（农业昆虫与害虫防治专业论文）苏云金芽孢杆菌杀虫基因的克隆和杀虫假单胞工程菌的构建.pdf

摘要 由于苏云金杆菌在使用过程中存在的一些不足及害虫对其抗药性的产生，人们逐 渐转向利用生物技术将b t 的杀虫基因转入其它更有优势的微生物中。本研究从本实 验室分离的野生型苏云金芽孢杆菌中克隆有特异杀虫活性的删基因和c ，) ，如臼基 因，并将其转入到植物根际有益微生物中，构建杀虫防病的工程菌。 利用p c r r f 凹方法对本实验室分离的苏云金芽孢杆菌w z 7 和s f w l 2 菌株进行 了基因型鉴定。鉴定结果表明，w z 一7 中含有c w 叫扫和v 杠纠，s 柳1 2 中含有c ，) ，j 肋 基因。 根据v p 鲥和州j 劢的基因序列分别设计引物，利用p c r 方法从本实验室分离 的苏云金芽孢杆菌w z - 7 和s 时1 2 菌株中扩增得到坳鲥一w z 7 全长序列及 c r y i b 口s 斯1 2 片段。将p c r 产物连入t - 载体并测序，得到的v i p 3 a - w z 7 基因序列翻 译为v i p 3 a _ w b s 蛋白一级序列，利用n c b i 在线的b l a s t 软件进行同源性分析。结果 表明，该蛋白与已报道的1 0 余个p 3 a 蛋白同源性达9 9 以上，与其它蛋白无同源 性。同样方法证实c r y l b a s 脚1 2 与c r y l b a 蛋白的同源性达9 9 。 将克隆的v 咖鲥w z 7 基因插入携带t h 5 转座子的p a g 4 0 8 自杀性质粒，并将其 转化到大肠杆菌s 1 7 1 ( 九p ) ，通过接合转移，将咖埘基因整合到假单胞菌染色体上， 根据发光强度，并结合生物测定，挑选出杀虫活性高的p s h v i p 9 接合子，p c r 鉴定表 明v f p 鲥基因已经插入假单胞菌染色体。生物测定结果表明，工程菌p s h v i p 9 对棉铃 虫及甜菜夜蛾有较好的胃毒活性，l c 5 0 分别为1 0 2 1 0 8c e l l s m l 和6 9 5 1 0 7 c e l l s m l 。 室内平板抑菌实验表明，其对黄瓜枯萎病菌和小麦根腐病菌及大肠杆菌和b t 等 有较强的抑菌作用，与出发菌株差别不大。对工程菌生长曲线的测定表明1 8h 左右就 可达到稳定期。对该工程菌同时在灭菌土和自然土中进行了小麦根部定殖试验，结果 表明，在2 0 天左右时能达到3 4 1 0 6 c f u g 土壤。以上结果表明，将v 幔谢基因导 入野生型假单胞菌p h b l 5 8 中，并末使其抑菌、定殖等功能发生改变。将该工程菌不 同培养基条件下培养，结果表明其在b p y 培养基中生长最好。 关键词：营养期杀虫蛋白；杀虫晶体蛋白；工程菌；定殖：抑菌活性 c i 伽i n go f i n s e c t i c i d a jg e n ef m m 肋讹s 踊咖泐睹柚dc o n s f n l c t j o no f 脚p d d 埘。甩口si n s e c t i c i d a ie n g i n e e r e db a c t e r i a a u t h o r ：m a ow e n j i e s u p e r v i s o r ：w a n go i n y i n g m a j o r ：a g r i c u l i u r ei n s e c ta n dp e s tc o n t r o l a b s t r a c t b e c a u s eo ft h ed i s a d v a n t a g e so f 占口c f 删h s 啦“r 打曙f e 船括i nt h ea p p l i c a t i o na n dt h e r e s i s t a i l c eo ft h ei n s e c tp e s t ，p e o p l et o d a yt u mt ot r a n s f e rb tt o x i np r o t e i ng e n ei n t os o m e s a l u t a r ym i c m o 唱a n i s m i no r d e rt oc o n s t r u c ta n t i m i c r o b i a la n di n s e c t i c i d a le n g i n e e r e d b a c t c r i a ，t h en o v e lv 弘纠a n dc p j b ng e n ew e r ec l o n e da n dt r a n s f e r r e di n t on e “如川彻口s s p u s i n g h ep c r r f l pt e c h n j q u e ，l h eg e d o t y p e so fb t s f r a j n ss e p a r a t e d b yi h i sl a bw e r ej d e 删1 e d n er e s u l t ss h o w e dt h ew z 7s t r a i nc o n t a i n e dc 砂朋6a n dv 驴鲥，s f w l 2c o n t a i n e d 叫j 肋 a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c e so fv 咖3 爿a n dc ，y j b 口，t 、v op a i r so fp r i m e rw e r e d e s i g n e d v 妒j 纠g e n ea n dp a r tc 7 口口g e n ew e r ea m p l i f i e df m mt h et w ob 咖h r m g l e n s j s w z 7a n ds f w l2s t r a i n sr e s p e c t i v e l ya n dt h e nc l o n e di n t ot - v e c t o lt h eo b t a i n e d 呦删一w z 7g e n ea n dc f 矿，毖s f w l 2g e n ew e r es e q u e n c e dr e s p e c t i v e i y t h er e s u l t s j n d j c a t e dl h eh o m o l o g yb e t w e e nv i p 3 aw z 7a n dv i p 3 a ( a ) w a s9 9 ；t h eh o m o l o g y b e t w e e nc r y l b a s f w l 2a n dc r y l b aw a s9 9 。 b yi n s e n i n gv 勿3 爿g e n ei n t ot h ev e c t o rp a g 4 0 8 ，w h i c hc a r r i e dt h 5t r a n s p o s o n ， m e d i u mp l a s m i d sc o n t a i n i n gv 本 i ，4g e n ew e r eg o t t e na n dt r a n s f o r m e d ：i n t oec 。“s 1 7 1 u s i n gt h et 1 1 5t r a n s p o s o n ，v 咖捌w e r er e c o m b i n e dt om eg e n o m eo fa e d 伽彻口ss p i n c o m p a n yw i t hb yc o n j u g a t i o n t h ep s h v ip 9s t r a i nw a sg o t t e nb yh a n d - l i g h ta n db i o a s s a y p c ra 彻l y s j sd 锄o n s t r a t e dt b a tv 鲥g e n eh a db e e nj n s e r t e di n t ot h ej 坫e “d d m d 胛5 r a n d o m l y t h el a bb i o a s s a yi n d j c a t e dt h a ti h ei n s e c t i c i d a ia c t i v i t i e s ( i c 5 0 ) o fe n 舀n e e r e d s t r a i nw e r e1 0 2 1 0 8c e l l s m la n d6 9 5 1 0 7 c e l l s n 1 la g a i n s t2 一d a y i n s t a rl a a eo f 胁“c o v g 伊口口硎喀已r a n d 印d 如s f 已旭倒堙h 口t h ee n g i n e e r e ds t r a i ns t i l lr e m a i n e ds t r o n g a n t i f u n g a la c t i v i t ya g a j n s tb 咖。胁r 地s d 加舡h i 口删m ；f h s 口r f “肌d 叫印o 码研a n de c d 纪 t h et e s to fg r o w t hc u i 、，et ot h ee n g i n e e r e ds t r a i ns h o w e dt h a ti t sg r o w t hc a ng e tt os i a b l e t j m ei n1 8 h i tw a st e s l e dt h a ll h ec 0 1 0 n j z e da b i h t yo fl h ee n g i n e e r e db a c t “ao nw h e a t r o o t si ns t e r i l ea n dn a t u r a ls o i lt h er e s u l t si n d i c a t e dt h ee n g i n e e r e db a c t e r i ac a nr e a c h3 4 1 0 6 c f u 鹰i n2 0d a y s t h er e s u l t s a b o v es h o w e dt h a tt h ea 1 1 t i f u n g a l a c t i v i t y a n d c o l o n i z a t i o n o fp h b l 5 8h a v en o tb e e ni n n u e n c e da f t e rv 咖朝w e r et r a n s f e r r e di n t o c u l t i v a t i n gt h ee n g i n e e r c ds l r a i nu i i l i z i n gs e v e r a ld i 仟e r e n tc u l t u r em e d j u m s ，t h er e s u l i s h o w e dt b eb p ym e d j l l n lw a si h eb e s ts u j l a b j ei ot h es t r a i n 】 【e yw o r d s ：v 驴王4 ；c ，y b a ；e n g i n e e r e db a c t e r i a ；c o l o n i z a t i o n ；a n t i l l u n g a la c t i v i l y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导帅指导f 进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丑韭垒些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同一【：作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：毛主奎、 签字r 期：神f 年。6 月j 子日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑a 垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑j 堡垒些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 毛，爻查， 导师签名：学位论文作者签名： 髦，又公， 导师签名： 锄炙 签字日期：夕一f 年d i 月，孑日签字日期：豇n ) f 年0 6 月咫日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 苏云金芽孢朴凶系虫丛的兜隆和杀虫假单胞￥菌的构建 1 引言 生防微生物的应捌是植物病虫害综合治理的重要手段，是保护生态环境、实现农 业可持续发展的有力保证，特别是近年来消费者的安全及环保意识的加强、生产技术 之提升以及各国政府的鼓励，使得生物农药产业得以快速发展。杀虫微生物中研究最 多，用量最大的是苏云金芽孢丰t 菌。苏云会芽孢杆菌从上世纪2 0 年代起就用于害虫 的防治。1 9 3 8 年苏云金杆菌首次在法国登记，1 9 5 7 年美国太平洋酵母公司生产出第 一个商品制剂t h u r i c i d e i “。到现在，苏云金芽孢杆菌已成为应用最广、用量最大 的微生物杀虫农药。 苏云金芽孢杆菌( 口口c i f ，“5 旃“r ! n 譬抬n s 括) 简称b t ，为革兰氏阳性土壤杆菌，可在 芽孢形成过程中产生称为d 一内毒素( d e n d o t o x i n ) 的伴胞晶体蛋白( c r v ) 。这些蛋白 具有很高的杀虫活性，因而又被称为杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) i z o l 。此外在营养生长和芽孢形成阶段产生的杀虫毒素还有溶细胞素c 、咔和v i p ( 1 忆g e t a t i v ei n s e c t i c j d a lp r o t e i n ) 毒素。七川。 b t 的大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，不同亚种甚至同一亚种的不同菌 株晶体蛋白的多肽成分都不同】。1 9 9 3 年，由c r i c k m o r e 负责成立了b i 伴胞晶体蛋白 基因命名委员会，提出b t 的伴_ | j 包晶体蛋白基因主要根据基因序列的同源性来进行归 类，并制定了一个新的命名法规。根据新的分类标准，到2 0 0 3 年已经报道的c w 基因 有4 2 群，2 7 0 种：通常c r y j ，c 厂y 2 ，c r y 9 基因编码蛋白对鳞翅目害虫有杀灭活性c r y j 口， c ，y j ，c ，归，c ，y 7 ，c 砂艿，c 砷j 艿基因编码蛋白肘鞘翅耳害虫具有毒力1 9 1 q “j ；c y “， c y t 2 ，c r y 2 tc 删4 ，c r y l o ，c r y n ，c w i 6 ，c r y l 7 ，c r y l 9 ，c r y 2 4 ，h y 2 5 ，c w 2 7 ，c r y 2 9 ， c 似加，c ，y ，c r y 3 9 ，c r y 4 d 基因对双翅目有活性1 1 2 ，”7 ”j ；c ，y 5 ，c w 6 ，c ，y j 2 ，c 口3 ， c ，y j 4 ，c w 2 j 基因编码蛋白可杀灭线虫【1 6 i 。印t 基因则包括2 个类群，每个类群又包括 数量不等的亚类、亚亚类【1 7 1 8 】，而且基因的群、亚群、类、亚类及数量还在不断增多。 不同c r y 基因编码的蛋白具有不同的杀虫活性。 在芽孢形成前的营养生长阶段产生另一种非d 内毒素的营养杀虫蛋白，即v i p 蛋 白( v e g a t a t i v ei n s e c t i c i d a lp r o t e i n ，v i p ) ，被称之为第二代杀虫蛋白。目前，已发现 了3 种营养杀虫蛋白：从腊状芽孢杆菌( b c e 肥“s ) 培养物中分离出的v i p l 、p 2 和从 苏云金芽孢杆菌( b 曲“，f n 鲁f e n s 8 s ) 培养物中分离出的v i p 3 a 。p 3 a 是一类新型的杀虫 蛋白，主要包括p 3 a ( a ) 、v i p 3 a ( b ) 、v i p 3 a ( c ) v i p s 1 8 4 、p 3 a 。p 3 a ( a ) 营养杀虫蛋白所具有的分子和生物学特性与b l6 一内毒素家族不同。生物测试结果表 明：p 3 a 有广谱鳞翅目杀虫活性，尤其对小地老虎、粘虫和甜菜夜蛾有特效。v i p 的有效作用浓度( 3 0 1 0 0 n 2 ) 与b l 杀虫蛋白类似【。 c r y 朋口、c 叫删6 利c i y j 爿c 三个基因主要来自b t 库斯塔克亚种( s u b s p k u r s t a k i ) ，是 杀虫毒力最高基因种类，其中c r y f 加基因是总体上毒力最高且使用最多的基因i 2 ”，其 作用对象也是农业经济中最重要的一类害虫，如危害蔬菜、棉花、玉米、水稻、烟草 以及森林等的鳞翅目昆虫。目前，大多数用作杀虫剂的b t 菌中均含有这三个基因。在 河北农业人学颂 “学f ( # 业) 论文 转鏖因抗虫植物和转基因工程菌中该基冈也址j 衄川最多的。 此外，苏云会芽孢杆菌制剂具有一些独特的优良特征，包括经几年储存仍保持稳 定、晶体可耐受太阳光的紫外线照射、选择r l 慢、对人畜、天敌、植物都非常安全等， 最重要的特征是在全球近3 0 年的使用过程中苏云金芽孢杆菌制剂仍被证实是安全 的。目前，苏云金芽孢杆菌制剂广泛用于粮食、经济作物与蔬菜、林业以及一些卫生 害虫的防治。但它也有些不足，如这类杀虫剂在环境中的生存期相对较短，需耍多次 的应用来保证效果：杀虫谱偏窄，仅对部分鳞翅目害虫有效；除了要求的c r y 蛋白， 同时还含有更多靶位点的h d 一1 菌株的种类太少；常年使用b t ，害虫可能产生抗药 性。此外，越来越多的迹象表明b t 可能有机会作为人类病原出现，磷脂酶、溶血素 和外毒素被认为是b t 毒性的主要因素。已有报道证明使用b t 杀虫剂的温室工人的粪 便中检测出了b t 【2 2 l 。b t 与一种食物致病菌的近源关系已经被证实。 人们一直在试图克服这些问题。现代生物技术的进一步发展，为这些问题的解决 提供了很好的技术平台，而丰富多样的b t 杀虫基因也为遗传改良b t 、构建杀虫工程菌 及转基因抗虫植物提供了广阔空间。将表达b t 毒素蛋白的基因转入作物成为此领域的 个里程碑 2 3 】，很多基于b t 的转基因作物已经商品化。但目前不考虑这种新技术的成 就，让消费者接受这些违反自然规律的产品以及其对哺乳动物的生物安全性的说法还 有些困难。并且在很多领域，诸如防治苍蝇和蚊子、防治有机农业中的害虫、防治温 室植物害虫等方面，采用这种新技术防治这些害虫有很多问题。另外一种解决b t 产品 这些缺点的途径是苏云金芽孢杆菌遗传改造和将杀虫基因转入到植物有益微生物中 并高效表达。 通过将多个杀虫基因整合到同一b t 菌株中可构建广谱b t 杀虫工程菌| 2 4 西j ，如将 c w j c 基因导入h d 2 1 及类似菌株后，可扩充其对甜菜夜蛾等灰翅夜蛾属昆虫的活性。 开发出的产品或制剂有美国的c u t l a s s 瞄j 和我国的w g 系列和b t 2 t n y 。c ，y 鲥基因也被 导入库斯塔克亚种，扩充其对鞘翅目昆虫的毒力，如美国的f o j l 和s a n 4 1 8 1 2 5 i 以及我 国的8 0 3 2 l ( 3 a ) 和u v 2 1 7 ( 3 a ) 。我国也己研制出将c 删朋c 导入杀鞘翅目b t 菌的广 潜重组杀虫剂l c j 2 1 2 等。通过启动子、终j 卜子的改造、帮助蛋白的表达，能够提高 b t 杀虫活性 2 6 ，2 钟。 巴斯德研究所构建的工程菌以含有c w l 4 c 基因且ok 缺陷的b t 菌作受体，一方面 具有较高杀虫活性，另一方面在芽孢形成的晚期受阻，不能完成芽孢形成过程，但不 影响晶体蛋白基因的表达，从而使得形成的伴胞晶体包裹在细胞内，而不能释放出来， 可制成生物囊制剂。同时由于芽孢不能再萌发，相当于在制剂中无活菌存在，从而提 高对环境的安全性，并有利于保护菌种专利。其缺点在 二晶体蚩白与芽孢对昆虫的协 同杀虫活性无法表现。在进一步构建工程菌时，利用解离载体导入杂合基因c 删c 、 c ，y 1 爿6 ，获得工程菌a g r 0 l 。田嵋j 实验表明其具有高效、广谱和抗紫外线能力【2 8 j 。 将b tc r y 基因移植入植物体内内生菌中，并且可以较高水平表达转入c r v 蛋白，构 建植物杀虫疫苗。例如美国c g i 公司将c w l 爿c 导入可在植物维管束内定殖的木棍状杆 菌f c 肠v 治口c f e r 删f i ) ，构建的c 2 x y l i 锘4 剂可用于防治欧洲玉米螟和稻螟的危害，损失可 减轻2 6 7 2 。张青文等将b t6 皮毒素转入到作物内生菌，如有益植物内生菌( 如 2 f i 金暂他柑卤杀虫基冈的克隆和杀虫假单胞i 程菌的构建 蜡状芽孢丰t 滴) 和u 1 【币优势菌( 如巨大芽孢杆菌) ，可作为杀虫i 程简的受体防治害 虫l2 9 1 。 将c ，y 基圳导入某止匕具有抑菌活性的微生物中构建杀虫防病烈苹 l 性的l ：程菌。 许多荧光似1 j 胞菌对作物病原菌具有抑菌活性( 如对小麦全蚀病菌) ，以及较强的根 部定殖能力m 川】。以这类假单胞菌为受体构建的工程菌【3 2 l ，能表现出防虫抗病活性， 如p 3 0 3 、p t 4 1 0 和p t 4 1 5 阻”】。为了控制危害植物根部的害虫，可利用具有较强根部 定殖能力的假单胞菌或固氮菌为受体，导入c n ，l d 6 基因或c 憎牾基因等。 基因转移的方法策略主要有两类，一类是质粒转移：绝大多数b t 杀虫基因定位 在质粒上，而且大部分定位在可结合转移的大质粒上1 3 5 1 ，通过质粒的结合转移可以实 现杀虫基因的重新组合，从而获得所需的重组杀虫菌，通过这种方法构建的工程菌称 为第二代工程菌，即细胞水平重组菌。但是转入菌株的质粒的稳定性也常让人担心。 另一种方法是将c ，y 基因整合在受体菌株的染色体上，在d n a 水平上重组d n a ，一般 采用同源重组或转座子介导而整合在染色体上【3 6 ，37 ，3 引。通过这种方法构建的重组菌具 有较强的稳定性” 呲”j 。 苏云金芽抱杆菌f b t l 是目前用应最广泛、效果最好的微生物杀虫剂之一。将b t 杀虫蛋白基因导入植物根际、叶面或内生的细菌，如荧光假单胞菌，不仅可以有效克 服天然b t 菌株对紫外线敏感、防效不稳定、田间持效期短以及难以防治根际和蛀茎 害虫等不足，而且还可以兼有防病、固氮或增产等功能，从而降低防治成本，促进它 们在生产实践中更广泛的应用，充分发挥其生念环保效益。 恶臭假单胞菌是土壤、植物根际与叶面的有益微生物优势种群，不少菌株使用安 全，可用于植物病害生物防治，有些菌株还具有重要的环保价值。本研究将首先通过 p c r 方法从本实验室保存的b t 菌株中寻找具有特异杀虫活性的杀虫基因，然后克隆 完整的基因，并以恶臭假单胞菌作为受体，构建具有杀虫和防病作用的工程菌。 3 河北农业火学硕十学位( 毕业) 论文 2 1 供试材料与仪器 2 材料与方法 2 1 1 供试菌株、质粒、培养基及抗生素 2 1 1 1 供试菌株和质粒见表l 。 表1 供试菌株和质粒 1 h b l e lb a c t e r i as 【r a i n sa n dd 1 a s m i d s 小麦根腐病菌 黄瓜枯萎病菌 芹菜斑枯病菌 黄瓜灰霉病菌 茅云会芽孢杆菌 火肠杆菌 口咿d 缸r 恬阳 折f 口n “，h f n ii u m0 研s p o r “m s 印t o r hq p l m 0 ks p e g b o t 7 v l ic l n e r e d b n 删u st h h r 嘴i n s l s e ，c o l l 河北农人植病实验室 北农大植旃实验室 河北农大植瓶实验室 河北农人植病实验窜 术室 术室 2 1 1 2 培养基 菌 4 液体l b ：蛋白胨1 0 9 ，酵母浸粉5 9 ，n a c l l o g ，定容1 0 0 0 ml ，p h 7 2 7 4 ，灭 苏云金芽弛卡f l # l 糸虫基i 的克隆和杀虫假单胞l ：程菌的构建 固体l b ：液体l b 培养基每l l 中加入1 6 9 琼脂，灭菌； 液体n a ：蛋白胨5 9 ，牛肉膏3 9 ，n a c i5 9 ，定容1 0 0 0 l i i l l ，p h 7 o 7 2 ，灭菌： 液体b p y ：蛋白胨l o g ，牛肉膏5 9 ，n a c l5 9 ，酵母浸粉5 9 ，葡萄糖1 9 ，定容 1 0 0 0 m l ，p h 7 0 ，灭菌： 液体牛肉汤：蛋白胨1 0 9 ，牛肉膏3 9 ，n a c l5 9 ，定容1 0 0 0 m l ，定容1 0 0 0 m l ， p h 7 2 7 4 ，灭菌； 液体k b 培养基：蛋白胨5 9 ，酵母浸粉3 9 ，葡萄糖2 5 9 ，定容1 0 0 0 m l ，p h 7 2 ， 灭菌； 液体b m 培养基：( n h 4 ) 2 s 0 41 9 ，k 2 h p 0 4 7 9 ，k h 2 p 0 4 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 1 9 ， 葡萄糖5 9 ，蛋白胨5 9 ，酵母浸粉5 9 ，定容1 0 0 0 m l ，灭菌； 固体p d a 培养基：马铃薯2 0 0 0 9 ，葡萄糖糖2 0 o g ，琼脂粉1 6 9 ，定容至1 0 0 0 m l 灭菌。 2 1 1 - 3 抗生素 氨苄青霉素贮存液( a m p ) ：用无菌d d h 2 0 配成1 0 0 m g m l ，分装，一2 0 保存。 使用时每1 0 0 m l 培养基加入1 0 0 pl ，使用浓度为1 0 0 u m l 。 卡那霉素贮存液( k m ) ：用无菌d d h 2 0 配成5 0 m 咖l ，分装，一2 0 保存。使用 时每1 0 0 m l 培养基加入1 0 0ul ，终浓度为5 0 u m l 。 利福平( r i f ) ：甲醇溶解，保存浓度3 4 m m l ，使用浓度1 5 0 l l m l 2 1 2 试虫 供试昆虫有棉铃虫、甜菜夜蛾，均为本室饲养。 2 1 3 试剂与溶液 ( 1 ) 限制性内切酶均购自t d k a r a 公司；t 4 d n a 连接酶购自p r o m e g a 及1 1 a k a t a 公司；t a q 酶购自西i i n l i n ；高保真酶p r i m e s l a r h s d n a p o l y m e r a s e 购自t a k a r a ； 蛋白酶k 及r n a s e 为s i g m a 产品。 ( 2 ) ec o f l 质粒提取液： 碱裂解溶液i ：5 0 m m 葡萄糖，1 0 0 m me d 7 r a ，2 5 m mt r i s h c l ( p h 8 0 ) ： 碱裂解溶液i i ：0 1 m n a o h ，1 0 s d s ，临用前以1 0 m n a o h 及1 0 s d s 配制； 碱裂解溶液i i i ：6 0 m l 5 mk a c ，1 1 5 m lh a c2 8 5 m ld d h 2 0 ； ( 3 ) t e 缓冲液：t r i s h c l ( p h 8 0 ) ；1 0 m m ；e d l l a ( p h 8 o ) 1 m m ； ( 4 ) 溶菌酶：1 0 m g 溶菌酶溶于1 m l 水，2 0 保存备用； ( 5 ) r n a s e 溶液：1 0 m gr n a s e 溶于l m l 水，沸水浴中加热1 0 分钟，一2 0 冰箱 保存备用； 河北农业人学硕十学1 ( 牛业) 论文 ( 6 ) 1 x t a eb u f f e r ：2 4 2 2t r i s ，5 7 l m l 冰乙酸，1 7 9e d l a ，定容至5 0 0 0 m l ； ( 7 ) d n a 加样缓冲液：o 2 5 溴酚蓝，( ) 2 5 ：甲苯青f f ，4 j 0 ( w v ) 蔗糖： ( 8 ) x - g a l 贮存溶液：用二甲基甲酰胺溶解x g a l ( s i g m a 公司产品) ，配成2 0 m g m l 溶液，分装，一2 0 保存备用； ( 9 ) i p l g 贮存溶液：将8 9i p t g ( s 堙m a 公司产品) 溶于1 0 m l 双蒸水中，过 滤除菌，分装，一2 0 保存备用： ( 1 0 ) 试剂盒及其它：p c r 产物纯化试剂盒购自t a k a r a 公司；小量质粒抽提试 剂盒购自上海生工；胶回收试剂盒购自上海生工；p g e m te a s y 载体系统购自 p r o m e g a 公司： 常用生化试剂均为市售、进口分装，其它化学试剂均为市售商品( 分析纯) 。 2 1 4 主要仪器设备 台式冷冻离心机：c e n t r i f u g e 5 8 1 0 r ，a p p e n d o r f 公司 移液器：芬兰f i n n p i p e t t e ； 紫外分光光度计：上海u n i c ou v - 2 6 0 2 ； 摇床：h z q q 全温振荡器，哈尔滨东联公司； 超低温冰箱：l e 2 a c i ，美国r e v c o 公司； 生化培养箱：广东医疗器械厂，l r h 一1 5 0 r 型； 细胞破碎仪：德国v i b 豫c e l l 公司； 微量离心机：韩国l m sv s 1 0 0 b ： p c r 仪：德国b i o m e t r a 公司。 2 2 研究方法 2 2 1b t 菌株基因型测定 利用宋福平建立的p c r r f l p 鉴定体系【4 3 j 进行鉴定。分别用c 拶j 、c 7 、c 叫2 、 c r y 3 、c h 4 c 印l o 、c r y 5 、c 叫6 、c q 7 、c r y 8 、c 强9 、c r y n 、c r y l 3 i 1 4 、c r y l 6 n 7 、 c q l 8 、c 玲1 9 、c q 2 l 、c r y 2 2 、c w 2 4 | 2 5 、c 2 6 2 8 、c r y 2 7 | 2 9 、c r y 3 0 、c q 3 2 、 c 砂3 4 3 5 、c 4 0 、c 2 ，的通用引物对w z 一7 和s m l 2 两个菌株进行p c r 扩增。 2 2 2 杀虫基因的克隆和鉴定 2 2 2 1 杀虫基因的克隆 6 1 ) 模板制备( b t 质粒提取) ： a 挑取单菌落，接种到1 【) m l 含抗生素的l b 培养基中，3 7 ，2 l o r p m 下剧烈 * 、，：仑芽地什曲杀虫基冈的克隆和杀虫假单胞喈曲的构建 震摇培养过收： b 4 ，8 ( ) ( ) ( ) r p m 离心去上清，用冰冷s t e 洗一遍并离心得菌体； c 将细菌0 c 淀重恳r2 0 0 “l 冰预冷的溶液i 中，剧烈振荡混匀； d 加4 0 m 儿新配制的溶液i i 到菌悬液中，上下颠倒离心管5 次，混匀内容物， 离心管置冰i ： e 加3 0 叫l 冰预冷的碱裂解液i i i ，反复颠倒数次： f 离心，将i 二清转移到另一离心管中，加等体积的酚：氯仿，混合有机相及水 相，离心，转移上层水相于另一离心管中； g 室温下加6 ( ) 毗l 异丙醇从上清中沉淀核酸，剧烈振荡混合，室温放置2 m i n ； h 室温下最人转速离心得核酸沉淀，用7 0 乙醇洗一遍，晾干后用t e 溶解， 立即使用或2 0 保存。 2 ) e c d “质粒提取 a3 7 振荡培养细菌3 ml 离心收集菌体，无菌水洗一次，加入溶液i2 0 0 ”l 悬浮，冰浴1 0 m i n ，加入溶液1 1 4 0 叽l ，迅速颠倒数次混匀，冰浴5 m i n ，加 入溶液i i l 3 0 叽l ，迅速混匀，冰浴1 0 m i n ； b 1 0 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，取上清用等体积异丙醇沉淀，2 0 放置1 0 m i n 以上： c 1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗涤两次，使乙醇挥发干净， 沉淀用5 0 m 儿超纯水溶解； d 在上述d n a 溶液中加入1 叽lr n a s e 酶，3 7 温浴3 0 m i n ，酶解去除r n a ； e 用等体积的酚：氯仿( 1 ：1 ) 抽提两次，温和振荡混匀5 m i n ，氯仿抽提一次， 1 0 0 0 0 r p m 离心，取上清； f 上清液中加入1 1 0 体积3 mn a a c ( 用冰乙酸调至p h 5 2 ) ，用2 倍体积无水乙 醇沉淀，2 0 放置3 0 f n i n 以上： g1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗涤两次，用无水乙醇洗涤 一次，室温干燥1 5 2 0 m i n ，沉淀用超纯水或t e 溶解； h 质粒d n a 在1 琼脂糖凝胶上电泳检测。 根据己发表的c ，y j 居口和唰基因序列，设计两对引物分别用_ 丁扩增c 俘佃矗 和坳翩基因，同时在距5 a 1 起始位点有5 个碱基加入s d 序列。 v i p 3 a s 5 ：5 一c c g g 爿g 洲g c c g c g a t g a a c a a g a a = i = aa 工a c ? i a a a 兀1 a a g c a c 一3 v i p 3 a t 3 ：5 - g c g a t c c c g 汀c t ( - c 丌a 芦( r a g a g a c a = r _ 3 c r y l b a s 5 ：5 一g c g g h g g 爿g t g c a g t r g a c l l a 4 t 4 g g 一3 c r v l b a t 3 ：3 一c a g t g a c t c a 戌r i 姗a t a a a c a c g c c a c 一3 以b t 菌质粒为模板进行p c r ：挑取b t 单菌落接于2 0 m l l b 培养基，2 8 培养过 夜：提取质粒1 3 0 4 5 】，保存于一2 0 备用。 p c r 反应体系如下： 7 河北农业人学硕 学位( 毕业) 论文 r e a c t l o nb u f t e r ( 儿】x )5 o “l d n t p ( 1 0 m m o l l )4 毗u 2 5 m me a c h ) p r i m e r l 1 靴u ( 5 0 p m 0 1 ) p r i m e r 2 1 靴“5 0 p m 0 1 ) t e m p l a i ed n a1 毗l p r i m e s t a r t mh sd n ap o i v m e r a s e0 5 “l d d h 2 03 6 跏l 1 0 t a iv o i u m e5 0 o “l 除p r i m e s t a r 7 mh sd n a p o l v m e r a s e 外，依次加入上述成分，混匀，瞬时离心 加入t a qp o l y m e 阳s e ，冰上操作，混匀，瞬时离心。 反应条件：h o i d1 0 5 ；9 5 ，5 m i n ：9 5 ，l m i n ；5 2 ，1 m i n ；7 2 ，3 m i n 3 0c y c l e s ；7 2 ，8 m i n 。 2 2 2 2 基因测序 对扩增v 毋训和c 叫j 占口产物连接t 载体后交与上海生工测序。 2 2 3 重组工程菌的构建 参照s a m b r o o k 等方法进行【4 4 ，4 5 ，“。工程菌中间质粒的构建策略如图1 所示 p c r 产物 ( 目的片段) 2 2 3 1 感受态细胞的制备 8 陶： 图1 工程菌中间质粒构建流程图 f i g1c 0 n s 【n l c t i o no f e n g i n e e f e db a c t c r i 3 1 ) 挑t g l 单菌落于l b 液体培养基中，3 7 ，2 1 0 r p m 振荡培养过夜 苏云金芽孢朴汹杀虫恭的兜隆和杀虫假单胞i 科曲的构建 2 ) 次日按1 ：1 0 0 体税比接种，3 7 ，2 1 0 r p m 振荡培养约2 5 h ，至0 d 6 0 0 n m 值 为o 3 5 左右； 3 ) 将培养物置冰浴1 0 m i n ，然后1 4 、5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ： 4 ) 除尽上清，每5 0 m l 仞始培养物用3 0 m l 冰预冷的1 0 0 m m o i l c a c l 2 重悬沉淀， 冰浴1 0 m i n ； 5 ) 在4 条件下5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，每5 0 m l 初始培养物用2 m l 冰 预冷的1 0 0 m m o l lc a c l 2 重悬细胞沉淀； 6 ) 每管分装2 0 0 “l ，立即使用或8 0 保存。 2 2 3 2 连接及转化 1 ) p c r 产物经p c r 产物纯化试剂盒纯化后， 体，方法如下： p c r 产物 t a q d n a 聚合酶5 x 反应b u f f e r d a r p t a q 酶 d d h ，o 进行加a 尾反应以便于连入t 载 5 “l 2 “l n l 1 “l 1 “l 7 0 温浴3 0 m i n 。 2 ) 连接反应： t 4d n a 连接酶2 快速连接缓冲液缸l p g e m e a s y 载体( 5 0 n g )1 肛l p c r 产物3 “l ( x “l ) t 4 d n a 连接酶l “l 无菌水补足至1 叽l 混匀，1 6 过夜孵育。 3 ) 转化反应： a 取制备好的感受态细胞，每管加入5 1 吮l 连接产物，轻轻旋转以混匀 内容物，冰中放置3 0 m i n ； b 4 2 热激9 0 s ，立即放回冰浴； c 2 m i n 后加入8 0 陬ll b 液体培养基，3 7 摇床上低于5 0 r p m 转速复苏 4 5 m i n 后涂布于含氨苄青霉素及i p t g 和x g a l 的l b 固体培养基平板上； d 设阴性对照，除小加d n a 外，其余处理相同；倒置平皿，3 7 温箱培 养1 0 1 6 h ，可观察到菌落，阴性对照应无菌落出现。 2 2 3 3 重组质粒d n a 提取 将转化产物涂板后长出的单菌落分别接种于5 m l 含有氨苄青霉素的l b 液体培 9 河北农业人学硕卜学何( 恍世) 论文 养基中，3 7 振荡培养8 h 左右；每个e p p e n d o r f 管q ，肌入1 5 m l 菌液，离心，去尽 上清，质粒d n a 提取使用上海生1 二的小量质粒抽提试剂盒，参照说明书进行操作， 最后片j4 叽l t e 溶解。 2 2 3 4p c r 鉴定 用重组质粒作为模板，用v f p j ：4 的一对引物进行p c r 扩增，反应条件同以b t 为 模板扩增v 妒削基因，以鉴定v 咖捌基因是否连入p g e m te a s y 载体。用s p 6 引物及 v i 删的下游引物对p c r 鉴定己连入目的片段的重组质粒进行p c r 扩增，阻鉴定目 的基因的连接是否丁e 向。 2 2 3 5 双酶切及连接 分别用a p a i 和b s t x i ( t a k a r a 产品) 双酶切重组质粒及p a g 4 0 8 ，酶切方法参照 t a k a r a 说明书。酶切后用胶匣】收试剂盒回收目的片段及载体d n a 。将载体d n a 与目 的d n a 按摩尔数约1 ：2 3 的比例混匀，加入适量的反应缓冲液和t 4 连接酶，于 1 6 连接过夜，次日转化。 2 2 3 6 接合转移 取过夜培养的供体菌ec o f is 1 7 一l 和受体菌p h b l 5 8 ，按1 ：4 的比例混合后用灭 菌的注射器将其混匀，抽吸三次，涂于l b 平板上2 8 接合2 4 h r ，菌体稀释后涂布 于含有k m 、r i f 的l b 培养基平板上，培养2 4 h 后，挑选发较强绿色荧光的接合子。 2 t 2 - 3 7 高毒力接合子的筛选 将选出的接合子重新在l b 平板上划线培养，再转接到l b ( k + 、r i “) 液体培养基 中培养2 4 h ，按1 ：5 的比例将菌液与棉铃虫人工饲料混合后饲喂2 同龄棉铃虫幼虫， 每个处理4 8 头幼虫，置于2 6 生化培养箱中，5 d 后记录死亡情况并称量活虫体重， 根据公式计算死亡率和体重抑制率。 2 2 4 工程菌杀虫活- 生及抑菌活性测定 2 2 4 1 杀虫活性测定 供试菌样品的制备：从平板培养基上挑耿工程菌株单菌落接入装有2 0 m ll b 培 养基的小三角瓶中，于2 1 0 r m i n 、3 0 恒温气浴摇床震荡培养1 2 h ，然后将此活化菌 按1 的接菌量转接入装有加入相应抗生素的2 0 0 m ll b 培养基的三角瓶中，