（生物化学与分子生物学专业论文）sars冠状病毒3cl蛋白酶的结构与功能研究.pdf

摘要 y i ：0 1 4 0 3 罨, s a r s 冠状病毒3 c l 蛋白酶的结构与功能研究 摘要 所有的冠状病毒基因组都编码一个3 c l 蛋白酶，用于对基因组的表达产物进 行翻译后加工。因此，3 c l 蛋白酶被看作是抗病毒药物设计的重要靶点。本文以 s a r s3 c l 蛋白酶为对象，深入研究了该酶的结构与功能。 我们构建了一个体内的自剪切活力测定方法，通过该方法证实了该蛋白酶与 其它来源的3 c l 蛋白酶具有相似的催化部位，解释了过去不同研究结果中的冲 突，支持该酶属于丝氨酸蛋白酶家族的看法，并发现删除该蛋白酶n 一端5 肽对 酶的活力有重大影响。结合体外活力测定方法，我们详细研究了该蛋白酶的底物 特异性。发现该蛋白酶的肽类底物至少需要p 4 - p 2 这样一个六个残基的核心片 段才能够被水解；底物p 4 位置上游的残基对酶切活性贡献很小，而p 3 一p 5 位置的残基也参与酶与底物的作用；删除底物p 4 或者p 2 残基将导致底物不能 被催化水解。在此基础上，我们利用自剪切系统研究了p 6 - p 4 十个位置的残基 要求。发现该蛋白酶的底物特异性主要通过p 2 一p 2 四个位置对残基的特殊要求 得以实现。其中p 2 位置不能被接受p r o 。p i 不能接受p r o ，i l e ，g l u ，但是 该位置可以接受t r p ，l y s 等侧链较大的残基，在此基础上我们研究了p 1 残基 的结合部位s l 的构成，发现l e u 2 7 参与该位置的空问位阻的形成。蛋向酶天 然切点上绝对保守的p 1 位置g l n ，在自剪切实验中仅可以被少量的残基取代。 p 2 位置的残基要求也比较专一，不但部分带电残基不能被接受( a r g ，a s p ) ，而 且侧链过小的残基( a l a ，g l y ) 也不易被接受。这部分结果与传统认识有很大差 异，澄清了过去一些错误的认识，为抑制剂设计提供了有利信息。 该蛋白酶对底物切点的p 2 ，p l 位置有电性要求，为此，我们研究了活性部 位周围可能参与作用的一个负电中心。发现a s p l 8 7 对酶的催化必不可少，比底 物结合模体更为重要，它可能就是催化链中寻找多年的酸性催化残基。我们还尝 试了对该酶进行工程化改造，结果具有实用价值。 关键词：s a r s3 c l 蛋白酶，自剪切，活性部位，底物特异性，药物设计 a b s t r a d s t u d y o nr e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n df u n c t i o no f s a r s c o v3 c lp r o t e a s e y u f e is h a n ( b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f g e n j u nx u a b s t r a c t a l lt h ec o r o n a v i r a lg e n o m e se n c o d ea3 c lp r o t e a s ew h i c hp l a y sa n m p o r t a n tr o l ei nc l e a v a g eo ft h e i rt r a n s l a t i o np r o d u c t s ，t h e r e f o r e t h ee n z y m e i st a k e na sap r o m i s i n gt a r g e tf o ra n t i w f f u sd r u gd e s i g n t h i sw o r kf o c u s e do n t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fs a r s c o y3 c lp r o t e a s e w ep r o p o s e da ni nv i v oa u t o - c l e a v a g ea s s a y t h r o u g ht h i sn o v e la s s a y w es u g g e s tt h ee n z y m eh a sas i m i l a ra c t i v es i t ew i t ho t h e r3 c lp r o t e a s e s ，a n d t h r o wl i g h to nt h ec o n t r o v e r s yo ft h er e s u l t sf r o md i f f e r e n t3 c lp r o t e a s e s f ur t h e r , o u re x p e r i m e n t ss u p p o r tt h ev i e wt h a ts a r s3 c lp r o t e a s eb e l o n g st o s e r i n ep r o t e a s ef a m i l y w ea l s on o t i c e dt h a tt h ed e l e t i o no ft h en - t e r m i n a 5 - m e rf i n g e rf r o mt h ee n z y m ew i l la b o l i s hi t sc a t a l y s i sa b i l i t y c o m b i n e dw i t hi n v i t r om e t h o d t h ea s s a yw a sa l s ou s e dt oe x p l o r et h es u b s t m t es p e c i f i c i t yo f s a r s3 c lp r o t e a s ei nd e t a i l w ef o u n dt h a tt h es u b s t r a t es h o u l dh a v ea tl e a s t a6 - m e rc o r e ( p 4 一p 2 ) p a r tf o re f f e c l i v eh y d r o l y s i s r e s i d u e su p s t r e a mp 4 c o n t r i b u t el i t t l et oc l e a v a g ee f f i c i e n c yb u tr e s i d u e sf r o mp 3 t op 5 d i r e c t l yt a k e p a r ti nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ee n z y m ea n di t ss u b s t r a t e s t a r t i n gf r o mt h i s p o i n t ，w es t u d y t h ea m i n oa c i dr e q u i r e m e n ta tt e np o s i t i o n s ( p 6 一p 4 ) s y s t e m a t i c a l l yp 2 c a na c c e p td i v e r s er e s i d u e sb u tp r o p 1 c a nn o ta c c e p tp r o l ea n dg l u ，w h i l eb u l k yr e s i d u e ss u c ha sm r p l y sc a ns e r v ea tt h ep l a c e w e f o u n dt h a tl e u 2 7t a k e sp a r ti nt h ef o r m i n go fs rt h ea b s o l u t e l yc o n s e r v a t i v e s a r s - c o y3 既蛋白酶鳝掬每萌雏鹩研究 g i na tp 1c a nb er e p l a c e db yo n l yaf e wr e s i d u e si na u t o - c l e a v a g ea s s a yt h e r e s i d u er e q u i r e m e n ta tp 2i sa l s oh i g h l ys t r i n g e n t t h ec h a r g e dr e s i d u e s ，a r g a n da s p c a nn o tb ea c c e p t e da n dt h er e s i d u e sw i t hs m a l ls i d ec h a i n ，s u c ha s a l aa n dg l y , a r ea l s ou n s u i t a b l et ot h es i t e t h eo u t c o m ei sg r e a t l yd i f f e r e n t f r o mt h et r a d i t i o n a ln o t i o n a n dw i l lb eu s e f u lf o ru n d e r s t a n d i n go fm e c h a n i s m o ft h ee n z y m ec a t a l y s i sa n dd r u gd e s i g n t h ep o s s i b l ef u n c t i o no fac o n s e r v a t i v en e g a t i v ec h a r g ec e n t e rc l o s et o t h ea c t i v es i t ew a ss t u d i e db e c a u s es o m ea c i dr e s i d u e sc o u l dn o tb ea c c e p t e d a tp 2a n dp 1 s i t e s a s p l8 7w a s p r o p o s e dt ob ev i t a lf o rt h ec a t a l y s i sa n di ti s m o r ei m p o r t a n tt h a nh i s l6 3o fs u b s t r a t em o t i f ，i tt e n t a t i v e l ys u g g e s t e dt h a t a s p l8 7m i g h tb et h ea c i dr e s i d u ei n v o l v e di nc h a r g er e l a ys y s t e m w ea l s o m a d es o m ee f f o r t st om o d i f yt h ee n z y m ef o ri n d u s t r yp u r p o s ea n dt h er e s u l t s a r ef e a s i b l e k e y w o r d ：s a r s3 c lp r o t e a s e ，a u t o ，c l e a v a g e ，a c t i v es i t e ，s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y , d r u gd e s i g n 中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。，除文中已经注明g l 用的内容或属合作研究共同完成的_ r 作外，本论文 不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均己在文巾以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：鳓久 f 日期：如。易年r 月硼 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使片学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的全都或部分内容，可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编术学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名 掺雪伐 铷张乒叁期 硼6 f 孳l 害 碍l 亩 导致严震急瞧释吸豢统综合瘸( s a r s ) 静瘸蛰惩一释藏链黼瘸毒，象愿予冠 状病感料( 国! 瑚酋r j r i d a o ) ，具程已知疑大的r n a 瘸毒基因缌( 约寓三万个碱纂) 1 ， 2 3 。羧煞搿编码蛋鑫袋瓣往矮不鬻，瘸毒基嚣缝酉鞋麓分藏嚣令帮努，上游大约三 努之二黪帮分编蕊i 缮襁囊自，涛魏赘籁酶( r e p l i c a s e ) 、转秉酶( t r s e r i p a s e ) 以及鬣白酶( p r o t e a s e ) ，负责瘸毒在受感染细胞内的复制与转录 3 3 。下游部分编 码缝稳蛋舀，受蜜携绦痪毒缓装瑟羲敦缝璃攀元【4 ，5 】。程痪繇复裁瓣轫热阶段， 基因缀被蠹接弱潺残鬻蒸长达a 予个氯蒸羧残麓静麓麓( 龟旋嚣荐多虽彝讳， p o l y p r o t e i n ) ，分子基分别约为4 5 0k o a 和7 5 0k d a 6 。它们强一系鳓蛋白酶的加 工下，最终教剪切戏具有特定大小的爨自质分予，露避一步执行其各国的功熊。遮 一蛋纛酶秘工过程 分关键，爨矮受到严揍蔽翻，在缀大蕊疆发上，邃释控制燕邋 遘蛋白酶对鼹条菔键上不丽讶点瓣劈惦效率菠异实现。参与鸷惦翔上过程瀚蛋囱 酶主鼹曲瘸毒自身编码，其中起次要作明的被称为辅助缀自酶( a c c e s s o r y p r o t e i n a s e ) ；起主要俘震赘鼓称麓圭簿蛋自戆m a i n p r o t e i n a s e ) ，迄羧篱舔为3 e l 蛋蠢麓( 3 e 泸) 露3 。下蘧我稻途蕊攀套绥3 c l 虽囊繇熬磷究拣凝。 一、嚣姨瘸臻3 e l 爨自装熬翠蓑磷筑 冠状病海科与动脉炎病毒科( a r t e r i v i r i d a e ) 属于巢型病毒鼹( n t d o v f r a l o s ) 。 这两个料的病毒均编码3 c l 蛋囱憋，但是两类3 c l 爨自酶在分子大小以及结构上有 镤夫不霆【翻，3 c u ”静名称亲源予3 c - l i k ep r o t e i n a s e ，袤示逡一粪黧蛋是酶帮琴 先发蕊静小烈a 病磷( p j c o r n a v i r i d a e ) 静3 c 蛋囱酶螽鸯裙戳的结构，结捣麓之闻 的空间关系和活性部位的催化残馨具肖相关性。3 c l 蛋自酶的存在最早是分析鸟类 霪状瘸毒的复制酶( r e p l i c a s e ) 多蛋鑫倦序魏丽辔翘奠，弼。在姥较了鸟类感絷瞧 支气繁瘸蠢( 疆￥) 翡多夤囊转移，l 、r n f i 痿霉瓣嚣爨骞酶之蕊黪关系螽，发筏了嚣 者的关联。在同一研究中，该文作者还预测了多蛋白体上切点的披嚣分布，以及叼 点都食囊ql ( s g ) 两膝这一典型的3 c 3 c l 蛋自酶的佟用位点，并认为在切点的 愆袋嚣上蘸羧墓舔带蠢体粳较大晦藏承秘穗，逶露是l e u 。嚣慕，这麓肇测又凌辱i 律到熬它溉状病毒3 c l 噩自酶的研究中，毽括鼠肝炎瘸毒( 唧) 、入冠状病毒 2 2 9 e ( h c o v2 2 9 e ) 以及猪传染性肠炎病海( t g e v ) 等等 6 ，1 0 ，1 1 。 l i u 等人最举藩道了蕊浚巍攥( 1 b y ) 基颡缀嚣敬霾滚攥o r f l a 煞3 翡表达产 物具膏器自酶活性，从实验上证变了溺状病毒3 c l 鬣白酶的存在。在低们的研究中， s 黼s 蠢搜翁毒3 江甓鑫臻瓣缭 霉与琏缝臻巍 带有3 c l 结构域的r d r p 核酸片段在表达时最示了蛋白酶活性，这一活性和表达体系 无关，蕊是由3 c l 豢自酶产生能【1 2 。勰v 以及h c o v2 2 9 e 龅研究也迸步支持了 晕麓静颈溺 7 ， 3 ， 4 】。这些互 乍结采表疆：澈状病毒3 e l 蛋白酶鹫鬣霹以在不两 的系娩中表达，产生有活性的酶。m h v 的3 c l 蛋白酶是在体外兔网织红细胞裂解物 中表达；h c o v2 2 9 e 的蛋白酶是在大肠杆菌中袭达；i b v 的缀白酶是用病海转染系统 转入v e r o 缨魏中袭达缮嚣。在i b v 臻究中，3 c l 蛋自酶积痰兹蛋白( 孤笈割酶静弱 点部位衍生而来) 共表达，结合产物s d s p a g e 分析和定点必变，发现绝大部分切点 位置和早先的预测相符 1 2 ，t 3 ，1 5 。在h c o v 以及m h v 的研究中，利用大肠杆菌表 达的3 c l 结构域水解重组蛋白底物，进亏亍了3 e l 蛋白酶切艨躬n - 端序列分拆；以及 囊合成靛作为底耪瓣俸乡 定量分辨，裙步硬突了酶豹动力攀特征 7 ，t 6 ，1 7 】。磷究 者在这些实验中发现了不同冠状病毒的3 c l 结构域都大约肖3 0 5 个氨撼酸残基，它 们不仪结构上相似，催他机制也相似，而且在多蛋白体中所处的位置相似；并提出 了3 c l 鬣自酶套导笈裂蘸剪窝藏熬戆模型，建立了基本豹溺力测定方法，为焘亲耱 研究工作打下了基础。 二、瓣跃病毒3 e l 鬃自酶静结穗蒺稿 脊髓灰质炎病瓣( p o l i o v i r u s ) 的3 c 蛋白酶是最早提出的3 e l 蛋自酶的基本结 构模型，它为双结构域蛋白，只有1 8 2 个残纂。丽冠状病瓣3 e l 蛋自酶的c 一端多了 一令大约1 2 0 令袋戆赘医蠛 5 】。在晶 奉终穗没鸯密寒之辩，有夭箍溅这区域懿捧 用可黼是：( 1 ) 维持酶的总体折疆结构；( 2 ) 参与催化；( 3 ) 底物识别；( 4 ) 起一 个非催化的功能。z i e b u h r 等人对h c o v2 2 9 e 的3 c l 蛋白酶做了许多c 端截短不同 长度驰突变 搴，这魏突交蒋在体岁 豹台成效剪甥实验中都浚骞显示活力【】8 。l u 等 人在体乡 转录系统中，删除m h v3 c l 蛋自酶的c 一端2 8 歙，瞧使之丧失了活力 1 9 。 除了冠状病毒的3 c l 蛋白酶之外，动脉炎病毒家族的3 c l 鬣自酶也有一个未知功能 的c 一端区域，只是秽小一点 4 。 a n a n d 等人在2 0 0 2 年报道了t g e v 懿3 c l 袋自酶钓晶体绐构 2 0 】，在诧之前己经 有人报道了几个不同的3 c 蛋白酶晶体结构 2 l ，2 2 ，2 3 ，2 4 。a n a n d 等人认为t g e v 的3 c l 蛋白酶可以划分为三个结构域，活性部位在n - 端的两个结构域之间，包含了 h is 4 i 器c y s l 4 4 ；c - 臻l1 0 个残鏊影或了谨掰叠结稳域窝个1 6 拿臻蘩豹套获区 ( 1 0 0 p ) ，这一套状区被认为参岛形成底物结合部位，而酶的n 一端和p 端之间的相 互作用稳定了套状隗的特定方向( 见图1 a ) ；卜端的两个结构域形成类似胰凝乳蛋白 酶豹辑囊模式。s a r s 爆发以后，瓣3 c l 蛋是鹣豹缮稳研究霉度零| 起一些奘验室懿注 意，先后有多个，j 、缀对s a r s3 c l 蛋白酶进行了褥源模建 2 5 ，2 6 ，2 7 】，y a n g 等人 2 0 0 3 牮首次报道了s a r s3 c l 骚臼酶的晶体以及和抑制剂拱晶的三维结构 2 8 ，并 2 ! l j 羔一 发现了p h 对酶结构变化的影响以及该酶与抑制剂的一种新的结合模式，为药物设计 提供了重要信息。比较3 c 与3 c l 两种酶的晶体结构发现，两者的三维结构高度同源， 活性部位有相似的底物结合口袋。实证了早先对3 c l 蛋白酶家族保守性的一些推测 r 1 7 ，2 9 ，3 0 ，3 l ，3 2 。 圈1 。3 c l 蛋白酶的结构示意圈以及与同滚蛋白酶的序列比较 图a 显示了酶由三个结构域组成，其中催化残基位予结构域i 与i i 之间( b 4 1 c 1 4 5 ) ， 螺旋用 大写字母a ，b c 等表示；b 一折叠片用小写字母a ，b c 等表示，同时加上其所在的结构域的序号。 图b 显示了s a r s3 c l 蛋白酶与同源酶之间的序列比较，两端的竖箭头为蛋白酶自剪切加工的位点， 同时显示了在不同3 c l 蛋白酶序列中保守的催化残基以及模体y m h 1 。 由于已经获得了多个蛋白的晶体结构数据，对c 一端结构域的了解现在已经深入 了许多。首先，虽然早期的研究发现，删除3 c l 蛋白酶c 一端结构域的一部分残基可 能导致酶失活，但是晶体结构显示s a r s3 c l 蛋白酶c 一端结构域并没有直接参与到 催化过程中，而且b a c h a 等人发现仅仅保留卜1 9 2 的部分，酶仍然具有活性( 活力 s 麟冠状病毒3 乳蚤自酶扮蝻 屿功耗研究 降低到野生型的2 0 左右) 5 2 。其次，c 一端结构域也没有壹接参与底物结合口袋 的形成，只是连接结构域l i 和i i i 的套状区( 1 8 4 - 1 9 9 ) 对催化以及底物和酶之间 的识别十分重要。c 一端结构域还和酶的n 一端有相互作用。我们在研究中发现：删除 s a r s3 c l 蛋白酶n 一端5 肽，将导致酶丧失活力；删除s a r s 蛋白酶c 一端结构域的部 分( 2 0 1 3 0 6 ) ，截短体在大肠杆菌中的表达产物形成包涵体，能够溶解于6 m 盐酸胍 中但不溶于8 j f f 尿素。这一现象暗示了在稳定酶的结构上，c 一端结构域起到重要作用。 酶以二体形式表现活力曾是普遍的看法，单体没有活力 3 3 ，而c 一端结构域和二体 的形成有关，所以表现在活力上的不可或缺。体外的动力学实验也支持二体是活性 形式的的推测 3 4 ，3 5 ，3 6 3 。不过，值得疑问的是，3 c l 蛋白酶需要通过自剪切首 先对自身进行加工，从多蛋白体上释放出来，而此时3 c l 结构域的还位于多蛋白体 内部，两端都带有很大的其它结构域，形成正常的二体可能性较小。所以，有人建 议酶也有可能在形成二体之前具有微弱活性 3 7 。n 一端的5 肽不可或缺，被解释为 这个5 肽参与了二体形成后的另一个亚基活性部位的维持，这是一种精确的调节 2 8 。不过在我们的实验中，即使在n 一端增加三十一个残基，酶一样可以发生自剪 切 3 4 。说明n 一端和c 一端一样可以容忍增加一定数量的残基 3 8 。 序列比较还显示了在复制酶多蛋白体分子内，3 c l 蛋白酶的两侧分别有一个疏水 的结构域( h o l 和h d 2 ) 。有人发现在体外翻译系统中，3 c l 蛋白酶从h d l 和h d 2 之 间剪切下来时，微球体的膜对剪切有促进作用 3 9 。不过剪切成熟以后，3 c l 蛋白 酶的活性，并不依赖膜或者其它辅助因子的存在，至少在体外的情况是这样 7 。有 人认为：h d l 和h d 2 很可能影响3 c l 蛋白酶在胞内的定位，或者在更大程度上介导 复制酶的定位，因为这两个结构域有很高的保守性，应当具有一定的功能。最近的 免疫荧光和电镜实验支持这一假说 4 0 ，4 1 。 三、冠状病毒3 e l 蛋白酶的催化部位 冠状病毒3 c l 蛋白酶的催化部位比较特殊，所以单独列出讨论。3 c l 蛋白酶家族 被划分到双b 折叠蛋白质家族( t w o p f o l dp r o t e i ng r o u p ) ，担任催化作用的 h i s c y s s e r 残基分别位于两组p 片层之间( 由1 2 个反平行的b 折叠片组成) ， 这一结构是胰凝乳蛋白酶等细胞内丝氨酸蛋白酶的基本特征之( 见图1 a ) 。因此， 3 c l 蛋白酶也被称为“类胰凝乳蛋白酶”。和胰凝乳蛋白酶相似，动脉炎病毒家族 3 c l 蛋白酶具有完整的电子转接链( h 3 9 - d 6 5 一s 1 2 0 ) 4 2 。但是在冠状病毒3 c l 蛋 白酶家族内没有发现电子转接链的酸性残基a s p ，而且催化残基s e r 也被c y s 取代 ( 见图1 ) 。有人认为：虽然冠状病毒3 c l 蛋白酶与动脉炎3 c l 蛋白酶有共同的原始 祖先，但是两者的进化方向已经不同，质者甚至和部分3 c 蛋白酶的同源性更高一些 5 。 4 引言 b o u r s n e l l 等人在1 9 8 7 年的工作是冠状病毒3 c l 蛋白酶催化系统的研究基础 r 4 3 。他们认为和3 c 以及其它来源的3 c l 蛋白酶相似，冠状病毒的3 c l 蛋白酶的催 化系统也涉及一个h i s a s p ( g l u ) 一c y s 电子转接链。根据这一预测，对3 个冠状病毒 的3 c l 结构域进行了定点突变研究，发现h c o v2 2 9 e 的h i s 一4 1 、c y s 一1 4 4 以及i b v 和 i h v 的相应残基不可替代 7 ，1 4 ，4 4 。有意思的是，在i b v 中c y s 被s e r 取代以 后，在顺式剪切实验中有残存的活性 3 9 ，支持3 c l 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶之问具 有亲缘关系的看法，但m h v 和h c o v 蛋白酶的相应突变体在体外反式作用实验中都未 能检o n , 【n 活性 1 8 ，早期推测这一现象可能和两种测活方法( 顺式与反式) 的灵敏 度不同有关。我们在s a r s 蛋白酶的实验中也发现，c y s 被s e r 取代以后的蛋白酶突 变体也可以发生顺式剪切作用，但是在以合成肽为底物的体外实验中则没有表现活 性。我们认为可能的原因是：酶主要是二体表现活力，体外测定时酶的浓度较低， 当突变体的比活力很低时，不易检测。 动脉炎病毒的3 c l 蛋白酶电子转接链的酸性残基是a s p 6 5 ，而冠状病毒3 c l 蛋白 酶电子转接链中没有发现对应的酸性残基。考虑到两个病毒家族3 c l 蛋白酶的同源 性，在分析冠状病毒i b v 的复制酶时，研究者认为g l u - 2 8 4 3 ( 相当于s a r s3 c l 蛋 白酶上l 6 6 ) 可能担任酸性残基的角色 9 ，而进一步分析其它冠状病毒复制酶的序 列之后，又发现g l u 一2 8 4 1 ( 对应s a r s3 c l 蛋白酶$ 6 4 ) 比g l u 一2 8 4 3 更加保守，并且 g 】u 一2 8 4 1 位于h i s 和c y s 界定的催化部位内。但对这位点上的定点突变研究，却 得到了各种不同的结论。在i b v3 c 蛋白酶中，g l u 一2 8 4 1 被g l n 取代后，仍然保持 活性 4 5 ；在m h v3 c l 蛋白酶分子中，与g l u 一2 8 4 l 对应的残基a s p 6 4 被突变成h l a 或者p r o 以后，并没有显著改变其活性 1 9 ：而g l y 取代了h c o y3 c l 蛋白酶相应残 基( h s n 6 3 ) 后，并不改变酶对特定底物的催化能力，p r o 取代a s n 6 3 后，酶的活力 降低 1 8 。综合起来，在上述工作中没有发现冠状病毒3 c l 蛋白酶具有和动脉炎病 毒3 c l 蛋白酶相对应的酸性催化残基。 我们在研究中发现，$ a r s3 c l 蛋白酶可能具有完整的电子转接链，这个残基就 是a s p l 8 7 。在s a r s3 c l 蛋白酶的t t i s 4 1 以及c y s l 4 5 的附近有一个负电荷相对集中 的区域，我们称之为负电中心，它包括h i s l 6 3 ，h i s l 6 4 ，6 1 u 1 6 6 ，h i s i7 2 ，a s p l 8 7 等残基。负电中一t k , 在冠状病毒3 c l 蛋白酶家族中高度保守性，暗示其具有特定功能。 对这一区域进行丙氨酸取代扫描以后，我们发现：负电中心中仅有a s p l 8 7 不能被 a l a 取代；g l u t 6 6 被丙氨酸取代以后，酶仍然具有和野生型相近的活性；h i s l 6 3 被 a l a 取代以后，酶活力有较大下降，这一现象和它在底物结合过程中扮演的角色相 符；其它突变对酶活影响不大。发现这现象以后我们又将a s p l 8 7 突变为其它的残 基，h s n ，g l n ，c y s 等残基取代a s p t 8 7 以后都不能得到有活力的酶，但是a s p l 8 7 g l u 突变体具有酶活。对于冠状病毒3 c l 蛋白酶家族来说，a s p t 8 7 这一位置是绝对保守 的，并且在已经得到的冠状病毒3 c l 蛋白酶晶体结构中，a s p l 8 7 非常靠近f t i s 4 l 和 s r s 冠状病毒3 c l 蛋白群的鳍构与功能研究 c y s l 4 5 ( 见图2 ) 。不过，a n a n d 等人认为：a s p l 8 7 绝对保守的原因是它需要和a r 9 4 0 发生电性作用，维持催化部位以及底物结合部位的构象 2 0 。但是这种看法不能解 释：为什么a s p l 8 7 在动脉炎病毒3 c l 蛋白酶家族中也是绝对保守，而a r 9 4 0 却相反。 我们认为即使a s p l 8 7 和h r 9 4 0 的作用很重要，也不能够排除它直接参与到电子转接 链中的可能，毕竟晶体结构给出的结果和实际生理条件下的情况可能会有所不同。 图2 ，s h r s3 c l 蛋白酶残基h s p l 8 7 与活性部位残基之间的相互作用 在h r 9 4 0 ，h is 4 1 ，a s p l 8 7 之州有一个水分子，它与a s p l 8 7 以及h i s 4 1 形成了氢键，同时这一水分 子的氧匣子还可以接受肽键提供的h ，在图中氢键用虚线表示。 3 c l 蛋白酶活性部位除了直接参与催化的残基以外，还包括一个决定底物结合的 底物结合口袋，其中有一个三肽保守序列，被称为t y r - x h i s 模体( m o t i f ) 4 6 3 。 这一模体在已知的3 c l 蛋白酶甚至3 c 蛋白酶家族( 此家族中是g l y 一卜h i s ) 中保守， 这一保守性似乎暗示了这一模体具有重要作用( 见图1 b ) 。在定点突变的实验中， 模体中的t y r 和h i s 被突变以后，酶的活力显著下降，甚至完全消失( 体外剪切合 成肽实验中) 1 8 。x 在冠状病毒3 c l 蛋白酶中通常是m e t 残基，但这一位置也可 以容忍其它残基。已有的一些晶体结构数据显示，h i s 和底物的p l 残基( g i n ) 之 问形成了氢键，t y r 没有和其它残基形成氢键，仅通过空间位阻限制模件的扭转， 从而决定底物的特异性 2 8 。但是实际上，t y r 被突变成p h e ，将导致酶活力很大的 下降( 大约为野生型的1 3 0 ) ，暗示t y r 的羟基可能参与了与底物的相互作用 4 6 。 引言 四、3 c l 蛋白酶的底物特异性 因为在病毒的生命周期中的作用十分关键，3 c l 蛋白酶必须维持自身高度保守的 底物特异性。在冠状病毒转录产生的多蛋白体上，以h c o v 多蛋白体p p l a b 为例，它 的分子内至少有1 1 个保守的剪切位点，都具有g l ni ( s e r a l a g l y ) 的二肽序列( 切 点用箭头表示) 。剪切的起始是3 c l 结构域对自身的两端进行自剪切加工，从p p l a b 上脱离下来的，产物3 c l 蛋白酶二聚化以后，再对其它剪切位点分别进行作用 3 1 。 具体的剪切位点在多蛋白体上的分布具有保守性( 见图3 ) 5 。 图3 ，l l c o v3 c l 蛋白酶在复制酶上的切点分布 三角形表示十二个切点在p p l a b 多蛋白体上的大致位置，其中擐左端的切点是辅助蛋白酶p l l ”的切 点，右端的十一个切点是主导蛋白酶( 3 c l 蛋白酶) 的作用位点，3 c l ”首先对位于自身两端的切点 进行加工，从两个疏水结构域( h d ) 的中间脱离出来，切点都具有典型的q ( s ，g ，a ，n ) _ 肽结构。 蛋白酶底物上的残基有传统的命名规则：从切点开始，往n 一端方向称为p x ；往 c 一端方向称为p x ，序号x 表示残基距离切点的顺序 4 7 。冠状病毒3 c l 蛋白酶的 底物特异性和其它的3 c 3 c l 蛋白酶相似 4 8 。以人冠状病毒h c o v2 2 9 e 为例( 见表 1 ) ，切点的p 1 位无一例外为保守的g l n ，而在p 1 位都是体积较小的脂肪族氨基酸 残基，如s e r 、a l a 、a s n 、g l y 、c y s 等，不过p l 位上的c y s 和a s n 并不常见，被 称为不规范( n o n c a n o n i c a l ) 切点。比较了不同3 c l 蛋白酶的大量切点以后，研究 者发现除了p l 、p 1 以外，p 2 、p 3 、p 4 、p 2 以及p 3 在可变性上都比较严格。p 2 和p 4 都带有较大的侧链疏水基团；p 2 主要是l e u ；p 4 位主要是v a l 、t h r 、s e r 、p r o 等。切点残基组成决定了剪切效率的不同 4 3 ，在病毒复制与转录的生命周期中， 这种剪切效率的差别和其它因素一起，调节病毒的活动状况 4 9 ，这种现象在其它 的r n a 正链病毒中也曾发现过 5 ，5 0 。 淌冠状病毒3 c l 蛋白爵的结梅与功能研究 表1 ，t t c o v2 2 9 e3 c l 蛋白酶切点的氨基酸残基序列 ，。、 ：t 。：j ” ，? j i 、：j ：。二，：j 1 ：o 。 ；i p 4 l 蓐：i j ，i 。- r ；! 。二：1 ；一- _ 1 。一一。蠢。瓣枣呦缈一薯鬟：1 | j 薯。：誊；簇荔粪鬻；鬻譬、薹姜鬟? ， 。“4。 4 等一簦“章。一t 7 。6 t 叫! + 瞧j ，瓣l 辚i 晦? 醺鳃：i 锺? 。麟：醚1 | 瞬：“嗲j g 黟零争酒! i 缀褰i 麟；2 女静囊 v 1 _ s ；| 孽譬爨o s j i t - 、：5 甄懑套e 鹭= “零零驴1 1 濒添麓一i 嘲暨囊 q m 、。f 蠡v 一封。p ，摹潮，嚣一岛io 黧 j 堂 。t ，奢焉簿! o 曩。1 萋鹾譬j e 一r ：_ 1v ：i ：篁j 一麓j 。“l - q n 。n霎1 ”j j 善t m _ ：。心。一，i 9 9 黟4 譬 i ，霹、氛，j 曩“，v ；冀，r 蕊、：溆漆澎。j 趋，_ r ；垂；n o 。自鲻毒_ 擎蓐一v烈：嚣。1 ：。：；乓 露r 一、嚣 霸，0 叠爱_ 蓐5ma 珏 嘻掺 q嵇 y g v + 辩l ，q毒霸 ，kv1 1 k，s 蚴。 c苣：一ti ；0 黑“嚣、嚣+ 髓辩。t ei斟pg 一、9 潞，“ ，_ ；薛- a ir 承vo v ；”i p 。- l 岵q 。t 蟊。_ 式i - 乳二。，番 蕈、；静t ，莺a 襄、 l ，譬，、舅1 ：+ 蓼点；gi 嚣叠”薹i j 、黛j i i s 要一：。i t 擎：_ 筻；够冀0l 镬j 一 霉 职- 。s 一镥、：稚一0 。一趋l ；n t 建电。垭，? 0 。耐，尊奄 。珏酷_ l s 5 ；。墨= 。渖：r ，、：qj a ? 噬盎曩溥 t by 0 2 6 一 十一个底物均为人工合成的1 5 肽，从左到右表示肽段n - 端到c - 端，按照预测的多蛋白体上不同切 点序列合成：( v m a x 饰) r e l 数据反映不同多肽底物的剪切效率，也被用来推测多蛋闩体不同切点的 剪切加工效率：p 2 ，p 1 两个位置的l q 高度保守，这也是冠状病毒3 e l 蛋白酶底物专一性的特征之一。 对于s a r s3 c l 蛋白酶的切点来说，也符合上述规则。但是p 2 残基在其它冠状 病毒的3 c l 蛋白酶的切点上一般都由l e u 占据，在s a r s 病毒的p p a b 上，有三个切 点的p 2 位置上分别是p h e 、v a 以及m e t 1 ，这在其它冠状病毒中很少见，因为 p 2 和另外一个位置p 4 也被认为是决定底物特异性的主要位置。有人建议3 c l 蛋白 酶的底物特异性与其致病性有关 5 1 ，目前还不清楚s a r s3 c l 蛋白酶切点这个位置 上出现多样性的意义。y a n g 等人在研究酶一抑制剂共晶的结构时发现，抑制剂结合 在底物部位后，原本应当和s 2 亚部位( s u b s i t e ) 结合的p 2 残基发生移动并进入溶 液中，而原本应当和s 3 亚部位结合的p 3 残基进一步移向原来的p 2 处。他们用这一 现象解释为何s a r s3 c l 蛋白酶的切点p 2 位置特异性减弱 2 8 。在切点上游的残基 ( 主要指p 4 ) 也有较高的保守性，暗示了底物结合口袋可能和底物之阳j 有多点结合， 得到的晶体结构和计算机模拟数据也证实了这一点 2 6 ，2 8 。 8 引言 圈4 ，冠状病毒3 c l 蛋白酶切点残基特异性示意图 横坐标表示切点的残基顺序，纵坐标表示在4 4 个切点中，不同残基在各位点上出现的概率 5 。 需要指出，现有的关于3 c l 蛋白酶底物特异性的认识基本上来自于已知切点的 统计处理，并没有改变切点不同位鼍残基然后对其特异性进行系统研究，推论依据 的数据有限。而晶体结构分析得出的结果也需要其它实验检验。为此，我们设计了 一个简单、灵敏的方法，仅仅用s d s - p a g e 就可以确定突变后的切点是否仍然可以被 作用。我们对s a r s3 c l 蛋白酶的一个切点的十个不同位置( p 6 一p 4 ) 进行了突变， 研究结果表明原先关于3 c l 蛋白酶底物特异性方面的看法很不完善。我们的结果进 一步详尽地丰富了3 c l 蛋白酶底物特异性的知识，显然，它对更好地设计有效的药 物，将有重要的参考价值。 五、s a r s3 c l 蛋白酶抑制剂研究 考虑到s a r s3 c l 蛋白酶在病毒生长调控中的关键作用，它被看作抗病毒药物设 计的重要靶点。a n a n d 等人在2 0 0 3 年提出了s a r s3 c l 蛋白酶和人鼻病毒( h u m a n r h i n o v i r u s ) 的3 c 蛋白酶具有相似的底物结合模式，因此3 c 蛋白酶的底物类似抑 制剂可以作为s a r s3 c l 蛋白酶抑制剂设计的原型 1 。此后，围绕s a r s3 c l 蛋白酶 抑制剂的研究工作大量展开。 b a c h a 等人对s a r s3 c l 蛋白酶的活性部位分析以后发现s e r l 3 9 ，s e r l 4 4 ，s e r l 4 7 组成的残基簇高度保守，并且位于活性部位的附近，它可以和芳烃硼酸类化合物结 合，从而抑制酶的活性。抑制的效率很高，抑制常数达到了4 0n m ，它是属于过渡 态类似物类的抑制剂，抑制剂和酶的结合是可逆的 5 2 。h s u 等人筛选了9 6 0 种已 经进入市场的药物，结果发现乙酸苯基汞( k j = o 7um ) 、噻汞撒( t h i m e r o s a l ， k i = 2 4um ) 以及六氯酚( k = 1 3 7um ) 可以抑制病毒在v e r o 细胞中的增殖 5 3 ， 9 s l s 冠状病毒3 乱蛋白酶的结构与功能研究 这类抑制剂主要作用在必需巯基上。j a i n 等人根据s a r s3 c l 蛋白酶底物的p 1 位置 为高度保守的g l n ，合成了g l n 的类似物( k e t o g l u t a m i n e ) ，然后在这一母体上增 加了三肽序列( a c v a 卜t h r l e u ) 得到底物类似物抑制剂，抑制常数在o 6 7 0 i x m 之间 5 4 。w u 等人筛选了超过l o ，0 0 0 种化合物，发现约有5 0 种化合物的抑制常 数在l oum 以下，其中有两种是已经上市的药物( r e s e r p i n e ， a e s c i n ) 。作者还 发现有两种抗艾滋病的药物可以抑制s a r s 病毒的增殖，一种是入胞阻断剂( e n t r y b l o c k e r ) ，另一种是3 c l 蛋白酶抑制剂 5 5 。c h e n 等人报道了一部分茶多酚具有抑 制s a r s3 c l 蛋白酶的能力，其中丹宁酸( t a n n i ca c i d ) 的i c ；。为3um 左右，作 者甚至比较了不同茶叶抽提物对病毒的抑制作用，发现普洱茶和红茶比绿茶的抑制 能力强 5 6 。另一篇报道中，c h e n 等人发现肉桂硫胺( c i n a n s e r i n ) 具有抗s a r s3 c l 。 蛋白酶的作用，肉桂硫胺早在六十年代就被用作抗精神分裂药物，曾经经过安全性 分析 5 7 。c h e n 等人报道了靛红( i s a t i n ) 衍生物具有抑制