到了良好的电化学响应特性，又进一步将这种载体固定黄嘌呤氧化酶( x n o x ) 和 辣根过氧化酶( h r p ) 构建一种双酶生物传感器，并且能够同时达到酶促反应产 生的过氧化氢的电化学氧化以及还原。构建的x n o 】( n a i l o c a c 0 3 单酶电极和 x n o 棚i 冲n a i l o c a c 0 3 双酶电极对黄嘌呤进行计时安培法检测时，分别将电位固 定在o 5 5v 和0 0 5v ( 相对于s c e ) ，信噪比为3 时，两种检测的线性范围分别 是2 l o 击到2 5 1 0 4m 和4 1 0 。7 到5 1 0 5m ，检测下限为2 1 0 石m 和1 1 0 。7m 。 在更低的操作电位0 0 5v 时，x n o x h r p 烈a n o c a c 0 3 电极表现出优异的选择性， 干扰实验中也反映出其对于抗坏血酸和尿酸呈现惰性反应。另外， x n o ) 洲a 1 1 0 c a c 0 3 电极的渗透性还通过旋转圆盘电极伏安法计算出来。 三、基于1 a p o n i t e 纳米材料黄嘌呤第三代直接电子传递和复杂电催化生 物电极 在本章中，进一步采用l a p o n i t e 纳米材料来设计构建第三代生物传感器。这是 首次采用l 印o n i t e 作为载体实现固定含有钼( m o i y b d e n u m ) 复杂多活性中心的黄 嘌呤氧化酶的直接电化学。x n o x l 印o n i t e 修饰电极只出现一对完好的可逆的循环 伏安峰，这对峰位置约为o 3 7 0v ( v s s c e ，p h 为5 0 ) ，是由黄嘌呤氧化酶的f a d 活性中心引起的。黄嘌呤氧化酶中的f a d f a d h 2 氧化还原电对的标准电位在p h 4 o 8 0 的范围内随着p h 的增加而线性变化，斜率为5 4 3m vp h 一，表明在电化学 反应中存在两个质子和两个电子的转移。另外，修饰电极中，黄嘌呤氧化酶保持 着很好的生物活性，对黄嘌呤的氧化和硝酸盐的还原都表现出完好的电催化性能。 电催化响应随着黄嘌呤浓度的增加线r 变化，信噪比为3 时，线性范围是3 9 1 0 罐 到2 1 1 0 巧m ，检测下限为1 0 xl o 。8m 。 a b s t r a c t 1 d e v e l o p m e n to fah i g ha n a l y t i c a lp e r f o r m a n c e - x a n t h i n eb i o s e n s o r b a s e do nl a v e r e dd o u b l eh v d r o x i d e sm o d i f i e d e l e c t r o d ea n d i n v e s t i g a t i o no ft h ei n h i b i t o r ye f f e c t b ya l l o p u r i n o l t h ed e t e n n i n a t i o no fx a 芏l t l l i n eh a sc o n s i d e r a b l ei i n p o i r t a l l c ei i lc l i n j c a l 觚df o o d q u a l 时c o n t r 0 1 t h e r e f o r e ，i i lt h i sp r e s e n tw o r k ，w ed e v e l o p e d an o v e lx a l l t h i n e b i o s e n s o rb a s e do ni m m o b i l i z a t i o no fx a n t l l i n eo x i d a s e ( ) ( i l o x ) b ya t t r a c t i v em a t 甜a l s 1 a 舯dd o u b l eh y d r o x i d e s ( l d h s ) a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no f x a n t l l i n ew a se v a l u a t e d b yl l o l d i n gt h em o d i f i e de l e c t r o d ea t0 5 5v ( v e r s u ss c e ) d u e t 0t h es p e c i a lp r o p e r t i e s o fl d h s ，s u c h 嬲c h e m i c a l i n e n i a ，m e c h a n i c a la n dm e 肌a ls t a b i l i 坝a i l i o i l i ce x c h a i l g e a b i l i 坝h i 曲p o r o s i t ya n ds w e l l i n gp r o p e n i e s ，x 1 1 0 x l d h sm o d i f i e de l e c 们d e e x l l i b i t e dad e v e l o p e da i l a l 如c a lp e r f o 锄a n c e t h eb i o s e i l s o rp r o v i d e dal i n e a rr e s p o n s e t ox a i l t l l i n eo v e rac o n c e 蛐r a t i o nr 觚g eo fl 1 0 _ 6m t o2 1 0 4mw i t ha s e n s i t i v i t yo f 2 2 0 m am 1 锄。2a n dad e t e c t i o n1 i m i to f1 l o 。7mb a s e do ns n = 3 1 1 1a d d i t i o n ，m e i l i l i l l o b i l i z e d o xl a y e r sh a v eb e e i lc h a r a c t 嘶z e du s i n ga t o m i cf o r c em i c r o s c o p yu i l d e r b o t ha i r 舳o s p h e r ea 1 1 dl i q u i de n v i r o n m e n t ，w h i c he x h i b i t e dt h ei n t e r e s t i n gs w e l l i n g p h e n o m 肌o no fl d h s t l l ei n v e s t i g a t i o no fi 1 1 1 1 i b i t i o no fx n o xb ya l l o p u r i n o lw a s c 州e do u tu s i n gt h i s o ) 【l d h s - m o d i f i e de l e c t m d e t h ee x p 耐m e n t a lr e s u l t s i n d i c a t e dt h a ti i l l l i b i t o 巧e 腩c tc o u l db ea c h i e v e db ya l l o p 嘶n o lw i maq u a s i r e v e r s i b l e c o m p e t i t i v et y p e 2 s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ex a n t h i n ea m p e r o m e t r i cs e n s o r sb a s e do n c a l c i u mc a r b o n a t en a n o p a r t i c l e s u s i n gc a l c i u mc a r b o n a t en a n o p a r t i c l e s弱c i 】【z y m e i n l l i l o b i l i z a t i o nm 撕x ，t 1 1 e d e v e l o p m e l l t so fx a n t h i n eb i o s e i l s o rw e r ea c h i e v e db yb o me l e c 仃oo x i d a t i o na i l de l e c 们 m d u c t i o no fm ee n z y m a t i cg e n e r a t e dh y d r o g e np e r o x i d eb a s e do nx a n t h i n eo x i d a s e ( x n o x ) a n dh o r s e r a d i s hp e m x i d a s e ( h r p ) a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fx a n t l l i n ew a s e v a l u a t e db yh o l d i n gm em o d i f i e de l e c t r o d ea t0 5 5va n d - 0 0 5v ( v e r s u ss c e ) ，f o r x n o x n a n o c a c 0 3a n dx n o x h r p n a n o c a c 0 3 ，r e s p e c t i v e l y t l l el i n e a rd y i l 锄i c r a n g e so fa n o d i ca n dc a t h o d i cd e t e c t i o n so fx a n t h i n ew e r eb e t w e e n2 lo - 6t o2 5 1o 4m a n d4 10 叫t o5 1o 。m ，r e s p e c t i v e l y ：t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r ed e t e n n i n e dt ob eo f 2 lo - oma n d1 1o 7mw i t ha n o d i ca n dc a t h o d i cp r o c e s s e s ，r e s p e c t i v e l y a tl o w e r w o r k i n gp o t e n t i a l ，o x h i 冲n 觚o - c a c 0 3b i e n z 舯a t i cs y s t e l l le x h i b i t e de x c e l l e n t s e l e c t i v i t y ；t h ee l e c 仃0 d ew a si n 舐t o w a r d sa s c o r b i ca n d 嘶ca c i dp r e s e n t m o r e o v m e p e 肌e a b i l i t yo fe 1 1 z y i n e n a n o - c a c 0 3w a se v a l u a t e db ym eu s eo fr o t a t i n gd i s k e l e c t r o d ev o l t a m m e t r y 3 x a n t h i n e o x i d a s e l a p o n i t en a n o p a r t i c i e s i n l m o b i l i z e do n g l a s s y c a r b o ne l e c t r o d e ：d i r e c te l e c t r o nt r a n s f b ra n dm u l t i e l e c t r o c a t a l v s i s mt h i sw o r k ，c o l l o i d a l l 印o n i t en a n o p a f t i c l e sw e r e 如r t h e re x p a n d e di m ot h ed e s i g n o fm e t h i r d - g e n e r a t i o n b i o s e n s o r d i r e c t e l e c t r o c h e i l l i s t w o fm e c o m p l e x m o l y b d o e n z y m ex a j l t h i n eo x i d a s e ( x n o x ) i m m o b i l i z e do n 酉a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) b yl a p o n i t en a n o p a r i _ i c l e sw a si n v e s t i g a t e df o rt h ef i r s tt i m e x n o ) 【l a p o n i t et h i n f i l mm o d i f i e de l e c t r o d es h o w e do n l yo n ep a i ro fw e n - d e f i n e da n dr e v e r s i b l ec y c l i c v 0 1 t a m m e t r i cp e a k sa t t 曲u t e dt ox r n o x - f a dc o f a c t o ra ta b o u t - o 3 7 0vv s s c e ( p h 5 0 ) t l l ef o m a lp o t e n t i a lo f 0 x f a d f a d h 2c o u p l ev 撕c dl i n e a r l yw i t ht h e i n c r e a s eo fp hi nt h er a n g eo f4 o - 8 0w i t has l o p eo f 一5 4 3m v p h ，w l l i c hi n d i c a t e d t h a t 似。一p r o t o n t r a n s f 打w a s a c c o m p a n i e d w i t ht w o - e l e c t r o nt r a n s f 打 i nt h e e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n m o r ei n t e r e s t i n g l y ，t h ei m m o b i l i z e dx i l o xr e t a i n e di t s b i 0 1 0 酉c a la c t i v i t yw e ua n dd i s p l a y e da ne x c e l l e n te l e c t r o c a t a l ”i cp e r f o 姗a n c et ob o m t h eo x i d a t i o no fx a n t h i n ea n dt h er e d u c t i o no fn i t r a t e t h ee l e c t r o c a t a l y t i cr e s p o n s e s h o w e dal i n e a rd 印e n d e n c eo nt h ex a n t h i n ec o n c e n t r a t i o nr a n 西n g 丘d m3 9 10 。8t o 2 1 1 0 巧mw i t had e t e c t i o n1 i m i to f1 o l o 8m b a s e do ns n = 3 j = 燕娜：纳米材料摹黄嘌岭氧化酶l 乜极 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 0 些a 卵 j 签字日期：研年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名： 寻童唧 f 导师签名： 签字日期：锄。9 年占月哆日 签字日期：l 月f 夕日 q 伊产和冲 燕娜：纳米村科摧黄嘿呤钒化确l u 撤 第一章绪言 生物传感科学是一门新兴的学科，它是生物工程和各种技术学科的相互渗透， 涉及到生物化学、电化学、固体物理学、微电予学和纤维光学等川( 见图11 ) 。自 2 0 世纪8 0 年代起，国际上对生物传感器进行了广泛的研究和探索，特别是近些年 来，已经研制出一系列在环境监测、临床检验和生化分析等方面具有实用价值的 生物传感器【“】。新的快速分析方法、新的生物仪器设备的来源、生物传感器与纳 米技术、信息技术、微电子技术的交叉，将促使更多、更新的生物传感器的产生。 未来的生物传感器将会和计算机紧密的结台，能够自动采集、处理数据，更科学、 准确地提供结果，并且实现采样、进样、虽终完成检测的自动化系统。 列曩曼 凳篡悖”p 删栅叫毒 受e r 豳删 f 蟾1 1 1 n i e 州e ds ”t e mo f b i o m a t e n a l sa n d e l e c t r o n l c f o r b l o e l e c 曲n l c s la p p h c a h o n 州 _ 耋 。 “ 一 旷弘忏忙忙。 l 一 池 一 ，一痧臣o 零宇a m n 9 2 扬州大学硕i ：学位论文 1 1 黄嘌呤氧化酶的研究 1 1 1 黄嘌呤氧化酶的研究历史和进展 1 9 0 2 年，s h a r d i n g e r 等人发现新鲜牛奶中含有一种物质，可使加入醛类的美兰 或靛蓝溶液褪色，而加热过的牛奶则没有这种特性，这种区分鲜奶和加热牛奶的 反应被称为沙尔丁格( s h a r d i n g e r ) 反应，这种物质后来被命名为沙尔丁格酶。但是 一直以来对此酶的性质无法获得进一步了解，直到1 9 2 6 年，d i x o n 等人用部分纯化 的黄嘌呤氧化酶( x a n m i n eo x i d a s e ，x n o x ) 进行了化学动力学的分析之后，发现 x n o x 除了可以催化氧化美兰、次黄嘌呤和黄嘌呤外，还可以与醛类物质发生氧化 反应，与沙尔丁格酶性质完全相似，这才第一次提供了沙尔丁格酶就是黄嘌呤氧 化还原酶的证据【5 1 。黄嘌呤氧化还原酶( x a n t h i n eo x i d o r e d u c t a s e ，x o r ) 属于含钼脱 氢酶黄素蛋白家族成员，它是黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s e ，x n o x ) 和黄嘌呤脱氢 酶( x a i l t h i n ed e h y d r o g e n a s e ，x d h ) 两种不同存在形式的统称，其主要作用于嘌呤代 谢过程【6 1 。一直以来认为x i l o x 主要在生物体的嘌呤代谢中起作用，最近的研究发 现x n o x 在脂肪合成、消化道抑菌、先天免疫、心血管疾病和缺血再灌注的损伤等 方面都发挥着重要作用，越来越引起人们的重视【7 1 。 1 1 2 黄嘌呤氧化酶x n o x 的分子结构与组成 黄嘌呤氧化酶广泛的存在于哺乳动物的组织中，特别是在肝脏和肠道都具有 较高水平。而且不同来源的x i l o x 均为分子量为3 0 0k d a 的蛋白质，它是由催化活性 相互独立的两个完全对称的亚基构成。每个亚基分子量为1 4 7k d a ，全长1 3 3 3 1 3 5 8 个氨基酸，具体数目依不同物种而定。两个亚基相互作用形成一个蝴蝶形的复合 体，硫化基团对维持酶活性是必须的。x n o x 分子由三个氧化还原中心组成，包括 一个钼喋呤辅因子、两个不同的2 f e 2 s 中心和一个核黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子 ( f a d ) 【8 】( 图1 2 ) 。从x n o x 的三维结构中可以看出这四个氧化还原中心几乎呈线 性排列。其中的钼原子是以喋呤铝复合物的形式存在，可以是价、v 价或价【9 】。 实验证明x n o x 中铁原子、不稳定硫原子、钼原子和f a d 中心的摩尔含量之比为4 ： 4 ：】：1 【10 1 。 燕螂：纳米村科幕前嘌呤钒化酶咆扳 a b 矗 f i 9 1 2 ( a ) m 0 1 e c u l a rs l n l c m r eo f 血ex n o x d hd l m 盯d i d e di n 协l h ei h 嫩m 面o r d o m a l i l sa n dt w oc o m c c m gh p s ( b ) f o rc l a n t y ，血ea n a n g m e l l to fm ec o f k t o ba n d s “t c m a k1 n o n es u b u n l to f x n o x ，) ( d ha rp r e s e r i t e dt h em o l o ni sl ng r e ，t h e 仳l n o n s p 证1 1 9 址b l u e ，a n d l h es u l 鼬a t o i i 】s l ny e l l o w 1 1 3 黄嘌呤氧化酶的一般特性 黄嘌呤氧化酶能够加速嘌呤、嘧啶、蝶呤、乙醛及许多氮杂环底物的还原反 应，这些底物都有相似的分子量和还原中心。黄嘌呤氧化酶有一种可相互转化的 形式即黄嘌呤脱氢酶( x d h ) 存在，这两种形式都能够还原氧分子，但相对而言黄嘌 呤氧化酶的活性更强，而黄嘌岭脱氢酶还能够还原n a d + 。这些反应都发生在黄嘌 岭氧化还原酶的铝蝶岭中心，电子通过两个f e s 中心传递到接黄素腺骠岭二核苷酸 f f a d l 的异咯嗪环。在人类的代谢过程中，黄嘌呤氧化酶能够催化嘌呤代谢过程中 的最后两步，即将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和将黄嘌呤氧化为屎酸和过氧化氢，其 中钼喋呤中心是黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的关键位点。 另外，x n o x 还有其他的一些特性，不同物质提取的x n o x 性质稍有区别。例如 牛乳中提取的x n o x 的等电点是53 5 4 ，屉高吸收峰在2 8 5n r n 处，最适口h 在8 _ 3 左右， 当p h 在酸性范围内时，酶活性随p h 的下降而降低，当p h 高于1 01 5 时，则酶活性随 口h 的升高而急剧下降【1 。酶的最适温度为3 5 左右，2 5 - 3 5 之问酶较稳定。 4 扬州人学硕j j 学位论文 1 1 4 黄嘌呤氧化酶的提纯和来源 x n o x 的主要来源是鲜乳和奶油，并且能够从中大量纯化出来。b a l l 首先发现 x n o x 存在于奶油中，找到了一种纯化的方法，但此类方法需要蛋白酶水解释放 x n o x ，后来又出现一种不需要蛋白水解的方法，避免了对x n o x 的降解，但仍含有 一些低分子量的多肽。 现在发展了采用m f g m 作为原始材料，在高浓度的还原剂存在下溶解x n o x ， 然后用硫酸胺分级沉淀，再通过透析和。d e a e s e p h a r o s e 层析，此种方法纯化出 的酶活力达到2 5u 1 1 i t s m g p r 0 【12 1 。国内也研究了不同对x n o x 的提取方法，如用聚苯 胺膜从牛乳中直接分离x n o x 【13 1 ，以及胰酶消化丁醇与硫酸铵分级处理硫酸铵盐 析凝胶吸附s e h p a d e xg 1 5 0 柱层析纯化工艺从新鲜牛奶中提纯高活性的x n o x f l 4 】 等等，各有其优异的特点。在本文中因为需要对x n o x 的电化学性质进行精确地比 较和分析，故使用购于s i 舯a 公司的纯化x n o x 试剂。 1 1 5 黄嘌呤氧化酶的生理功能 黄嘌呤氧化酶在人体中具有重要的作用，主要由于其参加的生理过程： ( 1 ) 参与机体内核酸的分解代谢。 人体的尿酸主要由细胞代谢分解的核酸和其他嘌呤类化合物以及食物中的嘌 呤，经酶的作用分解而来。但是人体内尿酸聚积过多，会引起痛风，而双氧水则 对人体细胞有严重的损害作用【1 5 】。尿酸是核酸的组成成分即腺嘌呤与鸟嘌呤在人 体内进行分解代谢的最终产物。次黄嘌呤和黄嘌呤是尿酸的直接前体，在黄嘌呤 氧化酶作用下，次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，黄嘌呤氧化为尿酸和双氧水。 ( 2 ) 促进铁的吸收与转运。 黄嘌呤氧化酶在小肠黏膜细胞中可以将从食物中吸收的亚铁离子氧化成高铁 离子，高铁离子与血浆转铁蛋白结合后被吸收至血液中，接着被输送到各组织【1 6 】。 1 1 6 黄嘌呤氧化酶的应用 ( 1 ) 与肝脏疾病有密切的关系。 f 燕娜：纳米材料基黄嘌呤氧化酶i 乜极 x n o x 广泛分布于人体心、肺、肝脏、小肠粘膜等组织细胞浆膜内，血清中 的x n o x 主要来自于肝细胞 1 7 18 1 。经研究证实，在通常情况下，此种酶的9 0 以黄 嘌呤脱氢酶( x d h ，d 型) 的形式存在，它是x n o x 的前体，相对无活性。但当组织 处于缺血缺氧等病理情况下，就可以转化为该酶的另一种形式x n o x ( o 型) ，使 活性大大提高并催化组织中由于缺氧不能进一步代谢和分解而积聚的黄嘌呤的氧 化反应，最终产生大量的自由基。自由基被认为是组织损伤的主要分子机制之一 f 1 9 】。有动物及临床研究证实【2 0 之3 1 ，钙超负荷是肝缺血再灌注的重要始动因素之一。 实验证实肝缺血再灌注的发生发展与x n o x 活性的增强及其引发的脂质过氧化反 应密切相关【2 4 】。 ( 2 ) 黄嘌呤氧化酶作用产物的抗菌作用。 目前有两种不同观点关于x n o x 活力的改变对肿瘤发生、发展过程中的作用： 一种观点认为肿瘤组织内x n o x 活力增加引起自由基产生增多，既能诱发肿瘤，又 能促进肿瘤生长；而另一种观点认为肿瘤组织中x n o x 活力增高是机体发生肿瘤后 的一种保护性反应，目的是为了产生更多的自由基，以杀伤肿瘤细胞，实验也证 明加入x n o x 抑制剂后肿痈再彦长大1 2 4 1 ，一峰化疗药物可勺x n o x 产乍的向f 1 节许 都说明x n o x 催化次黄嘌呤产生的自由基确实有杀伤肿瘤细胞的作用。因此，对黄 ( 3 ) 测定鱼的新鲜度 随着鱼死亡时间的增加，其体内所含的次黄嘌呤和黄嘌呤的量也相应增加， 因此可以通过x i l o x 对两者的催化氧化作用来测定鱼类的新鲜程度。具体测定方法 是：室温下取出不同死亡时间的鱼肉，放在研钵中加入充分研磨，并加入适量的 二次水，以充分溶解鱼肉中的次黄嘌呤和黄嘌呤。然后将处理好的鱼肉装移入5 0 m l 容量瓶中，用二次水定容后，用滤纸过滤，滤液即可用来测定。可以测定出鱼 度【2 5 1 。这种方法在本论文中也有详细实验过程和叙述分析。 6 扬州人学硕i ：学位论文 1 1 7 黄嘌呤氧化酶的抑制剂 由于黄嘌呤氧化酶的结构非常复杂，因此很多物质都可以对其活性进行抑制。 如嘌呤、嘧啶和其它杂环的物质可以与底物竞争酶的活性部位，这种抑制剂称之 为竞争性抑制剂，而亚砷酸盐、氰化物、甲醇等化合物则可与酶的钼原子中心作 用，使酶失活。其它抑制剂包括磷酸盐、咪唑、钠、氯化钾、苯甲酸盐、硼酸盐、 铜、抗坏血酸和二硝基苯酚【2 6 】等物质与酶的作用为其他方式，其中抗坏血酸对黄 嘌呤氧化酶的抑制作用是间接作用，牛奶中含有二价铜离子，而抗坏血酸可把c u 2 + 还原成c u + ，而c u + 是酶的强抑制剂 2 7 】。自上世纪6 0 年代以来，别嘌呤醇作为唯一 上市的黄嘌呤氧化酶抑制剂一直用于治疗痛风和高尿酸血症的治疗。长期的临床 应用表明，别嘌呤醇对痛j x l 具有良好的治疗效果，临床指导剂量为5 0 4 5 0m 天。 别嘌呤醇在体内半衰期为1 2h ，随后被代谢为奥西嘌呤【2 8 】。在本文中亦使用别嘌 呤醇作为x n o x 的抑制剂来研究抑制作用。别嘌呤醇作为嘌呤的类似物，通过与氧 化态的黄嘌呤氧化酶在钼蝶呤辅酶活性位点结合，竞争性地抑制了黄嘌呤氧化酶 与天然嘌呤碱的结合，阻断了从次黄嘌呤到尿酸的代谢途径。 1 2 生物传感器简介 根据近年来对生物传感器的研究，更加舰范了其定义。生物传感器即生物电 极是以固定化的生物成分( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物膜等) 或生物体本 身r 细胞、微生物、组织等) 为敏感材料，通过各种物珥! 、化学信号换能器捕捉席物 现对目标物定量测定的分析仪器【2 9 1 。 它利用生物物质作为识别元件，将被测物的浓度与可测量的电信号关联起来， 并将生物体功能材料( 酶、底物、抗体、抗原、微生物组织j 动物细胞等) 固定 化处理，当待测物质( 酶、底物、辅酶、抗体、抗原、抗菌素、维生素等) 与分 子识别感受器( 即接受器) 相互作用时，发生物理或化学变化，换能器件将此信 号转变为电信号等，从而检测出待测物质的浓度。 _ ：燕娜：纳米材料基黄嘌岭钒化酶l 乜极 7 1 3 酶生物传感器的应用和研究 生物传感器有很多类型，其中酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的 一种类型，而应用纯化的酶制备生物传感器可以省去提纯酶的繁杂步骤。生物酶 的种类繁多，把酶固定在电极上可以制成各种各样的酶生物传感器来检测底物， 如：葡萄糖、半乳糖、尿酸、肌氨酸、抗坏血酸、胆固醇等。目前达到实用水平 的酶传感器已有2 0 0 种以上，广泛用于生物、医药、化工等领域。 依据酶与电极之间的电子传递机理大致将酶电极生物传感器分为三代：第一 代生物传感器根据天然介体氧的催化机理进行反应的；第二代生物传感器是将诸 如二茂铁、铁氰化钾等化学介体或特定生物分子作为媒介体掺入酶层中，代替或 减小溶解氧的干扰；第三代生物传感器是指在无氧气无介体存在下，利用生物活 性酶与电极问的直接电子传递制作的生物传感器【3 0 1 。 第一代生物传感器( 图1 3 a ) 常常采用共价交联法可以有效地减少或防止敏 感基元从载体上脱落，提高传感器的稳定性；在反应中天然介体氧直接参与酶促 反应，通过电子在反应中心与电极表面之间的传递，实现生物化学反应信号向电 信号的转换，但是由于直接的电子传递过程较慢，传感器对底物敏感性不够理想， 而且传感器容易受到坏境氧浓度的影响。此外，在第一代生物电极反应的过程中， 需要较高的极化电位，一般在o 5 o 8 v 【3 1 0 3 1 ，在如此高的电位下进行氧化测定， 试样中共存的其它电活性物质，如抗坏血酸( v c ) 和尿酸等，也可以在此电位下 氧化而产生氧化电流，给测定带来干扰，因此该方法的灵敏度和选择性相对较差。 第二代生物传感器( 图1 3 b ) 采用一种化学介体或特定生物分子取代0 2 h 2 0 在酶促反应中和电极之间进行电子传递，因此在传感器构建之前需要选取具备条 件良好的介体【3 4 】。经过掺杂介体物质的第二代生物传感器，具有以下的优点：在 实际操作时只需较低的极化电位，就能使介体氧化，因而减少了其它具有较低氧 化还原电势物质干扰电极过程的机会；并且媒介质一般不与氧气起反应，使得传 感器对氧气不敏感，能够在缺氧或者氧浓度易变化的条件下使用；第二代生物传 感器采用一些非生理的氧化还原媒介体如二茂铁及其衍生物等代替氧，加强了酶 与电极问的直接电子传输作用，起到了酶与电极之间的电子闭丌器作用，加速了 扬州人学硕l ：学位论文 电极反应，降低了环境干扰。但另一方面，目前第二代电流型传感器还存在着介 体流失、电极污染及一些电活性物质的干扰等问题。在本文中还构建了第二代的 双酶传感器，在电极表面不只使用一种酶作为反应催化剂，在后面的章节中会有 具体的介绍。 a i m m o b i l i z e de n z v m e 魏每褫： ，? ：。一? 一j 一- ：，：i t ，l 砖毫。0 。i 一? 。十一、一，：，i ：o 、+ ：e l e e t r o d e l i o 二。l ：。1 二j 。? r ， ? ：，? ，| ，i ，l ，i ，t i ，。? + ，。 。，t t ，+ ，t 一? | ，7 | 一 ：一 b ； ； s o l u t i o n ： ： d 1 o d u c h _ - 。 ： p r o d u c t i i m m o b i l i z e de n z v m e + m e d i a t o r ? + 。，。| 。? ? 7 | ? l ，、，：二。，i + ，2 一，：。，、 。：一：一，：，。| ，、，i 一， i + 7 ，7 | 一? 。，。：，2 ， 、；秀乏荡影 。i 。 c o f h c t o r ； ； i s o l u t i o n ； ； ； m 帐小，尹蛐b s t r a t e 一a l 件d 一一 v f j i l h l | | i ； i i m m o b i l i z e d ； s o l u t i o n ： 黪缓缪 。e 玉e e t r o d e 臻0 1 0 钱： 萎戮荔 u b s t r a t e d r o d u c t f i g 1 3s c h 锄a t i cr e p r e s e n t a t i o no fd i f f 酥m tb i o s 朗s o rg e i l e r a t i o n ：( a ) m e 矗r s t g e n e r a t i o n ，( b ) t h es e c o n dg 即e r a t i o n ，( c ) t h et h i r dg 锄e r a t i o n j ：燕娜：纳米材料箍黄嘌呤钒化酶i u 极 9 第三代生物传感器( 图1 3 c ) 是指在无氧气和媒介体存在下，利用酶与电极间 的直接电子传递作用设计制作的酶传感器。2 1 世纪发展的生物传感器多为第三代 产品，直接电化学生物传感器主要用于解决酶等生物识别元件与电极之间的低效 率通讯的问题。随着微加工技术和纳米技术的进步，生物传感器不断地向微型化、 集成化方向发展，便携式测试仪已得到快速发展。与前两代生物传感器相比，第 三代生物传感器既不需要氧分子，也不需要化学介体分子作为电子传递体，通常 还不需要固定化载体，而是将酶分子直接吸附固定到电极表面，使酶的氧化还原 活性中心与电极进行直接“交流”，能够更快地进行电子传递，从而使酶电极生物 传感器具有更快的响应速度、更高的灵敏度，成为真正的“无试剂分析”。目前研 究较多的是辣根过氧化物酶与电极的直接电子转移行为【3 5 ，3 6 1 。 1 。3 1 酶生物传感器的固定化方法 在酶生物传感器中最主要的一个元件是固定化的生物酶敏感膜，因此酶复合 膜的固定一直是生物传感器研究的关键环节之一【3 7 1 。固定生物传感器中的酶复合 膜，将减少酶失活的可能性，因此制成的电极也更稳定，使用寿命更长，利用率 更高，所以酶的固定化技术与酶生物传感器结构的巧妙设计仍是该领域今后研究 的重要方向。目前已有的固定化方法有吸附法、化学交联法、共价键合法、电化 学聚合法、物理包埋法和分子自组装等。 1 3 2 酶生物传感器的固定化材料 固定化材料也是生物传感器的一个重要组成部分，对于传感器的分析性能有 着至关重要的影响，固定化酶活性的保持直接取决于选择的材料和固定化方法。 目前为了保持酶活性的稳定性和长期性，需要致力于寻找具有化学性质稳定、高 度亲水性能、较好的生物相容性的材料。常用固定化材料有有机、无机聚合物、 凝胶以及各种天然生物材料等。吸附法多以无机材料为载体，主要包括无机黏土 【3 8 或】、多孔玻璃f 4 3 1 、氧化铝f 4 9 】及活性炭【5 0 】等。包埋法多以天然或合成的聚合物凝 胶为载体，如藻酸斜删、树脂【4 5 1 、聚乙烯副4 6 1 、聚丙烯酰胺【4 7 】等。 扬州大学硕l 学位论立 l a 口o n i t e ，将对这三种材料的具体性质作详细介绍。 1 3 2 1 纳米碳酸钙( n 粕o _ c a c 0 3 ) 纳米材料有“2 l 世纪最有6 口途的材料”的美誉，根据研究显示当物质的结构 单元小到纳米数量级时会产生特异的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏 观量子隧道效应，其磁学、电学、光学和化学性质也会发生显著的变化，呈现出 一般常规材料所不具备的优越性能【4 ”。 在各种纳米材料中，n a n 0 c a c o 洇其应用普遍、价格低廉以及无毒无污染等 特性，具有更加广阔的应用前景，比如它在工业上的广泛应用，表现出较好的补 强性、优异的分散性及特殊的透明性。而且n a n o c a c o ，表现出远胜于普通碳酸钙 的一些特性，比如大的比表面积、亲水性、表面能高、多孔性以及生物相容性等， 这些优点都非常有利于酶或蛋白质的固定，并且能够很好地保持固定酶的生物活 性，已经引起了广泛的研究兴趣。这种纳米载体材料提供的良好微环境能很好的 保持酶活性并且大大加速了酶活化中心与电极界面间的直接电子交换，而且酶 的催化性能没有受到纳米载体材料的阻碍”。 1 3 2 2 类水滑石( l d h s ) f 嘻1 4 n l es 咖c n j r eo f h y d f o f a l c l t e 4 f k c 类水滑石( l d h s ) ，是一种阴离子粘土，其基本构造单元是八面体，在每一个 = l ：燕娜：纳米材料桀黄嘌呤氧化酶i 【l 极 八面体中，中心是金属离子，六个顶角是氢氧根离子，相邻八面体之间靠共用边 相互联结成二维延续的配位八面体结构层，单元层以面面堆叠形成晶体颗粒构成 类似层状的结构，决定了它多以片状的形态存在。目前报道中大多数合成的l d h s 的理想分子式为【m 。m 1 1 x ( o h ) 2 】i i l t 期 a n 加i l h 2 0 i 腑，其中m 1 1 和m 1 是金属阳离 子，a 是阴离子，i n t r a 和i n t e r 分别代表层内空间和层间地域，结构中类水滑石层 由共边的m ( o h ) 6 八面体构成，部分m 被m 川取代产生多余的正电荷，使得l d h s 带正电荷，晶体结构中多余的正电荷由层间阴离子平衡以维持整个分子的电中性， 层间通道中的阴离子是可交换的【5 0 j ( 图1 4 ) 。 l d h s 的层问区域是一个良好的化学反应场所，根据层板间距不同，可通过不 同实验方法插入其他化学物质，并且具有层问吸附、层间交换、层间柱撑、层间 催化、层问聚合的特性。同时l d h s 还具有耐热性、耐酸碱性和耐辐射性，因而 傲具塘人j “浆的新利科。l d h su j 自效地幽疋生物人分子，并挺供一柑廉价、伙魅、 简单的酶电极制备方法【5 l 5 2 1 ，是构制生物传感器的一种新型材料。 1 3 2 3l a p o n i t e l a p o m t e 是人工合成的锂蒙脱石，分子式为： ( m 9 5 5 l i o 5 ) s i 4 0 1 0 ( o h ) 2 ( n a 十o 7 3 n h 2 0 ) 其1 ：2 的主结构单元是圆盘结构，而每一个圆盘由两层硅氧四面体之问央着 一层铝氧八面体而构成的晶层，四面体和八面体的顶端共享氧原子，结构单元之