（果树学专业论文）山东主栽果树AFLP指纹图谱的构建.pdf

中文摘要 本研究选用苹果( m a l u s p u m i l am i l l ) 、梨( _ 尸妒u s l ) 、桃( j pp e r s i c ab a t c h ) 和枣( z i z i p h u s j u j u b em i l l ) 4 种山东主栽果树共5 3 个品种作为试材，应用a l f p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，扩增片段长度多态性) 技术构建了 这4 个树种的d n a 指纹图谱，并应用其d n a 指纹图谱对试材进行了分子水平 鉴定和遗传关系分析。 采取新鲜叶片作为果树基因组d n a 的提取材料，采用改良c t a b 法提取果 树基因组d n a 。其提取液成分为：3 c t a b ，1 4 m o l 几x a c 】， 2 0 m m o l l e d t a ，l o o m m o l l t r i s h c l ( p h 8 0 ) ，2 b 巯基乙醇。粗提后d n a 经酚 氯仿7 异戊醇抽提两次，除去蛋白质，经r n a s e 除去r n a ，最后用氯仿异戊醇除 去多余的r n a s e ，得到了浓度大，基本无降解，蛋白质和r n a 去除彻底，纯度高、 质量好的果树基因组d n a 。 通过对内切酶用量、酶切时i 白j 、连接时问、稀释倍数等的研究，建立了适于 果树分析的a f l p 银染技术体系。在5 0 儿酶切连接体系中，含基因组d n a 2 0 0 5 0 0n g ，n e bb u f i e r 25 l ，b s a 0 2 5 p l ，e c o r l ( 2 0 u g l )0 2 5 旺，m s e ， ( 1 0 1 5 ，7 9 l ) o 5 9 l ，e c o r ，接头( a d a p t e r ) ( 5 p m o l l ) 1 o g l ，? g s e ，接头( a d a p t e r ) ( 5 0 p m o l l a l ) 1 o l a l ，加无菌水d d h j 0 至5 0 p l ，3 7 过夜；酶切连接产物进行预 扩增，预扩产物稀释2 0 倍进行选择性扩增，加入7 9 l 上样缓冲液( l o a d i n g b u f f e r ) ，9 5 变性5r a i n ，立即冰浴；在6 o 变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分 析，银染法检测p c r 产物。 从4 0 对引物组合中筛选出8 对引物组合对5 3 个供试品种进行了扩增，初步 构建了节果、梨、桃和枣4 种果树的a f l p 指纹图谱。通过分析指纹图谱中品种 的特异带，可以将烟富系的6 个品系分成2 组：烟富1 号和2 号为一组，烟富3 ； 至6 号为一组：可以将供试的2 1 个梨品种和7 个枣品种全部区分丌。这体现 出了a f l p 在品种鉴定上的高效率，如继续筛选引物组合，可以区分丌供试所有 品种。 根据构建的d n a 指纹图谱，采用n t s y s 软件计算简单匹配系数( s m ) ， 进行分析，建立了节果和桃2 种果树品种的聚类分析树状图，分析了这2 个树种 的遗传多样性，初步揭示了树种内品种间的亲缘关系，为品种鉴定、种质资源保 存及育种亲本选配，提供了理论依据。 关键词：果树；a f l p ；d n a 指纹图谱；聚类分析：品种鉴定 a b s t r a c t f i f t y t h r e e v a r i e t i e sb e l o n gt of o u rk i n d o ff r u i tt r e e sm a i n l yc u l t i v a t e di n s h a n d o n gi n c l u d i n ga p p l e ( m a l u sp u m i l am i l l ) ，p e a r ( 聊nl ) ，p e a c h ( pp e l s i c a b a t c h ) a n dj u j u b e ( z i z i p h u s j u j u b em i l l ) ，w e r eu s e di nt h i se x p e r i m e n t t h ed n a f i n g e r p r i n t i n go f t h e s ef i f t yt h r e ev a r i e t i e sw e r ee s t a b l i s h e db yu s i n ga f l pt e c h n o l o g y t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h e s ef i f t yt h r e ev a r i e t i e s ，a n dt h eh e r e d i t a r yr e l a t i o n sa n a l y s i s w e r ea l s om a d eb a s e do nt h e i rd n af i n g e r p r i n t i n g t h eg e n o m i cd n ao ft h e s ee x p e r i m e n tm a t e r i a l sw e r ee x t r a c t e db ym o d i f i e d c t a bm e t h o d t h ec o m p o n e n t so fm o d i f i e di s o l a t i o nb u f f e ra r e ：3 c t a b 1 4 m o l ln a c l ，2 0 m m o l le d t a ，1 0 0 m m o l lt r is h c i ( p h 8 0 ) ，2 p m e r c a p t o e t h a n a l t h eg e n o m i cd n aw a sp u r i f i e db yp h e n o l c h l o r o f o r m i s o a m y la l c o h o l ( t w i c e ) ，a n d t h er n ai se l i m i n a t e df r o mt h es o l u t i o nw i t hr n a s e f i n a l l yt h eg e n o m i cd n aw a s p u r i f i e db yc h l o r o f o r m i s o a m y la l c o h o l ( o n c e ) t h ee x t r a c t e dg e n o m i cd n a o ff r u i t t r e e sw a ss u i t a b l ef o ra f l pa n a l y s i s a f t e rs y s t e m a t i c a l l ys t u d y i n go nt h em a i nf a c t o r si n c l u d i n gq u a n t i t i e so fe n z y m e r e a c t i o nt i m e ，l i n k a g et i m ea n ds oo n ，a na f l ps i l v e r s t a i n i n ga n a l 3 7 s i ss y s t e mf o r f r u i tt r e e sg e n o m i cd n aw a se s t a b l i s h e d ：t h ep u r i f i e df r u i tg e n o m i cd n a2 0 0 - 5 0 0 n g n e bb u f f e r 25 p l ，b s ao 2 5 9 l ，e c o r i ( 2 0 u g l ) 2 5 i _ t l ，m s ei ( 1 0 u u l ) o 5 p k e c o r ，a d a p t e r ( 5 p m o l g l ) 1 o l a l ，m s ei a d a p t e r ( 5 0 p m o l g l ) 1 o l ，a n d a d d e d d d h 2 0t o5 0 9 l ，a n di n c u b a t e da t3 7 。co v e r n i g h t t h el i n k e dp r o d u c t sw e r eu s e da s f o rp r e a n l p l i f i c a t i o n t h ep r e a m p l i f i e dp r o d u c t sw sd i l u t e d2 0t i m e s 、“t hd d h 2 0 a n du s e da sf o rs e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n a tt h ee n do ft h es e l e c t i v ea m p l i f i c a t i o n ，t h e f r u i tt r e e ss a m p l e sw e r ed e n a t u r e db y7 9 ll o a d i n gb u f f e ra n dh e a t e du p9 5 f o r5 m i n ，t h e nc o o l e do ni c ei m m e d i a t e l y t h ep c rr e a c t i o np r o d u c t sw e r ea n a l y z e do n 6 0 d e n a t u r a la c r y l a m i d e b i s a c r y l i m a d eg e l sb ys i l v e rs t a i n i n g e i g h tp a i r so f p r i m e r sw e r es e l e c t e da m o n gf o r t yp a i r st oa m p l i f yf o r5 3v a r i e t i e s a n dp r e l i m i n a r i l ye s t a b l i s ha f l pf i n g e r p r i n t i n go ff o u rk i n d so ff r u i tt r e e s ( a p p l e p e a r ，p e a c ha n dj u j u b e ) ，t h r o u g ha n a l y z i n gs p e c i f i cb a n d so fd i f f e r e n t 、7 a r i e t i e s i n f i n g e r p r i n t i n g ，t h ee x p e r i n a e n t a l v a r i e t i e sw a sd i s t i n g u i s he a c ho t h e rb a s i c a l l y e s p e c i a l l y6v a r i e t i e so fy a n f ul i n e sw a sd i v i d e di n t o2g r o u p s ：y a n f uia n dy a n f u1 1 w a sr e g a r d e da so n eg r o u p ，o t h e r sa sa n o t h e rg r o u p ；a l l2 1p e a rv a r i e t i e sa n d7j u j u b e v a r i e t i e sa l lc o u l d b e d i s t i n g u i s h e dc o m p l e t e l y , w h i c hd i s p l a y e d a f l p sh i g h e f f i c i e n c y o nv a r i e t yq u a l i f i c a t i o n ，i fc o n t i n u i n gt os e l e c tp r i m e r st oe s t a b l i s h f i n g e r p r i n t i n g ，a l le x p e r i m e n t a lv a r i e t i e sc a r lb ed i s t i n g u i s h e d a c c o r d i n gt oe s t a b l i s h e dd n af i n g e r p r i n t i n g ，n t s y ss o f t w a r ew a su s e dt o c a t c u l a t es mf o ra a a l y s i s c u s t e ra n a l y s i st r e ep l o to ft w ok i n d so ff r u i tt r e e ( a p p l e a n dp e a c h ) w a ss e tu p t h eh e r e d i t a r yv a r i e t yo ft h r e ek i n do ff r u i tt r e e sw a sa n a l y z e d ， t h eh e r e d i t a r yr e l a t i o na m o n gv a r i e t i e si no n ek i n do ff r u i tt r e e sw a sp r e l i m i n a r i l y a n n o u n c e d t h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nw a so f f e r e df o rv a r i e t yi d e n t i f i c a t i o n ，s e e d r e s o u r c es a v i n ga n ds e l e c t i o no fb r e e d i n gp a r e n t s k e y ，o r d s ：f r u i tt r e e s ；d n af i n g e r p r i n t i n g ；a f l p ；c l u s t e ra n a l y s i s ；v a r i e t y q u a l i f i c a t i o n 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他入已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名：鞠海瞒 签字日期：2 砟6 月署日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名：酌馋崩 签字日期：2 口够年i 月留e l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：曲寿荡纪崔研红所 通讯地址：山东奢青鸟币掌旌重 导师签字 签字日期汶誓厂年f 月罗日 啦t 。钌2 ，8 6 2 9 3 ” 邮编：2 钐c t a 山尔士栽果树a f l p 指纹| 茎| 谱的构建 第一章文献综述 1 1 国内外研究动态 1 1 1d n a 指纹图谱技术研究进展 分子标记是以生物的大分子，尤其是生物体的遗传物质d n a 的多态性为基 础的遗传标记。分子标记技术的出现大大提高了d n a 指纹图谱的准确性和有效性。 目前，广泛应用的分子标记技术有r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， 限制性片段长度多态性) 、r a p d ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，随机扩增 多念性d n a ) 、s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简单序列重复) 和a f l p ( a m p l i f i e d f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，扩增片段长度多念性) 。 1 1 1 1r f l p r f l p 是一种基于d n a 分子杂交方法【2 i ，出b o s t e i n 等提出作为标记构建遗传图 谱，在8 0 年代中期最早发展起来的分子标记技术。1 9 8 7 年，d o n i sk e l l e r 等构建出 了入的第一张r f l p 图谱。r f l p 的基本原理是：用限制性内切酶把很大的d n a 分 子降解成大量的长短不等的小片段，这些小片段的数目及各个片段的长度反映了限制 性内切酶酶切点在d n a 分子上的分靠。不同来源的d n a 具有不同限制性酶酶切位 点的分布，每一种d n a 限制性酶组合所产生的片段是特异的，从而产生多态性，它 能作为某一d n a 的特有指纹。 目自h ，有2 种方法可进行d n a 的r f l p 的分析：一是不同材料的d n a 用已知 的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的d n a 片段，电泳分离，s o u t h e m 印迹 转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切d n a 进行杂交，放射 自显影。其中，用作r f l p 的探针可以是特殊基因的d n a 克隆、c d n a 克隆、随机 的基因组d n a 克隆和合成的低聚核苷酸克隆。二是对那些分子量较小的d n a ( 如线 粒体d n a 、核糖体d n a 等) ，可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性 酶切d n a 片段分离吼 r f l p 是共显性标记，不受杂交组合方式的影m 可区分纯合体和杂台体，能可 靠地进行数量性状基因的作阁和定位。其标记数量较大，且非常稳定，实验结果可靠 性强。但r f l p 技术操作复杂、成本高、耗时长，通常还需要用同位素进行标记，这 山尔主救果树a f l p 指纹幽谱的构建 些部限制了r f l p 技术的推广。 1 l 1 2r a p d r a p d 是基于p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 技术的d n a 扩增方法，它是由 w i l l i a m s t 4 1 等和w e l s h 5 】等两个研究小组同时发现的一种分子标记。r a p d 能够进行多 态性检测的原理是：r a p d 所用的一系列引物的d n a 序列各不相同，但对于任一特 定的引物，它同基因组d n a 序列有其特定的结合位点。如果基因组在这些区域d n a 发生片段的插入、缺失或碱基突变就可以导致这些特定结合位点分布发生相应的变 化，而使p c r 产物增加、减少或发生分子量的改变。通过对p c r 产物的检测即可检 测出基因组d n a 在这些区域的多态性。由于进行r a p d 分析是可用引物数目很多， 虽然对每一个引物而言检测d n a 多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物就可 以便检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，融”d 从理论上将可以对整个基因组进行 多态性检测f e 。 r a p d 分析的方法是：以样本d n a 为模板，以个人工合成的随机寡核苷酸序 列( 通常1 0 b p ) 为引物，通过p c r 扩增反应、电泳分离，然后检测【3 】。一般说某一 引物在真核基因组中可能有很多结合位点，但只有2 0 0 2 0 0 0 b p 之内存在反向平行的 与陔引物互补的双链d n a ，爿能将合成的新链作下一次合成的模板，经3 5 4 0 个循 环，即可得到大量的d n a 片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、e b 染色，紫外灯下 显示兄p d 带纹。 r a p d 是一种显性的遗传标记，具有样品用量少( 通常1 5 - - 2 5 n g ) 、灵敏度高、 特异性强和检测容易的特点7 1 ，并且可以对没有进行任何分子生物学研究的物种进行 分析，具有简便迅速、高效、成本低的优点。它是迄今为止发展最快、应用最广的一 种d n a 指纹分析技术。但r a p d 技术也有自身的局限性，主要表现在三方面：一是 r a p d 为显性分子标记，无法在f 2 代中区分纯合体和杂台体的基因型：二是重复性 低：二是反应条件灵敏易受外界条件影响。 1 。1 。1 3s s r 在真核生物基因组中，散在分布着由卜4 个碱基对组成的简单重复序列，即 s s r ，它又成为微卫星d 州a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) 。s s r 序列的侧翼具有保守的d n a 序列，出于重复基数的数目变化大，因此s s r 显示出较强的多念性。人们把以s s r 山东主栽果树a f l p 指纹图谱的构建 技术建立的遗传连锁图成为继r f l p 作图后的第二代遗传连锁图。其基本原理足：每 一个位点的基因都由相应的产物，这部分基因被称为编码基因或结构基因，另一部分 基因由或长或短的碱基序列以不同的重复数目组成，分夼于整个基因组中【8 l 。这些重 复序列不含有蛋白质合成的遗传信息，不能转录和翻译。因此这些序列在生物进化过 程中通常没有被选择，即使在同一物种内非亲缘关系个体间基因序列功；有巨大差异。 同时由于其重复性，可产生大量的可描述的有差异的d n a 位点( 基本单位或核心序 列的重复数不同) ，可以帮助从d n a 分子水平上认识品种及个体阳j 的遗传差异。 s s r 的分析方法是：提取所要研究的目的物种的基因组d n a 把基因组d n a 用r e 切成均匀的小片段进行凝胶电泳，回收大小为3 0 0 - - 5 0 0 b p 的片段。把回收片 段克隆放大，然后用标记探针杂交，筛选出含重复序列的克隆并对其测序证实重复的 存在。对重复序列p c r 扩增( 用片段两端区域设计的引物) 然后对少量样本进行预 试验，挑选出重复性好、具有多念性的微卫星位点。 由于重复序列的长度变化大，分布广泛，s s r 是检测多念性的一种有效方法，s s r 技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点，等位基因与基因型检测方法简便， 微卫星p c r 扩增所需样本量极少，随着高效精确的基因分型自动化技术的发展，微 卫星基因型检测将会更加快捷方便。微卫星标记遵循孟德尔遗传法则，呈共显性遗传， 因此能很好地区分纯合子与杂合子。微卫星引物具有通用性，随着些物种已克隆微 卫星数目的增加，今后可望无须在另一些物种中重新克隆微卫星，这样将会节省大量 的人力物力【9 】。s s r 是一种中性标记，在多数情况下，微卫星标记没有任何表型效应， 因而不存在对样本的有害或次缴效应。目静，s s r 技术j 下在被广泛应用。 1 1 1 4a f l p a f l p 技术是p c r 与酶切相结合的方法，是目静广泛应用的指纹技术之一。由 z a b e a u 等i 】o j l 9 9 2 年创立，于1 9 9 3 年获欧洲专利局专利，专利权属荷兰k e y g e n e 公司。 其基本原理是：通过p c r 选择性地扩增整个基因组d n a 的内切酶片段，在高分辨率 的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，产生一组特异的d n a 限制性片段的指纹图。 a f l p 技术包括三个步骤：一是用两个切割频率不同的限制性内切酶消化基因组 d n a 之后与含相同内切酶位点的寡核苷酸“接头”( a d a p t o r ) 连接，通过热变性对内 切酶进行灭活处理，然后在t 4 连接酶作用下进行接头连接反应：二是限制性片段的 选择性扩增，根据接头设计引物，其3 端一般带有1 3 个选择性碱基，利用严格的 山东士就果树a f l p 指纹幽谮的构建 p c r 条件对酶切片段进行选择性地扩增；三是扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分栌， 然后根据引物的标记物质进行相应的产物检测。 a f l p 实际上是将r f l p 和p c r 相结合的一种技术，检测的是分布于某种生物全 基因组上的d n a 片段，扩增的带纹多( 5 0 1 0 0 条) 。a f l p 的大多数扩增片段与基 因组的单一位置相对应，试验重复性高m 】，该标记十分适合d n a 指纹图谱的构建， 因此本试验采用a f l p 技术。 表1 儿种常见d n a 指纹酗谱技术的比较 t a b l e1c o m p a r s i o no f d n a f i n g e r p r i n t i n gt e c h n i q u e s 1 1 2 d n a 指纹图谱技术在果树研究上的应用 优良品种是果树生产的基础，品种混杂和纯度降低会明显降低作物的品质。指纹 图潜是鉴别品种、品系的有力工具。它具有迅速、准确等优点。品种的i f 式性和纯度 鉴定，说到底是鉴定品种的基因型。分子标记技术同臻完善，为果树品种的真实性和 纯度鉴定提供了准确可靠的方法。d n a 指纹图谱在果树品种鉴定上有许多优点：( 1 ) 构建指纹图谱的基因组d n a 分子标记数量极多，遍及整个基因组，这是其它图谱所 无法比拟的；( 2 ) 直接以d n a 的形式表现，无植物器官、组织及发育阶段特异性， 各器官和生长发育阶段均可鉴定；( 3 ) 指纹图谱不受热和环境因素影响；( 4 ) 完全遵 ，r 简单的孟德尔遗传方式，并具有体细胞稳定性i l 。目i i ，d n a 指纹图谱技术已广 泛应用于节果、梨、桃、柑橘、香蕉、荔枝等多种果树。 4 山尔土裁果树a f l p 指纹1 兰| 谱的构建 1 1 2 1 苹果 节果作为一种主栽果树，栽培面积大，分布广，因此d n a 指纹图谱在节果方面 应用的报道较多。在国内，祝军 1 4 - 1 7 1 曾经应用a f l p 指纹技术分别构建了节果砧木、 品种、品系的d n a 指纹图谱，并利用建立的d n a 指纹图谱区分了2 5 个节果品种， 进而分析了苹果主栽品种问的亲缘关系，绘制了其亲缘关系树状图。祝军【1 8 1 等利用 r a p d 技术以o p j l 0 3 为引物，区分了1 0 个苹果品种，是迄今为止利用r a p d 技术 鉴定节果品种效率最高报道。余瑛1 9 】将a f l p 技术应用于苹果属植物的分类研究。 宣继萍等i 刈随机使用1 2 个i s s r 引物对7 个节果品种进行分析，利用引物i s 0 2 6 区 别丌富士、红星、新世纪、美国8 号4 个品种，构建了这4 个品种的指纹图谱。同时 利用引物r s 0 6 1 区别开长富2 、长富6 和富士3 个品种。在国外，e r n e s t 川应用a f l p 技术筛选出了一个抗节果黑星病基因标记。s a n s a v i n i 教授领导的研究小组在意大利 国家研究院( c n r ) 的资助下已经开始应用a f l p 技术构建本国果树的d n a 指纹图 谱库。h a l 。a d a 等1 2 2 l 用r a p d 和r f l p 技术鉴定t s u g a r n 的父本为红玉，三倍体的乔 纳会和陆奥的亲本为二倍体。d u n e m m mf 等1 2 3 】通过r a p d 分析，为栽培节果( m d o m e s t i c a ) 起源于普通芊果( m p u m i l a ) 和森林节果( m s y l v e s t r i s ) 的观点提供了新的依 据。 1 1 2 2 梨 梨是原产于我国的重要果树，其资源丰富。种类品种繁多，需要在遗传上进行分 类鉴定和亲缘关系探讨。同时在梨的杂交育种上也需要对亲本进行检测和对后代进行 有效预测与选择，在选种中还需要对芽变等突变体进行鉴定。廖明安等 2 4 】利用1 1 个 引物对1 5 个梨品种进行r a p d 分析，构建了指纹图谱用u p g m a 法将1 5 个品种分 成两大类：伏茄梨属西洋梨系统，其余l4 个品种均属东方梨系统。在东方梨的1 4 个品种中，白梨系统的品种与砂梨系统的品种聚在一起，表明白梨和沙梨的亲缘关系 较近。曲柏宏f 2 5 】利用r a p d 技术对1 5 个梨品种进行了研究。从1 0 0 个1 0 b p 随机引 物中筛选出1 2 个多态性引物用于正式扩增，共扩增出8 9 条d n a 带，其中多念性d n a 带8 4 条，占9 3 6 ，平均每个引物扩增的d n a 带的数目为8 条，初步建立了这些品种 的指纹图谱。通过指纹图谱分析初步认为延边节果梨应该归属于白梨系统。b a n n o 等 1 1 州用和r a p d 技术鉴定r 本梨“k u r a t s u k i ”的亲本，认为k u r a t s u k i 是s h i n s u i 和h o s u i 的杂交品种。 山尔土栽果树a f l p 指纹剧谱的构建 1 1 2 3 桃 桃是白花受粉果树，其遗传变异程度很低。l u 等人从8 0 个引物中筛选出适合桃 品种r a p d 分析的2 0 个引物，l u 等【2 7 1 人利用6 个引物区分了1 8 个营养系砧木， 其中包括同一母本中选出的2 个品系；c h a p a - r o 等【2 8 】人则利用5 2 2 个引物进行筛选时， 只在1 6 的引物上获得了多念性d n a 带。q u a r t a 等人利用6 个引物准确的区分了 2 9 个桃品种和油桃品种。曹后男等 2 9 1 从1 0 0 个引物中选出适合桃品种的2 3 个引物。 并利用这2 3 个引物，通过r a p d 分析法，对3 4 个供试品种都筛选出了可与其他的 品种相互区分的r a p d 标记，其中7 个供试品种可用1 个r a p d 标记就能与其他的 品种相互区分，其余的2 7 个供试品种可利用2 个或2 个以上的r a p d 标记与其他的 品种相互区分。z h e n g - x i a n gl u 等1 3 0 】用6 个r a p d 引物就区分了1 8 个桃砧木品种， 聚类分析结果与以前系谱分析完全吻合，证明了r a p d 技术的j f 确性。m a r i l y n 等i ”j 用r a p d 技术将美国桃资源圃的1 3 6 个栽培种分为1 2 类，9 0 个美国品种和从欧洲、 拉j 美洲引进的品种分布在3 类中，而其余来自其它洲的2 3 个种广泛分布于另外9 类中，由此说明美国桃种质资源还是很有限的。 1 1 2 4 其他果树 葡萄是栽培最广泛的果树之一。在长期的进化和栽培历史中形成了许多种群和品 种群。现在世界上存在的葡萄品种大约有1 4 0 0 0 个。葡萄品种繁多，且主要采用无性 繁殖，不同地域间品种交流频繁，导致同名异物和同物异名现象十分普遍。高爱农等1 3 2 i 选用9 个引物对巨峰等1 5 个葡萄品种进行了r a p d 分析，共扩增出9 8 条带，其中 有7 0 条带为多念性带，多态性百分率为7 1 4 ，将供试1 5 个葡萄样品明显区分为两 犬类群，5 个小组。o o g o r c e n a 等1 3 3 1 先后对3 1 个栽培葡萄品种进行r a p d 分析，从中 选出的可重复带型，可f 确区分所有品种无性系，同物异名和同名异物的种类办可利用 此方法加以确认。l o u r e i r o 等【3 4 】对1 8 个柬自不同地区的欧洲葡萄a l b a r i n o ，4 个与 a l b a r i n o 有亲缘关系的品种，及两个错误命名的品种，进行d n a 分析，结果证明了这些 异名的栽培葡萄品种都是a b l u b t i o n 。x u 等1 3 5 3 6 1 对9 个葡萄砧木进行了d n a 指纹分 析。王跃进等3 7 1 用r a p d 技术在幼苗期鉴定了圆叶葡萄亚属( m u s c a d i n i a ) 和真葡萄亚 j 禹( e u v i t i s ) 杂交的品种。 桃、梅、李、含4 种核果类果树经自然杂交，种质相互渗透，有关它们的亲缘关 系及归属问题有多种报道。归纳起来有两种观点：通过花粉形念比较认为梅和含应归 6 山尔土栽果树a f l p 指纹幽谱的构建 为同一亚属，桃和李各为一亚属；通过对核果类果树的过氧化物同工酶谱分析认为李、 含、梅的基因型比较相似，应归为同一属或亚属。高志红等【3 8 】采用1 0 个随机引物对 桃、李、梅、含4 种核果类果树的代表品种进行r a p d 扩增，建立了这几个树种的 r a p d 指纹图谱。通过分析指纹图谱证明：梅和含的亲缘关系最近，桃次之，李最远， 从而在基因水平上支持梅和含为同一亚属，李、桃各为一亚属的分类方案。张俊卫等 j 3 9 j 利用r a p d 技术对梅、桃、李、含、樱桃作亲缘关系鉴定，认为李、杏与梅在系 统发育过程中处于基本等同的地位，桃、樱桃与梅的亲缘关系则相隔甚远。 罗f 荣等利用1 个随机引物区分了l o 个柿品种，张潞生也利用a f l p 技术建 立猕猴桃的d n a 指纹图谱，宋婉【4 2 】建立了枣优良品种的d n a 指纹图谱。翁尧富 等利用r a p d 技术建立了板栗的指纹图谱，区分了长刺板红等1 4 3 】8 个浙江省板栗主栽 品种。南京农业大学的房经贵、刘大钧等【“】在以色列希伯来农学院利用a f l p 技术构 建了引自美国的两个芒果( m a n g i f r ti n d i c al ) 育种亲本的指纹图谱。易干军等1 4 5 运 用c t a b 、s d s 法获得了香蕉高纯度、高分子量( h m w ) 基因组d n a ，且获得了清 晰的a f l p 指纹图谱。 据所查资料显示，目前应用d n a 指纹图谱的果树有：节果、梨、桃、枣、荔枝、 葡萄、樱桃、板栗、柿、 甘橘、香蕉、荔枝、龙眼、梅、革莓、油橄榄、越橘、树莓、 番木瓜、欧洲李、含、柠檬、无花果等【4 6 _ 59 1 。 1 2 研究目的与意义 我省是全国果树生产的大省，以其众多的优质主栽果树产品闻名于世。众多 名牌主栽果树既是我省目前农村经济发展的支柱，又是我省参与w t o 果品市场 竞争的优势所在。如果这些宝贵资源意外流失异国他乡，将会给我省的果树生产 造成沉重的打击。为了保护我省这些具有自主产权的名牌主栽果树，扩大出口量， 增加农民收入，促进主栽果树栽培健康持续发展，追切需要进行我省主栽果树“产 地名牌注册登记”保护( 如烟台张裕葡萄酒2 0 0 2 年4 月己获准“产地名牌注册登 记”j 。d n a 指纹图谱f 是进行“产地名牌注册登记”的必需依据。但我省主栽果 树在d n a 指纹图谱领域的研究工作做得很少。本研究旨在应用d n a 指纹图谱技 术，建：茳果树a f l p 指纹图谱分析技术体系，通过筛选a f l p 多念性引物，分别 构建我省主栽果树品种的a f l p 指纹图谱，作为无性繁殖果树的永久档案使用。 并以此作为我省主栽果树“产地品牌注册登记”、鉴定品种、仲裁产权纠纷、繁育 山尔士栽果树a f l p 指纹i 璺| 谱的构建 优良苗木、标记和克隆重要经济性状基因的科学依据，保护我省主栽果树参与 w r o 果品市场竞争，扩大我省主栽果树产品出口，促进我省果树产业的健康发展。 随着d n a 指纹技术的不断发展和完善，应用d n a 指纹图谱技术构建果树指纹图 谱，进而标记、定位、克隆重要经济性状基因，辅助果树育种，已成为本领域的 发展趋势之一。 山尔士栽果树a f l p 指纹l ! f i 谱的构建 第二章苹果、梨、桃和枣a f l p 指纹图谱的构建 苹果、梨、桃和枣作为山东的4 种主栽果树，品种繁多，栽培面积大。对于一些 性状相近的品种，人们往往难以鉴定，因此急需一些新的技术来帮助解决种质资源研 究过程中品种鉴定问题。d n a 指纹图谱( d n a f i n g e r p r i n t i n g ) 是指能够鉴别生物个 体之问差异的d n a 电泳图谱。d n a 电泳图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和 环境稳定性，就像人的指纹一样，因而被称为“d n a 指纹图谱”。作为果树品种的“身 份证”，d n a 指纹图谱具有可靠方便、准确快速、不受环境影响等特点，反映了个体 的内在差异，是品种鉴定的重要依据。本研究旨在应用a f l p 技术，通过筛选多态性 引物分别构建苹果、梨、桃和枣4 种山东主栽果树品种的a f l p 指纹图谱。 2 1 试验材料 试材取自于烟台市良种繁育场和莱阳农学院果树种质资源圃。摘取供试果树品种 的健康新鲜叶片，沈净、擦干，于- 8 4 下保存。供试果树品种如下： ( 1 ) 苹果( m a l u s p u m i l a m i l l ) 品种：烟富1 号、烟富2 号、烟富3 号、烟富4 弓、 烟富5 号、烟富6 号、红王将、嘎拉、新红星和珊夏( 对照) 。 ( 2 ) 梨( j d w l ) 品种：莱阳茌梨、莱阳中香梨、莱阳香茌梨、黄县长把梨、大香 水梨、小香水梨、黄金梨、阳信鸭梨、四棱予梨、新梨七号、美国红巴梨、丰 水梨、新高梨、巴梨、廿世纪梨、雪花梨、茄梨、库尔勒香梨、月光梨、绿宝 石梨和伏梨( 对照) 。 ( 3 ，桃( 产p e r s i c ab a t c h ) 品种：中华寿桃、寒露蜜桃、莱山蜜桃、城阳蜜桃、春 艳桃、晚蟠桃、青研1 号、龙井桃、早蟠桃、曙光桃、早美光桃、早丰王桃、 礼品桃、五月火桃和川中岛桃( 对照) 。 ( 4 ) 枣( z i z i p h u s j u j u b em i l l ) 品种：余丝小枣、会丝4 号枣、沾化冬枣、大白 铃枣、王枣、雪枣和瓜枣( 对照) 。 2 2 试验方法 2 2 1 模板基因组d n a 的制各 2 2 1 - l d n a 提取试剂的配制 9 山尔土栽果树a f l p 指纹幽谱的构建 ( 1 ) c t a b ( 十六烷基三甲基溴化铵) 提取缓冲液：3 c t a b ，2 p v p ，1 4 m o l l n a c l 2 0 m m o l l e d t a ，1 0 0 m m o l l t r i s h c i ( p h 8 0 ) ，2 1 3 - 毓基乙醇。 ( 2 ) 1 m o l l t r i s h c i 贮液：在8 0 0 m l 水中溶解1 2 1 1 9 t r i s 碱，加入浓h c i 调p h 值至所需值。 ( 3 ) o 5 m o l 1e d t a ( 乙二胺四乙醇) 贮液：在7 0 0 m lh 2 0 中溶解1 8 6 1 9 n a 2 e d t a 2 h 2 0 ，磁力搅拌器搅拌，用n a o h 颗粒调p h 值至8 o ，加水至1 升定容，高压灭菌。 ( 4 ) 5m o l l n a c i 贮液：2 9 2g n a c l 加水至1 升定容，高压灭菌。 ( 5 ) 1 0 m l l 乙酸铵贮液：把7 7 0 9 乙酸铵溶解于8 0 0 m l 水中，加水定容至1 l 后过 滤，高压灭菌。 ( 6 ) t e 缓冲液( p h 7 41 0 m m o l l t r i s h c l ；1m m o l l e d t a ) ：若配制1 0 0 m l 需l m l 1m o l l t r i s h c i ( p h 7 4 ) 贮液和0 2m l0 5 m o l he d t a ( p h 8 0 ) 贮液。 ( 7 ) 1 0 m o l l r n a s e a ：将r n a s e a 溶于l o m m o l l i r i s h c i ( p h 7 5 ) 、1 5 m m o l l n a c i 中配成1 0 m g m l 的浓度，于1 0 0 。c 加热1 5 分钟，缓慢冷却至室温，分装成小 份保存于一2 0 。 2 2 1 2 基因组d n a 提取步骤 根据d o y l e 等报道的c t a b 法并参考相关文献进行了改进卧8 4 1 ，具体步骤 如卜： ( 1 ) 取若干5 0 m l 离心管，各加入7 5 m lc t a b 缓冲液在6 0 恒温水浴中预热 3 0 r a i n 。 ( 2 ) 称取2 0 9 叶片放入研钵中迅速加入液氮，并研磨至细粉术状( 研钵可放在冰 箱中预冷) 。 ( 3 ) 将叶片粉术迅速而y - 4 , 心地倒入已预热好的盛有缓冲液的离心管中搅拌均匀， 保温3 0 m i n 。 ( 4 ) 取出离心管放入冰中，迅速冷却至室温，各加入1 m l 饱和酚。轻轻摇动均匀 后，加入6 5 m l 氯仿异戊醇，轻微而彻底地混匀3 0 r a i n 。室温下以4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ( 必要时重复一次) 。 ( 5 ) 将上清液转移至新的离心管中，加适量冷异丙醇，混匀，可见核酸呈絮状沉淀。 ( 6 ) 将絮状沉淀转移到另一离心管中，加入1 0 m l 沈液，放置3 0 m i n 。 1 0 山东士栽果树a