（有机化学专业论文）无机磷试剂辅助下氨基酸反应的多样性研究.pdf

摘要 氨基酸缩合成肽反应是生命起源过程中的一类重要反应，而磷元素在生命起 源和生命活动过程中起到不可获缺的作用。因此，研究氨基酸在无机磷试剂辅助 下成肽的反应多样性，对于理解生命化学过程和生命起源均具有重要意义。 在无机磷试剂辅助下，氨基酸可以通过自组装反应形成多肽，且随着反应时 间的延长，所形成的肽链的长度也随之增加。研究发现，通过适当改变反应条件， 氨基酸在无机磷试剂辅助下不仅能缩合成肽，而且能生成氨基酸氢膦烷和环肽。 这个结果表明了氨基酸在无机磷试剂辅助下成肽反应的多样性和复杂性。 本文主要研究了氨基酸在无机磷试剂辅助下生成氨基酸氢膦烷和环肽的反 应。并利用高效液相色谱，核磁共振，电喷雾质谱，x 射线衍射等现代分析手段， 对产物进行了结构鉴定分析，并且对产物的电喷雾质谱裂解规律进行了分析。主 要成果如下： 以具有非极性侧链的a 氨基酸和三氯化磷为原料，加入三乙胺作为缚酸剂， 合成了7 种氨基酸氢膦烷，对其反应条件和提纯方法进行了优化，该方法对于氨 基酸氢膦烷的合成具有产率高，条件简便，产物单一等优点。在此条件下所得到 的氨基酸氢膦烷是一对非对映异构体，利用重结晶和制备液相色谱等技术，探索 了提纯单一构型产物的方法，得到了部分单一构型的产物。利用离子阱多级质谱 的功能对氨基酸氢膦烷负离子的质谱裂解特征进行了详细地研究，同时利用高效 液相色谱对氨基酸氢膦烷的构型进行了研究，用丙酮作为溶剂得到了缬氨酸氢膦 烷的单晶，运用x 射线衍射技术分析了缬氮酸氢膦烷的晶体结构，并确定了所 得缬氨酸氢膦烷的构型。 以具有非极性侧链的( i t 氨基酸和三氯化磷为原料，合成了7 种环二肽。和 以往的环二肽合成方法相比，该方法具有不需要保护，步骤简单等优点，为探索 新的环二肽合成方法奠定了一定的基础。同时利用液相色谱对所得环二肽进行了 分析鉴定，建立了相应的环肽液相色谱分柝方法，并利用电喷雾质谱对环二肽的 砸、负离子质谱裂解特征进行了研究，为相应的环肽化合物的质谱鉴定提供了一 定的依据。 关键词：氨基酸，氢膦烷，环二肽，电喷雾质谱 郑州大学硕士掌位论文 a b s t r a c t p e p t i d ef o r m a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tr e a c t i o n si np r e b i o t i ce v o l u t i o n m o r e o v e r , p h o s p h o rp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np r e b i o t i ce v o l u t i o na n di np r o c e s so f t h el i f e t h e r e f o r e , i ti sv e r yi m p o r t a n tf o rc o m p r e h e n d i n gt h ep r o c e s so f b i o c h e m i s t r y a n dt h eo r i g i no fl i f et os t u d yt h ed i v e r s i t yi nt h e 螂e 蟠o f p e p t i d ef o r m a t i o nf r o m a m i n oa c i d sa s s i s t e db yi n o r g a n i cp h o s p h o r u sr e a g e n t s s e l f - a s s e m b l yp e p t i d ef o r m a t i o nd i r e c t e db yi n o r g a n i cp h o s p h o r u sr e a g e n t sf r o m a m i n oa c i d sh a sb e e ni n v e s t i g a t e di nd e t a i l a m i n oa c i d sc o u l da s s e m b l ei n t o o l i g o p e p t i d c s ，f u r t h e r m o r e , a st h er e a c t i o nt i m ew a sp r o l o n g e d ，t h el e n g t ho ft h e p e p t i d e sw a si n c r e a s e d i tw a sf o u n dt h a ta m i n oa c i d s ，m e d i a t e db yp h o s p h o r o u s r e a g e n t s ，n o to n l yc a l la s s e m b l ei n t oo l i g o - p e p t i d e s ，b u ta l s oc a l lp r o d u c ec y c l i c p e p t i d e sa n da m i n oa c i dh y d r i d o p h o r a n e t h i sr e s u l tr e v e a l st h ec o m p l e x i t ) , a n d d i v e r s i t yi nt h ep r o c e s so fp e p t i d ef o r m a t i o nf r o ma m i n oa c i d sa s s i s t e db yi n o r g a n i c p h o s p h o r u sr e a g e n t 。 i n t h i st h e s i s ，t h er e a c t i o no fa m i n oa c i d sa s s e m b l i n gi n t oc y c l i cp c p t i d e sa n d a m i n oa c i dh y d r i d o p h o r a n ed i r e c t e db yi n o r g a n i c p h o s p h o r u sr e a g e n t sw a ss t u d i e db y n m r ，e s i m s ，h p l ca n dx - r a yt e c h n i q u e s m o r e o v e r , t h em a s ss p e c t r o m e t r y c h a r a c t e r i s t i c so f t h er e l a t e dc o m p o u n d sw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i lf o rt h es t r u c t u r a l e l u c i d a t i o n 田1 er e s u l t so f t h et h e s i sa r ei l l u s t r a t e da sf o l l o w s ： s t a r t i n gf r o ma - a m i n oa c i d sa n dp h o s p h o r u st r i c h l o r i d e , s e v e r l ta m i n oa c i d h y d r i d o p h o r a n e sw e r es y n t h e s i z e du s i n gt r i e t h y l a m i n ea sa n t a c i d s t h em e t h o dh a s t h eh i g h e ry i e l d sa n ds i m p l e rr e a c t i v ec o n d i t i o n sf o rt h es y n t h e s i so fa m i n oa c i d h y d r i d o p h o r a n e s i n c et h ep r o d u c t so fa m i n oa c i dh y d r i d o p h o r a n ea r on o r m a l ya d i a s t e r e o i s o m e r , t h em e t h o do fs e p a r a t i o nf o rap u r ei s o m e rw e r ee x p l o r e db yh p l c a n dr e c r y s t a l l i z a t i o n f u r t h e r m o r e , t h ec o n f i g u r a t i o n so fa m i n oa c i dh y d r i d o p h o r a n e s w e r ei n v e s t i g a t e db yh p l c o n eo ft h ea b s o l u t es t r u c t u r eo fv a l i n eh y d r i d o p h o r a n e w a sd e t e r m i n e db yt h eh e l po f x - r a yd i f f r a c t i o na n a l y s i s t h em s m sf r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i z a t i o n so fa m i n oa c i dh y d r i d o p h o r a n c sw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i la n dt h e i r 郑州大掌硕士掌位论文 f f a g m e n t a t i o np a t h w a y sw e r es u m m a r i z e d s e v e nc y c l i cd i p e p t i d e sw e r es y n t h e s i z e df r o mt h er e a c t i o no fa - a m i n oa c i d sa n d p h o s p h o r u st r i c h l o n d e c o m p a r ew i t ht h ep r e v i o u sm e t h o do ft h es y n t h e s i so fc y c l i c d i p e p t i d e , t h em e t h o dd o e s n tn e e dt h ep r o t e c t i o no fa c t i v eg r o u pa n dh a so n l yo n e s t e p ri sh e l p f u lf o ru st oe x p l o r ean e wm e t h o df o rt h es y n t h e s i so fc y c l i cd i p e p t i d e f u r t h e r m o r e ，t h em s m sf r a g m e n t a t i o nc h a r a c t e r i z a t i o n so fc y c l i cd i p e p t i d e sw e r e i n v e s t i g a t e di nd e t a i la n dt h e i rf r a g m e n t a t i o np a t h w a y sw e r es u m m a r i z e d k e y w o r d s ：a m i n oa c i d ，h y d r i d o p h o r a n e , c y c l i cd i p e p t i d e ，e s i - m s 郑州大掌司e 士掌位论文 第一章前言 1 1 生命起源中成肽过程的研究 在生命起源中的化学进化过程中，由生物小分子组装成生物大分子是生命起 源漫长历程中的一个重要环节。组成生命的基本物质一蛋白质和核酸是生命体中 最重要的生物大分子。蛋白质是生命体系中最主要的功能分子，而氨基酸则是蛋 白质的基本结构单元。在生命起源初期，这些单个的氨基酸是如何组装成肽、进 而形成蛋白质的，一直是人们探求的关键问题。 研究者们进行了大量地探索，研究如何从氨基酸单体缩合形成肽和蛋白，其 中能量的来源主要是热能和化学能。此外还有一些假说，认为先是非氨基酸的小 分子聚合成为链状多聚物，再由其他反应形成侧链。基于1 9 5 0 年u r e y s 的观点， s t a n l e y m i l l e r 进行了一系列的实验，结果显示f i 】，包含甲烷、氢气、氨、水和其 它一些简单的小分子的气体在原始地球的条件下受到放电和热能的作用可以生 成氨基酸，并由此奠定了“生命起源化学”的基础。后来m i l l e r 的实验结果被不 同的研究小组在不同的实验条件下( 不同的大气组成，不同的能量源等) 重复出 来，并且可以生成更多的前生命小分子，如糖、核苷碱基等【2 翔。因此，对原始 条件下成肽的研究依然集中在氨基酸缩合聚合反应上。从氨基酸缩合成肽的反应 是可逆的，正反应需要脱去一分子水，在水溶液中是一个热力学上不利的反应， g 为耻1 7k j m o l ，因此需要有能量的来源。在生物体内合成时的能量来源是a t p ， 那么，在生命起源的过程中，形成肽键的能量从何而来? 具有催化功能的肷或蛋 白如何演化形成? 这些都是需要进行大量的实验研究。迄今为止，关于原始条件 下肽键的形成人们进行了大量的研究，由不同缩合试剂诱导的均相氨基酸缩合是 其中一类重要的氨基酸“缩合反应”。 1 1 1 缩合试剂诱导氨基酸缩合 早期的研究者提出了一些可能用于生命起源的缩合试剂，包括氰氨、二氰氨、 氰基胍、二氨基马来腈、咪唑等。以氰氨为例，它可以由紫外光照射n h 4 c n 水 郑州大掌司e 士掌位论文 溶液或 r 射线照射k c n 水溶液生成，在星际空间也已观测到它的存在。它在酸 性条件下可以与氨基酸的羧基反应使之活化，继而发生成肽反应( 图1 1 ) 【4 1 。 h 2 n c 三n ! ! 二_ h 2 n c - = 南h h 2 n t = n h h 2 南= c = n h + 曰一 +曰，n h 2 h s “一手h 2 n - e = n h 一h a “p o 一n r r h + q n h 2 9+曰曰 星 心f l c h - 芒- o - c , n h , 州2 ”p 洲+ 卅r c h - c - h n - r d 洲+ h 2 n 足n h 2 图1 1 氰氨催化氨基酸的成肽反应机理 刘日河等人发现氧化- 酰化反应( o x i d a t i v ea c e t y l a t i o n ) b 以很高的产率生成 肽键。硫代乙酸本身用作酰化试剂产率极低( o 5 ) ，但是当加入弱氧化剂如 k i 1 2 ， f e ( c n ) 6 3 + 或f e 2 + 0 2 ( 即在氧气存在的条件下加入f e 2 + ) 时，它迅速被氧 化为二聚硫代乙酸( 通过二硫键连接) ，这是一个很好的酰化试剂，常温下它能迅 速地定量酰化氨基。这样的反应物和反应条件在前生命时期是完全可能存在的 ( 图l 艺) 【5 1 。 r 一l 一一s * r - - n h 2 + ( r 0 8 一s 毛簋一r 墨一h n 州+ r o 苎一s s h r 一n h 。+ r l 一。一s h - j ! ! 。r g h n r ，+ h s s h 图1 2 氧化酰化反应导致成肽的过程 w a c h t e r s h 狲e f 等人的研究发现共沉催化剂( n i ，f e ) s 和c o ( 压力约为lk b a r ) 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 共同作为催化剂及缩合剂，在1 0 0 。c 、p h = 7 1 0 水溶液的厌 氧性条件下，氨基酸可以被活化从而缩合成肽。某些氨基酸在不同的条件下生成 不同构型二肽的总收率为0 2 5 。并且实验还发现，在此条件下氨基酸的缩合 以及二肽的水解为一平衡反应，同样条件下二肽也会发生明显的水解。同时也提 出了氨基酸在州i ，f c ) s 和c o 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 共同催化下合理的缩合机理( 图 1 3 ) 旧。 2 郑州大掌硕士掣啦论文 但是以目前的观点，在早期的地球上( n i ，f e ) s 、c o 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 共 同存在可能是局域性的，不具有普遍性，况且如此高浓度的c o 存在的可能性更 是令人怀疑的 7 1 。另外未有报导显示在这样的条件下可以形成氨基酸，因此就提 出了一个新的问题：在肽的形成之前氨基酸是如何进化而来的。 a ap a 广s 一、， r o 7 c h c - o h 。 ”njc-shoj 、 f l i l i r 色r c h 秽p h q h n _ ，曲_ 一s“，u 吕 i ! l + a a + a a 弋趣一n - c 譬h c o o hr c 童- n - c 宁h - c o o hc h c n h c i ch h n h h n h - o hc = o 6 i ! i 。 a 卜。人b c 邑 拍4 。 h c o o h 图1 30 q i ，s e 、s 和c o 以及h 2 s ( 或c h 3 s h ) 催化氨基酸成肽反应机理 ( a a ：氨基酸；a a - a a ：二肽；? ：未知中间体) c o m m e y r a s 等发现氮氧化物也可能成为m 氨基酸成肽的缩合剂。他提出的 成肽途径是：甲醛、氰化氢和氨反应生成氨基甲酰心氨基酸，它与氮氧化物反应 生成氨基酸羧基混酐，混酐可以在弱碱性水溶液中聚合成肽( 图b 4 ) 【8 l 。 r c h o 一晶一。? “一 面。 “比 聿乏一电心 弋【乏。卜 h * p o h - 。h p 觳嵩_ 岬岛* - i 愚w 尘 ? 。 f 一 郑州大掌司i 士掌位论文 图1 4 氮氧化物与n 氨基甲酰氨基酸反应成肽的过程 近年的研究表明，在海底热泉附近形成的温度梯度也可能有利于有机物的形 成。处于数百个大气压下的海水，温度从热泉喷口处的4 0 0 c 迅速降到周围环境 中的0 c 左右，在这样的温度梯度下，氨基酸可以缩合成肽。k m a t s u n o 等人模 拟海底热泉的条件下获得了有趣的结果：甘氨酸在1 0 0 r a m 的较低浓度下，自发 生成了小肽。在加入二价离子如c u 2 + 以后，获得了六肽。在这个实验中，由氨 基酸生成肽的热力学平衡在高温高压下可能更偏向于成肽一边，而在高温反应器 中生成的肽进入低温容器中时由于迅速冷却而来不及发生水解反应 9 1 0 l u i s i 等人 的研究表明，脂质俸的磷脂膜也可以促使氨基酸和肽的迸一步缩合，并且磷脂膜 对疏水性的氨基酸和肽往往有较好的选择性【埘。 在前生命条件下氨基酸缩合成肽的研究中，一个全新的完全不同于以往研究 的新论点为无机盐诱导成肽( s a l t - l n d u c e dp e p t i d ef o r m a t i o n ，s i p f ) 。即在高浓度的 无机盐溶液( 最常见的是氯化钠) 中，金属离子周围的水分子数目不足以达到饱 和，那么这些“不饱和”的阳离子就有可能作为脱水试剂使用，因此能使成肽反 应的平衡向脱水方向移动。基于这样的想法，利用氯化钠作为脱水试剂在氨基酸 缩合成肽的研究中开展了大量的工作 1 1 , 1 2 1 。另外的一些理论研究工作显示二价的 阳离子可以通过和反应物的络合降低活化能，使反应进行得更快，包括碱土金属 离子和过渡金属离子。研究显示在甘氨酸和丙氨酸的缩合成肽反应中，以铜离子 为催化剂可以获得较好的结果【m ”) 。这类新的反应称为无机盐诱导成肽，并且 这是迄今为止在水溶液中最简单的成肽方法。但是由于分析方法的限制，尤其是 由于标准品的缺乏，在这类实验中检测到的肽链较短，目前七肽是反应几天后鉴 定出的最长的肽【1 6 】。 具体的反应过程可能是经过如下机理：氨基酸( 以甘氨酸为例) 与二价铜离子 形成螯合物，另一分子氨基酸以羰基氧成为铜离子的另一个配体，在中心铜离子 和另一配体水分子的共同作用下，经过质子转移和亲核反应生成甘甘二肽( 图 1 5 1 。 4 郑州大掌碍e 士掌位论文 图1 5 铜离子催化无机盐诱导成肽反应的机理 1 1 2 含磷化合物诱导氨基酸缩合 除了以上所述的各类氨基酸成肽的缩台试剂，含磷化合物( 主要是多聚磷酸 盐类) 是生命起源中氨基酸进化成肽的另外一类重要缩合试剂。1 9 9 6 年，荷兰的 a w s c h w a r t z 在第1 l 届国际生命起源会议上说，由于地球表面上磷的唯一来源 是磷灰石，溶解度太低，不足以构成生命所需的磷。他们在默奇逊陨石中鉴定出 烷基膦酸的存在，提出外源空间磷的来源，提供了早期基因物质来源的可能。 1 9 9 7 年e m a c i a 在有关原始生命条件下磷的来源及作用综述中提到：磷在前生 命起源条件下在地球上是存在的，并推断其可能是由彗星把磷引入了地球【1 n 。 1 9 8 3 年王文清用c i - h 、n 2 、n h 3 、h 2 0 、p h 3 组成的混合气体进行了氨基酸的前 生物合成i l g , 1 9 】，并与不含p h 3 的c h 4 、n 2 、n h 3 、h ：o 气体放电作了对照。对于 禽p h 3 的体系，放电后产生了1 9 种氨基酸，而不含p h 3 的体系却只生成了6 种 氨基酸。这一实验结果表明：磷可能在生命起源中早期的有机物合成阶段对氨基 酸的形成起重要作用，p h 3 可能是化学进化过程中气相和水相中的催化荆，因此 人们对在氨基酸缩合成肽的过程中含磷化合物所起的作用进行了广泛地研究。 f o x 【捌将把磷酸加热所产生的聚磷酸用于氨基酸的缩聚合反应。发现在6 5 可以发生氨基酸的缩聚合。这里磷酸具有脱水和催化的作用。但在同样条件下， 浓硫酸却不具有这种性质。由此可见，磷对于肽的合成具有重要意义。 f e l d m a n n 和r a b i n o w i t z 分别于1 9 6 9 年将多聚磷酸盐用于水中氨基酸缩合反 5 卜u y带l妒半孵l磐 2 ，斛 6 。一一 。ii卜井ii。罩ii?o-c- 。罩佣一r ) c 少+ p 2 时 hn7、夕” 。 c 卟珊一p o p o p o h - - i 、 y +o ， 女飞各占 0 0 卜c h j a a r a a - a a 一 。o p n c c hi i 州h c h o o c o 口 1 i h ill 7 郑州大掌礓士掌位论文 1 2 氨基酸五配位磷化合物 五配位磷化合物在磷化学中具有重要意义，许多三、四配位磷化合物的反应 均经历五配位磷化合物中闻体【3 2 期。例如，磷酰一弘氨基酸的四类特性反应，便 是经历氨基酸五配位磷中问体进行的。在生物化学中，五配位磷化合物也具有特 殊的重要地位，许多可作为酶底物的磷酸酯化合物的中间体便是不稳定的羟基五 配位磷化合物f 划。近三十年来，五配位磷化合物已逐渐成为一个十分活跃的研 究领域。w e s t h e i m e r 发现成环有利于五配位磷化合物的稳定 s j ，r a m i r e z 总结了 环状烷氧五配位磷化合物的形成规则，研究了环状磷化合物的结构，并报道了合 成环状磷化合物的一些方法【3 6 1 。自从五元环和六元环烷氧五配位磷化合物被看 作酶和非酶中间体或过渡态后，人们对五配位磷化合物的研究更加深入，研究内 容涉及合成方法、分子结构、生化反应等诸多方面。 1 2 1 五配位磷化合物的空间构型 x - 衍射分析、红外( 取) 、核磁( n m r ) 和拉曼( r a m a n ) 光谱研究表明， 绝大多数五配位磷化合物中磷原予所连接的五个共价键呈三角双锥构型 ( t r i g o n a lb i p y r a m i d ，即t b p ) ，只有少数化合物( 主要是双环类五配位磷化合 物) 呈四方锥型( s q u a r ep y r a m i d ，即s p ) 构型。在五配位磷化合物中，磷原子 成键的是d a p 3 杂化轨道，若参与杂化的是3 轨道，则形成t b p 构型；若参与 杂化的是3 砰产轨道，则形成s p 构型( 图l - s ) 。实验结果和理论计算均表明【3 7 耵， t b p 构型能量最低，而s p 构型能量比t b p 构型能量高约6 2 7 k u m o l ，这也是大 多数五配位磷化合物以t b p 构型存在的原因。 一k 哕b t b p s p a s p b 图l 。8 五配位磷化合物的空间构型 五配位磷化合物三角双锥结构的两个口键由两个p d 杂化轨道( 见和毋杂化) 8 lnr 郑州犬掌司e 士掌位论文 组成，互呈1 8 0 。夹角；三个e 键由s p 2 杂化轨道( 3 s 、现和璃杂化) 组成， 互呈1 2 0 。夹角。因为杂化轨道有毋而没有s 成分，所以a 键的电子云密度 较高，在形成五配位磷化合物时，吸电子基团优先占据a 位。磷酯的亲核进攻和 离去，通常发生在口位【3 9 】。 1 2 2 氨基酸五配位磷化合物的立体异构 四配位磷酰氨基酸分子中的磷原予是非手性的，但当它异构化为五配位磷化 合物后，磷原子就具有了手性，因而便产生了立体异构。螺环氨基酸五配位磷化 合物的两种立体异构体如( 图1 - 9 ) 所示嗍： o 如 c h ，普 o o 图1 9 螺环氨基酸五配位磷化合物的两种立体异构体 通过磷谱可观察到氨基酸五配位磷化合物的立体异构。g l y 分子中无手性碳 原子，所形成的五配位磷化合物为一对对映异构体，在磷谱中给出单蜂。其它氨 基酸本身即具有手性中心，所形成的五配位磷化合物为一对非对映异构体，所以， 其磷谱给出两个峰。而苏氨酸、异亮氨酸的情况比较特殊，其分子中有两个手性 碳原子，所形成的五配位磷化合物为两对非对映异构体，因而，其磷谱给出四个 降。 1 2 3 氨基酸五配位磷化合物的化学性质 氨基酸五配位磷化合物的结构决定了它们特有的化学性质。氨基酸五配位磷 化合物的化学性质非常活泼，可与带质子的亲核试剂如水、醇、胺等发生反应。 氨基酸五配位磷化合物与亲孩试剂的反应，实际上是亲核试剂进攻磷原子的取代 反应。在五配位磷结构中，磷原子具有空的d 轨道，它是很强的电子接受体，即 9 9 一 opl 一种强的l o w i s 酸。当亲核试剂沿着与离去基团成1 8 0 。夹角的方向进攻磷原子 时，反应先形成具有八面体构型的六配位磷负离子过渡态，然后离去基团离去， 其它的键经调整形成构型为t b p 的新的五配位磷化合物【4 , 4 2 1 。 氨基酸五配位磷化合物在生物化学中具有重要作用。磷所参与的绝大多数生 命化学过程，包括酶活性调节过程中酶蛋白的磷酰化和去磷酰化、信息传导过程 中蛋白的磷酰化与去磷酰化、a t p 的能量转移、r n a 的自体切割等，其化学本 质都是磷酰基转移反应。磷酰基的转移反应并不是简单的取代反应，而是经历一 个五配位磷化合物中间体来完成的1 4 3 1 。 1 2 4 氢膦烷 在五配位磷化合物中，存在着一类特殊的五配位磷化合物一氢膦烷。它是指 一类含有p h 键的五配位磷化合物。氢膦烷具有许多特殊的化学性质，可以用 来合成一些重要化合物【辨】。氢膦烷化学性质的特殊性主要表现在p h 键上。 通过p h 键与碳碳双键、叁键以及碳氧双键的加成，可以获得一系列不同类型 的五配位磷化合物1 4 5 1 ( 图1 - 1 0 ) 。因此，氢膦烷可作为合成五配位磷化合物的重 要原料。此外，氢膦烷还可以进行烷氧基化、硅氧基化、氯化以及与碳硫双键反 应生成一大类衍生物。刘纶组等利用氢膦烷在四氯化碳的作用下与亲核试剂反 应，发展了一个由氢膦烷合成磷烷的简便方法 4 6 , 4 7 1 ( 图1 1 1 ) 。这实际上是 a t h e r t o n - - t o d d 反应在五配位氢膦烷反应中的一个应用。 1 0 n h p h 。 k 吨沙 l k + c a 。+ 砌一 k + 伽， n u = r o ，r 2 n ，r n h ，r s 图1 1 l 五配位氢膦烷的类a t h e r t o n - - - t o d d 反应 1 3 环肽化合物 随着对越来越多的生命现象及蛋白质功能认识的深入，以及对药物设计的前 导化合物和各种功能材料需求的扩大，人们更加关注具有特殊形状和特殊性质的 多肽如环肽、变晶肽、肽样品库等。在新的复杂肽类化合物中，环肽无论从何种 意义上说都是其中最重要的一种。其特殊的结构以及对酶降解的稳定性使得它的 应用范围超出所有人的预料，特别是使用一些特殊的方法得到某种指定结构的环 肽时，人们甚至发现它在药物、纳米材料、生物离子通道及超分子自组装等领域 有着极其广泛的用途1 4 8 】。 环肽主要分为两大类：均环肽( h o m o d e t i c c y c l o p e p t i d e s ) 和杂环肽 ( h c t c r o d e t i c c y c l o p e p t i d e s ) 。全部由氨基酸组成并且严格按肽键成环的称均环肽； 主链由肽键组成，而以其他官能团如二硫键、酯键、醚键、硫醚键等成环的都属 于杂环肽。环肽在自然界中分布广泛，植物、动物、低等海洋生物、微生物、细 菌和病菌等都含有微量的环肽。这些环肽的含量虽然低，但其中很多具有明显的 生理活性。环肽及其类似物具有多种多样的生物学功能，可以作为激素 ( h o r m o n e ) 、抗菌素( a n t i b i o t i c s ) 、毒索( t o x i n s ) 、抗毒素( a n t i t o x i n s ) 、抗癌物以及 抗病毒物等，因此受到国内外许多化学家、生物学家和药学家的重视，他们从自 然界中提取到各种各样有生理活性的环肽。早在1 9 4 4 年，g a u s e 从细菌中分离 出环十肽短杆菌肽g s ( g r a m i c i d i ns 1 ，g s 对格兰氏阳性菌有很强的抗菌能力【4 9 】。 脑下垂体后叶激素中催产素( o x y t o c i n ) 鲫1 与加压素( v a s o p r 髂s i n ) 【5 1 j 均为最早研究 的杂环肽，它们的结构中均含硫一硫键。p e t - t i c 等i s 2 从印度海兔中提取分离了9 种抗肿瘤与细胞毒的d o l a s t a t i n s ，其中d o l a s t a t i n s 3 为含有两个噻唑氨基酸的环 五肽c p r o - l c u - v a l ( g l u ) t h z ( g l y ) - t h z 。g u i l l e m i n 等i ”l 从5 0 万头羊的下丘脑中分 离得到了8 5 r a g 生长激素释放抑制因子s o m a t o s t a t i n ( s r i h ) ，它是一个含二硫键 的环十四肽激素，它不但能抑制生长激素的释放，而且还能抑制许多其它生理活 性物质的释放，如胰高血糖素和胰岛素等。由于它分布在脊髓节和各种脑区域中， 所以化学家们推测其可能有神经递质的作用。我国化学工作者也从天然产物中分 离提取了许多有生理活性的环肽。周俊等i s 4 从我国传统中草药中分离鉴定了7 0 余种环肽，其中从小红参肽中提取出来的两个环肽中有一个带有糖苷配体与 l 甲基氨基酸残基，显示对p 3 8 8 肉瘤有较强的抑制活性。由于环肽的主链呈环状 结构，具有一定的构象约束作用，其构象相对线型肽有一定的稳定性，其抗酶解 能力比线型肽强。这一特点使环肽具有许多重要性质。药学家们发现某些具有生 理活性的线型肽或其类似物经头尾或侧链环化后所得环肽类似物限制了分子的 构象，使其活性增强【5 5 1 。化学家们还用环肽模拟蛋白质和其它一些受体的活性 部位的结构，由此寻求蛋白质的构象与功能之间的关系【捌。还有人利用环肽的 孔穴来研究环肽及其修饰物对小离子的选择作用1 5 ”。 1 2 1 3 1 环肽的合成 环肽的结构特点以及它在化学及药学上的优势引起了化学家们的兴趣，然而 与线型肽相比，环肽的合成要困难得多。环肽复杂的结构使得有机化学家合成环 肽仍然需要运用熟练的技巧并花费大量的时间一即使是中等尺寸的环肽，要使收 率达到5 0 以上并且纯度超过9 7 ，仍然是一件挑战性的工作。 合成均环肽实质上是形成一个分子内肽键的过程。影响成环最重要的因素就 是所成环的大小：含七个氨基酸残基以上的多肽都能顺利成环，六肽、五肽成环 有些困难，更小的环肽合成更加困难，但环二肽由于其特殊性结构是个例外。若 开链肽含有对成环有利的几何结构，像某些能诱导9 转角( p t u r n ) 结构的氨基酸 残基如甘氨酸、脯氨酸、d 氨基酸等，则会促进成环反应的进行【5 耵。在三、四、 五肽的成环反应中，由于两个多肽分子之间以氢键形成反平行的b 片层结构，从 而容易发生二聚成环的副反应。对五肽的环化反应的研究表明，单聚成环、二聚 成环产物的比率强烈依赖于开链肽的顺反异构平衡，顺式构象使两个末端靠得更 近而利于成环。n 取代的氨基酸的存在有利于顺反构象的转变，从而使三聚成环 产物明显减少【5 9 1 。反应物的浓度对关环产率有着直接的影响，高浓度容易引起 分子间的聚合，因此反应一般须在高度稀释的条件下进行。c a v e l i e r f r o n t i n 以环 四肽c h l a m y d o e i n 的合成为模型，使用g c n m o l 程序进行计算，表明影响多肽成环 的因素主要有：( 1 ) 立体阻碍因素；( 2 ) - 聚反应的动力学竞争；( 3 ) 过渡态能量高 低。他指出最佳底物是形成环状过渡态复合物弓 起环张力最小的那一种，所以含 刚性骨架的多肽通常很难成环1 6 。】。并且文献报道高温有利于线型肽链克服自己 的扭曲张力，增加首尾相遇的机会有利于环化，可加速环化的速度【6 1 】，但温度 过高，副反应也随之增加，且增加了消旋化的可能性。低温下反应时间过长，也 会有副产物产生。为了提高环肽的产率，反应开始时在低温下进行，缩合试剂加 完后反应一段时间再升至室温搅拌，有利于抑制副反应。 环肽的合成文献报道很多，主要有溶液合成法和固相合成法两种。溶液法合 成环肽是在高度稀释的溶液中进行( 1 0 - 31 0 4 m o u l ) ，游离的线型肽首尾相连成 环。固相合成法则是在树脂上成环，成环后从树脂上脱下得到环肽。溶液法是经 典的合成方法，即将脱保护后的线型肽前体直接在缩合试剂的缩合下成环，也可 先将一端( 一般为c 端) 活化，然后成环。c 端活化成环常用的方法有活泼酯法、 1 3 叠氮法和混合酸酐法等。活泼酯法是最初合成环肽的常用方法，将羧基制成活泼 酯脱去端保护基然后成环。活泼酯法有硝基苯酯法( o n p ) 【6 2 】，n 羟基琥珀酰亚 胺法( o s u ) 和五氟苯酯法( p 伊) 【6 3 】等。活泼酯中间体具有一定的稳定性，可以分离、 纯化和存放，也有一定反应活性，但活泼酯的立体效应大，反应活性不高，使环 化速度减慢，这样羧基活化的多肽链在溶液体系中长期存在增加了消旋的可能。 叠氮法是将羧端制成酰基叠氮活泼中间体，在稀释的碱性溶液中成环。叠氮法引 起的消旋较小，比活泼酯法效率高唧1 ，酰基叠氮中间体不稳定，且叠氮酸有毒， 制备步骤繁琐。混合酸酐法是将羧端制成混合酸酐，然后在稀释的碱性溶液中成 环，由于活泼中间体极不稳定，所以在制备酸酐时要严格保持低温，使用的仪器、 溶剂必需绝对干燥。若使用直接法成环，线型肽不必制成中间体，只在两端游离 的线型肽稀溶液中加入有效的缩合试剂缩合直接成环。 固相法合成环肽是在树脂上环化，然后脱落下来，因而避免了分子间的二聚 和多聚，反应不需在高度稀释的溶液中进行，过量的缩合试剂及副产物可通过洗 涤与过滤除去。近年来随着较温和的正交保护策略的发展和有效的缩合试剂的出 现以及分离手段的不断发展，越来越多的人倾向用固相法合成环肽，尤其是用于 中环肽的合成【6 5 1 。固相合成环肽的成功之处在于各种不同性质的保护基的正确 搭配。保护基有暂时保护基、半永久保护基及永久保护基。暂时保护基如b o c 、 f m o c ，每接完一个氨基酸便脱一次保护。半永久保护基则在成环前脱下，一般 是用于保护侧链的氨基或羧基。永久保护基是在成环后脱下，如侧链保护基b z l 、 t o s 等。固相法适合于中环肽的合成，a k 旬i 嗍等利用h e c k 反应，分别用固相和 溶液法合成环肽，发现固相法反应速度比溶液法快。v a l c r o 等【6 1 用3 种不同方法 合成一种环十五肽，溶液法的产率比固相法低。无论是溶液法还是固相法环化， 缩合试剂的选择都是很重要的，随着环肽合成的不断发展，新型的缩合试剂也不 断地涌现出来。 杂环肽的氨基酸( 包括非蛋白氨基酸) 残基之间存在的非酰胺键主要是酯键 和二硫键。酯键的形成与酰胺键的形成类似，二硫键相对而言与纯环肽的合成相 差较大。二硫键广泛存在于激素、酶和免疫球蛋白中嘟】。二硫键被认为在稳定 有生物活性的构象方面起了重要的作用。为了进一步提高生物活性，人们往往在 天然产物中引入二硫键对生物活性肽进行结构修饰【明。二硫键成环分为溶液法 1 4 郑州大掌硕士掌位论文 和固相法。通常溶液中合成二硫键的方法是先合成带有巯基保护的c y s 残基的线 型肽前体，然后脱去c y s 的保护基，氧化成二硫键后成环，或直接将带保护基的 c y s 氧化成为s s 键。 环肽化学作为有机化学和生物学的交叉研究领域，近年来得到了极大的发 展。随着对环肽的结构和性能研究的进一步深入，环肽将在超分子化学、生物有 机化学及药物化学等诸多领域得到更为广泛的应用。但由于环肽的合成不易，产 率不高而在目前限制了它的广泛应用，今后探求更有效的环肽合成方法将是研究 者的重要任务之一。 1 3 2 环二肽的合成 环二肽( 2 ，5 哌嗪二酮) 是最小的环肽，许多天然环二肽化含物都具有明确的 生物活性，例如作为抗生素，苦味剂，植物生长抑制剂以及激素释放抑制剂等。 环二肽结构的特殊性使得这类化合物的合成自成体系，通常由n 端游离的直链 肽酯在极性溶剂中回流便可以很容易地得到目的物。f i s c h e r 虽然在甲醇氨中 氨解线性二肽甲酯而得到环二肽，但同时发现这种方法易引起消旋。n i t e c k i f f o 提出将n 端游离的线性二肽甲酯在丁醇和甲苯的混合溶剂中回流合成环二肽不 会造成消旋。u e d a t ”1 使用甲醇为溶剂进行回流，也得到了很好收率的环二肽； c o o k 等人应用l ，2 乙二醇作为反应溶剂，得到了两种非对映异构体环二肽，总 收率达6 4 5 u 2 1 。最近汪有初等报道了参照u e d a 和c o o k 的方法合成了一系列 环二肽，收率在5 5 - - 9 9 之间，并且通过生物活性实验发现c y c l o ( p h e - p r o ) ， c y d o c l l e - i i e ) 和c y e l o ( m e t - m e t ) 具有轻微的钙拮抗效应，c y c l o ( a l a - a l a ) 和 c y d o ( p r o - p r o ) 则显示了增强钾所致的收缩效应m 7 4 】。 1 4 论文主要内容 以非极性侧链的氨基酸为起始原料和三氯化磷反应合成了7 种氨基酸氢膦 烷，并对氨基酸氢膦烷的合成，性质等方面进行了详细地研究。所得到的氨基酸 氢膦烷是一对非对映异构体通过使用重结晶和制备液相色谱提纯的方法，得到 了具有单一构型的产物。利用离子阱多级质谱的功能对氨基酸氢膦烷的负离子质 谱裂解特征进行了详细地研究。使用丙酮作为溶剂得到了缬氨酸氢膦烷的单晶， t 5 郑州大国哪士掌位论文 运用x 射线衍射技术分析了缬氨酸氢膦烷的晶体结构。 以具有非极性侧链的n 氨基酸和三氯化磷为原料，合成了7 种环二肽。和 以往的环二肽合成方法相比，该方法具有不需要保护，步骤简单等优点，为探索 新的环二肽合成方法奠定了一定的基础。同时利用液相色谱对所得环二肽进行了 分析鉴定，建立了一定的环二肽液相色谱分析方法，并且利用电喷雾质谱对环二 肽的正、负离子质谱裂解特征进行了详细地研究。 1 6 2 1 试验部分 2 1 1 仪器与试剂 第二章氨基酸氢膦烷的合成 仪器： b r u k e rd p x 4 0 0 m h z 核磁共振仪。 b r u k e re s q u i r e3 0 0 0 离子阱液相色谱质谱仪。 r i g a k u - a x b 一日本理学电机x 一射线面探仪。 t h n on i c o l e ti r 2 0 0 型红外光谱测定仪。 上海天平仪器厂j a 2 0 0 3 型电子天平。 大连依利特p 2 3 0h p l c 高效液相色谱仪。 x t 4 a 型显微熔点测定仪测定( 温度未校正) 。 试剂： 四氢呋喃：天津市江天化工技术有限公司，分析纯。 向四氢呋哺加入适量的氢氧化钾，干燥过夜，过滤，加入钠丝和二苯甲酮， 加热回流至溶液呈紫色，常压蒸馏，收集沸点为6 8 7 0 c 的馏分。 三氯化磷：天津市化学试剂一厂