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实时荧光p c r 检测转基因 农产品的研究 中文摘要 据国际农业生物技术应用咨询服务中心( i s a 从) 统计，2 0 0 1 年全世界转基因作 物种植面积为5 2 6 0 万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中9 9 的转基因作 物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，己批准商品化转基因作物有大豆、玉米、 油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、豫 麻、烟草、西瓜、菊苣等。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有 近万种。 对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的 影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦 点问题，先后出台了一系列的相关政策和规定，其中许多国家限制了转基因的最 低含量，阈值大小从卜5 不等。这就要求对转基因产品进行检测，以明确其种类， 确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因 产品任意扩散，造成不可挽回的损失。我国也于2 0 0 1 年5 月9 目公布并实旌农 业转基因生物安全管理条例，并于2 0 0 2 年1 月5 日公布了农业转基因生物安全 评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界3 6 个国家和地区出台 了各种转基因产品有关的法律法规。 虽然联合国所属机构( f a o 、w h o 等) 及一些地区性国际组织在召集建立世界 统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措旌及 其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。 为了能有效地检测转基因产品，我们已收集了国内外已商品化的转基因作物品 种的基因构建图，选择了能覆盖全部己商品化转基因品种的7 个基因作筛选目标 ( 3 5 s 、n o s 、n p ti i 、p a t 、b a r 、f m v 、c r y 3 a ) ，设计了多条特异性引物和荧光探 针，利用荧光p c r 方法进检测，相对检测灵敏度达到0 1 。目前已建立了转基因 荧光定性p c r 检测体系及转基因大豆r o u n d u pr e a d y ”和转基因玉米b t 一1 7 6 的荧 光定量检测体系。同时采用u n g 去污染酶，将p c r 产物污染的可能性降到最低。 为进一步确认所检基因，我们将部分p c r 产物克隆到t 一载体上，转化大肠杆菌阴5 a ，筛选阳性克隆，经测序结果表明，扩增产物与g e n e b a n k 中的序列同源性达 9 9 9 以上。同时还克隆了两个全长基因做阳性对照。 本论文在国内首次建立了转基因荧光p c r 检测方法，并与公司合作推出配套试 剂盒。这对今后进出口转基因产品的检测将产生深远的影响，并具有重要的现实 意义。 关键词：转基因作物荧光p c r 检测 e n g l i s ha b s t r a c t j a c c o r d i n gt oi s j 气a a c o u n t ， t h ec u l t i v a t e da r e ao ft r a n s g e n i cc r o p si n t h ew h 0 1 ew o r l di s5 2 ，6 0 0 ，0 0 0h e c t a r e si n2 0 0 1 ， m o r et h a nt e nc o u n t r i e s h a v ea l r e a d yp l a n t e dt h et r a n s g e n i cc r o p s ，9 9 o ft h et r a n s g e n i cc r 印sa f n o n g t h e ma r ep l a n t e di n u s a ，a r g e n t i n a ， c a n a d aa n dc h i n a c o 衄e r c i a l i z e d t r a n s g e n i cc r o p sa r es o y b e a n s e s ，m a i z e ，r a p e s ，c o t t o n s ，t o m a t o e s ，p o t a t o e s ， s w e e tp e p p e r ，f r e n c hg o u r d ，c h i n e s ef l o w e r i n gq u i n c e s ， b e e t s ，f r a g r a n t c h i n ap i n k ，m o r n i n gg l o r y ， f l a x ，t o b a c c o ，k i n d so ff o o dt h a ti sp r o c e s s e d w i t ht h et r a n s g e n i cc r o p si nt h ew h 0 1 ew o r l d p e o p l ea n da n i m a ls e c u r i t yf r o mt h et r a n s g e n i cp r o d u c t s ， e s p e c i a l l y t r a n s g e n i cf o o dh e a l t h ya n dt h ei 叩a c tc l ne c o l o g i c a le n v i r o n m e n t ， s i n c e t h eg e n et e c h n 0 1 0 9 ya p p e a r e d ，h a sb e e nt h ef o c u sq u e s t i o no fi n t e r n a t i o n a l o r g a n i z a t i o n s ，i n c l u d i n gm a n yc o u n t r i e sa n du n ，e t c a n dm a k eo u tas e r i e s o fr e l e v a n tp o l i c i e sa n d1 a w ss u c c e s s i v e l y a1 0 to fc o u n t r i e sa m o n gt h e m l i m i t e dt h em i n i m u mc o n t e n to ft h et r a n s g e n i cp r o d u c t i o n ， t h et h r e s h o l d v a l u ei sv a r y i n gf r o m1 t o 5 i tn e e dt od e t e c tt r a n s g e n i cp r o d u c t s p r e c i s e l y ，d e f i n i t e l y i no r d e rt op r e v e n ts o m et r a n s g e n i cp r o d u c t sw i t h r i s kf r o ms p r e a d i n g ，o u rc o u n t r ya n n o u n c e da n di 叩1 e m e n t e d ”a g r i c u l t u r a l t r a n s g e n i cb i o l o g ys a f em a n a g e m e n tr u l e ”o nm a y9 ，2 0 0 lt o o ，a n da n n o u n c e d a g r i e u l t u r a lt r a n s g e n i cb i o l o g y s a f e a p p r a i s 8 1 ，s i g n 8 n di m p o r tt h e m a n a g e m e n tm e t h o do f t h r e ec o m p l e t en e t w o r k so fs a f e t y珊a n a g e m e n t o n j a n u a r y5 ， 2 0 0 2 v a r i o u s o f t r a n s g e n i cp r o d u c t s r e l e v a n tl a w sa n d r e g u l a t i o n si s s u ep r e s e n ti n3 6c o u n t r i e sa n dr e g i o n s i nt h ew h o l ew o r l d a n ds o m er e g i o n a li n t e r n a t i o n a lo r g a n i z a t i o n sa r ec o n v e n i n gt os e tu pt h e u n i f i e dd e t e c t i o nt e c h n i q u e a n dm e t h o ds t a n d a r do ft h ew o r l d i nt h e o r g a n i z a t i o n ( f a o ，1 眄h o ，e t c ) u n d e rt h eu n ，b u ti n c o n s i s t e n t t ot h es e c u r i t y r i s kc o n t r o lm e a s u r e sa n do t h e ri n t e r e s t so ft h et r a n s g e n i c p r o d u c t s ，e t c h a sb e e nr e a c h e du n a n i m o u ss u g g e s t i o na t p r e s e n t f o r m e a s u r i n gt r a n s g e n i cp r o d u c t se f f e c t i v e l y ， ec o l l e c t g e n e s t r u c t u r eo ft r a n s g e n i cc r o p st h a tc o 唧e r c i a l i z e da l r e a d yb o t ha th o m ea n d a b r o a d ，c h o o s e7g e n e sf r a 舯e n t ( 3 5 s 、n o s 、n p t i i 、p a t 、b a r 、f m v 、c r y 3 a ) t h a tc o v e ra l la l r e a d yc o 唧e r c i a l i z e dt r a n s g e n i cc r o p sa sg o a lo fs c r e e n i n g ， a n dd e s i g nf l u o r e s c e n c ep r i m ea n dp r o b ee s p e c i a l l y ，u t i l i z er t p c rm e t h o d t om e a s u r et r a n s g e n i ct a r g e tp e c u l i a r l y ，a n ds e n s i t i v i t yr e l a t i v l yi s1 w eh a v es e tu pt r a n s g e n i cr t p c rm e a s u r es y s t e md e t e r m i n et r a n s g e n i cb t 一 1 7 6m a i z ea n dt h er o u n d u pr e a d y t ms o y b e a na n da d o p tu n ge n z y m et or e d u c e p 0 1 l u t i o np o s s i b i l i t ya tt h es a m e t i m e i no r d e rt oc o n f i r t h e g e n e s f u r t h e r ，w ec l o n es 伽ep c rp r o d u c t st ot c a r r i e r ， t r a n s f o r eec o l fd h 5 ， s c r e e np o s i t i v ec l o n e ，a n ds e q u e n c i n g t h es e q u e n c eh o m 0 1 0 9 yb e t w e e n t a r g e tp r o d u c ta n dg e n e b a n kr e a c hm o r et h a n9 9 9 w ec l o n e dt w ol e n g t h g e n e sf r a g m e n tf o rp o s i t i v ec o n t r 0 1 a tt h es a 曲et i m e t h i sp a p e rs e tu pt r a n s g e n i cr t p c rd e t e c t i o nm e t h o df o rt h ef i r s tt i m e a th o m ea n dc o o p e r a t ew i t hc o m p a n yt op u to u tt h er e l a t e dk i t t h i sw i l l e x e r ta f a r r e a c h i n g i n f l u e n c eo n m e a s u r i n gi l p d r t a n d e x p o r t t h e t r a n s g e n i cp r o d u c t sa n dh a v ei m p o r t a n tr e a l i s t i cm e a n i n g si nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：t r a n s g e n i cc r o p s r e a lt i m e p c rd e t e c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不论其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作过的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 ，7 研究生签名：j 时 间沙唪c ) 月9 日 关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编论文。同意湖南农业大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论 文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：j 圭：吐 兰师星潮日 导师签名： h 盆趔i 时间渗咿伽，日 1 前言 新的世纪已经来到，但人口增长与粮食匮乏的危机依然摆在人们面前。拒 推测，2 0 2 5 年全球人口达到8 0 亿，其中新增加的2 5 亿人口大部分将来自发展中 国家。届时要想满足全球的粮食需求，粮食产量就必须比1 9 9 0 年增长8 0 。由于 资源的限制，增加的产量不可能寄希望于耕地面积的扩大和灌溉能力的增加，而 只能依靠提高作物的单产来实现。“2 “5 ”1 “1 从2 0 世纪8 0 年代初发展起 来的植物基因工程技术能够对植物进行精确地改造，转基因作物( g m c ， g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r 叩s ) 在产量、抗逆能力和品质等方面有显著的改进； 同时，也可极大地降低农业生产的成本，缓解不断恶化的农业生态环境。邙7 “”1 人们将这次技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”，这次技术革命将使全球农 业生产发生深刻的变革，使人们看到消除饥饿与贫困的希望。据国际农业生物技 术应用咨询服务中心( i s a a a ) 统计，2 0 0 1 年全世界转基因作物种植面积为5 2 6 0 万 公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中9 9 的转基因作物种植在美国、阿根廷、 加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马 铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣 等阳，”“”。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。 一、转基因研究的状况 生物技术革命是二十世纪科技领域的重大事件，也是世界新技术革命的重要 组成部分，现代生物技术已成为人类彻底认识自然和改造自然的重要工具，生物 技术产业也将是二十一世纪重要支柱产业之一、是各国政府竞相发展和重点支持 的领域之一印“”。 转基因技术，通俗地说，就是指与那些传统的遗传育种技术不同的，能克服 自然生育繁殖障碍的核酸重组、细胞融合等现代生物技术曲3 。通过转基因技术， 能很容易地将一种生物的遗传物质转移到其它生物之中，从而产生新的功能或性 状，或者使某种生物丧失某些特性“。利用这种技术生产出的生物叫做转基因活 性生物( l m o ，l i v i n g d i f i e d0 r g a n i s m ) 也可以叫做转基因生物( g m o ， g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ) ，目前g m o 一般也包括转基因生物和转基因生 物产生或加工出来的产品，从转基因产品纯化出的不含遗传物质( 核酸) 的新加 工产品是否还算是转基因产品，目前在国际上还有争论“5 。”2 “。 转基因技术在植物遗传改良方面的应用主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 抗虫性将编码杀虫活性产物的基因导入植物后，其表达产物可以影响 取食害虫的消化功能，抑制害虫的生长发育甚至杀死害虫，从而使植物获得对取 食害虫的耐性，减少或替代农药的使用。目前用于植物抗虫基因工程的基因主要 包括以下几类：1 ) 毒蛋白基因o ”，如苏云金芽孢杆菌( b t ) 毒蛋白基因等“； 2 ) 蛋白酶抑制剂基因，如豇豆胰蛋白抑制剂基因( c p t i ) 等n ”；3 ) 淀粉酶抑制 剂基因，如菜豆a 一淀粉酶抑制剂基因等嘞1 ；4 ) 植物外源凝集素类基因o “，如 雪花莲外源凝集素( g n a ) 基因等强“；5 ) 昆虫特异性神经毒素基因，如蜘蛛毒素 基因等“1 。这些基因的表达产物都具有相当杀虫活性并具有一定的专化性，对 人及哺乳动物并不构成危害。目前苏云金芽孢杆菌( b t ) 毒蛋白基因已导入了番 茄、烟草、马铃薯、水稻、玉米等植物，转豇豆胰蛋白抑制剂基因的烟草、棉花 等，转菜豆a 一淀粉酶抑制剂基因的烟草、豌豆等，转雪花莲外源凝集素( g n a ) 基因的马铃薯、烟草、番茄、水稻、小麦等植物也相继问世，并在不同程度上表 现出了对取食害虫的抗性，其中，转8 t 毒蛋白基因的抗棉铃虫棉花、抗玉米螟玉 米、抗块茎蛾马铃薯、抗果虫番茄等已进行商品化生产瞳3 2 4 2 “2 。2 “。 ( 2 ) 抗菌性植物对病原菌的抗性机理至今尚不十分清楚，因而相应抗病基 因的克隆较为困难，目前用于植物抗菌基因工程研究的基因比较庞杂，抗菌机理 也很复杂，主要包括以下几种类型：1 ) 抗病基因，如白叶枯病抗性基因x 8 2 1 等”“； 2 ) 解毒酶类基因，如对烟草野火毒素具有解毒作用的t t r 基因、对草酸毒素起作 用的草酸氧化酶基因g e r m i n 等噼“；3 ) 抗菌肽及抗菌蛋白类基因，如人溶菌 酶基因h l ，天蚕素基因c e c r o p i n 嘲1 、兔防御素基因n p 一1 、核糖体失活蛋白基因 r i p 蜊等；4 ) 病程相关蛋白类基因，如几丁质酶基因3 、葡聚糖酶基因咖1 等； 5 ) 活性氧类基因，如葡萄糖氧化酶基因g o 等5 州；6 ) 植保素类基因，如芪合 酶基因等口7 。白叶枯病抗性基因x a 2 1 可明显提高水稻品系的抗性；t t r 基因 导入烟草后，已获得了高抗烟草野火病的株系，将大麦根草酸氧化酶基因导入油 4 菜后，也增强了其对草酸的耐受性；转天蚕素基因c e c r o p i n 的烟草也获得了定 的抗菌：几丁质酶基因和葡聚糖酶基因成功地介导可黄瓜对灰酶病、番茄对枯萎 病的抗性：源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因g o 导入马铃薯后大大提高了其对软腐 病的抗性”。 ( 3 ) 抗病毒性病毒是造成植物病害的另一个主要原因，自1 9 8 6 年将烟草 花叶病毒( t m v ) 外壳蛋白基因导入烟草，获得了第一例抗病毒转基因烟草后，植 物抗病毒基因工程的研究日趋活跃。目前抗病毒基因工程研究的策略主要有以下 几种：1 ) 病毒复制酶介导的抗性：主要利用源于病毒的复制酶基因干扰病毒的复 制，如黄瓜花叶病毒复制酶基因、烟草花叶病毒复制酶基因、番木瓜环斑病毒复 制酶基因等”“；2 ) 病毒外壳蛋白介导的抗性：主要是利用本无毒刑的病毒外壳 蛋白抑制病毒的复制或激发宿主的抗性反应，如烟草花叶病毒外壳蛋白基因、黄 瓜花叶病毒外壳蛋白基因、大麦黄矮病毒外壳蛋白基因等咖“1 ；3 ) 失活的病毒 移动蛋白介导的抗性：主要是利用编码失去活性的病毒移动蛋白的基因干扰病毒 的扩散和转移，如烟草花叶病毒移动蛋白基因等“；4 ) 病毒基因相关序列介导 的抗性：主要是利用病毒基因反义序列、核酶( 一种能够特异性切割r n a 的r n a ) 基因等抑制病毒基因的复制、剪接和表达，如马铃薯卷叶病毒基因的反义序列等 n “；5 ) 其他来源的基因介导的抗性，如核糖体钝化蛋白类基因、抗体基因等。 目前已获得了转番木瓜环斑病毒复制酶基因的抗病毒番木瓜等，转马铃薯卷叶病 毒1 7 k d 移动蛋白突变体基因的抗病毒马铃薯等，转多种病毒外壳蛋白基因反义 r n a 序列的抗病毒烟草等。这些转基因抗病毒植物的获得大大拓宽了植物抗病毒 研究的思路和视野，并创造了大量抗病毒新种质。1 9 9 9 年美国已批准了转基因抗 病毒马铃薯、西葫芦、番木瓜品种进行商业化生产。我国也已有转基因抗病毒烟 草、番茄和甜椒品种获准商业化应用“1 。 ( 4 ) 抗除草剂特性抗除草剂基因的研究往往是与广普高效除草荆相结合 的，利用的基因主要包括两类，一类是可以改变除草剂靶物敏感性的基因，另一 类是除草剂解毒基因。它们主要针对以下几种除草剂发挥作用：1 ) 草甘膦 ( g l v d h o s a t e ) “1 ：它是目前应用最为广泛的非选择性除草剂，其作用是特异 性地抑制5 一烯醇丙酮酰莽草酸一3 一磷酸合成酶( e p s p s ) 的活性，利用源于细菌、 植物抗性细胞系的e p s p s 基因可以大大提高植物对草苷膦的耐受性，这类基因导 入烟草、大豆、番茄、马的铃薯、棉花、玉米等植物后已获得了大量耐草苷膦的 株系。2 ) 草丁膦( g l u f o s i n a t e ，h o s d h i n o t h r i c i n ( p p t ) ) ：t h e g l u f o s i n a t e t 0 1 e r a n t ( p a t ) g e n e 是一种灭生性除草剂，是一种谷氨酰胺类似 物，可抑制谷氨酰胺合成酶( c s ) 的作用，使氨积累造成植物中毒，源于土壤细 菌s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s 的b a r 基因和s t r e p t o y c e s v i r i d o c h r o 0 9 e n e s d 的p a t 基因可以编码草丁膦乙酰转移酶( p a t ) ，能够使草 丁膦的自由氨基乙酰化从而对其解毒，目前b a r 基因己导入烟草、番茄、马铃薯、 拟南芥、水稻、小麦、玉米等植物，获得了大量草丁膦抗性株系，但一般是把它 作为筛选标记基因加以利用的“”。3 ) 黄酰脲类及咪唑啉酮类除草剂：这类广普 性除草剂的作用是抑制乙酰乳酸合成酶( a l s ) 的活性，从而影响缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸的合成，将拟南芥变异的a l s 基因及源于烟草的s u r b _ h r a 导入番茄、甜 菜、油菜、苜蓿、玉米、亚麻等植物后都获得了耐除草剂植株“”。4 ) 溴苯腈： 是光系统ii 的强抑制剂，能通过与醌联蛋白结合抑制电子转移，源于土壤微生物 e l e b s i e l l ao z a e n a e 的b x n 基因编码的腈水解蛋白可以降解溴苯腈从而对其解 毒，该基因导入烟草、棉花、番茄、小麦等植物后也获得了抗性植株。5 ) 2 ，4 一d ： 是一种生长素类似物，可选择性地抑制双子叶植物的生长，源于细菌a 1 c a l i g e n e s e u t r o p h u s 的t f d a 基因编码的2 ，4 d 单氧化酶可以将其氧化解毒，该基因已在大 豆等双子叶植物中显示了作用。抗除草剂转基因植物是最早进行商业化应用的转 基因植物之一，现已有水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、甜菜等作物的抗除草剂 转基因品种进行商业化生产。植物抗除草剂基因工程研究中应特别注意转基因植 物与田间杂草杂交的可能性，及植物本身转为杂草的可能性“1 。 ( 5 ) 抗逆性盐碱、旱涝、不适温度、强光、农药残毒的环境逆境在一定程 度上限制了具经济价值植物的产量和种植范围，为了更充分的利用现有耕地、提 高产量，植物抗逆育种一直都较受重视，但由于抗源少，抗逆机理不明，其研究 进展不够理想，现代生物技术的发展为改变这一局面提供了新的可能。目前用于 该领域的基因大体有以下几类：1 ) 逆境诱导的植物蛋白激酶基因；编码细胞渗透 压调节物质的基因；超氧化物歧化酶( s o d ) 基因；类黄酮途径相关酶基因；防治 6 细胞质蛋白变性的基因及前面提到的除草剂解毒基因等。目前已获得了耐盐碱的 转基因烟草、玉米、水稻等，耐土壤农药残毒的转基因亚麻已在美国进行商业化 生产。 ( 6 ) 品质改善 目前利用植物基因工程技术进行的品质改良主要集中改良种 子贮藏蛋白、淀粉、油脂等的含量和组成上。目前已有经油脂改良的转基因大豆、 油菜品种在美国获得商业化生产许可。 ( 7 ) 雄性不育性由于迄今尚未克隆到效果明显的雄性不育基因，利用基因 工程方法创造雄性不育多是采用特特异性启动予与r n a 酶基因构建嵌合基因这一 策略来实现的。1 9 9 0 年，m a r i a n i 等开创性的研究工作为这一研究领域带来了全 新的思路和方法，他们利用烟草花药绒毡层特异性启动子t a 2 9 与源于b a c i l l u s a i i l y l o l i q u e f a c i e n s 的r n a 酶基因b a r n a s e 拼接构建成t a 2 9 - b a r n a s e ，导入烟草 和油菜后获得了这两种作物的雄性不育基因工程植株。随后又将r n a 酶抑制基因 b a r s t a r 与t a 2 9 连接构建成t a 2 9 - b a r n a s e 基因的恢复基因t a 2 9 _ b a r s t a r ，该基因 转化烟草和油菜后能使利用t a 2 9 - b a r s t a r 基因创造的雄性不育植株的育性得以 恢复。利用这一策略已在烟草、油菜、小麦、水稻和一些果树育种中获得了雄性 不育植株，剥用类似的方法，如采用花粉特异性启动子p s l 替代t a 2 9 启动子、采 用9 1 u c a n a s e 基因替代b a r n a s e 基因等，在烟草、莴苣等植物中也获得了雄性不 育植株“。目前已有利用这一技术育成的玉米、菊苣雄性不育品系在美国获得了 商业化生产许可。基于对花粉肌动蛋白的多年研究，最近有研究者提出将反义豌 豆肌动蛋白基因与花粉花药特异性启动子拼接构建成“雄性不育基因”的策略， 并在小麦、番茄中获得了初步成功，该领域的研究很可能为利用基因工程技术培 育植物雄性不育提供一条新途径。 特别是近年来大肠杆菌、酵母、水稻、线虫、人类等基因组计划的完成，使 得细菌、真菌、线虫、植物、动物、人类的基因全序列都已大致清楚，这将进一 步加速转基因技术的应用和发展。 二、争论的几大焦点问题 7 但是，最近两年来，作为现代生物技术核心内容，转基因重组技术以及转基 因生物或产品，在世界范围内引起了广泛的争论，从一般民众到政府部长、总理、 国家元首，从科学、宗教、新闻出版界到各国政府主管部门，直至联合国各级组 织，都先后发表看法和评论，或召开有关会议，制订有关法律、法规。并且这场 争论还将延续下去，目前它已对各国政治、科学、文化、宗教等各方面造成很大 影响。其争论的主要问题集中在转基因活性动、植物及微生物的环境释放和由转 基因生物生产出的食品的安全性上o ”“1 。 对转基因产品的争论，除了转基因产品本身的风险外，还具有一些政治、经 济、宗教、以及各国间的利害关系等因素在内，但除极个别情况外，很少有人全 盘肯定或否定转基因技术。即使完全赞成转基因技术的人也没有一个能保证转基 因产品1 0 0 无风险，主要问题是这种风险的种类、大小、范围以及如何控制，争 论的分歧主要体现在以下三个方面： 1 ) 遗传工程的实质支持者认为在具有自然界隔离的不同物种之间进行基因 操作，是自然进化的延续，有利于物种进化；而反对者则认为这可能造成灾难“。 2 ) 转基因食品的安全性支持者认为，已有成千上万的实验数据表明，转基 因食品对人类无毒副作用，转基因食品和非转基因食品“实质等同”，无显著差 异，不需要特别标明；而反对者认为目前转基因食品安全性实验主要由开发者完 成，而且大多是短期的动物实验，实验数据不充分，并且认为转基因食品和非转 基因食品“实质不等同”，它们是不一样的，要有标签表明是否含有转基因成份， 让消费者选择“”1 。 3 ) 环境影响支持者认为，转基因生物和同种非转基因生物，除转基因性状 外，实质等同，而转基因性状在自然界者存在，经过严格的环境释放实验后，不 会对环境造成多大影响阻1 ；而反对者认为，转基因生物进入生态环境后，对生态 环境的许多影响尚不清楚，特别是一些需要长期观察的生态问题，需要科学数据。 总之，争论的双方都具有相应的科学或理论依据，这些问题不可能在短期内 形成一致的意见，还需积累更多的数据和等待公众的认可“。 三、各国政府的反应 1 9 9 8 年秋，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明， 1 9 9 9 年，要求出口到欧盟的非转基因产晶不得含有1 的转基阏产品污染( 并且有 可能进一步将标准提高到0 1 ) ，这样对农场主、运输商、加工者，以及制造商 等提出了一系列要求，使得农场主要将转基因产品与非转基因产品分开种植，也 促使出口商至少要做一种d n a 检测，证明有无转基因产品，转基因产品压力增大， 市场份额受影响，不少国家纷纷出现退货、中止合同等现象，已影响到进出口贸 易，给转基因产品的研究、生产、经营造成了较大压力，转基因工作正处于它发 展中的一个十字路口。2 0 0 2 年欧盟执行新的转基因产品管理法规，要求对转基因 产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”、检测，以保证转基因产品不 污染非转基因产品。美国提出了品种“个性保存”方案，所不同的是要求对非转 基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的“跟踪”检测，以确保非转基因 产品不被转基因产品污染( 事实上完全不被污染是不可能的，但要控制在一定的许 可范围之内) ”“。许多国家对进口非转基因食品，要求出口商提供经检测合格的 非转基因产品证明。 由于欧盟采取谨慎态度，要求对转基因产品实行标签制度，并对一些进口农 产品进行了检测，英国、德国暂停一些转基因作物商品化生产( 卜3 年) ，仅作 田间实验，特别是1 9 9 9 年，科学杂志报道抗虫玉米能杀死非目标昆虫一蝴蝶，使 得采取相对开放政策的美国政府来自国外的压力增大，美国一些国会议员也要求 实行标签制度，美国f d a 在1 9 9 9 年1 1 月份召开了两次听证会，公众要求政府办 事更加透明化，采取标签制度，政府部门要独立进行安全及环境风险测试，农业 部成立了专门由消费者、科学家、生产者和经营者等组成的3 5 人的委员会，为政 府出谋划策，e p a 计划增加环境安全评估实验等。日本、澳大利亚、新西兰还成 立了新的机构来研究新情况，而且不同国家对转基因成分的最低含量做了不同规 定，阈值从1 5 不等。因此，各国政府正在重新调整各自的转基因相关工作的 策略和部署。我国于2 0 0 1 年5 月9 日公布并实施农业转基因生物安全管理条例， 于2 0 0 2 年1 月5 日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配 套管理办法，并于2 0 0 2 年3 月2 0 日起正式实施。“1 。 四、国内外转基因产品检测研究状况 虽然联合国所属机构( f a 0 ( 粮农组织) 、w h 0 ( 世界卫生组织) 等) 及一些 地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因 产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一 致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成以下三 个类型：检测插入的外源基因；检测外源基因表达物( r n a 或蛋白质) ；检测插 入外源基因对受体生物基因表达的影响( 主要检测外源基因对插入位点附近基因 影响及对整个代谢产物的影响) 。由于第三类型的检测成本高、所需时间长， 并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中涉及较少。在前两种 类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型：d n a 、r n a 和蛋白质。对于蛋 白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳 定，血清学检测方法仅限于个别转基因产品检测中应用曲3 “3 。对于蜊a 和r n a 的检测主要采用p c r 及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前 为止已经历了以下几个方面的发展：p c r 一电泳检测、传统杂交或测序；p c r e l i s a ； 实时荧光p c r 。实时荧光p c r 技术具有很多优点：使用了杂交探针，提高了检测 的准确性；荧光检测的高灵敏度；不做p c r 后处理，有效降低了检测过程污染的 机会；边扩增边检测，提高了检测速度。为此，我们采用荧光p c r 方法作为主要 检测手段”。 基因糖目 _ _ _ - _ - - - - - - 、 启动千 螺止千 鞭_ _ _ _ _ _ 基因蛆d n 基因蛆d n c 左地界)c 右垃界) 丫丫 _ _ _ _ _ ，_ _ 一 v l v 3 3 k - 一f 、_ 一 4 h 呐缸p 嚏h - h 山t f p - 出一如m l ， 竹扣 盯m f p m c 姆 l 一f 呻帏瞰钟和r 岫糟- “n 州_ _ 蹦廿 为了能有效地监测转基因产品，不形成漏检，我们收集了国内外已商品化的 转基因作物品种( 见附表) 的基因构建图( 如上图) ，选择了能覆盖全部已商品 化转基因品种的7 个基因( 3 5 s 、n o s 、n p ti i 、p a t 、b a r 、f m v 、c r y i i i a ) 作筛选 1 0 目标，设计了多对特异性引物和荧光探针，并筛选出最佳组合，优化了检测条件 和参数，使检测参数尽量一致以便于多基因同时筛选检测。相对检测灵敏度可达 到0 1 。 我们选择了目前人们最关心的、产量最大的转基因玉米和大豆建立了实时荧 光定量p c r 方法，分别以玉米和大豆的单拷贝基因1 e c t i n 和z e i n 作内标基因， 以转基因大豆的3 5 s 启动子和玉米的c r y l a b 基因作目标基因，设计了多对引物及 探针并筛选出最佳组合，利用购自f 1 u k a 公司的转基因大豆及玉米标准品进行定 量参数优化，建立了相应的检测体系o “”6 “。 五、荧光p c r 检测方法的原理及应用 荧光p c r 技术于1 9 9 6 年由美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司推出，由于该技术 不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且与常规p c r 相比，它具有特异性更强、 有效解决p c r 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到较为广泛应用。 ( 1 ) 几种传统定量p c r 方法简介： a 、内参照法：在不同的p c r 反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因 工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内 标也被扩增。在p c r 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可 用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照对待检测模板 进行定量“”1 。 b 竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切酶位点的外源竞争性模板。 在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增( 其中一个引物为 荧光标记) 。扩增后用内切酶消化p c r 产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片 段，而待测模板不被切割，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧 光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。“州。 c p c r e l i s a 法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特 异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物， 最终酶使底物显色。常规的p c r e l i s a 法只是定性实验，若加入内标，作出标准 曲线，也可实现定量检测目的呻1 。 ( 2 ) 定量所用参照物 p c r 技术应用于核酸的定量检测早有报道，但技术上的不成熟阻碍了其广泛 应用。p c r 在定量过程中须广泛借助于各种形式的参照物。参照物在定量p c r 中 具有以下作用：( a ) 作为扩增系统的阳性对照；( b ) 作为未知样本定量的参比 标准；( c ) 通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。 参照物按其性质不同可分为内参照( 内标) 和外参照( 外标) 。由于传统定量方 法都是终点检测，即p c r 到达平台期后进行检测，而p c r 经过对数期扩增到达平 台期时，检测重现性极差，无法直接从终点产物量雄算出起始模板量。加入内参 照后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。即使如此，传统的定量方法也 都只能算作半定量、粗略定量的方法。若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内 标，则p c r 反应变为双重p c r ，双重p c r 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争， 尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由 于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。 也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法o ”。 美国得克萨斯大学的科研人员对外标法定量和内标法定量进行了比较，认为 将内标法作为定量或半定量的手段不可靠，而外标准曲线的定量方法是准确的、 值得信赖的方法呻“删。 ( 3 ) 荧光定量p c r 技术 上述几种传统定量p c r 方法，一直面牦着两大难题，p c r 的假阳性污染和定 量的准确度m 1 。用这些方法进行检测，都依赖于各种不同类型的p c r 后处理过程， 而这些处理过程很易使数量巨大的p c r 产物飞散到空气中，使p c r 假阳性污染成 为可能，尤其是电泳所用染色翔e b ( 溴化乙锭) 为强烈致癌物质9 1 ，若操作不 当，会严重危害操作者的健康。另一方面，所有这些方法的定量都是针对p c r 终 产物来进行的，而p c r 的平台效应在一定程度上干扰了p c r 的原始模板数量和终 产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。与这些传统方法不同，实时定量p c r 方法采用完全闭管检测，不需p c r 后处理，避免了交叉污染；采用实时监测技术， 定量p c r 仪采用激光器光源，保证高能稳定无干扰的荧光激发，由一系列透镜、 滤镜和一个双色镜组成的光学系统将激发荧光聚焦到光谱仪上，光谱仪以间隔的 1 2 方式将荧光按照波长的不同分开，进入c c d 相机，序列检测应用软件从c c d 相机 中收集这些荧光信号，对数据进行分析。从检测开始到定量结束，整个过程耗时 短，操作方便。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测p c r 产物的积累，可非 常精确、重复地定量基因拷贝数，并且比一般的定量方法劳动强度小。 a 荧光p c r 原理 实时荧光定量p c r 技术，是指在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个p c r 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。 实时定量p c r 技术是在常规p c r 基础上，添加了一条标记了两个荧光基团的探针。 一个标记在探针的5 端，称为荧光报告基团( r ) ：另一个标记在探针的37 端， 称为荧光抑制基团( q ) 。两者可构成能量传递结构，即5 端荧光基团所发出的 荧光可被荧光抑制基团吸收或抑制。当二者距离较远时，抑制作用消失，报告基 团荧光信号增强。荧光信号随着p c r 产物的增加而增强。实时定量p c r 方法就是 利用此原理，在p c r 过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信 号增强到某一阅值( p c r 反应的前1 5 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光 闽值的缺省设置是3 1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的1 0 倍) 时，此时的循环 次数( c t 值) 就被记录下来。该循环参数( c t 值) 和p c r 体系中起始d n a 量的对 数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的c t 值，制成标准曲线，再根 据样品的c t 值就可以准确确定起始d n a 的数量。 b 荧光p c r 所用荧光探针 目前应用于实时定量p c r 检测体系中的荧光探针主要有：t a q m a n 探针