（内科学专业论文）阿托伐他汀对脂多糖致大鼠急性肺损伤的影响.pdf

阿托伐他汀对脂多糖致大鼠急性肺损伤的影响 。摘要 目的：观察阿托伐他汀钙对脂多糖( l p s ) 尾静脉注射所致s d 大 鼠急性肺损伤中的肺组织中核因子佃( n f k b ) 表达和肺泡灌洗 液中的肿瘤坏死因子a ( n 师a ) 、白介素1 b ( i l l b ) 等炎症因子表 达的影响；探讨阿托伐他汀钙在内毒素所致大鼠急性肺损伤的作用。 方法：通过s d 大鼠尾静脉注射内毒素( l p s ) 建立大鼠急性肺损伤模 型。9 0 只清洁型雄性s d 大鼠随机分为空白对照组( 1 8 只，简称n 组， 尾静脉注射生理盐水) 、模型组( 1 8 只，简称l 组，尾静脉注射内毒 素6 哦) - 、干预组( 5 4 只，简称t 组) 【分3 个亚组：t 1 组( 1 8 只) ： 阿托伐他汀5 m 删加尾静脉注射内毒素6 m g l 【g 组、t 2 组( 1 8 只) ： 阿托伐他汀1 0 m j g l 哕d 加尾静脉注射内毒素6 m g l 【g 组、t 3 组( 1 8 只) ： 阿托伐他汀2 0 删d 加尾静脉注射内毒素6 m g l ( g 组) 】，各组又在2 小时、4 小时和8 小时3 个时间点各处死6 只。取大鼠右肺下叶髓染色 观察肺组织病理，并根据病理学改变进行相应评分；采用w r e s t e m 免 疫印迹( w e s t e mb l o t ) 法分别测定右肺上、中叶肺组织匀浆中胞浆和 胞核n f 1 ( b 的表达；并使用双抗体夹心酶联免疫吸附测定( 叫s a ) 法 测定支气管肺泡灌洗液中n 师a 、i l l b 、的表达。结果：1 大鼠右下 肺肺组织髓染色2 0 0 倍光镜下病理结果显示n 组正常，l 组、t 组肺内 中性粒细胞大量浸润，伴出血、透明膜形成，提示肺损伤模型成功。 对肺泡和肺间质水肿、出血、炎症细胞聚集或聚集反应的肺损伤评价 进行五级分类，l 、t 组病理学评分均和i i 乏组有显著性差异( p 0 0 5 ) ， 而l 组的病理评分要比t 组更严重，并且有统计学意义( p o 0 5 ) 。 2 l 组和t 组肺组织n f k b 在胞浆的表达都明显高于n 组，有显著性差 异( p o 0 5 ) ；而在胞核中l 组和t 组n f 诏的表达也都明显高于n 组，有显著性差异( p o 0 5 ) ，以l 组表达最高，且l 组和t 组之间比 较差异显著，有统计学意义( p o 0 5 ) 。l 组和t 组胞浆和胞核的n f 1 c b 分泌高峰均在2 小时，呈递减趋势。t 组各亚组间n f 1 出在胞浆和胞 核中表达相比较均未出现统计学差异( d o 0 5 ) 。 3 l 组和t 组大鼠支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子a ( n 师- a ) 、白 介素1 b ( i l l b ) 水平明显增高，和n 组比较有显著性差异( p 0 0 5 ) ， t 组的各项指标较l 组低，和l 组比较差异性显著，有统计学意义 ( p 0 0 5 ) 。从分泌趋势看肿瘤坏死因子a ( ，n 晒- a ) 、2 小时达峰、 白介素1 b ( i i 厂1 b ) 则是4 小时达峰；t 组各亚组间以上指标并未 表现出统计学差异( 办o 0 5 ) 。 。 4 我们使用s p s s 软件对胞核中l 组和t 组n f 1 ( b 表达的数据和支气管 肺泡灌洗液中l 组和t 组肿瘤坏死因子a ( 耵师a ) 、白介素1 b ( i l l b ) 表达的数据进行直线相关性分析，提示它们呈正相关( r = o 7 2 2 ， p 0 0 5 ：r - o 3 3 3 ，p o 0 5 ) 。相关系数的差别可能和炎症因子分泌 的时间性有关系，l 组和t 组核因子础分泌高峰在2 小时以前，肿 瘤坏死因子a ( 耵腰a ) 2 小时达峰、白介素1 b ( i i 广1 b ) 4 小时达峰， k 组无高峰。 结论：阿托伐他汀钙可以减少脂多糖所致大鼠急性肺损伤肺组织中的 核因子- k b 从胞浆向胞核移位，使核因子佃的生物学活性下降。 从而可能间接影响炎症介质肿瘤坏死因子a 、白介素1 b 等表达，减轻 脂多糖( l p s ) 所致大鼠急性肺损伤。 关键词：急性肺损伤；阿托伐他汀；核因子仰( n f 1 c b ) ；肿 瘤坏死因子a ( 耵师- a ) ；白介素1 b ( i l l b ) ， t h ee f f e c to fa l t o r v a s t a t i nc a l c i u mo nr a t sw i t ha c u t el u n g i l l j u r yi n d u c e db yl i p o p o l y s a c c h a 订d e s a b s t 咫c t ：o b j e c t i v e ：，】oo b s e r v et h ee 虢c t o fa t o r y a s t a t i nc a l c i u m o nt h ee x p r e s s i o no fn u c l e a rf a c t o r - 1 c 1 3 ( n f - 1 圆) i i l l u n gt i s s u ea n d i n n a m m a t o 巧 f a c t o r ss u c h弱t u m o rn e c r o s i sf a c t o ra c n 吓- a ) ， i n t e r l e u k i n1 b ( i i ，1 b )i l lb a l fi i ls dr a t sw i t ha c u t el u n gi n j u 巧 m d u c e db yl i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) b yi n t r a v e n o u s 嫡e c t i o n ，a n dt 0 i n v e s t i g a t et h er o l eo fa t o r v a s t a t i nc a l c i u mi nt h es d r a t sw i t ha c u t el u n g i n j u 巧m d u c e db yl i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) m e t h o d s ：a c u t el u n gi n j u r y s dr a t sm o d e lw a se s t a b l i s h e d b y i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s ) ，9 0c l e a n t y p em a l es dr a t sw e r er a n d o i i l l y d i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ( 18 ，r e f e 盯e dt oa sn g r o u p ，n o m a ls a l i n e i n j e c t e db yi n t r a v e n o u s ) ，m o d e lg r o u p ( 18 ，r e f e r r e dt o a slg r o u p ， e n d o t o x i i li i l j e c t e db yi n t r a v e n o u s6 m g l 【曲，t h ei 1 1 t e e n t i o ng r o u p ( 5 4 ， r e f e r r e dt o 硒d 【d i v i d e di n t o3s u b g r o u p s ：t 1g r o u p ( 1 8 ) ：a t o r v a s t a t i n 5 m g l 【鲋a n d l p s6 m 如i n j e c t e d b yi l l t r a v e n o u sg r o u p ，他g r o u p ( 1 8 ) ： a t o r v a s t a t i l l 1 0 m g 瓜g 坩 a n de n d o t o x i n 6 m g l ( gi n j e c t e db y i n t r a v e n o u sg r o u p ，1 3g r o u p ( 1 8 ) ：a t o r v a s t a t i n2 0 m k da n de n d o t o x i n 6 m g 肚gi n j e c t e db yi n t r a v e n o u sg r o u p ) 】， 6r a t si ne a c hg r o u pw e r e s a c r i f i c e di i l2h o u r s ，4h o u r sa n d8h o u r sa t3t i m ep o i n t s t h ep a t h o l o g y o ft h er i g h tl u n g1 0 w e rl o b el u n gw a so b s e e d b yh es t a i l l i n g n f 一心 4 e x p r e s s i o ni i lc y t o p l a s m 锄dt h en u c l e u si nu p p e r 柚dm i d d l eo ft h er i g h t l u n gw a s m e a s u r e db yw e s t e mb l o t ( w ，e s t e mb l o t ) 锄dt h ec o n c e n t r a t i o n s o f ，n 吓- a ，i i 广1 b i i lb - 心w e r ed e t e c t e db yt h ed o u b l e a n t i b o d ys a n d w i c h e n z y m e l i n k e di 删n u n o s o r b e n ta s s a y ( e ：l i s a ) 。r e s u l t s ：1 ：n ep a t h o l o g y o ft h er i g h tl o w e r l u n gi ns d r a t sw a so b s e e du n d e r 脏s t a i n i i l g2 0 0 t i m e sm i c r o s c o p e t h e g r o u pnw a sn o r m a l ，b u tg r o u pl 、g r o u pt w e r ea l a 唱e n u m b e ro f n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n c o m p a n y i i 坞 w i t h h e m o 曲a g e 、f o r m a t i o no 仆y a l i n em e m b r a n e t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t l u n gi n j u 巧m o d e ls u c c e e d e d l 1 l n gi n j u 巧e v a l u a t i o nw e r ec l a s s i f i e dt o f i v ec a t e 9 0 r i e sb yt h ei i l t e r s t i t i a le d e m a ，h e m o r r h a g e ，i i l n a m m a t o 巧c e ui 。j “ a c c l l m u l a t i o no r a g g r e g a t i o n i nt h ea l v e o l a ra n dp u l m o n a 够，n l e p a t h o l o g i c a ls c o r e si 1 1g r o u pl 、t w e r es i g n i f i c a n t l yd i f 诧r e n tf 硒mg r o u p n ( p o 0 5 ) ；w h i l et h ep a t h o l o g ys c o r ei i lt h eg r o u pl w a sm o r es e r i o u s t h 觚t h a ti nt h eg r o u pt ，w h i c hw a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c ep 0 0 5 ) 2 ：t h ee x p r e s s i o no fn f - l c bi nt h ec y t o p l a s mi nt h el u n gt i s s u eo fg r o u pl a n d g r o u pt w e r e s i g n i f i c a n t l yh i 曲e rt h a nt h o s ei nt h eg r o u pn ( p o 0 5 ) ；、h i l et h ee x p r e s s i o no fn f - k b i nt h en u c l e u si ng r o u pla n d g r o u pt w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti ng r o u pn ( p 0 0 5 ) ，lg r o u p i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e ng r o u pl a n d 伊o u pt ( p o 0 5 ) 3 ：n ee x p r e s s i o nl e v e lo fn n o rn e c r o s i sf a c t o ra ( t 一a ) ，i n t e r l e u k i n1 b ( i l - 1 b ) i l lb r o n c h o a l v e o l a rl a v a g en u i d0 孔气l l f ) i i lg r o u pl a n dg r o u pt s i g n i f i c a i l t l yi n c r e a s e d ，t h e r ew a ss i g n i f i c a n t l yd i f e r e n c eb e t w e e ng r o u p ta n dg r o u pl 劬mg r o u pn ( p o 0 5 ) o b s e r v i l l gt h es e c r e t i o n t r e n d s ，t u m o r n e c r o s i sf a c t o r a ( t n f a )p e a k e d a t2h o u r s ，a n d i n t e r l e u k i n1 b( i 】，1 b ) p e a k e da t 4 - h o u r s；t h e s ei n d i c a t o r s a m o n g s u b g r o u p s ts h o w e dn os t a t i s t i c a ls i g i l i f i c a n c c( d - o 0 5 ) 4 ：n ee x p r e s s i o no fn f 一心i nn u c l e u s ，a n dt h ee s p r e s s i o no ft u m o r n e c r o s i sf a c t o ra c n 师- a ) ，a n d i i l t e r l e u k i i l1 b ( i i 广1 b ) i n b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g en u i di 1 1t h eg r o u pla n dg r o u ptw e r ea n a l y s e d b yl i n e a rc o 盯e l a t i o na n a l y s i sw i t hs p s ss o 腑a r e 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h e yw e r ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e d ( r = o 7 2 2 ，p o 0 5 ；r = 0 3 3 3 ，p o 0 5 ) 。 i i l g r o u pla n dg r o u pt ，t h ed i 骶r e n c eo ft h ec o n e l a t i o n c o e f i c i e n ti n i g h tb er e l a t e do nt h et i m i n go fc y t o k i n e ss e c r e t i o n ，a n dt h e s e c r e t i o np e a ko f 肌c l e a rf a c t o r - 1 d 3w a sb e f o r et h e2h o u r s t l l m o r n e c r o s i sf a c t o ra ( t n f - a ) p e a k e da t2h o u ra i l di i l t e d e u l 【i n1 b ( i l - 1 b ) p e a ：k e da t4h o u l h o w e v e r ，t h e r ew a sn op e a ki ng r o u pn c o n c l u s i o n s ：a t o r v a s t a t i nc a l c i u mc o u l dr e d u c et r a n s l o c a t i o no fn u c l e a r f a c t o r 1 c bf b mt h ec y t o p l a s mt ot h en u d e u si i la c u t el u n gi n j u 巧i n d u c e d 6 b yl p s ，a n dd e c r e a s et h eb i o l o g i c a la c t i v 时o fn u d e a rf a c t o 卜递r n l u si t m a i g h ti i l d i r e c t l ya f e c tt h ee x p r e s s i o no fi i l n a m m a t o 巧m e d i a t o r ss u c h 弱 t l l m o rn e c r o s i sf a c t o ra 、i n t e r l e u l 【i n - 1 ba n d o n ，r e d u c et h ea c u t e l u n g 蛳u 巧i n d u c e db yl p s 鬟yw o r d s ： a c u t el u n gi n j u 巧；a t o 弱t a t i i l ；i m c l e a rf a c t o rk a p p a b ( n f - k b ) ；t l l m o rn e c r o s i sf a c t o raf n 晒- a ) ；i i l t e r l e u l ( i n1 b ( i i 广1 b ) 7 厶j 刖吾 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u 巧，删和急性呼吸窘迫综合征( a c u t e r e s p i r a t o 巧d i s t r e s ss y n d r o m e ，铷5 m s ) 是临床常见的危重急症，是由多 种肺内外致病危险因子导致的以血管通透性增加、透明膜形成为主要 t 表现的炎症综合征，其发病机制非常复杂，死亡率可高达5 0 一7 0 。尽管目前急性肺损伤的发病机制并未完全明了，但是多数学 者认为，损伤过程中炎性反应，凝血纤溶系统的改变，氧化应激反应 内皮功能破坏等等都参与了a u 的发生发展。其中炎性反应与抗炎反 ，应之间平衡与失衡关系在其发病过程起重要作用，炎症介质过度表达 在急性肺损伤( a u ) 的发生、发展中起关键作用吲。a l i 剐r d s 时中 性粒细胞( p m n ) 在肺毛细血管内大量黏附、聚集，继之游出肺血 管床，移至肺泡腔，并持续活化，一方面通过释放活性氧、蛋白酶及 脂类代谢产物等炎症介质直接损伤肺组织；另一方面通过激活核因子 k b ( n u d e a r f a c t o r _ - k a p p ab ，n f k b ) 诱导肿瘤坏死因子a ( 耵师一a ) 白介素1 b ( i l l b ) 白介素8 ( i l 8 ) 等促炎症细胞因子的释放引起瀑 布效应；中性粒细胞在炎症部位生存周期明显延长是失血性休克和内 毒素血症所致a l i 早期重要的炎症效应细胞，在启动炎症反应和肺损 伤的过程中起主要作用吲。核因子础是一种能与免疫球蛋白k 轻 链基因的增强子，它可高效诱导多种细胞因子( 如i l 一1 、i l 一6 、i l 一8 、田帅) 、黏附分子( 如i 洲一1 、v 洲一1 、e i a m 一1 ) 、 趋化因子和急性期反应蛋白的基因表达，同时对参与炎症级联瀑布 效应的多种酶( 如一氧化氮合酶) 的基因表达也具有重要的调控作用。 如果能有效拮抗核因子佃的活化可以阻断炎症的级联放大效应， 可起到事半功倍的抗炎效果。 他汀类药物是3 一羟一3 一甲基一戊二酰辅酶a ( 删c i c o a ) 还原 酶的抑制剂近年来许多证据表明他汀类药物除了其明确的降低胆 固醇的作用之外，还发挥着许多非调脂作用，包括抑制炎症介质的释 放和血小板的聚集、抗凝、抗氧化、改善血管内皮功能、抗炎和免疫 调节反应等。抗炎的机制主要与调节炎性核因子叫b 有关，其次是 减轻白细胞( 主要是中性粒细胞) 向炎症区侵润，减轻局部炎症。一 系列的研究证实他汀有以下作用机制能起到抑制核因子础亚单位 p 6 5 核移位的作用，可以使异戊二烯化g 蛋白减少从而降低核因子 础的活性，可降低r h o 蛋白的异戊二烯化，使r h o 蛋白不能附着于 细胞膜，降低了r h o 蛋白的生物活性，释放进入细胞核的核因子佃 减少。基于以上的研究结果认为他汀类可能通过对肺组织细胞核因子 叫b 活化的表达影响，从而减少炎性因子过度表达，缩小炎症信号， 最终减轻了急性肺损伤。设计本研究旨在观察阿托伐他汀钙在脂多糖 所致大鼠急性肺损伤，对比研究对脂多糖所致大鼠肺损伤模型的病理 改变；肺组织核因子_ k b 表达的变化以及支气管肺泡灌洗液的 n 师a 、i l - 1 b 表达的相关性；从而探讨阿托伐他汀钙在脂多糖所致大 鼠急性肺损伤中的作用和地位。 材料与方法 l 实验材料与仪器 1 1 实验动物 清洁型雄性s p r a g u e d a w l e y 大鼠( 体重2 2 1 2 6 曲，泸州医学院 动物中心提供。所有的操作和实验流程均遵守实验动物管理条例。 动物在实验前均自由进食和进水。 1 2 主要实验试剂 脂多糖( 大肠杆菌0 1 2 7 ：b 8 e ，美国s 远m a 公司产品) 、阿托 伐他汀g a ( 美国辉瑞) 、大鼠白介素- 1b( i l - 1b ) e u s a 试剂盒 9 6 孔、大鼠肿瘤坏死因子一a ( 1 阿一a ) e u s a 试剂盒9 6 孔、n f k b 一抗 ( 美国a b z o o m 公司) 、d a b 试剂盒( 北京中杉金桥) 、b c a 试剂盒 ( 碧云天) 脱脂奶粉( 皖达山) 、发光底物( p i e r c e ) 、辣根酶系列 二抗、( 北京中杉金桥) 、显影液( 乐凯) 、定影液( 乐凯) 。 1 3 主要实验仪器 超低温高速离心机，水平摇床( 北京市六一仪器厂) ，普通 离心机( m i c r oc e n t a u r ) ，电泳电源( c i b - m 如) ，制胶器，转膜仪，电泳槽 ( 北京市六一仪器厂) ，磁力搅拌器( 江苏省金坛市金城国胜实验仪器 厂) ，恒温培养箱( 上海医疗仪器械厂) ，电子称，移液器：1 0 0 u l 一1 0 0 0 u l ， 1 0 u l - 1 0 0 u l ，o 1 u 1 1 0 u 1 ( 大龙) ，p h 计， 制冰机，细胞刮，酶标仪， 9 6 孔板。 2 实验方法 2 1 建立模型 9 0 只清洁型雄性s d 大鼠由泸州医学院动物中心提供，随机分为 空白对照组( 1 8 只，简称n 组，尾静脉注射生理盐水) 、模型组( 1 8 只，简称l 组，尾静脉注射内毒素6 m g l ( g ) 、干预组( 5 4 只，简称 t 组) ( 分3 个亚组：t 1 组( 1 8 只) ：阿托伐他汀5 m g l 【g d 加尾静脉 注射内毒素6 m g l ( g 组、t 2 组( 1 8 只) ：阿托伐他汀1 0 m g k 鲥加尾 静脉注射内毒素6 哦组、t 3 组( 1 8 只) ：阿托伐他汀2 0 m 刚k d 加尾静脉注射内毒素6 m g l 【g 组) ，各组又分为2 、4 和8h3 个时间 点，每组每个时间点处死6 只。t 组在注射脂多糖1 4 天前即开始每 天胃管注入相应剂量阿托伐他汀g a ( 立普妥) 均稀释为1 l n l 混悬液，k 7 组和l 组注入1 血生理盐水，1 次天。造模第一步是l 组和t 组使 用脂多糖( 6 m g l 【g ) 稀释成0 5 面进行大鼠尾静脉注射，k 组使用0 5 血 生理盐水大鼠尾静脉注射。各组又分为2 小时、4 小时和8 小时3 个 时间点，分别于注射脂多糖和生理盐水后2 小时、4 小时、8 小时处 死动物。 2 2 灌注固定和取材 处死动物后结扎右肺后，暴露气管行气管插管，用生理盐水以大 鼠体重的1 0 剂量的生理盐水分3 次进行支气管肺泡灌洗，回收率达 7 0 ，以2 0 0 0 g 离心1 0m i n ，留取上清液，储存于一8 0 0 c 冰箱备用。 取大鼠右肺下叶，支气管插人6 号套管针，注人1 0 中性福尔马林液， 待肺叶僵固后，浸泡在1 0 中性福尔马林液进行固定，3d 后切片， h e 染色后光镜下观察。大鼠右肺上叶、中叶置入e p 管放入液氮中拟 1 1 查n f k b 用。 2 3 标本检测方法 2 3 1 病理学观察 对取材的右下肺肺组织h e 染色后2 0 0 倍光镜下观察，对肺损伤的 程度采用胁l d 评分方法对肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出 血、肺不张和透明膜形成分别进行o 4 分的半定量分析：无损伤0 分， 病变范围 2 5 为1 分，病变范围占2 5 5 0 为2 分，50 病变 范围 7 5 为3 分，病变满视野为4 分，总肺损伤评分为上述各项之和。 每只动物观察1 0 个高倍视野，取其平均值。由两位病理科医师分别单 盲法评分后取平均分。 2 3 2 肺组织n f kb 测定 肺组织核蛋白与胞浆液的提取n f kb 参照d e r y c k e r e 等的方法 改进：将冷冻肺组织与液氮一起碾磨；放入组织匀浆器，加入5i i d 细胞裂解液 0 6 n p 4 0 ，1 5 0m m o l ln a c l ，1 0m m o l 晓乙基 哌嗪乙磺酸( 脏p e s ，p h 值7 9 ) ，1 衄o l l 乙二胺四乙酸( e d t a ) ， 0 5m m o l l 苯甲基磺酰氟化物( p m s f ) 】，用碾棒碾磨，并移至4 皿 试管中，20 0 0r m i n 离心3 0s 以上除示碎组织；上清液于冰中孵育5 m i n ，随后5o o or m i n 离心5m i n ( 取沉淀) ；核团重悬于1 0 0u l 胞核裂斛 液【2 5 甘油，1 0m m o l l 髓p e s ( p h 值7 9 ) ，4 2 0m m o l l n a c l ，1 2 m m o l lm g c l 2 ，o 2m m o l le d l a ，o 5m m o l l 二硫苏糖醇 ( d 田，o 5 m m o l l p m s f ，5u g 砌胃酶抑索，5u g 血亮肽菌素，5 u g m l 抑肽素】中，震荡1 5s 干冰中孵育3 0l n i n ；溶解的核移至微离 心试管中，1 4 0 0 0r m i n 离心2i n i n ，使细胞碎片聚集成团；上清液含 d n a 结合蛋白，液氮速冻，一8 0 下保存备用。采用w r e s t e mb l o t 法 检测肺组织细胞n f kbp 6 5 、的表达检测组核蛋白中n f k bp 6 5 的 表达差异，以4 5u g 蛋白泳道上样，经1 0 s d s p a g e 电泳分离后， 电转移到p ) f 膜上，3 b s a 封闭液封闭4h ，加入一抗兔抗鼠n f xb p 6 5 多抗( 工作浓度1 ：6 0 0 ) 及抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 i g g ( 工作浓度1 ：1 00 0 0 ) 进行杂交，d a b 试剂盒检测杂交信号，显影 于x 光( 柯达) 感光胶片上。积分灰度值测定：用b a n d s c 柚图像分析 系统对w e s t e mb l o t 目的条带扫描后进行分析，结果用积分灰度值表 示，以此代表n f kbp 6 5 蛋白的相对表达。 2 3 3 支气管肺泡灌洗液中t n f - a 、i l - 1 b 的e u s a 测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定( e u s a ) 法检测支气管肺泡灌 洗液中双抗体夹心酶联免疫吸附测定( e u s a ) 法双抗体夹心酶联免疫 吸附测定耵师a 、i l l b 的含量。双抗体夹心酶联免疫吸附测定( e u s a ) 法操作步骤：1 加样：每孔各加入标准品或待测样品1 0 0 u l ，7 将反应 板充分混匀后置3 7 1 2 0 分钟。2 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4 6 次，向滤纸上印干。3 每孔中加入第一抗体工作液1 0 0 u l 。将反应 ，板充分混匀后置3 7 6 0 分钟。4 洗板：同前。5 每孔加酶标抗体工作 液1 0 c h l l 。将反应板置3 7 3 0 分钟。6 洗板：同前。7 每孔加入底物 工作液1 0 0 u l ，置3 7 暗处反应1 5 分钟。8 每孔加入1 0 0 u l 终止液混 一匀。9 3 0 分钟内用酶标仪在4 5 0 n m 处测吸光值。1 0 以标准品1 0 0 0 、 5 0 0 、2 5 0 、1 2 5 、6 2 、3 1 、1 5 6 、op g 砌l 为横坐标，0 d 值为纵坐标， 在坐标纸上作图，画出标准曲线。1 1 根据样品o d 值在该曲线图上查 出相应耵师a 、i l l b 含量。 2 4 统计学处理 使用s p s s l 3 0 软件对数据进行处理，统计学方法采用成组设计的 秩和检验、单因素方差分析、直线相关分析进行统计描述。p o 0 5 有统计学意义。 多士毋 三日7k 1 1 肺组织病理学 在大鼠尾静脉注射给l p s 后，分批次处死大鼠后从右肺下叶肺组 织旺染色( 2 0 0 倍) 光镜下的病理上看，n 组完全正常，而l 组大鼠 和t 组大鼠都出现了明显肺泡和肺间质水肿、出血、炎症细胞聚集或 聚集反应的肺损伤表现，以4 小时最为显著，8 小时次之，2 小时最弱。 病理学评分参照上述标准( 最小损伤= o 分，轻度损伤= 1 分，中等度 损伤- 2 分，严重损伤= 3 分，极度损伤4 分) 。经评分后使用秩和检验进 行统计学分析，结果如表1 。从结果看l 组和t 组有明显的差异 ( 尸 o 0 5 ) 。因病理学改变以4 小时时最显著，所以本描述病理图片 仅选取4 小时组，见图1 5 。 图l ：n 组4 小时病理图片图2 ：l 组4 小时病理图片 图3；t 1 组4 小时病理图片图4 ：t 2 组4 小时病理图片 图5 ：t 3 组4 小时病理图片 表l病理评分结果 注：宰和l 组比较尸( 0 0 5 撑和n 组比较p o 0 5 ) ，见表2 。而在胞核里面n f kb 的表达l 组和t 组有显著性差异，l 组的表达明显高于t 组( 尸 o 0 5 ) ，t 组和l 组表达 都明显高于n 组( 尸 o 0 5 ) ，见表3 。从时间上看在2 小时时l 组和t 组 1 7 表达最高，8 小时组表达最低，呈递减趋势。t 组各亚组之间并没有明 显的显著性差异，没有显示剂量的优势( 跏0 5 ) 。 t 衢t 2 l o t 2 加t 4 5t 4 l ot 4 瑚伯t o 髓约 l 2l 4l 8k 2k 4 k 8 图7 ：胞核n f kb 表达 n f k b p 6 5 n n m p 两 t 2 5t 2 l o t 2 t 4 5h i o t 4 惭t 8 l ot 8 2 0 m 7 k b p 6 5 l 2l 4l 8k 2k 4k 8 图8 ：胞黼kb 表达 注。因标注问题，上述图片组别和文本描述不一致，特作以下说明：t 2 5 = t l 组- 2 小时、睨1 0 = - t 2 组2 小时、t 2 2 0 = t 3 组2 小时、t 4 5 = - t l 组_ 4 小时、t 4 1 0 = 1 r 2 组- 4 小 时、t 4 2 0 = t 3 组_ 4 小时、t 8 5 = 组- 8 小时、t 8 1 0 = 疋组- 8 小时、t 8 2 0 = t 3 组- 8 小时、 l 2 = l 组2 小时、i ，4 _ i 组- 4 小时、l 8 - l 组8 小时、n 2 - n 组- 2 小时、n 仁n 组_ 4 小时、 n 8 = n 组8 小时。 嗍 m h 表2胞浆n f kb 蛋白积分光密度值结果i n 吖咖n 2 时间 t ll n 2 小时 2 s 4 4 2 i 侈o “酗2 1 4 l 撑2 4 9 7 2 田o 1 2 6 5 7 7 错抛5 4 1 2 0 士1 4 9 6 0 9 l 群2 配1 4 7 3 2 士1 5 7 6 5 l l 弗 8 5 4 1 静l 士7 1 邺 2 3 7 8 8 慨1 6 7 3 勰皑2 2 0 4 6 慨1 7 2 0 0 6 7 掌2 3 3 1 o l l 3 士1 2 3 7 l 弗脚4 舵6 士儿9 o i 8 小时 2 l l o 7 3 8 0 圭1 4 0 5 6 2 簖2 1 1 5 6 5 l 雌1 2 5 7 5 0 鲥2 1 3 2 7 4 4 仳1 3 4 5 5 跎#2 l 鹪9 3 8 4 士1 7 4 j 珥2 粥 8 l o 酆9 l 士7 6 7 6 注：撑和n 组比较p 0 0 5 表3胞核n f kb 蛋白积分光密度值结果n t m m 2 时间 t l他ln 2 小时 1 3 6 2 田2 0 士粥粥7 9 哨1 3 4 9 2 3 4 0 士8 7 8 妇5 螂1 3 1 9 士7 1 1 7 7 5 增1 5 6 5 l 仳1 1 1 1 s 7 硝 4 小时 1 2 3 0 6 1 7 0 士昭7 4 “嘲1 2 2 9 o o 蝴舰4 1 2 2 叩1 2 3 5 9 l 蜘4 5 6 5 增 1 3 5 3 3 2 4 0 士枷2 3 9 错 8 小时 l l l 4 3 5 4 0 士1 1 8 1 6 哗l 啪5 2 9 0 七l 救7 0 4 2 喈l 8 8 7 8 她1 1 3 6 3 7 ：3 吖1 2 3 9 6 4 3 哟4 5 8 0 孵 注：和l 组比较尸 0 0 5 群和n 组比较尸 0 0 5 ： 主 羹 口 图9 ：胞浆核因子kb 表达趋势 图1 0 ：胞核核因子kb 表达趋势 y 两托伐他汀5 - g 御托伐他汀l 阿托伐他汀2 0 - 髓多糟 空白组 y 罚托伐他汀5 _ g 阿托伐他汀l o - g 阿托伐他汀2 0 - g 脂多糖 空白组 2 3 支气管肺泡灌洗液中1 n f - a 、i l l p 的e l 璐a 结果 在支气管肺泡灌洗液中e l i s a 法测n 盯a 、几一l p 表达结果( 见 表4 - 5 ) 提示：b a l f 中的，n 晒a 、儿一1p 浓度变化相同于胞核n f k b 的表达，即t 组和l 组有显著性差异( 脚0 5 ) ，t 组各亚组之间并没 有明显的显著性差异( 舢0 5 ) 。t 组和l 组表达都高于k 组( 氏o 0 5 ) 。 在时间表达趋势上( 图1 1 - 1 2 ) 看在卧l p 组是4 小时表达最高，8 小时 最低，而耵盯- a 则是在2 小时是最高，8 小时最低。 表4 m 1 p 结果删： 注：和n 组比较p ，0 0 5 群和l 组比较p o 0 5 。 表5 n 师- a 结果p 咖l 注：和n 组比较p o 0 5 撑和l 组比较p o 0 5 。 口 图1 1 ：b a l f 中n 师- a 的表达趋势 图1 2 ：b a l f 中i l 1 p 的表达趋势 y 搠托伐他汀5 - o 阿托伐他汀1 0 - 阿托伐他汀2 “g 精多糖 空白组 y 研托伐他汀5 - g 阿托伐他汀l o - g 弼托伐他汀2 “g - 搪多糖 空白组 2 4 b a l f 的1 n f - a 和广邛的表达和胞核的卜卜ib 相关性分析 因为l 组和t 组是使用脂多糖建立的肺损伤模型，所以我们使用l x c 至 薯墨 组和t 组支气管肺泡灌洗液中e l i s a 法测t n f a 、 1 p 表达的数据 和肺组织胞核的kb 测定结果分别做相关性分析( 见图1 3 1 4 ) ，我 们发现，支气管肺泡灌洗液中的耵盯a 和和胞核的n f kb 表达呈正相 关( 间7 2 2 ，砌0 5 ) ，支气管肺泡灌洗液中的i l 1 p 的表达也和胞 核的n f kb 表达呈正相关( 间3 3 3 ，尸 0 0 5 ) ，但是相关系数相差 较大，根据3 者的表达趋势分析，可能和表达高峰有关，b l a f 的n 师a 和和胞核的n f kb 的表达高峰值都是2 小时，然后成递减趋势，而 b l a f 的i l 1 p b 的表达是在4 小时达到高峰，2 小时时最低。而n 组的相 应数据没有相关性( r = o 3 2 7 ，舢0 5 ；闻2 4 5 ，础0 5 ) ，相应图表 省略。 6 0 o 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 o 0 0 0 l o o o o o o o1 2 0 0 0 0 0 01 4 0 0 0 0 0 0 1 6 0 0 。o o o o 胞核n f - 由 图1 3 ：b a l f 的i l l p 和和胞核的核因子砌相关性分析图 l o o o o o o 6 0 o o l o o o 0 0 矗棱n f 由 图1 4 ：b 剐l f 的n 师- a 和和胞核的核因子1 出相关性分析图 一la，的掌一 -l1的一z1 讨论 急性肺损伤o ) 是临床常见的呼吸系统急危重症。目前认为， 虽然急性肺损伤的发病机制迄今尚未完全阐明，但致病过程中失控性 的炎性反应，凝血纤溶系统的改变，氧化应激反应内皮功能破坏等等 参与了急性肺损伤的发生发展。其中炎性反应与抗炎反应之间平衡与 失衡关系在其发病过程起重要作用。近年来的研究发现急性肺损伤 急性呼吸窘迫综合症( a r d s ) 本质上是肺组织对严重感染、创伤、 休克等打击后产生广泛而过度的炎症反应，炎症反应在急性肺损伤 急性呼吸窘迫综合症起到核心作用。 急性肺损伤急性呼吸窘迫综合症时中性粒细胞( p m n ) 在肺 毛细血管内大量黏附、聚集，继之游出肺血管床，移至肺间质和肺泡 腔，并持续活化，一方面通过释放活性氧、蛋白酶及脂类代谢产物等 炎症介质直接损伤肺组织；另一方面通过激活核因子一1 ( b ( 猢) 诱导白介素1 b ( i 卜1 b ) 、白介素8 ( i l 一8 ) 、肿瘤坏死因子a m a ) 等促炎症细胞因子的释放引起瀑布效应，在炎症部位生存周期明 显延长。中性粒细胞是失血性休克和内毒素血症所致急性肺损伤早期 重要的炎症效应细胞，在启动炎症反应和急性肺损伤的过程中起主要 作用。 核因子_ k b 是一种能与免疫球蛋白k 轻链基因的增强子，核因 子一k b 日j 4 高效诱导多种细胞因子( 如白介素1 、白介素6 、白介素8 、肿 瘤坏死f 六i 子a ) 、黏附分子( 如i 删一1 、v c 蝴一1 、e i a m 一1 ) 、 趋化冈厂和急件期反应蛋白的基因表达，同时对参1j ：；三症级联瀑布 2 5 效应的多种酶( 如一氧化氮合酶)