（物理化学专业论文）hiv蛋白酶多肽类抑制剂的筛选及修饰和构效关系研究.pdf

天津师范大学硕士学位论文 摘要 计算机辅助药物设计的理论的方法不断走向成熟，开展生物大分子( 受体) 与先导化合物( 配体) 的相互作用机制、蛋白质三维结构预测等前沿领域的研究 具有重要的理论意义和实用价值，并能加快发现创新药物的步伐。本论文围绕这 些热点课题，运用分子模拟技术，进行h i v 蛋白酶和受体三维结构的预测、配 体受体相互作用机制的研究及药物分子设计。 本论文共分四章： 第一章：简述了计算机辅助药物设计的基本方法和最新进展。 第二章：选择p d b 数据库中h i v 蛋白酶复合物为研究对象，通过分子叠合、分 子对接研究，预测出了这类抑制剂与已经上市的抗艾滋病的药物s a q u i n a v i r 之间 的相似性和对h i v 病毒蛋白酶的不同抑制作用。这些工作为基于h i v 蛋白酶结 构的药物设计莫定了基础。 第三章：选取一组高活性的h i v 蛋白水解酶抑制剂为研究对象，通过定量构效 关系的研究，得到了这类抑制剂的q s a r 模型，建立了这类抑制剂的生物活性 指标圮。的预测模型，并成功地预测了三个同类抑制剂的庀，。所得模型可以用 来做为此类抑制剂的活性预测。 第四章：以h i v 蛋白酶过渡态类似物的抑i i i i i 为研究对象，根据“变形钥匙” 理论，把可剪切肽转变成理想的竞争性抑制剂。这些结论和所用的方法对h i v 蛋白酶的多肽类抑制剂和非肽类抑制剂的设计提供了有价值的参考。 关键词：计算机药物辅助设计、h i v 蛋白酶、抑制剂、变形钥匙 天肄师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t a st h et h e o r ya n dm e t h o d so fc o m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g nb e c o m em o r ep o w e r f u l ， s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fb i o m o l e c u l e sw i t hl e a dc o m p o u n d sa n dt h e s t r u c t u r a lp r e d i c t i o no fp r o t e i n sh a v eg r e a tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e ，a n d i tc o u l de x p e d i t et h ep r o c e s so fd i s c o v e r i n gn e wd r u g s a r o u n dt h e s eh o tt o p i c s ，w e p e r f o r mt h e o r e t i c a ls t u d i e so nl i g a n d sw i t he n z y m e sa n dr e c e p t o r sr e l a t i n gt ov i t a l d i s e a s e s ，a n dd r u gd e s i g n i n g t h i sd i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do ff o u rc h a p t e r s c h a p t e rl ：g i v e sab r i e f i n t r o d u c t i o na n dp r o c e e d i n g so f d r u gd e s i g n c h a p t e r2 ：i n v e s t i g a t e sp e p t i d e si nc o m p l e xw i t ht h eh u m a nl m m u n o d e f i c i e n c y v i r u sp r o t e a s ef o u n di nt h ep d bb a n k ，u s i n gf l e x i b l em o l e c u l ea l i g n m e n ta n d m o l e c u l a rd o c k i n g p r e d i c t st h es i m i l a r i t i e sb e t w e e nt h ei n h i b i t o r sa n ds a q u i n a v i r f i n d st h o s ei n h i b i t o r sh a v ed i f f e r e n c ei n h i b i t i n ga b i l i t i e st oh i vp r o t e a s e 。t h ew o r k h a sp r a c t i c a lu s a g ei nn e wc o m p o u n dd e s i g n c h a p t e r3 ：s t u d i e st h ei n t e r a c t i n gm o d eo fi n h i b i t o r sw i t hh 1 vp r o t e a s eb yq s a r t h eo b t a i n e dm o l e c u l a rm o d e l sp r e d i c t st h eb i o l o g i c a la c t i v i t yi n d e x c 5 0o ft h r e e c o n g e n e r i ci n h i b i t o r s t h i sq s a r m o d e lc a nb eu s e df o rp r e d i c t i o n ， c h a p t e r4 ：s e l e c t e st h ea h p b a a st h ec a n d i d a t e sf o ri n h i b i t o rd e s i g nf o rh u m a n i m m u n o d e f i c i e n c yv i r u sp r o t e a s e t h ec l e a v a b l ep e p t i d e sa r em o d i f i e da c c o r d i n gt o t h e d i s t o r t e dk e y ”t h e o r y , a n dt h en e wi n h i b i t o r sa r ef o r m e d t h e s ec o n c l u s i o n sa n d m e t h o d su s e di nt h i sd e s i g ns e tab a s ef o rd e s i g no fp e p t i d ei n h i b i t o r sa n dn o n p e p t i d e i n h i b i t o r sf o r t h eh u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y r u sp r o t e a s e k e y w o r d s ：c a d d 、h i v p r 、i n h i b i t o r s 、d i s t o r t e dk e y 2 天津师范人学硕十学位论文 第一章：计算机辅助药物设计概述 1 、2 1 1 引言 建国以来，我国的药学研究和医药产业有了很大的发展，但总体上仍以仿制 为主，自主创制的薪药仅 2 - 3 。随着国际上知识产权保护的各项法规在我国 逐步实行，薪药的研制己日益显示出其重要性和紧迫性。然而，新药的寻找至今 仍是一件耗资巨大而效率很低的工作。据国际t 近年来的统计，研制成功一种新 药，平均需要花费l o 1 2 年的时问，耗资2 0 3 5 亿美元，并且这一费用正以每年 2 0 的速度递增。造成这种状况的一个重要原圳就是缺乏深入的理论指导，凼此 迫切需要应用新的理论方法和技术加以改进。近年来，应用各种理论计算方法和 分子模拟技术，进行计算机辅助药物设计( c o m p u t e r a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) , 成为国际上十分活跃的研究领域。由图1 1 可以看出，c a d d 方法能加速药物先 导化合物的发现。目前药品专利的保护期限为2 0 年，如果药物上市前研究与开 发( r & d ) 花费的时间为1 0 年，那么药品的有效市场销售时间就仅有1 0 年。如果 r & d 时间能缩短2 - 3 年，那么不但能节约r & d 的经费，而且能为争取市场赢得 宝贵的时间。这将产生巨大的经济效益和社会效益。c a d d 方法己被国外许多制 药公司用于新药的研究与开发，并且近年来己取得了极大的成功。所以，c a d d 方法与应用的研究不但具有深远的科学意义，而且具有巨大的应用价值。本章着 重介绍c a d d 的一些进展。 1 2 药物先导化合物的发现 图1 1 是寻找药物先导结构的几个循环。发现药物先导化合物的最基本循环 是随机筛选，即图1 1 中的“基本循环”。运用这种方法发现新药，首先必须收 集大量的化合物化台物可以是天然产物有效成分，也可以是化学合成的化合物， 或是从化学品公司购买的化合物。一般大的制药公司均有自己的法人样品库，其 中的化合物是公司几十年研究的积累。其次是针对具体的研究体系，建立合理的 生物( 药理) 筛选模型，对所能收集到的化合物进行随机筛选，从中发现有苗头 的化合物进入临床前研究。据文献报道，平均随机筛选1 2 万个化合物，才能发 现l - 2 个有希望的先导化合物。因此，随机筛选的效率极其低下。 为了克服传统随机筛选方法的缺陷，人们将合理药物设计方法( r a t i o n a ld r u g 天津师范人学硕士学位论文 d e s i g n ) 加入到药物先导结构发现的循环中，从而大大提高了发现新药的几率。 在此过程中，人们发展了很多药物设计的方法，如定量构效关系( q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ，q s a r ) ；f n _ _ - - - 维定量构效关系( 3 d q s a r ) 方法、三 维药效基团模建、数据库搜寻以及全新药物设计( 如n o v o ) 等。这些方法均己应用 于具体的新药研究与开发过程中，特别是用于先导化合物的发现和优化( 图1 1 ) 。 图1 1 药物先导结构发现的几个循环 在合理药物设计中，种常用的方法就是以药物小分子构效关系研究为基 础，结合分子模拟，建立一系列具有相同药理作用分子的药效基团模型和 q s a r 3 d q s a r 模型，然后用数据库搜寻或其它药物设计方法设计新的先导化 天津师范人学硕士学位论文 合物，合成或购买设计的化合物并进行药理测试，以此发现有苗头的化合物进入 临床前研究。这就是图1 1 中所示的“以小分子为基础的循环”，这种方法经常 应用于缺乏受体生物大分子三维结构( x 一衍射晶体结构或n m r 结构1 的情况。 近年来，随着分子生物学的不断发展，许多药物作用靶标分子的一级序列已 经测定，但它们的三维结构还没有测定( 如多巴胺受体和阿片受体) 。这时可用 分子模拟和蛋白质结构预测等方法建立这些生物大分子的三维结构，然后用数据 库搜寻或全新药物设计等方法设计新的先导化合物或对原有的先导化合物进行 结构优化，发现有菌头的化合物进入临床前研究。如图1 1 中“以蛋白质结构模 型为基础的循环”。 随着分子生物学和结构生物学的发展，许多受体生物大分子的三维结构己经 被测定，在此基础上也可以用数据库搜寻或全新药物设计等方法设计新的先导化 合物或对原有的先导化合物进行结构改造，发现有苗头的化合物进入临床前研 究。这就是图1 1 中“以受体实验结构为基础的循环”，文献上称这种方法以及 上面介绍的“以蛋白质结构模型为基础的循环”为基于结构的药物设计 ( s t r u c t u r e b a s e dd r u gd e s i g n ，s b d d ) 方法。 2 0 世纪9 0 年代初以来，组合化学得到了迅速发展并在药物发现中起着越来 越重要的作用。同时随着结构基因组学和功能基因组学等学科的建立和发展生 命科学和信息科学的结合，产生了生物信息学( b i o i n f o r m a t i c s ) 。组合化学方法 可以快速合成大量的化合物与高通量筛选( h i g h t h r o u g h p u ts c r e e n i n g ，h t p ) 方法 的结合，大大提高了筛选的效率。近年来，人们也发展了组合化学和计算机辅助 药物设计相结合的方法，用于先导化合物的设计。 上面介绍的几种药物先导结构的发现和优化方法并不是孤立的，相互之间不 但有广泛的联系，而且可以联合应用，有时用一种方法不能获得很好的先导化合 物，必须同时使用几种方法才能获得较好的结果。 1 3 计算机辅助药物设计的策略 从上面的讨论我们可以看出分子模拟、理论计算和计算机辅助药物设计方法 在新药先导化合物发现和优化中起重要作用。总的来讲，理论计算和计算机辅助 药物设计方法可以用来研究受体生物火分子上药物结合部位的结构与性质、药物 一受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和选择性( 特异 天津师范大学硕士学位论文 性) 、药物分子的活性基团和“药效构象”，等等，可为改造现有的生物活性物质 的结构、设计新的药物，提供理论上的先导和思路，从而改变目前新药研究“泛 泛合成、普遍筛选”的状况，大大提高新药研究的效率，逐步形成“理论研究一 药物设计一药物合成一药理研究”相结合的寻找新药的新途径。图1 2 显示了计 算机辅助药物设计的常用途径，计算机辅助药物设计的方法可分为以下三类： 1 3 1 基于药物小分子构效关系的药物设计 大多数药物作用的受体生物大分子三维结构尚不清楚，在这种情祝下，一般 以小分子的结构和活性为基础，对系列化合物进行定量构效关系和或三维定 量构效关系研究，得到预测能力较强的q s a r 3 d q s a r 模型，对设计化合物的 活性进行预测，并且3 d q s a r 模型还会给出结构改造的信息，这对新化合物的 设计目标更为明确；运用构象分析和分子模拟技术，得到化合物的活性构象，结 合构效关系研究结果，建直三维药效基团模型：然后运用药物设计方法，如数据 库搜寻和全新药物设计方法，设计新的化合物。这一方法的基本思路如图1 2 中 循环2 4 6 7 9 1 0 ( 或1 2 ) 一1 3 一1 4 1 6 4 ( 循环1 ) 。 1 3 2 以受体的三维结构为基础的药物设计 近年来，越来越多的受体生物火分子的j 维结构被测定。有些具有莺要药理 作用的受体生物大分子的三维结构虽然目前还没有被测定，但他们的一级结构已 被阐明，这时可以用结构预测的方法建立其三维结构模型。在这种情况下，我们 可以用基于结构的药物设计方法设计新的的先导化合物。一般是先根据受体的三 维结构，用分子模拟或理论计算方法研究药物和生物大分子的作用方式，得到生 物大分子，特剐是生物大分子上活性部位或结合部位的详细结构性质，如静电作 用、疏水作用和氢键结合等区域的分布。然后用全新药物设计或数据库搜寻的方 法，设计新的化合物。图1 2 中与此方法对应的循环为3 ( 4 ) 一5 6 8 9 1 0 ( 或1 2 ) 一1 3 1 4 1 6 4 ( 循环2 ) 。 1 3 3 与组合化学相对应的计算机辅助药物设计 组合化学的建立与发展，也推动了计算机辅助药物设计方法的发展，随之也 产生了计算机模拟组合化学方法，用分子模拟和计算机技术设计合成组合样品库 的构造块( b u i l d i n gb l o c k ) 、根据分子多样性( m o l e c u l a rd i v e r s i t y ) 评价样品库的质量 或者建立虚拟组合样品库。同时高通量筛选所产生的大量信息也必须用计算杌来 天津师范大学硕士学位论文 处理。这类方法如图1 2 中循环9 一1 1 一( 1 5 ) 一1 3 1 4 一1 6 4 ( 循环3 ) 。 厂 。删。 图1 2 计算机辅助药物设计的常用途径 o m ：量子力学：m m ：分子力学； m d ：分子动力学；f e p ：自由能微扰： q m m m ：量子力学和分子力学或分子动力学相结合的方法； m d l a c d 一3 d n c i ：有机小分子数据库 上面介绍的三种方法并非孤立的，三者之间既有区别，义有联系。例如，根 人津师范人学硕士学位论义 据配体与受体的相互作用方式，可以得n - 维药效基团模型，这样就可以用基于 小分子的药物设计方法设计新的化合物；根据三维定量构效关系分析和药效基团 模型，可以建立受体的假想模型，然后用基于结构的药物设计方法设计新的先导 化合物：计算机模拟组合化学方法也可与基于受体三维结构的药物设计方法紧密 地结合起来。 1 4 计算机辅助药物设计成功的例子 目前，西方发达国家都有一批著名科学家领导的研究组从事这方面的理论和 应用研究。许多制药公司也纷纷建立运用计算机进行理论研究以带动新药开发的 部门。目前，己有许多应用c a d d 设计或c a d d 参与设计的新药上市。这标志 着该领域的研究己开始向实用化方向迈进。下而列举一些实例。 1 4 1q s a r ，3 d q s a r 成功的例子 传统的h a n s c h f u j i t a q s a r 方法在农药和医药研究中也取得了成功。其中的 一个成功的例子就是通过q s a r 研究，得到了治疗早老性痴呆症( a d ) 药物 e 2 0 2 0 ( d o n e p e z i l ，化合物1 ) 的开发，商品名为a r i c e p t 。c a r d o z o 等通过对一系列 二氢茚酮和苄基哌啶类化合物进行了构象分析、分子形状比较和q s a r 研究， 获得了一系列对乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 有较高活性的二氧茚酮苄基哌啶类化合 物，经过进一步的药理和临床前研究，选定化合物e 2 0 2 0 进入临床研究获得成 功。最后e 2 0 2 0 由日本e i s a i 公司开发，1 9 9 6 年通过美国食品和药品管理局( f d a ) 批准上市，是目前用于治疗a d 效果较好的药物之一。e 2 0 2 0 一t c a c h e ( 加利福 尼亚电鳐a c h e ) 复合物的晶体结构也于1 9 9 9 年被以色列w e i z m a n n 研究所的 s i l m a n 和s u s s m a n 等测定。 最近3 d q s a r 研究也有许多好的结果报道，美国a b b o t t 实验室的m a r t i n 研究小组在多巴胺d l 受体激动剂方面的研究就是其中的一个典型的例子。m a r t i n 等运用药效基团模建、三维数据库搜寻和比较分子力场分析( c o m f a ) ，建立了 可靠的c o m f a 预测模型。该模型能从1 7 0 个化合物中“筛选”出有括性的化合 物，从而验证了理论模型的可靠性。然后m a r t i n 等用上述c o m f a 模型预测了 2 0 1 个化合物与d 1 受体结合的亲和性( d l - - b i n d i n ga f f i n i t y ) ，最后挑选了1 9 个 化合物进荦亍合成和生物活性测定，有1 0 个化合物的p k 6 5 ，其中有5 个化合 天津师范大学硬士学位论文 物的p k 7 0 ，4 个化合物的p k ，为6 5 7 0 。这一研究结果最终为a 一8 6 9 2 9 ( 化 合物2 ) 噻吩环2 号位的结构改造提供了重要线索。最近，m a r t i n 等根据卜述结 果设计的化合物己进入临床试验。 ：m n h 化合物2 ( a 一8 6 9 2 9 ) 1 4 2 药效基团一构象分析成功的例子 s m i t h k l i n eb e e c h a m 公司的一个研究小组发现含有a r g g l y a s p ( r g d ) 的多 肽( 化合物3 ) 能拮抗血纤维蛋白原与血小板g p i i b i i i a 受体，从而抑制血小板 的聚合。该研究小组首先测定了一系列含有r g d 片段环肽的n m r 溶液构象和 x 射线衍射晶体结构，其中环肽3 的h - n m r 结构作为模板分子被应用于非肽化 合物母核( s c a f f o l d ) 的设计。他们在设计化合物时保留了化合物3 结构上的精氨酸 和天冬氨酸残基的主要作用位点，在天冬氨酸相邻的位置上放置疏水性的基团。 根据3 的三维结构，该研究小组的研究人员发现，1 , 4 苯并二氮杂萆的结构满足 上述天冬氨酸的结构要求，比较1 ，4 - 苯并二氮杂革和3 的n m r 结构，发现1 , 4 苯并= 氮杂蕈的c 2 原子对应于天冬氨酸的c 。原子，羧基甲基可以连接在c 2 原子上，并且需采用平伏键耿向。根据3 中精氨酸与天冬氨酸间的距离要求，可 在1 ，4 一苯并二氮杂蕈的c 8 原子卜加一羰基，以模拟精氨酸主链羰基的功能， 同时选取脒基苯乙基模拟精氨酸侧链的功能。在n 4 位上加一苯乙基模拟3 上疏 天律师范入学硕 t 学垃论文 水性苯环的功能。如此他们得到了化合物4 。合成和生物测试表明4 的k ，为 1 2 n m o l l ，最近4 的一个类似物己进入临床试验。 化合物3化合物4 g e n e t e c h 研究小组用类似的方法得到了具有良好抗凝血活性的化合物苯并 二氮杂革二酮类似物；m e r c k 公司的研究小组也根据r g d 类环肽的n m r 结构 设计了不同于苯并二氨杂釜类化合物的有机小分子，现正在进行临床研究。 1 4 ，3 数据库搜寻的例子 m e r c k 公司的l a m 等根据h i v 蛋白酶一抑制剂复合物的晶体结构及其作用 方式，得到了h i v 抑制剂的药效基团模型，以此模型为提问结构搜寻了剑桥晶 体结构库，获得了活性较高的化合物5 ，化合物5 曾进入一期临床试验，后因水 溶性低和血浓度不稳定等因素而放弁了进一步的临床试验。但这并不影响它做为 用数据库搜寻方法发现新的先导化合物的例子。 h 化合物5 h 化合物6 s m i t h k l i n eb e e c h a m 的研究人员用收据库搜寻的方法得到了内皮素受体的 0 天津师范人学硕卜学位论文 拮抗剂化合物6 ，它的一个类似物现正在进行临床试验，有望发展成治疗肺动脉 高血压的药物。 1 4 4 基于结构的药物设计( s b d d ) 基于结构药物设i , t ( s b d d ) 成功的例子很多，有些用s b d d 设计的化合物已 经上市( 见表1 1 ) 。在此举一些h i v 抑制剂设计的例子。h i v - 1 蛋白酶在十年前 就被确定为基于结构的药物设计靶标，经过不断的努力己有四种用s b d d 设 计的药物批准上市，另外些正在进行临床试验。 m e r c k 公司在原来的。肾素结构模拟的基础上，将己知抑制剂l 6 8 9 5 0 2 对接 到天然h i v 蛋白酶( h 1 vp r ) 的构模型，分子模拟的结构与后来晶体结构测定的 结果相近。后来他们又将注意力集中在羟乙酰基类似物的设计上，以羟乙酰基类 抑制剂与h i v p r 复合物的晶体结构为模板，模建抑制剂一h i v p r 复合物的三维结 构。分子模拟结果表明，对起始化合物，p 1 位取代基虽然能插入到蛋白质中去， 但其构象不是低能构象，不利于化合物与h 1 v p r 作用，活性也不高。对p l 进 行结构改造，得到活性较高的抑制剂l 7 3 5 5 2 4 ( 7 ) 这一化合物在1 9 9 6 年经美国 f d a 批准上市，商品名为i n d i n a v i 。 化合物7 h o f f m a n n l a r o c h e 用s b d d 方法开发了h i v 蛋白酶抑制剂s a q u i n a v i r ( 8 ； r 0 3 1 8 9 5 9 ) ，1 9 9 5 年经美国f d a 批准上市，商品名为i n v i r a s e r ，这是f d a 批准 上市的第一个h i v 蛋白酶抑制剂。 h n p 化合物8 c o n h 2 o l i 爿气! 天津师范大学硕十学位论义 上面我们介绍了一些计算机辅助药物设计成功的例子，从中可以看到，不管 是经典的q s a r 方法，还是近2 0 年来发展的基于结构的药物设计方法，均设计 出了效果很好的药物分子上市或进入临床研究，表明计算机辅助药物设计在发现 新药的过程中的作用越来越重要。表1 1 中列举了其它一些计算机辅助药物设计 成功的例子，至于用计算机辅助药物设计方法得到候选化合物进入临床前研究的 例子就更多，这里不再一一列举。 1 5 展望 1 、2 、4 、5 从1 9 6 4 年h a n s c h 和f u j i t a 发展经典定量构效关系方法算起，计算机辅助药 物设计已经有3 5 年历史了。8 0 年代l j 期以来，计算机的软件、硬件均得到了飞 速发展，特别是8 0 年代末出现的计算机图形工作站( 如s g i ，s u n 和h p ) ，为实 时地处理药物和受体生物大分子的结构以及药物与受体的相互作用提供了很好 的平台。在此期间，人们也将许多新的计算方法应用于计算机辅助药物设计，出 现了许多新的计算机辅助药物设计方法，如三维定量构效关系分析方法、三维数 据库搜寻方法、分子对接方法和全新药物设计方法。与此同时，作为发展计算机 辅助药物设计方法基础的其它理论方法也得到了迅速的发展，例如量子化学方法 也已进入了实用化的时代，从头计算方法和密度泛函理论方法能计算上百个原子 的分子，半经验量子化学方法能计算上万个原子的分子；统计热力学方法也能准 确地预测药物和受体生物大分子的结合自由能。这些方法在新药设计、特别是新 的先导化合物的发现和优化中发挥了各自的作用，并有许多成功的例子足以说明 计算机辅助药物设计方法实用化的时代已经到来，这些成功的例子的确令人振 奋，标志着计算机辅助药物设计在未来新药研究与开发中的地位日益重要，国际 上大的制药公司的新药研制状况也充分说明了这一点。 1 8 9 4 年，f i s c h e r 提出了生物大分子( 如酶) 与配体( 如底物) 作用的“锁 钥原理( 1 0 c ka n dk e yp r i n c i p l e ) ”距今已有一百多年历史了，这一原理曾经指导了无 数的生物化学家和药物化学家的研究工作，并且在今天依然有它的生命力。不管 是传统的药物化学家或者是药物设计工作者，锁钥原理已经深刻地印在了脑海 中，每当人们进行科学研究时，药物化学家或药理学家首先想到的是药物作用的 靶标，即受体，然后是想为受体配制一把“钥匙”，以达到治病的效果。因此， 将受体当作锁，将药物或其它生物活性分子当作钥匙已是药物研究工作的一个常 天津帅范大学硕士学位论文 识。我们不难发现，几乎所有的计算机辅助药物设计的方法均是以锁钥原理为基 础的。例如：分子对接方法和全新药物设计方法，是直接从数据库搜索或设计与 生物大分子活性部位或结合部位的结构相匹配的化合物，这是锁钥原理最形象的 表示。即使是三维数据库搜寻或定量构效关系方法，也不同程度地考虑了药物与 药物设 计的靶研究组所用方法结果 标分子 反复运用分子模拟、有机合成和蛋白 凝血酶h o f f h l a n n l质晶体结构优化化合物在酶催化中心 r 0 4 6 6 2 4 0 ，现已进行抗凝血方面 抑制剂a r o c h e 公的疏水性区域的结构，得到了抑制剂的临床试验 的新型母核和取代基 根据凝血酶的三维结构模型，设计了 凝血酶 b i o g e n 同时与酶催化活性部位和负离子结合 b g 8 9 6 7 ，现已进入i i 期临床试验 抑制剂公司部位作用的双功能抑制剂 以胺为探针分子，用g r i d 程序搜寻4 - 胍基n e u 5 a c 2 e n ( g g l 6 7 ：现正 了神经氨酸酶的结合部位，发现用胍作为抗感冒病毒a 的药物进行i i 期 神经酸m o n a s h 大基取代抑制剂n e u 5 a c 2 e n 的4 羟基，临床试验，最近根据美国科学 酶( 唾液学g i a x o有利于活性的提高，分子模拟预测结杂志报道，此药临床工作已结束， 酶)w 色l l c o m e 果被后来的晶体结构证实即将上市，此分子对于有很强的抗 抑制剂公司感冒病毒变异能力，克服了以往抗 感冒病毒药物抗药性的缺陷，具有 很好的市场前景 反复运用分子模拟、合成和晶体结构 嘌呤核 b i o e r y s t 制 测定方法，筛选出候选化台物用b c x 3 4 ，进行了多种临床试验对 苷磷酸药公司m o n t e c a r l o 能量优化方法将候选化t 细胞癌，r a 和m s 进行口服i 化酶( 合物对接( d o c k ) 0p n p 的结合部位 i i 期临床试验，表皮注封i 期临床 p n p ) 中，分子的低能构象用分子图形学方试验：牛皮癣：表皮注射期临床 抑制剂法研究，结果与晶体结构一致在此试验 基础上进行了新化合物的设计 天津师范大学硕士学位论义 药物设 计的靶研究组所用方法结果 标分子 胸莆酸 运用g r i d 程序搜寻t s 的结合部位， 合成酶 a g o u r o n 制 得到探针分子与其结合的能量最佳部 t l a y m i t a q ( a g 3 3 7 ) ，现j f 作为抗癌 ( t s ) 药公司位，然后再用分子模拟结合有机合成药物进行临床试验 抑制剂和晶体结构的方法设计分子 碳酸综合运用c ai i 的晶体结构和嚣子化 酐酶m e r c k 研究学构象分析，确定了c a 抑制剂s - 2 t r u s o p t ( m k - 5 0 7 ) 现已作为治疗青 ( c a )实验室噻吩噻喃2 磺酰胺类化合物与c ai i光眼疾病的药物上市 抑制剂结合的活性构象，并在此基础上进行 了结构改造 人体鼻 病毒根据d i s o x a r i l 与h r v - 1 4 复合物的品w i n 5 4 9 5 4 和+ 个化合物现正作为 1 4 ( h r s t e r l i n g 体结构，进行话性化合物和九活性化治疗感冒药物进行i 期临床试验 v - 1 4 ) w i n t h r o p 合物的体积图像分析，得到了化合物 抑制剂结构改造的信息 在几百个化台物台成( 其巾1 0 0 个化 合物其类似物) 和药理测试的基础上， 醛糖还a v e r t进行了半经验量子化学计算，得到了 t o l r e s t a t 已作为治疗糖尿病药物上 原酶抑实验室研结构改造的信息：在6 号位上加供电 市 制剂 究公司子基幽，5 号位上加吸电r 基团根 据这一预测结果合成了两个化合物， 其中包括化合物t o l r e s t a t 表1 1 计算机辅助药物设计的些成功例子 受体的结合或匹配问题。 以“锁钥原理”为基础的药物设计方法实际上有其固有的缺陷，即仅考虑药 物结合到受体活性部位伯i n d i n g ) 的作用情况，至于药物是怎样到达活性部位的动 态过程不予考虑。因此，9 0 年代以来，用基于这种原理发展而成的药物设计方 天津师范大学硕士学位论文 法所设计的化合物的成功率还不够高。从理论上来说，药物一受体的相互作用是 一个动态的过程，即药物必须通过具有一定距离的“空腔”，才能到达活性部位 或结合部位，这就是说药物通过受体“空腔”时，药物一受体复合物，可能有一 个类似于化学反应过渡态的结构存在。正如反应过渡态的结构，这一过渡态的结 构也不能用实验方法测定，而目前还没有一个现成的方法可以模拟这一过程。因 此，发展模拟药物与受体生物大分子相互作用动态过程的方法，并在此基础上建 立合理药物设计的方法可能是今后计算机辅助药物设计的发展趋势之一。另一方 面，s b d d 方法没有考虑药物在体液中的传输过程和药物的代谢途径，即对药物 与受体作用前和作用后的过程都没有给予足够的重视，这样必然失去了许多药物 作用的信息，所以考虑药物作用的详细过程，即药物的传输、与受体生物大分子 的结合和代谢是今后药物设计发展的又一趋势。因此，今后计算机辅助药物设计 的趋势是由现在的仅考虑药物与受体的结合( 即s b d d 方法) 逐步向基于药物 作用机制的计算机辅助药物设计( m e c h a n i s m b a s e dd r u gd e s i g n ，m b d d ) 方法发 展。 参考文献： 1 】陈凯先，蒋华良，嵇汝运计算机药物辅助设计- 原理、力法及应用，2 0 0 0 ，1 1 7 【2 】王红武，陈凯先，嵇汝运三维定量构效关系的研究与应用国外医学：药学分册， 1 9 9 3 ，6 ：3 2 5 3 3 2 【3 】唐云，陈凯先，嵇汝运计算机辅助药物设计的三维结构搜寻方法化学通报，1 9 9 5 1 i 1 7 【4 唐云陈凯先全新药物设计方法国外医学( 药学分册) 1 9 4 5 ，2 2 ：1 - 6 5 】朱维良，蒋华良，陈凯先，嵇汝运，曹阳，生物大分子体系量子化学计算方法新进展化 学进展1 9 9 9 ，1 1 ( 4 ) ：3 6 7 天津师范人学硕士学位论文 第二章：v - 1 蛋白酶多肽类抑, i i n 的理论研究 2 1 引言： 艾滋病 1 - 3 1 ( a i d s ) ，全称“获得性免疫缺陷综合症”( a c q u i r e di m m u r e d e f i c i e n c ys y n d r o m e ) ，是全世界范围内十大致命疾病之一。因其蔓延快，临床 症状复杂，死亡率高，又被视为“超级癌症”和“世纪瘟疫”。从1 9 8 1 年在美国 发现首例患者至今【1 ，2 1 ，己在1 8 0 多个国家和地区发现此病。据世界卫生组织 报道，在发现首例艾滋病患者2 5 年后的今天，已经有2 5 0 0 万人死于这种疾病， 至少有4 0 0 0 万艾滋病病毒携带者，它所引起的危害已经成为2 l 世纪人类面临的 最严峻的挑战之一。 面对这一严峻挑战，全世界的科学工作者进行了艰苦的研究工作，在a i d s 的病理机制、病毒的结构生物学以及药物开发等领域都取得了巨大进展。在1 9 8 3 年，法国科学家首先证实了艾滋病是由人类免疫缺损疾病病毒感染人类免疫系统 引起的。1 9 8 5 年，国际病毒命名委员会决定将这种病毒称为人类免疫缺损病毒 ( h u m a ni m m u n o d e 矗c i e n c yv i r u s ，简称h i v ) 4 】。h i v 病毒粒子是一种直径约 1 0 0 n m 的球状病毒，其外膜由两层脂类物质构成。外周膜上覆盖一层糖蛋 刍( g p 4 1 和g p l 2 0 ) ，外周膜内侧有两层蛋白质内膜( p 2 4 和p 1 8 ) ，内有基因组r n a 链，链 上附着反转录酶，其功能是催化病毒r n a 的反转录。该病毒能选择性地感染c d 4 细胞从而导致机体免疫缺陷。下面是h i v 病毒粒子结构模式图( 图2 1 所示) ： 一g , ，1 2 g e p q l n “ r t 托十k 粕 图2 1h i v 病毒粒子结构模式图 g p l 2 0 和g p 4 1 为外膜蛋白；m a 为内膜蛋白： c a 为外壳蛋白：n c 为核衣壳蛋白；r t 为反转录酶 h i v 侵袭靶细胞的过程为： 天肄师范大学硕士学位论文 、结合：病毒的g p l 2 0 与c d 4 细胞的抗原分子结台，外周膜融合并把病 毒粒子遗传物质r n a 释放到胞质中，即所谓脱壳； 、逆转录：经过病毒逆转录酶的作用，以病毒r n a 为模板合成互补的d n a 副链，然后再以d n a 副链为模板合成d n a 双链； 、整合：d n a 双链经环合整合进宿主细胞染色体的d n a 链中； 、修饰和翻译：细胞酶系在病毒长末端重复顺序( l t r ) 指导下，将整合 进染色体中的病毒d n a 大量转录成r n a ，其巾一部分r n a 分子作为m r n a 翻 译出子代病毒的结构和功能蛋白，另一部分则成为子代病毒的遗传物质，并装配 成新的病毒粒子： 、装配和释放：成熟的子代病毒通过芽生方式穿透c d 4 细胞而释放出来， 再感染其他t 4 细胞。 因此可针对h i v 复制的五个阶段之不同特点进行抗h 1 v 药物研究： 、病毒与靶细胞结合阻止剂：由于h 1 v11 要与靶细胞膜表面的c d 4 受体 结合。故该类药物设计的着眼点放在特异性作用于病毒蛋白( 尤其是被膜蛋白) 或靶细胞t 4 抗原，病毒结合位点以及能干扰病毒被膜的完整上。 、病毒逆转录酶抑制剂：病毒进人靶细胞后，其逆转录酶( r t ) 是催化 产生正链d n a 共聚物的关键。因此，该类药物设计的靶点为逆转录酶。目前， 批准上市的五个药物均基于这一着眼点。但它们均属_ 丁核苷类化学药物，毒副作 用大，选择性不高，且有耐药菌株出现，故都面临被淘汰的危险。因此，具有选 择性高的非核苷类逆转录酶抑制剂是未来抗h i v 药物的研究热点之一。 、h i v 蛋白酶( h i vp r o t e a s e 即h i vp r ) 抑制剂：h i v 的前体蛋白裂解 成各种结构和功能酶蛋白，是在蛋白水解酶的作用下实现的，这是h 1 v 复制周 期中非常重要的一步。因此，寻找化学结构和立体结构能满足h i v 蛋白酶对底 物的要求，模拟肽水解过程，通过氢键等方式与h i v 蛋白酶形成底物一酶复合 物来抑制h i v 蛋白酶活性，就可达到阻止h i v 前体蛋白裂解，终止h 1 v 复制之 目的。 、h i v 基因表达抑制剂：该类药物可考虑从抑制病毒末端重复顺序编码的 调节蛋白t a t 活性着手，来抑制h i v 的复制，从而达到有效地抑制h i v 基因表 达之目的，这是抗h i v 药物研究的新方向，是将来发展抗a i d s 药物的重点。 天津师范大学硕士学位论文 、病毒装配及释出阻断剂：病毒的装配及释出是其复制和感染细胞的最后 阶段，研究特异性作用于此阶段的抗病毒剂十分重要。该类药物研究可模拟肿瘤 药物的研究，即重点应放在抗有丝分裂和抗突变两个方面，从而达到抑制病毒细 胞增殖的目的。 、h i v 细胞杀灭剂：以上设计主要是针对h i v 复制周期的几个阶段，以 抑制h i v 复制为目的，为艾滋病患者靠自身免疫消灭h i v 提供了机会，但均不 能直接杀死h i v 。目前研究既能杀死h i v 和被感染c d 4 细胞，又对人体正常细 胞无害的药物，尚是世界最大的难题。 在卜述几类药物中，h i v 蛋白酶抑制剂的药物以其花费低廉、研制周期短、 与目前生产水平接近以及h i v 疫苗安全等特点在抗病毒的化学治疗中越来越引 起人们的注意。其诱人的研究前景使得许多医药厂家及科研机构都在积极地参与 h 1 v 蛋白酶抑制剂的研究。 2 。2h 1 u 1 蛋白酶及其抑制剂复合物的结构特征 h i v 蛋白酶是人类免疫缺陷病毒产生的，这类蛋白酶专门负责病毒及其酶的 前体清除工作，是为病毒感染所必需的。蛋白酶根据其作用机理不同分为四种： 丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。基于其公认的 活性位点同源性【5 】以及其晶体分子结构，h i v 蛋白酶归属于天冬氨酸蛋白酶。天 冬氨酸蛋白酶是以同源双体的形式产生功能作用的：其同源双体是由两条相同的 由9 9 个氨基酸链组成，每一条链在第2 5 至u 2 7 位包含了一个序列为a s p t h r - g l y 的 活性位点 5 】，两条链整体形成一一个四角双锥形晶体【6 】并呈现出精确的双轴g 对 称【7 。而保守的活性中心则位于靠近双体中心的套环结构上。两个亚单位之间 由四股富含甘氨酸的反平行p 片层连接，片层结构包括了每个亚单位的氨基端和 羧基端。在两个亚单位中各自形成了一个相当长的裂隙，而具有催化作用的重要 的天冬氨酸就以共面构型位于裂隙的底部。另外，每个亚单位的一端包含一个移 动性较高的所谓“挡板结构”，它由一个反平行口片层和一个螺旋延展至底物结 合位点形成【8 j 。“挡板结构”功能嘲是对底物或抑制剂的进出起到作用。具体 和抑制剂结合我们在后面还会做进一步的解释说明。 夫津帅范大学硕士学位论文 a 网2 2h i v 蛋白酶结构示意图，显示己形成双体结构 其中a 、b 、c 分别对应的是“捎板结构”、活性位点、双体结合区 同源双体结构的h i v 1 蛋白酶之活性位点，为一高保守区 l e u 一( l e u v a l ) a s p t h r a s p - t h r - g l y - a l a - a s p l y s 。其中以三联方式每个单体位置 为a s p t h r - g l y 最为重要，考虑到蛋白酶的双体结构则包括6 个氨基酸残基，它 们相应于氢基酸位置的2 5 到2 7 位以及2 5 到2 7 i 位，到目前为止，t h r 2 6 及t h r 2 6 ，g l y 2 7 和g l y 2 7 的作用尚不明确，不过有假说提出，是山于t h r2 6 及t h r 2 6 残基之间产生的强力氢键稳定了活性位点的结构构型，而g l y2 7 和g l y2 77 是 容纳并结合底物，使之处在一个适合的方位，以便起催化作用的a s p 2 5 和a s p 2 5 羧基基团可以攻击底物的氨基部分y 0 1 。当然h i v 蛋白酶活性不止与活性位点密 切相关，其他部