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学 位 论 文: 大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 中文摘要 大鼠 肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 研究生:幸宇 导师:廖志钢教授 研究背景及目 的: 在法医学实践中， 历来对损伤时间的 推断建立在创 伤修复反应的病理生理学基础之上，即以不同经历时间的创口在修复过 程中 所表现的生活反应( v i t a l r e a c t i o n ) 特点 炎症反应、肉 芽组织及上 皮增生和疤痕修复所产生的各种形态、组化及生化变化特征作为推断损 伤时间和性质的依据。 机体损伤大多导致血管内皮的损伤， 其直接后果 是凝血过程的启动及其后的组织充血水肿，炎细胞浸润，组织修复再生 等， 其间v o n w i l l e b r a n d f a c t o r ( v w f ) 对损伤血管内 皮部位血小板的 粘附 聚集起到了重要作用;血管内皮生长因子 ( v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r , v e g f ) 是作 用最强， 特异性最高的 血管生 成调控因 子， 在损伤 的早期起到调节血管内 皮细胞通透性， 趋化炎细胞的作用， 在修复期起 改变细胞外基质，使其更易于血管的生长.在创伤的修复过程中，细胞 一生长因子 一细胞外基质( e c m, e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ) 三者相互作用、 相互 影响的复杂动态过程，生长因子参与了创伤愈合的整个过程井在其中发 挥着举足轻重的作用。 创伤修复过程中，内 源性生长因子起着重要的调 控作用，因而检查创伤后机体内的凝血因子及生长因子的改变，使更加 精确地推断损伤时间成为可能。 方 前伤组、 法: 健康s p r a g u e - d a w l e y 大鼠 ( s - d 死后伤组和正常对照组， 分为 1 5 m i n , 3 0 m i n , l h , 3 h , 6 h , 每组 1 2 h , 5只: 大鼠) 6 5 只，随机分为生 生前伤组按处死时间不同 i d , 3 d , 5 d , 7 d共十个亚组; 学 位 论 文、 大鼠 肌肉钝挫伤v w f 及v e g f 表达的实验研究 死后伤组分为死后3 0 m i n 和死后1 h 两个亚组. 建立大鼠 肌肉 钝挫伤模型， 通过免疫组织化学方法和图 像分析仪检测损伤后不同时间段的v wf及 v l : g f 表达的动态变化情况，并进行统计学分析。 结果:( 1 ) 损伤早期小动脉和小静脉v w f表达出现差异，小动脉内 皮细胞v w f 表达在损伤早期迅速下降， 在伤后1 d 开始回升， 3 d 回复至正 常水平，小静脉内皮细胞 of表达则与之相反，在早期明显上升， 损伤 后3 h 开始缓慢下降， 3 d 左右降至正常水平; 但总体of 信号强度先下降， 后回升。( 2 ) v e g f 在损伤后表达立即升高，在 3 d 经短暂平台期后继续上 升，7 d 达峰值并维持在较高水平。 结 论: 在局部肌肉 挫伤的 情况下 ，v e g f 和v w f 在损伤早期就发生 明显变化:v e g f 表达上升，v w f 表达下降，且v w p 下降持续时间较短。 联合应用v w f 和v e g f 可能成为肌肉 挫伤早期时间的客观指标. v e g f 在损 伤后早期升高和修复期的进一步升高与其在损伤修复不同时期的生理功 能密切相关。 关键词:v w f v e g f肌肉 挫伤 损伤时间推断 学 位 论 文大鼠 肌肉 钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 ab s t r a c t a s t u d y o n t h e e x p r e s s i ono f v w f i n t h e s a m e t i m e , v wf e x p r e s s i o n i n t h e e n d o t h e l i u m c e l l o f s ma l l vein g o e s a n o t h e r w a y , i t in c r e a s e s i g n i f i c a n t l y i n t h e e a r l y s t a g e o f i n j u ry , a n d d e c r e a s e s l o w l y s i n c e 3 h a ft e r i n j u ry a n d g o b a c k t o n o r m a l l e v e l b y 3 d a ft e r i n j u ry . b u t i n g e n e r a l , t h e s i g n a l l e v e l o f v wf o f m u s c l e t i s s u e d e c r e a s e d i m m e d i a t e l y a ft e r i n j u ry , a n d t h e n s l o w ly c o m e b a c k t o n o r m a l l e v e l . ( 2 ) v e g f e x p r e s s io n i n c r e a s e d i m m e d ia t e l y a f t e r i n j u ry , a n d r e a c h t h e p e a k v a l u e a n d k e e p a t a h i g h l e v e l b y 7 d . 学位论文大鼠肌肉钝挫伤v wf及 v e g f表达的实验研究 c o n c l u s i o n : b o t h v e g f a n d v wf c h a n g e i n t h e e a r l y s t a g e o f inj u ry: vegfe x p r e s s i o ni n c r e a s e s a n d v wfe x p r e s s i o nd e c r e a s e s , 润十走fl oo a n d v wf r e m a i n s a t l o w l e v e l f o r a s h o r t p e r i o d . t h e a p p l i c a t i o n v e g f a n d v wf c o u l d b e o b j e c t iv e i n d i c a t i o n o f e x t i m a t i o n s inc e inj u ry. w o r d s : v wf , v e g f， m u s c l e c o n t u s i o n , e s t i m a t e o f t i m e inj u ry 学 位论 文大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 前言 在法医学实践中， 解决刑事案件中受害者损伤后存活时间是法医工作 者重要任务之一。损伤后机体产生应激、炎症及组织的修复再生等一系 列反应， 因而历来对损伤时间的推断建立在创伤修复反应的病理生理学 基础之上，即以不同经历时间的创口 在修复过程中所表现的生活反应 ( v ita l r e a c t io n ) 特 点 一 炎 症 反 应 、 肉 芽 组 织 及 上 皮 增 半 和 疤 痕 修 复 所 产 生的 各种 形态、 组化及生化 变化 特征 作为 推断 损伤时间 和 性质的 依据d 1 国内外诸多学者利用各种指标及方法对损伤后存活时间的推断进行了大 量的研究:从组织形态学的改变，到机体内电 解质的量变化，到细胞因 子的动态改变， 以及结构蛋白及d n a的降解等， 利用了 组织学、 酶组织 化学及免疫组织化学及p c r技术等方法。 机体损伤大多导致血管内皮的损伤， 从而引发凝血过程的启动， 凝血 囚子的改变可以说是机体对损伤最早做出的反应之一。v wf ( v o n w ill e b r a n d f a c to r) 是 一 种 大 分 子 糖 蛋 白 ， 在 调 节 血 管 壁 损 伤 时 的 血 小 板 粘 附中起关键作用。 v wf主要在血管内皮细胞及巨 核细胞合成和分泌，其 多聚体在内皮细胞中贮存于w e i b e l - p a l a d 。 小体; 在巨核细胞的v wf 贮存 在血小板的a 颗粒中。v wf 功能主要为:在血管损伤处介导血小板的 粘附、聚集和血栓的形成。与v l l l 因子前体结合成v l l l 因子l v w f复 合物，在血液循环中直到v l l l 因子载体蛋白作用，防止其过早被蛋白 水 解酶破坏， 稳定v i l l 因子活性。 v w f 还可与肝素、 培养的内 皮细胞及 平滑肌细胞基质等结合。各种以血管内皮损伤为主要病变的原因均可使 内皮细胞中v wf 释放入血，如: 缺血、缺氧、 感染、烧伤及再灌注损伤 等。研究表明，v wf可反映各种理化因素所致损伤后的血管内皮细胞的 学 位 论 文 : 大鼠 肌肉 钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 功能状态，并对创伤的严重程度做出评估(2 ,3 1 纤维蛋白由纤维蛋白原，即凝血因子i 在凝血酶的作用下聚合而成， 在出血及炎症渗出性改变中起到重要作用，可形成互相交织的纤维网， 将r b c , wb c等包罗在内而形成血块， 是血液凝固的重要成份; 纤维蛋 自还可破坏血管内皮细胞的结构和功能，造成内皮细胞对某些大分子物 质的通透性增加，而且纤维蛋白原还可直接作用于血管壁平滑肌细胞， 促进血管壁平滑肌细胞的 迁移和增殖(4 1 血管生 成 ( a n g i o g e n e s i s ) 是在胚 胎的发育、 炎 症及 伤口 愈合中的 一 种正常的生理反应，它在创伤的修复全过程中具有重要意义。血管内皮 生长因子 ( v e g f ) 被认为是作用最强， 特异性最高的血管生成调控因子 15 1 ， 通 过 促进内 皮 细 胞的 募 集 和 增 殖， 介导 血 管 生 成的 开 始 (6 1 。 在 成 年组 织中， 维 持 毛细 血 管 相 邻内 皮 的 通 透 性 是v e g f 主 要 功能 之 一 (7 1 a v e g f 促血管通透性增高，并对单核细胞产生趋化作用， 可使单核细胞等聚集 并 进入 组 织间隙 (8 1 , v e g f 还能 改 变 细 胞 外 基 质， 使 其更 易 于血 管的 生 长， v e g f的这些功能为内皮细胞的迁移和肿瘤细胞的转移提供形态学基础 ( 9 1 创伤修复是一个复杂而有序的生物学过程， 每一修复阶段均受到机体 精细的调节。血管反应是炎症修复过程的中心环节， 细胞一生长因子一 细 胞外基质( e c m, e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ) 三者 相 互作用、 相互影响。目 前认 为，创伤修复是多种修复细胞、生长因子和细胞外基质之间相互作用的 复杂动态过程，生长因子参与了创伤愈合的整个过程并在其中发挥着举 足轻重的作用。创伤修复过程中，内源性生长因子起着重要的调控作用 10 ,1 1 ， 因 而 检查 损 伤 后 机体内 的 凝 血因 子及 生 长因 子的 改 变， 使更 加 精 确地推断损伤时间成为可能。 在刑事案件中， 损伤时间的推断尤为重要， 而在此类案件中大多存在 学 位论 文: 大鼠肌肉 钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 肌肉的钝挫伤。国内外对脑损伤后存活时间的研究比较多，而对肌肉钝 挫伤后生化指标的改变研究报道较少。 基于这一点，我们在本实验中建 立了大鼠肌肉钝挫伤模型，采用免疫组织化学染色 ( e n v i s i o n 法) ，并进 行图像分析处理技术检测v wf 和v e g f 在肌肉 钝挫伤愈合过程中表达变 化规律，试图比较在挫伤肌肉 修复过程中，其周边组织的v wf 及v e g f 表达变化情况，研究两者表达规律的异同及两者的相关性，是否与损伤 时间共有相关性: 同时应用ms b染色对纤维蛋白在损伤后的渗出情况进 行对比，从而为损伤时间的推断提供相应的依据. 学 位论 文: 大鼠 肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 结果 1 实验动物肌肉损伤后表现 大鼠 在受打击后伤腿抽搐痉挛， 伤灶处皮肤完整， 皮下出 血明显。 致伤后不予任何处理， 自由进食。 伤后6 小时左右大鼠逐渐恢复活动， 进食基本正常，伤后2 天活动基本恢复正常。 2 解剖所见 致伤组大腿肌肉 挫伤明显， 伤灶肌肉断裂，形成积血腔隙，伤后 1 5 m i n -6 h 肌肉出血较多，组织充血水肿;伤后 1 2 h 伤灶积血明显减 少，组织水肿;伤后 i d伤灶积血基本吸收，组织水肿渗液，积血腔 隙收缩; 伤后3 d 组织渗液减少， 伤灶积血腔隙进一步收缩;伤后5 d 组织渗液基本停止， 伤灶轻度充血; 伤后 7 d伤灶积血腔隙消失， 伤 灶无明显充血渗液。 3 肌肉损伤后h e染色组织病理学改变 肌肉伤灶周围见大量r b c ， 细胞水肿， 血管明显充血， 炎细胞浸 润情况与文献报道相同。 周边肌肉改变主要为充血水肿表现。 3 . 1正常对照组 大鼠肌肉肌束丰富， 肌束间为血管及神经走行，肌束膜间可见散 在成纤维细胞及少量巨噬细胞分布，肌束肌外膜间散在毛细管分布。 肌束内的肌细胞间排列紧密。 3 . 2损伤组 1 5 m i n - 3 0 m i n组挫伤缘肌细胞广泛断 裂， 胞浆淡染， 细胞水肿， 细胞间隙增大。l h - 3 h 组部分肌束内肌细胞间完全分离，细胞间质水 肿明显，血管周围炎细胞渗出。6 h - 1 d 组见挫伤缘炎细胞浸润明显， 正常肌肉肌细胞间质水肿明显，大量肌束内肌细胞间完全分离。3 d 学位论文: 大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 -5 d 组见肌束内肌细胞间隙开始减少，7 d 组见肌细胞间水肿己不明 显。 死后损伤组损伤缘未见出血等生活反应， 肌细胞间广泛分离， 间 质水肿，肌细胞体积缩小。 4 肌肉 损伤后免疫组织化学染色结果 4 . 1 v wf染色结果 v w f阳性着色位于血管内皮细胞胞浆及胞膜，血管管腔内血细 胞，内皮细胞基膜及出血损伤部位。 4 . 1 . 1 正常肌肉v wf 表达情况 v wf 阳性着色仅见于血管内 皮细胞胞浆及胞膜，内 皮细胞基膜。 其中小动脉及小静脉阳性表达明显， 肌细胞间毛细血管呈广泛弱阳性 表达，血管内血细胞团块偶见弱阳性表达。 4 . 1 . 2损伤后肌肉v wf 表达变化情况 损伤组中的自身对照侧 v wf染色阳性结果位于血管内皮细胞及 基膜， 其表达呈现动态改变 ( 表 1 , 3 ) , 1 5 m i n - 3 0 m i n阳性信号强度 明显降低，阳性信号总面积也同时减少; l h - 3 h v wf阳性信号强度开 始回升，阳性信号总面积随之回升:6 h血管内皮细胞阳性信号强度 回复至正常水平， 阳 性信号总面积回升至正常水平: 1 2 h 间阳性信号 强度达峰值后迅速回落， 1 2 h - l d 阳性信号强度回落到正常水平; l d - 7 d 组血管内皮细胞阳性信号强度及总面积在正常水平附近波动 ( 图1 , 3 ) 。死后组自身对照侧v wf 染色结果与空白组正常情况相同。 损伤组挫伤缘出血区周边呈强阳性着色， 1 5 m i n - 3 0 m i n 肌细胞间 毛细血管内皮细胞呈弱阳性或阴性着色， 小动脉内皮细胞阳性信号强 度迅速下降至谷底， 小静脉内 皮细胞阳性信号强度上升， 阳性信号总 面积较正常水平减少;1 h毛细血管内 皮细胞广泛呈阴性着色，小动 脉内 皮细胞阳性信号强度维持在低水平， 小静脉内 皮细胞阳性信号强 学 位论 文: 大鼠 肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 讨论 肌肉钝挫伤模型的选择及比较 钝性暴力所致组织器官损伤的模型， 可通过单摆打击， 液压冲击， 钳压及自由落体打击等方法复制:在脑损伤的模型复制中，经典的 d a i 瞬间旋转模型， 避免了外力对头部的打击或头部撞击物体， 消除 了 接触现象的影响” 2 1 本实验采用陈晓刚 1 3 改进后的，由m a r m a r o u a等建立的自 由 落 体打击大鼠颅骨致颅脑损伤模型， 将其应用于大鼠肌肉钝挫伤模型的 复制。 自由落体打击法影响模型的因素较多， 如动物种属及年龄不同， 技术熟练程度不同， 动物固定不良 致打击部位不一致， 重锤打击受力 面的形状与接触部位面积大小不同等情况，都可影响模型的重复性。 在本实验中， 因大鼠 大腿致伤部位面积较大， 接触面平整， 通过重锤 打击建立的肌肉钝挫伤模型， 打击力定量方便准确， 其损伤的可重复 性较好， 损伤程度和部位均较为一致， 在肌肉钝挫伤模型的复制中本 方法效果理想，简便易行。 大鼠肌肉钝挫伤v wf , v e g f 表达变化规律及意义 v w f在介导正常的 止血 及病理 性血管内 血栓形 成 1 4 ,1 5 中 起关 键 作用， 主要在血管损伤处倡导血小板的粘附、 聚集和血栓的形成;同 时还与v i i i 因子前体结合成v i i i 因子/ v wf 复合物， 防止其在血液循 环中 过早 被蛋白 水 解 酶 破 坏 16 1 ; v w f 还 通 过内 皮 细 胞 及平 滑 肌细 胞 基质与血管壁结合， 在止血中起到重要作用。 血管损伤部位的血小板 的枯附、 聚集依赖于多种粘附及可溶性收缩受体的协同作用， 同时受 到血管内血流状态的影响， 而v wf 在介导在高剪切条件下的血小板 血 栓的 形 成起 到至 关 重 要的 作用 1 7 .1 8 。 内 皮 细 胞的v w f 单 体形 成二 学位论文: 大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 聚体后转移到高尔基体及 w e i b e l - p a l a d e形成多聚体，并贮存于 w e ib e l - p a l a d e 小体;在巨 核细胞的v w f 贮存在血小板的a 颗粒中。 合成 后的v w f 被分泌进入到 血浆 及血 管内 皮细 胞基 膜中 19 。 正常 情 况下机体血液内v wf 含量较低，且主要为v wf 前体及二聚体形式。 高分子多聚体贮存在 w- p小体中，受到刺激再分泌，其生物学活性 较高， 故内皮细胞选择性贮存活性较高的大分子多聚体， 并在受刺激 时 释放以 加速止 血反应， 具有重 要生 理 意义 2 0 ,2 11 。 研究 认为， 尽管 v wf不是血管内皮细胞的特异性标志，但是以其标记内皮细胞和反 映内皮细胞的损伤情况，其敏感性和特异性都十分理想。 本实验中，正常组 v wf阳性信号主要位于血管内皮细胞及其基 膜， 在血管内血细胞团块偶见弱阳性信号; 在损伤组中， 不同损伤时 间的v wf 表达呈动态变化， 而且其动态变化过程仅见于内皮细胞中。 自 身对照侧v wf 表达在损伤早期1 5 m i n - 3 0 m in 呈一过性下降，其后 迅速上升，于6 h 恢复至正常水平后，1 2 h 呈轻度升高，i d 后再次回 落并维持在正常水平: 其早期呈一过性下降的原因主要有二点， 一是 损伤后的应激反应本身就可引起内 皮细胞反射性地释放 v wf多聚 体，二是可能与损伤后局部v wf 含量下降，机体进行调控，使v wf 发生再分布有关，从而保证局部v wf 含量维持在一定水平，使凝血 功能不致受到影响: 其后的v wf 表达升高系内皮细胞对v wf合成增 加所致。 本实验中损伤侧小动脉及小静脉内皮细胞在不同时间的 v wf表 达不同，小动脉 v wf表达在损伤早期即明显下降，3 0 m i n左右即降 至低点并持续到3 h 左右， 其后缓慢回升， i d 左右仍略低于正常， i d - 3 d 问基木恢复至正常水平，5 d - 7 d 维持在正常水平波动:而小静脉在损 伤后v wf 表达不降反升， 在损伤早期表达明显增强， 在损伤后3 h 达 学 位论文: 大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 到峰值， 3 h - 6 h间下降明显， 其后缓慢下降至正常水平， 7 d 时略低于 正常水平;毛细血管内皮细胞v wf 表达在损伤早期迅速降低，1 h 降 至低点，3 h 开始回升，3 d 后回升至正常水平，5 d 后表达略升高，7 d 后再次回落到正常水平。从阳性信号的平均强度和总面积的变化来 看，损伤后v wf 表达较自 身对照侧下降更为明显和迅速，维持在低 点的时间也更长， 3 h 左右降至谷底后缓慢回升， 3 d 后恢复正常水平， j 飞 5 d 升至略高于 正常水平后回落， 7 d 回复正常。 在损伤灶周围的 血 管内皮细胞中v wf的动态变化主要与损伤出血相关，内 皮细胞的损 伤使凝血过程启动，导致了v wf大量释放，从而导致小动脉及毛细 血管内皮细胞 v wf的含量明显下降:在损伤早期上游血管释放的 v wf大量进入血液，及其后组织出血停止进入炎症修复期后， v wf 及 其降 解产物 进入 血液， 一 部 分被 小 静脉内 皮细 胞 吞 饮， 从而 小 静脉 v wf 表达在早期即持续升高: 毛细血管内皮细胞v w f的动态变化在 损伤早期较小动脉内皮细胞变化更为迅速和敏感， 回复正常时间与小 动脉基本一致。 由于v wf的清除主要是在肝脏单核一巨噬细胞系统， 小静脉内皮细胞吞饮吸收的v wf最终仍释放进入血液，转运到肝脏 进行清除。 血管内皮生长因子 ( v e g f )在血管内皮细胞生长和分化中是一 重 要的多功能调节物2 2 1 : 在成年组 织中， 维持毛 细血 管相邻内 皮的 通 透性是v e g f 主要功能之一2 3 1 ; 在损 伤后v e g f 促血管 通透性 增高， 并对单核细胞产生趋化作用，可使单核细胞等聚集并进入组织间隙 2 4 1 ， 它通过促进内皮细胞的募集和增殖， 介导血管生成的开始2 s 1 v e g f 还能改变细胞外基 质， 使其更易 于血管的 生 长2 6 1 ， 因而被认为 是作用最强， 特异性最高的 血管生成调控因子， 它全程参与了创伤修 复。 本实验证实在正常情况下v e g f 在肌肉组织仅呈弱阳性表达， 学 位 论 文: 大鼠 肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 在血管壁表达与其维持毛细血管内皮间通透性相关， 在神经纤维可见 阳 性 表达， 与文献报道12 1 v e g f 兼有促神经生长 功能 有关 相符。 本实验发现，在损伤早期血管壁及周围基质和附 近肌细胞v e g f 表达就开始升高， 在损伤后i d - 3 d 经短暂平台期后， 持续上升， 至7 d 仍处于峰值，同时发现在血管内皮细胞亦出现阳性表达。 文献报道在 损伤后组织v e g f 表达立即上升， 与本实验结果一致: 也有人对大鼠 mc a闭塞模型研究发现， v e g f m r n a在缺血周边区于缺血后 3 h 开始表达， 持续至第7 天v e g f m r n a的水平仍很高 12 8 1 ， 其早期表 达 。 木实验略有差异，可能与动物模型不同及检测目 标为m r n a有 关。 不少学者发现血小板在v e g f 的产生及调节中起重要作用。 有人 用血小板和凝血酶在体外孵化， 结果发现有大量的v e g f 产生， 因此 认为血小板和损伤的血管壁接触激发凝血机制后导致v e g f 的释放。 s a l g a d o ( 1 9 9 9 ) 在对患高度恶性肿瘤病人的 血液标本进行检测发现， v e g f 血清浓度与血小板数呈正相关性， 血小板增多病人血清v e g f 浓度是正常病人血小板的3 .2 倍。 此结果支持血小板具有储存生物活 性的v e g f的作用，这对防止血液循环中的v e g f在血液凝固部位 以外出现诱导新生血管作用有益。 活化的血小板能释放v e g f ， 这对 伤口 愈合及其它病理条件下的 ( 如动脉粥 样硬化、 肿瘤的 生 长和转移 形成) 血管形成具有重要意义， 血小板对v e g f 详细的作用及调节机 制有待于进一步研究。 本实验发现损伤后v e g f 表达立即升高， 可能 是血小板对储存的v e g f 在损伤后释放造成。 f r a n k ( 1 9 9 5 ) 和h o w d ie s h e l l ( 1 9 9 8 ) 在实验发现， v e g f 在伤口 部位 浓度明显增高。 本实验结果与其相符， 表明v e g f 对伤口 部位通透性 增加和伤口部位血管生成、肉芽组织的形成有关。 v e g f 是一种分泌 性蛋白， 其受体主要存在于血管内皮细胞表面， v e g f 通过与特异的 学 位 论 文 : 大鼠 肌肉钝挫伤v w f 及v e g f 表达的实验研究 细胞膜受体f l k -1 ( k d r 和f l t -1 相互作用， 介导实现其生物学 效应， 这解释了在损伤后内皮细胞阳性信号的来源机制; v e g f由内 皮细胞邻近的细胞产生， 表明了血管形成的一种旁分泌机制; 在损伤 后组织水肿， 局部存在缺氧， 研究证实v e g f的表达是受缺氧程度调 节的， 这样便提供了一种生理反馈机制， 即通过促进血管的形成， 调 节不充足的组织氧合作用。 本实验发现，在损伤早期 v wf表达就出现明显下降，且小动脉 与小静脉内皮细胞表达出现差异;v e g f在损伤早期表达也立即上 升， 在修复中晚期维持在高表达水平; 在死后损伤组两者表达都没有 发生改变。在损伤早期，v e g f与v wf的释放与血小板关系密切， 与 凝而 _ 过程及组织的水肿紧密相关，可望应用于损伤早期的时间推 断; v e g f 在损伤修复全程中的调控作用， 使其能够对损伤后期的时 间推断提供依据。 大鼠肌肉钝挫伤纤维蛋白 渗出变化情况 在损伤后的止血及炎症过程中， 纤维蛋白的渗出对凝血过程、炎 细胞的浸润， 细胞基质成分的改变和组织的修复再生提供支持等起到 了重要作用。本实验通过ms b法对渗出 纤维蛋白 进行染色，结果提 示在损伤后纤维蛋白渗出由 少到多，同时伴随炎细胞的浸润， 在 3 d 内f新鲜纤维蛋白 着色， 结合其渗出量及细胞浸润的形态学改变， 可 以为损伤早期的时间段划分提供大体上的依据: 在损伤晚期纤维蛋白 呈陈旧性染色改变，仅提示存在陈旧性损伤或纤维蛋白 渗出 性病变。 开放性损伤与闭合性损伤的差别 本实验建立的大鼠 肌肉 挫伤模型为中度肌肉挫伤， 损伤范围 较为 局限， 肌肉存在明显挫伤， 但尚不致产生广泛肌肉挫伤 ( 如挤压综合 症) 的 情况， 因 而在 对 肌肉 挫伤后 损伤时间的 推断仅提供初步 依 据。 学 位 论 文大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 在开放性损伤中，由于可能会出现严重的失血及感染等情况， v wf 的动态变化可能与本实验的闭合性损伤模型的情况有所不同， 在小动 脉及小静脉的内皮细胞表达的情况可能会趋于一致; 同时 在感染的情 况下， v e g f 的表达可能会更为迅速， 表达强度也更高， 这与其对炎 细胞的趋化作用，增加血管内皮细胞的通透性等生理功能密切相关。 未解决的问题及未来研究方向 本实验主要研究在损伤早期细胞因子的表达变化情况， 试图为法 医学实践中损伤后存活时间的推断提供客观指标及依据， 考虑到实用 j性，在时间分组上并未考查 7 d后的细胞因子动态变化情况。另外， 由于模型本身的原因， 对挫裂伤、 严重的失血性损伤， 全身合并多部 位肌肉挫伤及不同损伤程度的肌肉挫伤等情况下， 细胞因子的动态变 化尚需进一步的研究。 v e g f 和v wf 与血管损伤密切相关，同时分子量小，不易分解; 能够区分生前伤及死后伤， 在损伤早期反应灵敏， 因而可能用于多种 不同损伤情况下损伤后存活时间的推断， 故而可以对同一部位不同情 况下的损伤、 同一损伤在不同部位、以及不同损伤在不同部位的细胞 因子的动态变化进一步进行比较研究， 同时建立标准化的检验流程和 分析量化标准， 从而为法医学检案中损伤时间提供更为可靠和客观的 指标。 学位论文大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 结论 本实验应用免疫组化和图像分析技术对自由 落体打击致大鼠 肌肉钝 挫伤模型的v w f 和v e g f 动态变化进行定位及半定量研究，结果表明: 1 . 正常对照组大鼠肌肉 组织中v wf 仅表达于血管内皮细胞及其基膜， v e g f 在血管中膜层有表达，在肌肉细胞仅散在弱阳性表达。 2 在局部肌肉 挫伤的情况下， v e g f 和v wf 在损伤早期就发生明显变 化: v e g f 表达上升， v wf 表达下降， 且v wf 下降持续时间较短。 联合 应用v wf 和v e g f 可能成为肌肉挫伤早期推测损伤时间的客观指标。 3 .v e g f 在损伤后不同时期作用不同，在损伤早期主要与调节血管内 皮细胞通透性和炎细胞趋化有关，在修复期主要起改变细胞基质，促进 内皮细胞生长和血管生成的作用。 4 . 结合 ms b染色显示纤维蛋白的渗出情况，可以对损伤后时间段进 行大致划分，但是当存在纤维蛋白渗出性疾病的情况时，会影响判断的 雕确性。 5 .有必要对不同部位的肌肉 挫伤，同一部位不同程度的肌肉挫伤， 及 不同因素造成损伤后的v wf 及v e g f的动态变化， 应进一步研究和进行 横向比对分析，以期为法医学检案提供客观依据。 学 位 论 文大鼠 肌肉 钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 参考文献 1 . 王慧君， 武忠强， 黄光照. 细胞因子在皮肤创伤修复中的表达及其与损 伤时间的关系. 中国法医学杂志， 1 9 9 9 年， 1 4 ( 2 ) : 1 1 9 - 1 2 3 2 . 高政慧， 艾玉峰， 郭树忠等. 猪后肢皮肤撕脱伤后v wf的变化. 第四军 医大学学报， 1 9 9 9 , 2 0 ( 9 ) : 8 0 4 - 8 0 5 3 . 袁志敏. v o n w i l l e b r a n d因子与心血管疾病. 国外医学老年医学分册， 1 9 9 7 , 1 8 ( 2 ) : 5 8 - -6 1 4 .n a i t o m, h a y a s h i t , k u z u y a m, e t a l . e ff e c t s o f f i b r i n o g e n a n d fi b r i n o n t h e m i g r a t i o n o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s i n v it r o j . a t h e r o s c l e r o s i s , 1 9 9 0 , 8 3 : 9 5 .b r o o k s p c , ma n t g o m e ry a m, c h e r e s h d a , e t a l . u s e o f 1 0 - d a y - o ld c h i c k e m b r o m o d l e f o r s t u d i n g a n g i o g e n e s i s . c a n c e r me t a s t a s i s r e v , 1 9 9 6 , 1 5 ( 2 4 2 ) : 1 8 7 - 1 9 4 6 . ma u l ik n , d a s d k . r e d o x s i g n a l i n g i n v a s c u l a r a n g i o g e n e s i s . f r e e r a d i c b i o l me d . 2 0 0 2 , 3 3 ( 8 ) : 1 0 4 7 - 6 0 7 .c o n n o l l y d毛o l a n d e r j v , h e n v e l m e n d h e t a l . h u m a n v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y f a c t o r j . j b i o l c h e m , 1 9 8 9 , 2 6 4 : 2 0 0 1 7 8 . c l a u s s m, we i c h h, b r e i e r g. j b i o l c h e m, 1 9 9 6 , 2 7 3 ( 3 0 ) ; 1 7 6 2 9 9 . t a d d e i l , c h i a r u g i p , b r o g e l l i l , e t a l . i n h i b i t o ry e ff e c t o f f u l l - l e n g t h h u m a n e n d o s t a t i n o n i n v i t r o a n g i o g e n e s i s . b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n , 1 9 9 9 , 2 6 3 ( 2 ) : 3 4 0 - 3 4 5 l 0 .f a l a n g a v . g r o w th s f a c t o r w o u n d h e a l i n g j . d e r m a t o l c l i n , 1 9 9 3 , 1 1 : 6 6 7 1 1 .g r e e n h a l g b d g . t h e r o l e o f g r o w th f a c t o r s i n w o u n d h e a l i n g j .j 学 位 论 文大鼠 肌肉钝挫伤v wf 及 v e g f 表达的实验研究 f r a u m a , 1 9 9 6 , 4 1 : 1 5 9 1 2 . g e n n a r e l l i t a, t h i b a u lt l e , a d a ms j h, e t a l . d i ff u s e a x o n a l i n j u ry a n d t r a u m a t i c c o m a i n t h e p r i m a t e .a n n n e u r o 1 , 1 9 8 2 , 1 2 ( 6 ) : 5 6 4 - 5 7 4 1 3 . 陈晓刚.大鼠弥漫性脑损伤一淀粉样前体蛋白早期表达及法医学应 用.华西医 科大学硕士学 位论文;学校代码:1 0 6 3 ; 2 0 0 0 年5 月2 0 日 1 4 . s u g im o t o m, m i y a t a s . f u n c t i o n a l p r o p e r ty o f v o n wi l l e b r a n d f a c t o r u n d e r fl o w i n g b l o o d . i n t j h e m a t o l . 2 0 0 2 ; 7 5 ( 1 ) : 1 9 - 2 4 1 5 . d e g r o o t p g . t h e r o l e o f v o n wi l l e b r a n d f a c t o r i n p la t e l e t f u n c t i o n . s e m i n i h r o m b h e m o s t . 2 0 0 2 ; 2 8 ( 2 ) : 1 3 3 - 8 1 6 . 洪欣，李凤芝，尹昭云等. 不同应激损伤所致血管内皮细胞中v wf的 变化，中国 应用生理学杂志; 2 0 0 0 , 1 6 ( 4 ) : 3 1 03 1 3 1 7 . s u g i m o t o m, mi y a t a s . f u n c t i o n a l p r o p e rt y o f v o n wi l l e b r a n d f a c t o r u n d e r fl o w in g b lo o d . i n t j h e m a t o l . 2 0 0 2 ;7 5 ( 1 ) : 1 9 - 2 4 1 8 . j a c k s o n s p , n e s b i tt ws , k u l k a r n i s . s i g n a l i n g e v e n t s u n d e r l y i n g t h r o m b u s f o r m a t i o n . j t h r o m b h a e m o s t . 2 0 0 3 ; 1 ( 7 ) : 1 6 0 2 - 1 6 1 2 1 9 . t u r e c e k p l , v a r a d i k , s c h l o k a t u , e t a 1 . i n v i v o a n d i n v i t r o p r o c e s s i n g o f r e c o m b i n a n t p r o - v o n wi l l e b r a n d f a c t o r . h i s t o c h e m c e l l b i o l . 2 0 0 2 ; 1 1 7 ( 2 ) : 1 2 3 - 9 2 0 . c a s t a m a n qf e d e r i c i a b , r o d e g h i e r o f , e t a l . v o n wi l l e b r a n d s d i s e as e i n t h e y e a r 2 0 0 3 : t o w a r d s t h e c o m p l e t e i d e n t i f i c a t i o n o f g e n e d e f e c t s f o r c o r r e c t d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t . h a e m a t o l o g i c a . 2 0 0 3 j a n ;8 8 ( 1 ) :9 4 - 1 0 8 2 1 . r u a n c .m o le c u l a r d i a g o s i s o f v o n wi l l e b r a n d d i s e as e . i n t j h e m a t o l . 2 0 0 2 a u g ; 7 6 s 叩p l 2 : 1 4 5 - 8 2 2 . b r e i e r g . a l b r e c h t u , s t e r r e r r s , e t a l . e x p r e s s i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r d u r i n g e m b ry o n i s a n g i o g e n e s i s a n d e n d o t h e l i a l c e l l 学位论文: 大鼠肌肉钝挫伤v wf 及v e g f 表达的实验研究 d i ff e r e n t i a t i o n j . d e v e l o p m e n t , 1 9 9 2 , 1 1 4 ( 2 ) : 5 2 1 - 5 3 2 2 3 .贾军，张志明.血管内皮生长因子与肿瘤.陕西肿瘤医学 2 0 0 2 , 1 0 ( 3 ) : 2 3 3 - 2 3 4 2 4 . 潘 欣。血管内皮细胞生长因子的研究进展。国外医学临床生物化学 与 检 验学 分 册， 2 0 0 0 , 2 1 ( 2 ) :6 6 - 6 9 2 5 . a n d r e w s r k , k a m i g u t i a s , b e r l a n g a o , e t a l .t h e u s e o f s n a k e v e n o m t o x i n s a s t o o l s t o s t u d y p l a t e l e t r e c e p t o r s f o r c o l l a g e n a n d v o n wi l l e b r a n d f a c t o r . h a e m o s t a s i s . 2 0 0 1 ma y - d e c ; 3 1 ( 3 - 6 ) : 1 5 5 - 7 2 . 2 6 . c a s t a m a nqf e d e r i c i a b , r o d e g h i e r o f , e t a l . v o n wi l l e b r a n d s d i s e a s e i n t h e y e a r 2 0 0 3 : t o w a r d s t h e c o m p l e t e i d e n t i f i c a t i o n o f g e n e d e f e c t s f o r c o r r e c t d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t . h a e m a t o l o g ic a . 2 0 0 3 j a n ; 8 8 ( 1 ) :9 4 - 1 0 8 2 7 . m e i r e r r , g u r u n l u o g l u r , s i e m i o n o w m . n e u r o g e n i c p e r s p e c t i v e o n v a s c u l a