（作物栽培学与耕作学专业论文）蝴蝶兰种质资源鉴定与评价.pdf

m l l l l i i l l l i i i | i l l l l l i i l l l l 0 l i l l l y 17 9 8 6 4 9 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 木人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：彳易谚 同期：年月日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和屯子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在 导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 墨妻蓑喜囊竺霉嚣规定。导师签名：可佐饷 论义作者签名：稚参鹾导师签名：。可钐支刊 r 期：驯年月j h 闩期：列6 年石月夕r 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全义数据库发伟章程 ，同意将本 人的学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章 程”- l i 规定享受耷h 关权益。囤童迨塞握銮丘迸唇：旦坐笙；旦= 生；旦三釜筮塑。 论文作者签名：荔移劳 f 1 期：加肜年多月r 导：夕 同期：砂卜年占闩 俭“ 摘要 蝴蝶兰( p h a l a e n o p s i sa p h r o d i t ah gr e i c h e n b a e h ) 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 蝴 蝶兰属( p h a l a e n o p s i sb l u m e ) 植物。是当今世界上最受欢迎的兰花品种之一。对 现有蝴蝶兰种质资源进行鉴定，了解其遗传多样性和亲缘关系，为今后的育种提 供参考依据。本研究从形态学、s r a p 分子标记两个方面进行亲缘关系分析，结 果如下： 1 参照蝴蝶兰种质资源描述规范对蝴蝶兰属5 8 份资源的4 9 个性状进 行了观测。结果表明，资源间各数量性状均存在较大差异，资源间具有丰富的遗 传多样性。利用观测数据对种质资源进行树状聚类分析，当遗传相似系数为0 6 2 时，可将5 8 份品种分为八大类群。 2 通过实验建立了适合蝴蝶兰基因组的s r a p 反应体系及扩增程序。2 5 此 的反应体系中m 9 2 + 浓度为2 0m m o l l 、t a q 酶1 0u 、d n a 模板4 0n g 、上下游 引物o 8m m o l l 。p c r 扩增程序为：9 4 预变性5m i n ；9 4 变性1m i n ，3 5 复性lm i n ，7 2 1 2 延伸lr a i n ，5 个循环：9 4 变性lm i n ，5 0 复性1m i n ，7 2 延伸1m i n ，3 5 循环：7 2 延伸1 0r a i n ；4 保存产物。 3 从1 0 0 对s r a p 引物中筛选出3 0 对多态引物，3 0 对引物在5 8 份资源 中共扩增出4 6 5 条带，用筛选出的这3 0 对有效引物对5 8 个供试材料进行s r a p 扩增，共获得4 6 5 条d n a 谱带，每条引物的扩增带数在8 , - , 2 0 条之间，平均每 条引物扩增的d n a 条带1 5 5 条，其中多态性d n a 条带有4 0 6 条，多态性百分 率为8 7 3 l ，每个引物检测出的多态性条带平均为1 3 5 3 条。 4 应用u p g m a 法对电泳结果进行聚类分析，当遗传相似系数为0 8 6 时， 可将5 8 份品种分为六大类群，l 号、2 号等骨干亲本与具有亲缘关系的1 6 号、 3 4 号品种聚为同一类，与系谱吻合性较好。 关键词：蝴蝶兰种质资源遗传多样性形态学s r a p 分子标记 a b s t r a c t p h a l a e n o p s i sa p h r o d i t ah g r e i c h e n b a c hi sak i n do fo r c h i d a c e a ep h a l a e n o p s i s b l u m ep l a n tw h i c hi st h em o s tp o p u l a ro r c h i dv a r i e t yi nt h ew o r dn o w a d a y s i nt h i s s t u d y ，w ei d e n t i f i c a t e dt h ec u r r e n tp h a l a e n o p s 西g e r m p l a s m ，f i n do u tt h e i rg e n e t i c d i v e r s i t ya n dr e l a t i o n s h i p ，a n dp r o v i d e d r e f e r e n c ef o rt h ef u t u r eb r e e d i n g i nt h i s s t u d y ，t h er e l a t i o n s h i po fp h a l a c n o p s i sg e r m p l a s mr e s o u r c e sw e r ea n a l y z e do nt h e b a s i so fm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n ds r a pm a r k e r 1 1 1 er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 4 9c h a r a c t e r so f5 8p h a l a e n o p s i sr e s o u r c e sw e r eo b s e r v e do rm e a s u r e d a c c o r d i n gt ot h ec r i t e r i ao fm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h e r ew a s b i gd i f f e r e n c ei nq u a n t i t a t i v ec h a r a c t e r sa n dt h eg e n e t i cd i v e r s i t i e so fp h a l a e n o p s i si n t h eg e r m p l a s mr e s o u r c eb a n kw e r ea b o u n d i n g t h ec l u s t e ra n a l y s i sw a se s t a b l i s h e do n t h eb a s eo fo b s e r v e do rm e a s u r e dd a t aw h i c hs h o w e dt h a tw h e nt h eg e n e t i cd i s t a n c e w a s0 6 2 t h e5 8g e r r n p l a s m sw e r ec l a s s i f i e e di n t oe i g h tm a i ng r o u p s 2 a no p t i m i z e ds r a pr e a c t i o ns y s t e mf o rp h a l a e n o p s 西g e n o m ew a s e s t a b l i s h e db yt l l i se x p e r i m e n t 2 5 t t lr e a c t i o ns y s t e mc o n t a i n e d2 0m m o l lm 9 2 + ， 1 0ut a qd n ap o l y m e r a s e ，4 0n gt e m p l a t ed n a ，0 8m m o l lu p s t r e a mp r i m e ra n d d o w n s t r e a mp r i m e r t h ep c rr e a c t i o np r o c e d u r ef o rs r a pa n a l y s i sw a sa st h ef o l l o w , t h et e m p e r a t u r ep r o f i l eu s e df o rp c rw a s9 4 f o r5 m i n f o l l o w e db y5c y c l e so f9 4 1 2 f o rl m i n , 3 5 f o rl m i n , 7 2 f o rl m i n t h e n3 5c y c l e so f9 4 f o r l m i m5 0 f o r l r n i n , 7 2 f o rlr a i n a n dw a st e r m i n a t e dw i t ha7 m i nd n ae x t e n s i o ns t e pa t7 2 3 3 0p a i r so fp o l y m o r p h i cp r i m e rw a ss e l e c t e df r o m10 0p a i r so fs r a pp r i m e r , w h i c hw e r ep o l y m o r p h i ca m o n gt h e5 8p h a l a e n o p s i sr e s o u r c e sg e r m p l a s m s ，4 6 5 p o l y m o r p h i s mb a n d sw e r eo b t a i n e d ，t h ep r i m e rp a i r sa m p l i f i e d8t o2 0b a n d sa n dw a s l5 5b a n d sp e rp r i m e rp a i r so na v e r a g e 4 0 6p o l y m o r p h i s mb a n d sw e r eo b t a i n e d t h e p o l y m o r p h i s mr a t i oo fp r i m e r sw a s8 7 3l 13 5 3 p o l y m o r p h i s mb a n d sw e r e o b t a i n e dp e rp r i m e rp a i r so na v e r a g e 4 t h ec l u s t e rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tw h e nt h eg e n e t i cd i s t a n c ew a s0 8 6 t h e5 8 g e r m p l a s m sw e r ec l a s s i f i c e di n t os i xm a i ng r o u p s n u m b e rl6a n d3 4c u l t i v a r sw h i c h h a dg e n e t i cr e l a t i o n s h i pw i t hn u m b e rla n d2w e r ec l a s s i f i e di n t ot h es a m eg r o u p t h e c l u s t e rr e s u l tw a sc o n s i s t e n t 、i t ht h ep e d i g r e eo ft h e s ev a r i e t i e s k e yw o r d s ：p h a l a e n o p s i s , g c r m p l a s mr e s o u r c e ，g e n e t i cd i v e r s i t y ，m o r p h o l o g i c a l ， s r a pm a r k e r h 目录 摘要。i a b s t r a c t i i 目录i i i 1 前言1 1 1 蝴蝶兰简介1 1 1 1 蝴蝶兰的原生种、主要栽培品种和近缘种。l 1 1 1 1 蝴蝶兰的原生种1 1 1 1 2 主要栽培品种2 1 1 1 3 近缘种3 1 1 2 蝴蝶兰的形态特征3 1 1 3 蝴蝶兰的生态习性一4 1 2 国内外蝴蝶兰研究现状4 1 2 1 蝴蝶兰种质资源的收集与保存4 1 2 2 蝴蝶兰种质资源的研究情况6 1 2 2 1 形态学研究6 1 2 2 2 细胞学研究6 1 2 2 3 分子生物学研究7 1 2 2 4 组织培养的研究8 1 2 2 5 栽培技术及生理研究9 1 2 本研究目的及意义1 0 2 蝴蝶兰种质资源的形态学研究l l 2 1 实验材料1 l 2 2 实验方法1 2 2 2 1 蝴蝶兰种质的形态指标测量1 2 2 2 2 数据统计与分析12 2 3 结果与分析13 2 3 1 数据测量及编码结果13 2 3 2 形态聚类分析2 1 2 3 2 1 阀值的确定2 1 2 3 2 2 聚类结果分析。2 3 3 蝴蝶兰种质资源s r a p 分子标记研究2 6 3 1 实验材料、仪器与药品2 6 3 2 实验方法2 7 3 2 1 溶液配制2 7 i ! i 3 2 1 1d n a 提取2 7 3 2 1 2s 黜谨分子标记2 8 3 2 2 蝴蝶兰d n a 的提取及检测2 8 3 2 2 1 蝴蝶兰d n a 提取2 8 3 2 2 2 蝴蝶兰d n a 样品检测2 9 3 2 2 2 1 琼脂糖电泳检测2 9 3 2 2 2 2 紫外光谱分析检测2 9 3 2 3 蝴蝶兰种质的s r a p 分析3 0 3 2 3 1 引物的设计与合成3 0 3 2 3 2s r a p p c r 反应体系的优化。31 3 2 3 2 1 模板d n a 用量3 1 3 2 3 2 2m g 。2 + 浓度31 3 2 3 2 - 3 引物浓度一3 2 3 2 3 2 4t a qd n a 聚合酶用量3 2 3 2 3 3s r a p p c r 扩增程序3 2 3 2 3 4 多态性引物的筛选3 2 3 2 3 5 聚丙烯酰胺凝胶的制胶过程3 2 3 2 3 6s r a p p c r 扩增和电泳3 3 3 2 _ 3 7p c r 扩增产物的银染检测。3 3 3 2 3 8 数据分析。3 3 3 3 结果与分析3 4 3 3 1 蝴蝶兰d n a 提取3 4 3 3 2s r a p 分子标记最佳反应体系的建立3 4 3 3 2 1d n a 模板浓度对p c r 扩增的影响3 4 3 3 2 2m 9 2 + 浓度对p c r 扩增的影响3 4 3 3 2 3 引物浓度对p c r 扩增的影响3 5 3 3 2 4t a q 酶浓度对p c r 扩增的影响。3 5 3 3 3 引物的筛选3 5 3 3 4 蝴蝶兰种质的聚类分析。3 8 4 结论4 3 5 讨论4 l 参考文献4 5 缩略词及其英汉对照4 9 附图5 0 i v 1 前言 1 1 蝴蝶兰简介 蝴蝶兰( p h a l a e n o p s i sa p h r o d i t ah gr e w h e n b a c h ) 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 蝴蝶兰属( p h a l a e n o p s i sb l u m e ) 植物。主要分布在我国的台湾省，是观赏价值 和经济价值很高的著名盆栽植物。在千姿百态的洋兰大家族中，蝴蝶兰被誉为洋 兰王后，其流行程度仅次于洋兰之王的卡特兰而位居第二。蝴蝶兰的属名 p h a l a e n o p s i s ，是由拉丁文p h a l a ( 蝴蝶) 和o p s i s ( 模样) 两字组成，意指其花 型似蛾蝶，而中文名就以蝴蝶兰为正式命名。蝴蝶兰一般在早春开花，且枝叶繁 茂，花朵硕大，颜色艳丽，形态独特，花期长久，结构精巧、奇特，故深受广大 栽培者的欢迎和喜爱，是目前室内绿化、美化的新型观赏花卉。 1 1 1 蝴蝶兰的原生种、主要栽培品种和近缘种 1 1 1 1 蝴蝶兰的原生种 蝴蝶兰属植物自然分布区只限于赤道南北纬各2 3 度范围内的东南亚及北 澳地区，1 7 4 0 年在菲律宾吕宋岛发现第一个种，1 7 5 0 年在印尼摩鹿加岛也发现 此属植物，当时称为a n g r a c u ma l bm 旬惦，是月亮兰的意思。迄今已发现七 十多个原生种，大多数产于潮湿的亚洲地区，自然分布于阿隆姆、缅甸、印度洋 各岛、南洋群岛、菲律宾以至台湾。台东的武森永一带森林及绿岛所产的蝴蝶兰 最著名。但由于森林砍伐与采集过度，资源明显减少( 李协和，2 0 0 0 ) 。我国约 有6 个原生种，蝴蝶兰( 户p h r o d i t e ) ：滇西蝴蝶兰( p s t o b a r t i a n a ) ；海南蝴蝶 兰( p h a i n a n e n s i s ) ：华西蝴蝶兰( p w i l s o n i i ) ：版纳蝴蝶兰僻m a n n i i ) 和产于 台湾的小兰屿蝴蝶兰( pe q u e s t r i s ) ( 陈心启，2 0 0 3 ) 。原生种通常作为种质资 源而被收集和保存，并陆续从杂交后代中筛选出优良单株作为杂交亲本。兰花育 种选拔标准常随流行趋势而有所改变，不具经济价值者将被遗弃而消失，而依某 固定观念进行育种，最后常面临无法突破的困境，这时，原生种所具有的多样性 特质就可提供更广泛的育种材料。 目前，蝴蝶兰的栽培种大部分是由蝴蝶兰属的原生种杂交而来的。而有些蝴 蝶兰，特别是红花系蝴蝶兰除来自蝴蝶兰属外，还有来自朵丽兰属( d o r i t i s ) 的 血统。朵丽兰与蝴蝶兰杂交，后代称朵丽蝴蝶( d o r i t a e n o p s i s ，简写d t p s ) 。以 下是几种常见的蝴蝶兰品系及其原生种：白底喷点花的特性源自原生种 p s t u a r t i a n a 及p a m b o i n e n s i s 白底喷点系列；黄花的特性多源自原生种 p a m b o i n e n s i s 及p l u e d d e m a n n i a n a 黄底喷点系列；白花红唇源于原生种 p e q u e s t r i s 、p l u e d d e m a n n i a n a 等；香味花主要源自原生种p a m b o i n e n s i s 及 p v i o l a c e a e ：另外，原生种p 1 u e d d e m a n n i a n a 、p s c h i l l e r a n a 、p s t u a r t i a n a 等具有 香味，营养系经连续杂交育种的过程，也会贡献香味特性；血红花以p p u l c h r a 、 p f a s c i a t a 、p v i o l o c e a 、pa m b o i n e n s i s 等四种原生种相互杂交选拔，再加上引入 异属d o r i t i s p u l c h e r r i m a 的红紫色，育成粉红到紫红的朵丽蝶兰属商品红花( 胡 松华，2 0 0 5 ) 。 1 1 1 2 主要栽培品种 红花系的蝴蝶兰，有些是由原生种席氏蝴蝶兰( p h a l s c h i l l e r i a n a ) 衍生而 来的，但目前花形较好、色彩较佳者，多为朵丽蝶兰( d t p s ) 系统的蝴蝶兰。 红花系蝴蝶兰包括粉红花和紫红花等。常见的品种有：d t p s h a p p yv a l e n t i n e ( 华 伦天奴) ( p h a lo t o h i m ex d t p s o d o r i k o ) 由日本培育，p h a l a b e n d r o t ，p h a l l i p p e r o s e ，d t p s t a i t u n gg l e a m ，d t p s s o g os m n h ，d t p s v i o l e tp r i n c e s s 等。 黄花品系的蝴蝶兰，大多数是以原生种p h a lm a n n i i 杂交而来的，由于该 原种为小花种，为了获得大花种的黄花品种，多用大白花原种或杂种与其交配。 第一个杂种黄花品系是p h a lg o l d e nl o u i s ，早期的黄花蝴蝶兰在花形、花色等方 面多不理想，直至美国f i e l d s 兰园培育出第一个纯黄色蝴蝶兰一金帝王p h a l g o l d e ne m p e r o r “s w e e t f c c a o s ( p h a l s n o wd a f f o d i l p h a l m a n b o ) 。其叶片 宽大，浅墨绿色，花纯黄色，直径约1 1 厘米，一梗有花l o 余朵，排列优美、花 质厚实。常见杂种有：p h a lb r o t h e rl a w r e n c e ，p h a l b r o t h e rv i c t o r y ，p h a l b r o t h e r s t a g e 等。 目前大白花蝴蝶兰的品种系大部分源于日本培育的亲本，如砌以m o u n t k a a l a ，其最大花径可达1 4 厘米，花形非常饱满圆整、排列有序，以其作亲本交 配，均有较佳子代出现，培育出著名斑点花杂种p h a l p a i f a n g sq u e e n 。具p h a l d o r i s 血统的p h a l g r a c ep l a t o m i w a 也是一个非常优秀的大白花亲本，培育 出诸如：p h a l m u s a s h i n o ，p h a l y u k i m a i ，p h a l g l a d y sr e a d 等优秀子代，并且仍 2 源源不断地涌现出新的杂种。 斑点蝴蝶兰大部分具有原生种p h a l 1 u e d d e m a n n i a n a 血统。由它培育出的p h a l p a i f a n g sq u e e n 成为斑点红花蝴蝶兰育种的里程碑。其花径8 1 0 厘米，花白底 布粗细不等的红斑，唇瓣鲜红色，质地厚实，被广泛用作亲本培育了大红斑蝴蝶 兰，其子代好花辈出，可谓超级亲本。 线条花有白底线条花、红底线条花及黄底线条花等多种。白底线条花的著名 亲本有：me l l af r e e d 、p a l f r e e d sd a n s e u s e 、尸口正f r e e d ss h e n k 、等，其杂交 当代和子代都有不错的表现，代表了线条花蝴蝶兰育种的主流。 多花蝴蝶兰是指植株成熟后花梗易分枝、花小且花朵的一类蝴蝶兰，其花径 最大为7 5 厘米，株型和花朵排列紧凑。常见的原生种有p a l e q u e s t r i s 、p h a l l i n d e n i i 、p 砌f 1 0 b b i i 、p h a l s c h i l l e r h 2 n a 和p h a l s t u a t i a n a 等。目前培育的多花蝴 蝶兰绝大部分具有p a l e q u e s t r i s 的血统，只有0 1 的多花蝴蝶兰例外( 朱根发， 2 0 0 5 ) 。 1 1 1 3 近缘种 与蝴蝶兰的近缘属不多，它们在植株形态和花形上十分相似，惟不同的只是 某些微小的差别，如花粉块数目和唇瓣的外形等。这类被兰花分类学家排斥于蝴 蝶兰属之外而另立一属。它们能与蝴蝶兰相互杂交，并由此产生了一些异属杂交 的品种，如五唇蝴蝶兰属( d o r i t a e n o p s i s ) 就是蝴蝶兰与近缘属的五唇兰属 ( d o r i t i s ) 的杂交属。 由于大部分蝴蝶兰近缘的种类花朵很小，观赏价值不大，多作为野生兰种质 资源收集，作为分类和生态学科学研究之用。常见的近缘种有五唇兰属( d o r i t i s l i n d l ) ；棒叶蝴蝶兰属( p a r a p h a l a e n o p s i s a dh a w k e s ) = 胼胝兰属( k i n g i d i u mp e h u n t ) ( 朱根发，2 0 0 5 ) 。 1 1 2 蝴蝶兰的形态特征 蝴蝶兰，为单子叶植物纲、兰科蝴蝶兰属植物。叶近2 列，肉质，扁平，较 宽阔，长椭圆形，长2 0 - - 2 5 c m ，宽8 l o c m ，基部收狭，具关节和抱茎的鞘。茎 短，基部肥厚，有气生根，而且生长特别旺盛：根簇生，肉质，圆柱形。花葶从 植株基部发出，直立或下垂；总状花序有时分枝，疏生少数或稍多数花( 陈心启， 2 0 0 3 ) ；多在早春开花，花期长达2 4 个月，每根花茎开花8 1 2 朵，花淡红紫色， 十分鲜艳，香味较淡。花两性，两侧对称，花瓣直径约6c m ，花朵直径可达1 0c m 3 左右。花被片6 片，排成两轮，外轮3 片为萼片，呈花瓣状，离生；内轮三片， 两侧的2 片称花瓣，下部( 或中央) 的1 片特别艳丽，结构相当复杂，称“唇瓣， “唇瓣一分裂成上唇和下唇( 前部与后部) ，上唇上部有脊，基部有“囊”，“囊 内含有密腺：下唇由雄蕊和花柱合生成合蕊柱，花粉粒粘合成花粉块，花粉块基 部有粘盘，着生在脊上部的前端。合蕊柱的结构十分精巧，对昆虫传粉的适应非 常复杂( 董必慧等，2 0 0 2 ) 。 1 1 3 蝴蝶兰的生态习性 蝴蝶兰的原产地为带热和亚热带，气候常年高温多湿，阳光照射猛烈，蝴蝶 兰就附生于离地3 5 米树冠下的树干或树桠上。树冠下的环境湿度极高，可达到 9 0 以上，这是树冠受到太阳照射，水气上升的缘故。蝴蝶兰靠气生根吸收雨露 和空气中的湿气，以满足水分需求；越冬温度不低于1 5 ( 2 。生长适温为2 5 3 0 ( 2 ， 光照不宜太强，遮阴3 0 0 6 5 0 。根部要求通气和排水好( 江新晓，2 0 0 8 ) 。 1 2 国内外蝴蝶兰研究现状 1 2 1 蝴蝶兰种质资源的收集与保存 种质资源是育种工作的物质基础。要加快我国的蝴蝶兰育种速度，必须加强 对种质资源的收集、整理和研究等基础工作。据不完全统计，目前我国收集到的 蝴蝶兰种质资源已超过1 0 0 0 份，但尚未见对收集到的资源进行系统研究的报道 ( 刘芳等，2 0 0 8 ) 。因此，加强对蝴蝶兰资源的整理和研究，对加快蝴蝶兰育种 速度，推动我国蝴蝶兰产业的发展具有重要的意义。近2 0 年来，中国科学院植 物研究所进行了野生花卉资源的调查、引种、驯化、栽培、繁殖、筛选、评估和 种质资源保护工作，其他学者和植物保护者对野生兰花资源进行了调查和收集 ( 杨士辉等，2 0 0 8 ；朱根发，2 0 0 2 ；庄画婷等，2 0 0 8 ：卢思聪等，1 9 9 4 ：杨琪等， 2 0 0 2 ) 。我国对野生兰花资源的保护，采取原境保护和异境保护两类，即建立自 然保护区，进行原境保护( 周介雄、代正福，1 9 9 9 ) ；建立种质资源圃和采取离 体保存、种子保存和利用保存，进行异境保护( 景士西，1 9 9 9 ) 。我国已在广西 乐业县雅长林场建立了全国第一个兰科植物自然保护区，自然保护区是国家或地 方政府用来保护野生生物物种和自然生态系统而划定的一片区域。在深圳市梧桐 山苗圃总场建立了兰科植物种质资源保护中心，收集保存了我国极度濒危和有重 4 要开发价值的兰科植物原生种5 0 0 多种；中国热带农业科学院品种资源研究所、 华南农业大学农学院热带兰研究开发中心和海南尖峰岭热林站植物园也各自收 集和保存海南兰科植物原生种：台湾糖业研究所从1 9 8 8 年以来一直在进行蝴蝶 兰种质资源的收集，并陆续从杂交后代中筛选出优良单株作为杂交亲本，至今已 收集了记录在案的5 0 多个原生种中的4 2 种，并保存了1 8 8 3 个杂交亲本( 陈玉 水，2 0 0 5 ) 。荷兰农科院植物育种繁殖中心( c p r o d l o ) 开发了新型的花卉数 据库管理软件v i s o r 花卉图像信息系统，其中包括花卉品种图谱数据库，可对 资源进行鉴别及登录( 潘会堂等，2 0 0 0 ) 。 兰科植物常用的种质资源的保存方法是利用组织培养离体保存。日本的 h a n a k o 和y a s u n o r i 研究了一套高效快速繁殖技术，对著名濒危野生杓兰属的一 个变种( c y p r i p e d i u mm a c r a n t h 0 5v a r r e b u n e n s e ) 进行异境保护。印度m a r t i n 和 p r a d e e p 以喀拉拉邦的一个濒危兰花( 1 p s e a m a l a b a r i c a ) 为保护原种，建立了一套 简单、廉价、无污染、长期高效的试管苗离体保存方案( s b i m u r a ，2 0 0 4 ：m a r t i n kp ，2 0 0 3 ) 。p a r k 等以蝴蝶兰的种子、茎尖、茎段、根尖、叶和花梗等外植体进 行组织培养，实现离体保存( p a r k ) 。张晓申等( 2 0 0 5 ) ，对红花品种蝴蝶兰杂交 种的种子，进行无菌播种，获得实生苗，在改良的k c 培养基上，原球茎发生率 达9 0 以上，原球茎生长以附加1 0 香蕉汁和0 3 活性炭的改良k c 培养 基，进行离体保存，效果最好。姚丽娟等( 2 0 0 5 ) ，采用蝴蝶兰杂交品种：即红花 系i ( 红色不带条纹和斑点) 、红花系i i ( 红色带条纹) 、红花系( 红色带斑点) 、 白花系( 白花红唇) 和白花系v ( 白底带斑点) ，对其种子进行无菌播种，也 证实了张晓申的试验结果，最佳培养基是改良k c ，添加1 0 椰乳或香蕉汁， 果龄3 - - 4 个月的蒴果播种萌发率达1 0 0 ，能够在短期内获得大量幼小植株， 是离体保存的重要途径。蝴蝶兰高效离体繁殖技术不但可以保持母本的优良特 性，而且变异率低，生产周期短，繁殖系数大，离体保存十分有效( 卜朝阳，2 0 0 5 ) 。 台湾糖业研究所掌握了蝴蝶兰种子的贮存技术，蝴蝶兰果荚的生产主要集中在 6 1 0 月，在生产上要避免播种时问过分集中，于2 0 0 1 年开始，将蝴蝶兰种子在 4 c 条件下贮存6 个月后，种子发芽率没有受到影响。其优点是所需贮存空间小， 实用性强，可以定时、定量提供种子批量生产，有效地解决了实生苗生产时间过 于集中的问题( 陈玉水，2 0 0 5 ) 。 5 1 2 2 蝴蝶兰种质资源的研究情况 1 2 2 1 形态学研究 形态标记指生物特有的肉眼可见的外部特性( 方宣钧，2 0 0 1 ) 。从形态性状 来检测遗传变异是最直接也是最简单易行的方法。形态特征是遗传和环境、结构 基因和调控基因综合作用的结果，其变异有自己的遗传基础。形态特征的变化可 以作为遗传变异的标志，它表现简单直观、快速方便的优点最早受到人们的重视。 遗传力较高、多态性较好的形态标记至今在遗传学及分类上广泛应用。由于表现 型和基因型之间存在着基因表达、调控、个体发育等复杂的中间环节，如何根据 形态上的差异来反映基因型上的差异就成为用形态学方法检测遗传变异的关键 所在。通常利用的形态性状有两类：一类是符合孟德尔遗传规律的单基因性状 ( 质量性状) ，另一类是由多基因决定的数量性状。 长期以来，种质资源的分类、鉴定及育种材料的选择通常是根据形态性状来 进行的。育成品种、杂种的注册登记及杂交种的识别也都依赖于形态特征。但是 形态性状常会受环境因素的影响而发生变化，而且所需周期长，有些情况下形态 变化并不能真实反映遗传变异。因此，必须通过有效的采样方案，运用数学统计 方法，对质量性状和数量性状进行研究，揭示这些性状的遗传规律、变异大小以 及种群的遗传结构。广东省农科院花卉研究所的李娜等人( 2 0 0 9 ) 以主成分分析 确定的1 0 个主成分为指标，采用离差平方和的方法对3 9 份中小花型蝴蝶兰品 种资源品种进行系统聚类分析，在离差平方和为0 0 7 水平上，3 9 份中小花型蝴 蝶兰品可划分为4 大品种群，说明在供分析的中小花型蝴蝶兰品种中同样存在 遗传多样性的变异。 1 2 2 2 细胞学研究 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性细胞学特征，包括染色体形态、数目、 结构等方面的改变。染色体多样性主要包括染色体数目变异和染色体结构变异两 方面，主要表现在染色体数目、核型( 随体、着丝点位置等) 和带型( c 带、n 带、g 带等) 方面( 罗林广，1 9 9 7 ) 。 蝴蝶兰属的细胞学研究大多以原生种做为研究对象，有报道该属染色体数为 2 n = 2 x = 3 8 ( s h i n d o & k a m e m o t o ，1 9 6 3 ；s a g a w a & s h o j i ，1 9 6 8 ) ，k a o 等( 2 0 0 1 ) 报道了5 个种的典型核型和9 个种的染色体数，也均为2 n = 2 x = 3 8 。有研究表 6 明蝴蝶兰的栽培品种主要为多倍体。刘芳( 2 0 0 8 ) 对8 5 份蝴蝶兰根尖染色体的 鉴定结果表明，3 5 为二倍体，1 0 6 为三倍体；8 5 9 为四倍体。由于蝴蝶兰 属与多个近缘属如五唇兰属( d o r i t o 和朵丽蝶兰属( d o r i t a e n o p s i s ) 之间都有较 好的杂交亲和性，多数杂种之间还能杂交繁育，种内、种间异花授粉和长期的无 性繁殖造成了现有品种( 系) 复杂的遗传背景。 蝴蝶兰的多倍体品种主要是通过不同倍性蝴蝶兰杂交育成的，研究蝴蝶兰杂 交后代的倍性变化规律，弄清不同倍性杂交后代形成的原因，对预测杂交后代的 倍性分离、有效开展蝴蝶兰染色体工程育种具有十分重要的意义。对不同倍性观 赏植物杂交后代的倍性分离及其原因已有一些研究报道( k r o o n & v a n e u k ， 19 7 7 ；n e g r i & v e r o n e s i ，1 9 8 9 ：c r e sp e l & g u d i n ，2 0 0 3 ；b a r b a o g o n z a l e ze ta l ， 2 0 0 4 ，2 0 0 6 ：向仕华等，2 0 0 7 ：z h o ue ta l ，2 0 0 8 ) 。吕复兵( 2 0 0 5 ) 对兰属种间 杂交后代的倍性进行了鉴定，结果表明不同倍性杂交组合后代的倍性发生分离。 庄东红等( 2 0 0 7 ) 采用酶解去壁法，对蝴蝶兰属3 8 个品种( 系) 进行了染色体 观察计数和形态分析。结果表明，供试蝴蝶兰的5 个品种中有3 个四倍体( 2 n = 4 x = 7 6 ) ，2 个三倍体( 2 n = 3 x = 5 7 ) ；2 0 个外引品系中有1 4 个四倍体，1 个三倍 体和5 个非整倍体；1 3 个自育品系包括1 0 个四倍体和3 个非整倍体。不同品种 ( 系) 的染色体长度和形态相差较大，存在核型多样性：有2 1 个品种( 系) 的染 色体组全部由小染色体( 长度2 5i x r n 左右) 组成，1 7 个品种或品系除了含小染 色体外还含有大染色体( 长度为5 - 9 5i x m ) ，染色体大小组成与花色有一定相关 性。周建金等( 2 0 0 9 ) 对不同倍性蝴蝶兰小孢子母细胞减数分裂及其杂交后代的 根尖染色体数进行了检测。结果表明，除三倍体和三倍体杂交未能产生杂交后代 外，不同倍性蝴蝶兰杂交后代的倍性均出现分离。 1 2 2 3 分子生物学研究 种质资源遗传多样性的评价是种质资源研究的重要内容之一。遗传多样性对 植物遗传育种研究具有重要意义。通过遗传多样性检测，可以对植物品种遗传变 异的大小和遗传结构进行分析，进而评价种质资源的遗传潜力。目前，蝴蝶兰种 质资源数量很多，遗传多样性丰富，利用分子标记技术分析种质资源在d n a 水 平上的多态性，可以了解各资源在遗传上的同源程度，为育种工作中亲本的选择 提供参考。常见的d n a 分子标记有：限制性片段长度多态性( 1 强l p ) ，随机扩 增多态性d n a ( r a p d ) ，扩增片段长度多态性( a f l p ) ，简单序列重复( s s r ) ， 7 简单序列重复区间扩增多态性( i s s r ) ，相关序列扩增多态性( s 凡廿) 等。 g o h 等( 2 0 0 5 ) 利用r a p d 分析了蝴蝶兰属4 6 个种的1 4 9 份材料的遗 传距离和亲缘关系，2 0 个随机引物中筛选出6 个多态性高、重复性好的引物用 于分析，结果共扩增出1 2 3 条多态性带，平均每个引物扩增2 1 条带，而没有 出现非多态性条带，多态性比例达到1 0 0 。c h u a n g 等( 2 0 0 4 ) 利用r a p d 和 i s s r 标记分析了1 1 个台湾当地的蝴蝶兰品种和1 7 个菲律宾蝴蝶兰品种的系 统发育情况。由2 0 0 个r a p d 引物和1 0 0 个i s s r 引物中分别筛选出1 2 个 r a p d 引物和3 个i s s r 引物，结果共获得9 5 个r a p d 标记片段和5 0 个i s s r 标记片段，合并r a p d 和i s s r 标记的数据进行聚类分析所获得的亲缘树状图， 可以把2 8 份材料分为6 组。明凤等( 2 0 0 3 ) 利用r a p d 标记分析1 2 个不同 花色蝴蝶兰品种的遗传多样性，在所选用的4 0 个随机引物中，筛选出重复性好， 条带清楚且多态性丰富的2 5 个引物用于r a p d 分析，共扩增出9