（动物营养与饲料科学专业论文）氧化三甲胺对尼罗罗非鱼诱食、生长和肉质的影响.pdf

致谢 值此硕士学位论文完成之际，谨向三年来倾心指导我的导师夏枚生副研究 员、孙建义教授致以最诚挚的谢意。导师渊博的知识、一丝不苟的工作作风、对 学科前沿敏锐的洞察力、严谨的治学态度、高尚的为人品格、忘我的工作精神深 深地影响着我，将使弟子终身受益。感谢两位导师在过去三年中为我的成长倾注 了大量的心血，在生活上、学习上和科研工作上给予的无微不至的关怀和教诲。 在本论文的选题、论证、试验和撰写过程中，白始至终都凝聚了导师大量的心血 和精力，再次表示衷心的感谢和崇高的敬意。 在课题的设计和试验过程中胡彩虹老师给予了很多的关心、指导和支持， 在学习和生活中给予了我无私的关怀和鼓励，谨向胡老师表示由衷的敬意和感 谢。感谢许梓荣教授在过去三年中在生活上、学习上和科研工作上给予的无微不 至的关怀和教诲；另外，本试验还得到本研究所汪以真，李卫芬、贾仁清等全体 老师的悉心指导和帮助，在此表示衷心的感谢。 感谢江霞、张红梅、潘金敏、熊莉、朱兴一、姚江涛、杜文理等同学无私 的帮助， 在华家池度过的三年是我生永远最值得记忆的时光。感谢2 0 0 2 级学友陆 平、李奎、周绪霞、李勇竞、沈坚、刘进国、许英蕾、刘明启、潘林、赵燕飞、 刘光富、初晓娜、井明燕及舍友贾巧君、孙亚丽、郑晓娟、刘欣、胡春霞在学习 和生活上的关心和帮助。 一份特别的感谢送给我远方的家人，深深感谢父母对我成长默默付出的心血 和努力，感谢姐姐在我的求学道路上所给予的鼓励和关心，家人的鼓励和关心永 远是支持我前进的坚强后盾。 最后向参加论文评阅和答辩的全体专家和同学致以最真挚的谢意! 孙海香 2 0 0 5 年5 月于杭州浙江大学华家池畔 浙江大学硕士学位论文 中文摘要中文摘要 本课题以尼罗罗非鱼为试验对象，研究了氧化三甲胺对罗非鱼的诱食效果、 生长性能和肉质的影响，并探讨了其作用机理。 本试验分为体内和体外试验两个部分。体外试验选取罗非鱼3 0 尾，体长 1 3 1 5 e m ，用行为观察法和电生理方法研究氧化三甲胺溶液对罗非鱼诱食反应， 观察不同浓度的氧化三甲胺对e o g 的影响，以探讨t m a 0 的诱食效果及其最佳 作用浓度。试验前，罗非鱼暂养于试验室中。t m a o 配成1 的母液，实验时将 其稀释成o 2 、o 4 、0 6 和o 8 溶液，实验过程中水温为2 5 2 5 。试验鱼 随意分组，嗅电图和迷宫观察法各1 5 尾。结果表明，氧化三甲胺对罗非鱼有强 烈的神经兴奋作用，罗非鱼对氧化三甲胺的反应图形为典型的e o g 图像，罗非 鱼对不同浓度的刺激液的e o g 反应波形均相似，仅振幅值随刺激液浓度的增加 而上升。迷宫实验进一步表明氧化三甲胺对罗非鱼的兴奋作用表现为诱食效应， 试验组与对照组集鱼数差异显著( p o 0 5 ) 。 3 6 0 尾尼罗罗非鱼分4 组在水族箱中饲养，每个水族箱中放养3 0 尾鱼，每 组3 个重复。实验期间水温为2 4 3 0 c 水中溶解氧含量为9 7 1 0 5 m g l ， p h 为7 2 7 4 。实验前将罗非鱼在水族箱中暂养1 周，然后开始试验，试验期 6 0 天。每天投喂2 次，日投饵料为体重的2 一5 。饲养期间每日记录料耗， 饲养结束后，禁食2 4 小时后称重。 饲养结束后，随机从对照组和试验组中各选试验鱼2 7 尾，每缸9 尾，共1 0 8 头，按常规方法进行解剖，测定各器官重。取血清，测定血清中总蛋1 ；i ( t p ) 、白 蛋i 白( a l b ) 、尿素氮( s u n ) 、甘油三酯( t g 3 ) 、游离脂肪酸( f f a ) 、葡萄糖( g l u ) 、 钙( c a ) 、磷( p ) 、游离脂肪酸( f f a ) 含量及碱性磷酸酶( a l p ) 、超氧化物岐化酶 ( s o d l 、谷丙转氨酶( g p t ) 、谷草转氨酶( g o t ) 活力和血清中胰岛素样生长因子 i ( i g f i ) 、生长激素( g h ) 、游离三碘甲状腺原氨酸( f t 3 ) 、游离四碘甲状腺原氨 酸( f t 4 ) 、胰岛素( i n s u l i n ) 含量：取肠系膜脂肪样品，测定脂肪苹果酸脱氢酶、葡 萄糖磷酸脱氢酶和激素敏感脂肪酶活力；取背部肌肉样品，测肌肉中粗蛋白和粗 中文摘要 脂肪含量、肌肉中肌红蛋白、肌苷酸、t m a 0 含量。 饲养试验表明：添加t m a o 的各组的末重、曰增重、特定生长率较对照组 均有上升，各组的饵料系数均有所下降。0 2 t m a o 的实验组与对照组相比， 末重、日增重和特定生长率均有显著差异( p 0 0 5 ) ；但显著提高了罗非鱼肠道蛋白酶和淀粉酶的活力，实验组 与对照组之间蛋白酶活性差异显著( p o 0 5 ) ，其中0 4 t m a o 组蛋1 3 酶活性最 高。与对照组相比，实验组肠道淀粉酶活性极显著提高( p o 0 5 ) 。 屠宰试验表明：在饲料中添加t m a o 对于改善罗非鱼的体形以及内脏器官 的相对重量是有作用的。与对照组相比，t m a o 实验组肥满度增加，肝体比下 降，肠系膜脂肪占体重百分比也下降。相对应的可食部分增加。o 4 t m a o 添 加量的去内脏比与对照组之间差异显著( p o 0 5 ) 。 血清样品分析表明：与对照组相比，o 2 、0 4 和0 8 组血清总蛋白显著 升高( p 0 0 5 ) ，其中0 8 添加组的白蛋白提高了3 9 7 ( p o 0 5 ) 。血清尿素氮、 总胆固醇有下降趋势，其中o 8 添加组较对照组显著下降( p o 0 5 ) 。钙、磷及 g p t 无显著差异，但g p t 呈现下降趋势，o 。4 组的g o t 贝, t 下降了2 5 2 ( p o 0 5 ) 。 血清中脂肪酶、游离脂肪酸、甘油三酯有上升趋势，o 4 和0 ，8 组的游离脂肪 酸较对照组下降显著( p 0 0 5 ) ，o 2 组差异不显著。o 2 、o 4 和0 s 组的甘 油三酯较对照组分别升高了5 3 4 ( p o 0 5 ) 、1 0 8 8 ( p o 0 5 ) 和1 3 0 7 ( p 0 0 5 ) ， o 4 与0 8 组间差异不显著。 脂肪样品分析表明：与对照组相比，添加不同剂量的t m a o 显著提高了激 素敏感脂肪酶的活力，o 4 和o 8 组较对照组差异极显著( p o 0 1 ) ，0 2 组差 浙江大学硕士学位论文 异不显著。t m a o 明显降低了m d h 、6 p g d h 、g 6 p d h 的活力，o 2 、0 4 和 0 8 组的m d h 差异极显著( p o 。0 1 ) ，o 8 组的6 p g d h 、g 6 p d h 较对照组差 异显著( p 0 0 5 ) ，o 2 和0 4 组差异不显著。 本试验结果提示：氧化三甲胺可促进罗非鱼采食生长、改善饲料利用率，提高 罗非鱼的可食率，改善肉质：影响肠系膜脂肪活力，改变体脂；使鱼体t 3 和胰 岛素分泌增加，通过神经一内分泌水平调控机体代谢活动，从而实现其促进蛋白 质合成和体脂重分配的功能。 关键词：氧化三甲胺、尼罗罗非鱼、诱食、生长性能、肉质 1 前言 随着人们生活水平的提高，人们对水产产品的需求量越来越高。国际食品政 策研究机构i f p r i 在其一项名为( 2 0 2 0 年水产品展望：满足全球需要的报告 中称，到2 0 2 0 年，全球将消费1 2 7 8 亿吨水产品。水产品消费量增长主要出现 在发展中国家，增长幅度为5 7 ，而发达国家的增长幅度为4 。该报告预测， 在未来的二十年里，发展中国家的水产品消费量将占全球总消费量的7 7 ，水产 品产量将占全球总产量的7 9 。发展中国家的水产品消费量将从1 9 9 7 年的6 2 7 0 万吨增长到2 0 2 0 年的9 8 6 0 万吨，发达国家的水产品消费量将从1 9 9 7 年的2 8 1 0 万吨增长到2 0 2 0 年的2 9 2 0 万吨。在1 9 9 7 年- 2 0 2 0 年期间，全球人均水产品消费 量将以每年o 4 的速度增长。中国和印度的人均水产品消费量增长速度最快， 分别为1 3 和o 9 ，拉丁美洲和东南亚的增长幅度分别为0 4 和0 5 。 另外，人们愈来愈认识到膳食与健康之间的关系，这反映在人们愈来愈要求 质量稳定的优质保健食品。随着水产养殖规模的增加，人们对水产品食用品质的 抱怨越来越多，此外人们对食品安全考虑越来越多，特别是有无药物、激素和类 激素残留，进而关注水产养殖动物的饲料和养殖条件。因此，研究发现既安全又 能改善动物胴体品质和饲料利用率的饲料添加剂就显得格外重要。从许多国外学 者的报导来看，氧化三甲胺可以提高动物采食速度、降低脂肪沉积，而且氧化三 甲胺是动物体内天然存在的物质，对动物及人类健康不会产生负面影响，因此其 符合市场发展方向，具有广阔的发展前景。 1 1t m a o 及其在鱼体内分布情况 t m a o ，( c h 3 ) 3 n o ，熔点9 6 。c 。( c h 3 ) 3 n o 2 h 2 0 ，针状闪光晶体，熔点2 5 5 2 5 7 。c 。溶于永和甲醇，稍溶于乙醇，不溶于乙醚，其水溶液呈强碱性。与酸结 合成结晶盐。t m a o 的化学结构与甲基供体如胆碱、甜菜碱和s 一腺苷甲硫氨 酸相似。t m a o ( c h 3 ) 3 n o 与甜菜碱 ( c h 3 ) 3 n c h 2 c o o h 的区别是甜菜碱的甘氨 酸被0 取代。 氧化三甲胺( t m a o ) 作为一种特殊的化合物广泛存在于原核生物和真核 生物的许多组织中存在，具有一种特殊的鲜味。t m a o 广泛分布于海产硬骨鱼 4 浙江大学硕士学位论文 类的肌肉中( 见表1 1 ) ，但在鱼体中并不是均匀地分布。它在鳍肌肉、肌节的头 部和尾部含量特别高。在黑肉色的鱼中，红肌中t m a o 含量比白肌中高；而在 白肉色鱼中情况却相反( y a m a g a t a 等，1 9 8 8 ) 。奶牛喂甜菜渣后牛奶中也含有 t m a o ，其来源于甜菜渣中的甜菜碱。大量的因素会影响鱼体肌肉中t m a o 的 含量，如品种、年龄、日粮、盐度、季节和地理位置( a g u s t s s o n 和s t o r m ，1 9 8 1 ) 。 一般来说，t m a o 随着年龄的增加和盐度的提高而提高，海水鱼比淡水鱼含量 丰富( a r e n ，1 9 8 8 ，m a r t i n 等1 9 8 2 和d a i k o k u 等1 9 8 5 ) 。在雨季捕到的鱼的t m a o 含量比干旱季节高( s h i r mt 1 9 9 8 ) 。研究发现，对于海洋动物，深海中的动物和 深潜水动物体内的含量要比浅海动物体内的含量多，而且动物在水中栖息的深度 越深，潜水越深，体内组织中的氧化三甲胺含量越高。另外发现在鲨鱼、鳐鱼、 甲壳类和头足类动物中t m a o 含量最高，占组织干物质重的7 。t m a o 在海 洋硬骨鱼类中的含量比板鳃类鱼少，其中又以鳕鱼最高，比目鱼最低。海洋板鳃 类鱼中t m a o 含量为l 一1 s g & g ，而海洋硬骨鱼类为0 1 0 3g k g 。对于双壳纲 动物，t m a o 的含量通常很低，仅江珧科、扇贝科和鸟哈科三家族含有一定数 量的t m a o ，每l o o g 体组织中含有大约7 1 - - 5 5 5 m g ，其中以闭壳肌中含量最高， 内脏中含量甚微。h e b a r d 等发现几种双壳纲类动物t m a o 的含量随其地理位置 而变化，这可能与浮游植物的组成和可利用性有关。 表1 - 1 海生动物肌肉中t m a o 含量 t a b l e l 1c o n t e n t so f t m a oi nm a r i n ea n i m a l sm u s c l e 种类含 量m e v x g 角鲨 比目鱼 鲱 鲸鱼 扇贝 蟹 虾 7 0 0 1 4 0 0 1 0 0 6 0 0 2 0 0 3 0 0 0 1 2 0 2 0 0 6 0 0 7 0 1 5 0 2 0 0 5 0 0 前言 1 2t m a o 在体内的代谢 鱼体内t m a o 主要有两种来源：( 1 ) 来自于其摄取的食物，如浮游植物： ( 2 ) 自身生物合成。淡水浮游动物和甲壳纲动物含有极少量的t m a o 。淡水海 藻也缺乏可以检测的t m a ，而淡水鱼如罗氏鱼和尼罗河鲈却有相对较高水平的 t m a o ，可见部分淡水鱼类具有从日粮中的前体物合成t m a o 的能力。b i n s k i ( 1 9 6 4 ) 发现，三甲胺、甜菜碱、肉碱、胆碱、甘氨酸和蛋氨酸都是比目鱼t m a o 的前体。n o r i f u m i 等( 2 0 0 1 ) 在硬骨罗氏鱼属尼罗非鲫饵料中分别添加胆碱、甜 菜碱、肉碱和磷酸胆碱，结果发现仅添加胆碱可使肌肉中t m a o 含量明星增加。 从这四种物质对t m a o 的沉积作用来看，胆碱的效果最好，其次是甜菜碱，肉 碱和磷酸胆碱效果甚微。目前研究表明饲喂含有胆碱的日粮使t m a o 沉积的机 制可能是：首先小肠内微生物将日粮胆碱降解为三甲胺( t m a ) ，经吸收后在肝 和肾中三甲胺氧化酶的作用下转化为t m a o ，最后大部分沉积在肌肉中。r e h m a n h v ( 1 9 9 也报道，t m a 由肠道中胆碱和肉碱经细菌降解而来，在肝中生成无 味的t m a o ，然后随尿排出体外。可见，t m a 能重新合成t m a o ，这与a l w a i z 等( 1 9 8 7 b ) 报道的相同。并不是所有的鱼类都能进行t m a o 的生物合成。虽然 金鱼能转化胆碱形成三甲胺，但金鱼注射甜菜碱或胆碱却不能形成t m a o ，很 明显，金鱼缺乏三甲胺氧化酶。日本鳗鲡也缺乏三甲胺氧化酶，而某些猪肝脏中 存在三甲胺氧化酶0 3 a k e r 等，1 9 6 2 ) 。动物三甲胺氧化酶的存在与否与亲缘关系无 关，在软骨鱼中，鲨鱼的肝脏中含三甲胺氧化酶，但角鲨鱼肝脏中却检测不到三 甲胺氧化酶。三甲胺氧化酶位于肝脏和肾脏，不存在于肠道，骨骼肌中( a g u s t s s o n 等，1 9 8 1 ) 。 a r e n v a nw a a r d e ( 1 9 8 8 ) 年，t m a o 可以降解为d m a ( 二甲胺) 和甲醛。 这个反应中甲醛的产生引起交叉蛋白的产生，进而引起提取蛋白氮降低。大量资 料表明，t m a o 酶催化t m a o 生成d m a 和甲醛。鳕鱼中存在t m a o 酶，它能 催化t m a o 降解成二甲胺和甲醛( p a r k i n 等，1 9 8 2 ) 。鱼体死后新鲜度逐渐下降， 肌肉中t m a o 由于t m a o 还原酶作用被还原成三甲胺，即生成三甲胺含量越多 则说明鱼新鲜度越差。t m a o 还原酶可以由细菌污染产生，但有的鱼类的红肌 中含有内源性的t m a o 还原酶。f e 2 + 在t m a o 转变为t m a 和d m a 中起重要 6 浙江大学硕士学位论文 作用，而c u 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 完全没有作用，在f e 2 + 存在时，4 c 下t m a o 转变 为t m a 、d m a 。t m a o 在有酶或无酶的情况下均可转变为t m a 、d m a 。在鱿 鱼提取物中，两类微生物c f r e u n d i l 和a h y d r o p h i l i a 使t m a o 更易转化成t m a ， 氯霉索( o 4 1 6 m g m 1 ) 完全抑制了这些微生物的生长并有效阻抑了t m a o 向t m a 的转变。另外，f e 2 + 和抗坏血酸加速了t m a o 向t m a 的转变。研究表明，胆碱、 肉碱和t m a o 都是t m a 的前体，但t m a o 为主要前体，甜菜碱、肌酸和卵磷 酯并非有效前体。 人们已开始将t m a o 进行动物试验，t m a o ( 5 9 、k g ) 经皮下注射后，每 8 h 一次给药，血清浓度维2 2 m m ，小鼠耐受性好( 7 2 h ) ，无死亡，尿中t m a o 浓度高达4 0 0 m m ，提示t m a o 主要以尿中排出为主。a q z h a n g ( 1 9 9 9 ) 年发现， 口服n 讧a o 后，7 8 的t m a 0 从尿中排出，并认为5 0 的t m a o 在消化道中 降解为t m a ，然后在肝中重新合成氧化，其合成效率达9 5 9 9 。另有报道表明， 口服1 5 m m o lt m a o ，第一天尿中三甲胺水平增加到2 3 倍( 1 0 _ 2 1 t m o l 2 4 h r 对照 一一2 3 3 5 4 1 t m o l 2 4 h r ) 尿中t m a o 水平增加到3 6 倍( 3 1 5 1 0 7 p m o l 2 4 h r 对照 一一1 1 3 2 5 1 9 1 2 1 t m o l 2 4 h r ) 。在很多情况下，t m a o 来源于日粮，当金鱼饲喂无 t m a o 日粮，其肌肉中无t m a o ，当饲喂t m a o 时，肌肉中t m a o 显著升高， 禁食后两天，肌肉中t m a o 消失( h a s h i m o t o 等，1 9 5 8 ) 。mo v e r l a n d ( 1 9 9 9 ) 年 在生长肥育猪( 4 2 3 k g - 5 0 k g ) 日粮中添加1 0 0 0 m g k g t m a o 和1 9 k g - 1 0 1 k g 生长 肥育猪日粮中添加1 0 0 0 0 m g k g t m a o 时均发现，t m a o 在粪中无存在，在血浆、 肌肉、脂肪、肝组织中均无t m a o 存留，但t m a o 和t m a 在尿中均被发现。 朱梅通过微量滴定法测定t m a o 和t m a 在肌肉组织和肝脏组织中含量，发现 添加t m a o 对体内肌肉和肝脏中t m a o 含量无影响，t m a 在肌肉和肝脏中均 无残留。另有资料报道，采食4 8 2 0 m g k gt m a o 使3 1 3 0 m g k g t m a o 得以利用， 这说明，t m a o 被胃肠道吸收，部分积累在体内，或未被代谢排出或生成t m a 形式在尿中排出。健康人尿中三甲胺和t m a o 每天排泄量分别为l m g 和4 m g ， 当进食海生动物时，其尿中排泄量显著增加( m a h a m 等，1 9 8 7 ) 。 t m a o 的代谢图如下： n a d p h ，0 2n a d p , + h 2 0 ! 丙酮酸乳酸 注：1 三甲胺氧化酶；2 t m a o 还原酶；3 t m a o 酶 1 3t m a o 的生物学特性 日粮 v t m a 0 d m af a t m a o 为广泛分布于海产动物( 鱼类及无脊椎动物) 体内的一种含氮物质。 在海洋环境中，t m a o 作为一种前体物质，能在一定范围内作用于含氮物质酶 而对氮的生化循环以及大气p h 值的调节起着重要影响( t a n c e r yp h ，s i e b e n a l l e r j f ，1 9 9 9 ) ，它具有以下多种生物特性。 1 3 1 参与海生动物体内渗透压的调节 研究发现，对于海洋动物，深海中的动物和深潜水动物体内的含量要比浅海 动物体内的含量多，而且动物在水中栖息的深度越深，潜水越深，体内组织中的 氧化三甲胺越高。硬骨鱼中的t m a o 含量维2 0 一7 0 m o l ，软骨鱼中的含量高 达1 4 0ut o o l ，淡水鱼类和陆生动物体内含量却很低。t m a o 参与构建了渗透调 节系统( k i g 和g o l d s t e i n ，1 9 8 3 ；p a r k i n 和h u l t i n ，1 9 8 2 ) 。c h o l e t t 等( 1 9 7 3 ) 发 现，八日鳗类鱼在6 5 0 1 5 0 0 m 渗透压摩尔的海水中生活时，肌肉t m a o 含量与 环境渗透压存在线性相关。c h o l e t t e 和c n a g n o n ( 1 9 7 3 ) 也报道，肌肉t m a o 量与 血浆渗透压成线性相关。类似地，t m a o 参与海生硬骨鱼和某些广盐性硬骨鱼 等的渗透调节。l a n g e 等( 1 9 6 5 ) 发现，比目鱼从海水中转到淡水中，肌肉中t m a o 含量下降了5 0 ，肌肉中t m a o 含量与血浆渗透压存在线性相关。因此，t m a o 影响膜的通透性。研究表明，t m a o 在克服因流体静力压升高引起的蛋白质结 构的变性及蛋白分解方面起重要作用。通过动物试验表明：当t m a o 达到2 5 0 m m 时可显著的减少胰蛋白酶的分解作用，保护细胞结构。t m a o 同时可稳定l d h 浙江大学硕士学位论文 系列酶的活性以及显著的减轻压力增高所致的蛋白变性( b a s k k o v i ，b o l e n d w ， 1 9 9 8 ) 1 3 2t m a o 可作为小分子蛋白稳定剂 氧化三甲胺可以与甘油、d m s o 一样，作为小分子蛋白稳定剂，又称为分子 伴侣( t a t z e l tj ，1 9 9 9 ) 。作为化学伴侣，t m a o 可能主要有两方面的功能：一方 面是阻断非生产性蛋白质之间的相互作用：另一方面则是把正在折叠的蛋白质与 其它蛋白质隔离开来，使蛋白质处于一种有利的折叠状态。而且在动物体外细胞 研究中已证实t m a o 能纠正某些蛋白的传输缺陷，保护细胞及稳定蛋白结构( b a i c ，b i w e r s ij ，1 9 9 8 ) 。众所周知，细胞内为完成某生物学功能，其肽链需要经过正 确的折叠、加工、定位于细胞内合适的位置；有时还需要与其他肽链形成复合体， 细胞内蛋白质浓度假浓，从核糖他上新合成的多肽在其成熟过程中，会与其他蛋 白质的结构域发生结合，为防止蛋白质的错误折叠，应避免成熟前蛋白结构之问 的接触，蛋白质在穿过生物膜时，需要伸展结构，这都需要t m a o 协助完成。 此外，在生物体处于细胞蛋白变性的应急状态下，t m a o 可发挥分子伴侣作用， 使蛋白质肽链重新折叠，恢复蛋白质原来的构象、结构，使细胞蛋白质恢复原有 的功能，维持生物体细胞蛋白的结构和功能，保持细胞蛋白的稳定性( g o d t r e ， f o g a e ar t , 1 9 9 3 ) 。b a s k a k o vi v ( 1 9 9 9 ) 年发现，t m a o 使两种非折叠蛋白折叠成 有功能的自然品种蛋白。t m a o 使糖皮质激素受体片段的残基1 - 5 0 0 和残基 7 7 2 6 2 重新结合。t m a o 的作用是协同的，是蛋白质形成单一结构的条件特征。 1 3 3t m a o 对细胞有保护作用 g o b t 等发现，t m a o 可增加肌肉纤维的f m a x ( m a x i m a lc a l c i u m - - a c t i v a t e d f o r c e ) ，可以扭转高浓度k c i 溶液对肌球蛋白重链和轻链，以及肌钙蛋白从兔肌 纤维中分离出来的状况，显示出在高盐存在状态下，可起到保护细胞蛋白的作用 ( s a k u r a it k a i s et , 1 9 9 8 ) 。在温度升高和化学性变性等破坏因素存在时，t m a o 也可起到细胞保护作用。研究发现，高水平尿素可以影响膜或膜蛋白，搅乱了蛋 白质的三维结构，而尿素：t m a o ( 4 0 0m m 尿素：2 0 0m m t m a o ) 为2 ：1 时， 则不会有此隋形( b a r t o n k n ，1 9 9 9 ) 。虽然尿素有紊乱蛋白质结构的效果，t m a o 可减轻尿素诱导的细胞内蛋白质多聚体的分离作用起重要作用，它可明显降低细 前言 胞蛋白分离时的l d h 含量，并保护各种酶免受尿素诱导的时间依赖型酶失活作 用( h a s h i z u n eh ，1 9 9 9 ) ，还能抑制细胞肿瘤坏死因在的释放，减轻对细胞产生的 损害( h a s h i z u m eh ，c h e nm ，1 9 9 8 ) 。这种现象也发生在哺乳动物( a r e n ，1 9 8 8 ) 。 t m a o 还可以通过与酶的相互作用来对细胞进行保护作用。t m a o 能保护过氧 化氢酶的活性，显著的降低其热失活，保护蛋白质结构，减少细胞的损害；同时 能激活其它许多酶的活性，增加蛋白质结构的稳定性( m a s h i n ot ，f r i d o b i e hi ， 1 9 8 7 ) 。核糖核酸酶a ( r i b o n u c l e a s e a ) 的活性可被t m a o 恢复，而且研究表明 在相当低的t m a o 有效浓度时，也可产生明显的对蛋白质分子三维结构的修饰 作用( p a l m e rh r ，b e d f o r dj j ，2 0 0 0 ) 。在由低渗环境、甘醇、二基脲引起的细胞容 积扩张状态下，酪氨酸激酶的活性可被激活，从而调节t m a o 在细胞内的转移， 发挥生物效应；而酪氨酸激酶抑制剂可抑制t m a o 的转移。t m a o 在细胞中的 转运也可通过有机渗透性通道，机理与渗透剂牛磺黄酸相似( k o o m o ad l ，m u s c h m w , 2 0 0 1 ) 。可见，t m a o 可通过改变细胞内酶活来对细胞进行保护作用。 1 。3 4t m a o 参与细胞分裂 人脑内t a u 蛋白的4 4 1 个氨基酸被环腺苷酸依赖蛋白激酶( p k a ) 或3 b 葡 萄糖合成酶激酶磷酸化，磷酸化的t a u 蛋自不引起微管蛋白的组装。但加入 t m a o 后，t m a o 促进p k a 磷酸化的t a u 蛋白结合在微管蛋白上，并使微管蛋 白在低浓度既可用于组装( t s e n gh c 1 9 9 9 ) 。e q u c h in ( 1 9 9 7 ) 年报道，t m a o 、 d m a 、m m a 这三种物质，都具有诱导有丝分裂开始和四倍体产生的作用。朱梅 认为，t m a o 的促生长作用可能与其促进有丝分裂有关。 1 3 5 其他作用 s t e n b e r ge ( 1 9 8 4 ) 报道，t m a o 的减少伴随着能量转变的化学渗透机理。o r e n a ( 1 9 9 0 ) 也报道t m a o 作为电子受体提供了在分子氧缺乏时，起到能量产生的另 一途径。 t m a o 明显提高了三碘甲腺原氨酸( t 3 ) 的产量( l e a r ys c 1 9 9 9 ) 。众所 周知，t 3 是促进生长的激素之一。此外，r o u v i r m e nk i ( 1 9 5 7 ) 报道，t m a o 可 以降低铁的吸收，但mo v e r l a n d 等( 1 9 9 9 ) 发现1 0 0 0 m g k g 、2 0 0 0 m g k g 和 10 0 0 0 m g k g t m a o 对肝脏储备铁影响差异不显著。但5 0 0 0 m g k g 组t m a o 较 1 0 浙江大学硕士学位论文 对照组铁储降低2 8 。 1 4t m a o 在畜禽、水产上的应用 1 4 1t m a o 作为诱食剂，促进动物采食生长 t m a o 具有特殊的鲜昧和爽口的甜味，对水产动物有引诱作用。r o r v i k 等对 鲫鱼进行了摄食反应试验，结果发现，实验组比对照组鱼的咬饵频次平均高出 8 6 ：对虾的饱胃时间由对照组的6 0 m i n 以上降到2 0 3 0 m i n 。吕民主( 2 0 0 4 ) 等 利用t m a o 在甲鱼生态养殖上做了对比试验，发现试验组甲鱼上食明显，比对照 组生长速度快2 4 9 ，并且试验组的甲鱼生长较对照组均匀，僵鳖少。其还发 现浓度为0 1 的t m a o 对红鲫鱼有极显著的诱食效果，试验组是对照组鱼啄食 次数的4 4 2 倍。吕民主( 2 0 0 4 ) 报道t m a o 对鲫鱼有极显著的促生长作用，添 加剂量在1 0 0 0 - - 2 5 0 0 m g k g 范围时，促生长效果随着添加量的增加而提高：但添 加量超过2 0 0 0 m g k g 后，生长速度减慢，添加2 0 0 0 m g k g 组与2 5 0 0 m g k g 组增 长速度无显著差异。o v e r l a n d 等( 1 9 9 9 ) 报道在生长肥育猪( 1 9 k g 一1 0 1 k g ) 日粮 中( 粗脂肪为1 1 3 ，m e t + c y s = o 2 4 + 0 2 9 ，限制采食) 中添加1 0 0 0 0 m g k gt m a 0 ， 与对照组相比，t m a o 组日增重提高了7 5 ( p o 0 2 ) ，饲料转化效率提高了 7 ( p o 0 9 ) ；1 0 0 0 m g k g 组饲料转化效率提高了7 ( p o 0 1 ) ，料重比明显降低； 5 0 0 0 m g k g 组平均日采食量明显提高( p 0 0 5 ) ，料重比明显降低( p 0 0 5 ) 。 1 4 2 调节脂肪代谢，改变胴体组成 r o r v i k 等( 1 9 9 8 ) 报道，虹鳟鱼日粮中添加t m a o 显著降低了腹脂率，显著 增加了胆汁体积。r o r v i k 等( 1 9 9 8 ) 发现( u n p u b l i s h e dd a t a ) ，大西洋鲑鱼日粮中添加 4 0 0 0 m g k gt m a o ，显著降低了腹脂率，而添加1 0 0 0 0 m g k gt m a o 提高了腹脂率。 这提示t m a o 对胴体脂肪含量的影响存在剂量依赖关系。h e r s t a d 等 ( u n p u b l i s h e dd a t a ) 发现，肉鸡日粮中添加t m a 0 ，显著增加了胆汁体积。胆汁的 主要作用是( 1 ) 促进脂肪的消化吸收；( 2 ) 促进脂溶性维生素的吸收；( 3 ) 胆 汁酸是胆固醇的水溶性衍生物，胆固醇变成胆汁酸是机体排除胆固醇的主要途 径。表明t m a o 会提高粗脂肪或其他营养成份的消化率，影响胆固醇的代谢。 挪威农业大学动物研究中心的o v e r l a n d 研究发现日粮中( 粗脂肪为 1 3 3 ，m e t + c y s = 0 3 + 0 5 ，自由采食) 中添加1 0 0 0 m g k gt m a o 时，与对照组相比， 生长肥育猪( 2 1 7 k g 一1 0 4 7 k g ) 瘦肉率提高了2 2 ( p o ，1 1 ) ，胴体脂肪含量下降 了6 5 ( p 0 1 2 ) ；2 0 0 0 m g k g 组背膘厚下降了2 0 ( p 0 0 5 ) ，瘦肉率提高了 2 4 ( p 0 0 9 ) ：1 0 0 0 m g k g 和2 0 0 0 m g k g 组血清三酰甘油分别提高了7 和1 2 5 ， 而5 0 0 0 m g k g 组血清三酰甘油下降了2 7 7 。o v e r l a n d 等认为，t m a o 降低胴体脂 肪含量的最佳添加量为1 0 0 0 2 0 0 0 m g k g ，高水平的t m a 0 有提高背膘厚的趋势， 对胴体脂肪的含量、瘦肉率、屠宰率和肉的感觉评分均无显著影响。此外。与对 照组相比，1 0 0 0 m g k gt 姒o 组粗脂肪的表观消化率提高了4 6 ( p 0 0 3 ) ，因此 o v e r l a n d 等认为t m a o 不影响氮的沉积，其改善胴体品质是降低了胴体脂肪含量 而不是促进了瘦肉的生长所引起的。 1 5 有待进一步探讨的问题 如上所述，氧化三甲胺作为水产动物的饲料添加剂研究，除了在其诱食效应 方面有些零星报道，同时对其促生长效果方面有些应用研究外，迄今就其对水生 动物的促进生长、改善肉质及作用机理等方面仍缺乏系统的、科学的研究，而就 其对水生动物的生理生化指标的影响仍无报道，同时就其用作不同水产养殖品种 饲料添加剂的用量、效果等方面仍存在不完善之处。总之，氧化三甲胺在水产动 物中的作用研究主要存在以下几个方面： ( 1 ) t m a 0 作为水产诱食剂，其对不同品种、不同阶段的水产养殖动物作用效 果及其作用机理； ( 2 ) t m a o 对不同品种、生长发育不同时期的养殖动物的生长性能的影响及 在动物组织中的残留等副作用； ( 3 ) t m a o 对水产养殖动物各项生理生化指标的影响，及其促生长、改善肉 质的作用机理。 1 6 本试验研究的目的和内容： 本实验首次在国内外就氧化三甲胺对罗非鱼的生长性能、胴体品质和肉 质的影响进行研究，并探讨其作用机理，为氧化三甲胺在生产中应用和深入 浙江大学硕士学位论文 研究提供科学依据。 本课题包括以下试验内容： ( 1 ) 诱食试验：测定t m a o 对罗非鱼的诱食活性。 ( 2 ) 饲养试验：测定t m a o 对罗非鱼的生长速度和饲料利用的影响。 ( 3 ) 屠宰试验：评定t m a o 对罗非鱼的内脏器官和肉质的影响。 ( 4 ) 肌肉、脂肪、血清和肝脏指标测定：探明t m a o 对罗非鱼的影响 及其作用机理。 ( 5 ) 肝脏和肠道组织切片制备。 材料与方法 2 1 试验材料 2 试验材料与方法 2 。1 1t m a o 结构 t m a o 含量为9 8 ，由杭州海斯高饲料科技有限公司生产提供。其结构式为 分子式c 3 h 1 3 n 0 3 ，结构式( c h 3 ) 3 n = o 2 h 2 0 。 2 1 2 试验动物 罗非鱼，体长1 3 1 5 c m ，体重2 8 - - 3 3 9 ，雌雄不限，实验前暂养于室内。 2 1 3 试验日粮 每种饲料的配方及营养含量见表2 1 。 表2 1 饲料配方及营养成份 组分对照组实验1 组实验2 组实验3 组 1 4 oh2 l j o = n | 地飓 c c c 一 浙江大学硕士学位论文 注：1 其中消化能、钙、磷系根据原料组成计算所得，其余均为实测值； 2 多维、微量元素均由浙江大学华家池校区饲料科学研究所提供。 2 2 试验方法 2 2 。1 诱食试验 将t m a o 配成l 的母液，实验前将其稀释成0 2 、o 4 、o 6 和o 8 溶 液，实验过程中水温为2 5 2 5 。试验鱼随意分组，嗅电图和迷宫观察法各1 5 尾。 2 2 1 1 嗅电图试验 实验前，选择生理状况正常的罗非鱼3 0 0ug m l m s 2 2 2 中浸泡约1 5 m i n ，背 肌注射神经肌肉阻滞剂( 三碘季胺酚，o 0 0 5 m g gb w ) 固定。待鱼体完全麻醉 后，在鱼的一侧前后鼻孔间剪开剪开表皮，形成2 5 3 5 删n 2 的创面，暴露嗅囊。 将鱼固定于有机玻璃缸中( 装置如下图2 - 1 ) ，除了头部外，整个鱼体都浸泡于水 中，用乳胶管从口腔至鳃连续灌入含氧的去c l - 正常水，辅助其被动呼吸。在嗅 囊上方置一尖端直径1 2 m m 的塑料细管，向创口连续注入冲洗液或刺激液( 流 速6 0 m l m i n ) ，使嗅囊保持在水环境中。选用阻值相近的电极作为记录电极和 参考电极，记录电极与暴露的嗅上皮轻触，参考电极置于同测眼眶上方，电极经 屏蔽线与放大器连接，鱼体接地。用m e d l a b - - u 4 c s 生物信号采集处理系统记录 处理d c 。实验时间为1 0 s ，间隔时间为5 m i n ，以便可以充分冲洗鱼体，减少可 能引起的误差。在整个实验过程中，均以1 0 。5 m o l l 1l - s e r 为标准刺激液检测 嗅上皮敏感性的稳定性，当其e o g 振幅变化超过5 时，实验数据弃之。 材料与方法 图2 - 1 嗅电图实验装置 f i g 2 - 1e x p e r i m e n t a le q u i p m e n to f e o g 2 2 1 2 行为观察法 行为观察法的实验装置参考经典的桥本芳郎的迷宫装置如图2 2 ，迷宫用玻 璃制成，内有5 室：a 、b 、c 、d 、e 。实验鱼在e 室中，在a 、b 、c 室中注入 刺激液，蒸馏水注入d 室作为对照，3 m i n 后开始计时，观察记录进入集鱼室中 鱼尾数，以集鱼数作为实验液诱食效果的指标。实验前，将入水口与自来水龙头 相连，实验鱼放入e 室适应1 0 r a i n 后，开始实验。试验t m a o 溶液以流速为 5 m l m i n 加入a 、b 、c 中，用蒸馏水作为对照。实验结束后，用自来水冲洗被 试鱼、迷宫、隔板，每种浓度的刺激液重复3 次。 图2 - 2 桥本芳郎的迷宫装置 f i g 2 - 2t e s tt a n k u s e da s s e s st h ea t t r a c t i o no f t m a o 2 _ 2 2 饲养试验 3 6 0 尾尼罗罗非鱼分4 组在水族箱中饲养，每个水族箱中放养3 0 尾鱼，每 1 6 浙江大学硕士学位论文 组3 个重复。水源为经充分曝气的自来水，每个水族箱中配置一个2 0 l m i n 的过 滤器，水温为自然水温，实验期间水温为2 4 3 0 。c 水中溶解氧含量为9 7 l o 5 m g l ，p h 为7 2 7 4 。实验前将罗非鱼在水族箱中暂养1 周，然后开始试 验，试验期6 0 天。每组水族箱的鱼类单独喂一种饲料，投饲的饲科精确到o 1g 。 每天投喂2 次，日投饵料为体重的2 一5 。饲养期间每日记录料耗，饲养结束 后，禁食2 4 小时后称重。计算试验鱼的日平均采食量、日增重和饵料系数。 2 2 3 消化试验 在饲养试验结束前两周，每缸选择8 尾，以c r 2 0 3 为外源指示剂进行饲料养 分消化率测定。在饲料中均匀地拌入o 5 c r 2 0 3 ，预试期为5 天，正试期为3 天， 选择完整无污染的粪条，每次收集的粪样品按各缸集中后保存于冰箱中，待测定。 至分析时6 5 烘干。按常规方法分析各样品中c r 2 0 3 和养分含量( 中华人民共和 国国家标准g b6 4 3 2 6 4 3 9 8 6 ) 。 消化率按以下公式计算： 某养分消化率= 1 0 0 ( ( c 1 p 2 ) ( c 2 p 1 ) ) 1 0 0 c 1 = 日粮中c r 2 0 3 的含量( ) c 2 = 粪中c r 2 0 3 的含量( ) p i = e 粮中某养分的含量( ) p 2 = 粪中某养分的含量( ) 2 2 4 解剖试验 试验结束时，使鱼空腹2 4 h 后，随机从每箱中随机取鱼9 尾，立即杀死，将 鱼体表面擦干，进行称重、采血、解剖，去除鱼鳞及鱼皮，取肝胰脏，在鱼体背 鳍两侧取鱼体肌肉待测。 肥满度= 去内脏重，体长* 1 0 0 去内脏比= 去内脏重，全鱼体重* 1 0 0 内脏比= 内脏重全鱼体重+ 1 0 0 肝胰指数= 肝胰脏的重量全鱼体重 肠脂比= 肠脂的重量，全鱼体重胃重比= 胃的重量全鱼体重 肠重比= 肠的重量，全鱼体重 样品收集和保存 血清样品：采用切断尾柄采尾静脉血于离心管中室温静置，待析出血清后， 材料与方法 吸取血清于离心管中，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n s ，得浅黄色血清样品，分装于e p p e n d o r f 管，置7 0 。c 冰箱保存，待分析用。 肌肉样品：在两侧侧线上取背肌，装入塑料袋中，浸入液氮，于7 0 。c 冰箱 保存，待分析用。 肝胰脏样品：把上述解剖取下称重后的完整新鲜肝胰脏放入塑料袋中，浸入 液氮，然后转移至7 0 c 冰箱保存，供分析用。 脂肪组织：剖离肠系膜脂肪，装入塑料袋中，浸入液氮，然后转移至7 0 c 冰箱保存，供分析用。 切片样品：样品( 肌肉、肝胰脏、前肠) 新鲜采集后，立即置于相应的固定 液中保存，待制作切片。 2 2 5 生化指标测定 2 2 5 1 罗非鱼肌肉和肝胰脏中常量养分的测定 量) 采用g b 6 4 3 2 6 4 3 9 8 6 测定常量养分( 包括水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分含 2 2 s 2 整鱼微量元素的测定 称取7 04 c 风干整鱼样品1 9 ，在电炉上炭化，在高温炉中5 0 0 。c 干法灰化5 小时，冷却后用稀酸溶解并定容，在日本岛滓a a 6 5 0 1 原子吸收仪上测定微量元 素含量。 2 2 5 3 肝胰脏、肠道消化酶活性的测定 试验结束时将试验鱼在池中饥饿1 天，以减少肠道中食物残渣对肠道消化酶 活性的影响。组织样品酶液的制各：分离罗非鱼的肝胰脏或肠道组织在4 下解 冻后，剪碎，称重，按1 0 的组织样品重量比加入4 。c 左右的生理盐水，然后匀 浆3 m i n ，1 9 3 7 4 9 离心1 5 m i n ，取上清液，置于4 。c 冰箱中保存，8 h 内测定完毕。 2 2