（分析化学专业论文）流动酶催化化学发光新体系的研究与应用.pdf

ab s 七日 d ab s t r ac t 玩 there v i ewof 伽sthe s i s ， 山.b asl cp n 口 心 婚 le s， c h ar 朗t 晰stics andthe 即 p l i a at l o nsofc h e m l l 也 过 n e “ 笼 n c e 晚 brie ny i n th 记 u 以 刃 . 丁 七 e 且 ow inje ction 哪一 c l) 15悦co 面绍 m 。 茂朋dm o r e pop u l ar。 胡 朋召to its s l m p l ei ns tr 切 m e n tati 叽 hi gh 邵 璐讯 v i ty， 诫de d 州画c 屁 川 g e ， 比 p ro d u cibil ity， s l m p l ic ity 朗 d r a p i d i ty . n ew fi ow 坷“ t l on c h e 而l u n u n e sc e n c em e 比 d ds co upl ed w i th o t h e rt e c h 币 q u e s即 c has 1 朋 1 o bi l i 双 刃 。 皿y m e，兹 川 吐 u n o as s a y 而cro re a c t l o ncen ， 犷 即e w 的le sud 触 ce ass ay 明 限 r e b u 1 1 t fo r thed e t e n n i n a t i o n o f a s c o rbi c 即i d， s e n 从 n cho le 血ro land 玩 口朋。 gl o b u lingb 别 姆 d onl w n 访 o l and hydrog e n per o xi 血c l sy s t e m s 1 、 i s thesis 比。 se h o n 姆 r ad i sh per o 劝 d a s e o l rp) 助dh e m o gl obi n ( h b ) as typic at e 汀 m eof 讲r o x l d 出 犯明 d m 加e t i c per o x l 山 始 e . 仆c 化 se ar c h ， 沁 t i onincl u d e s 公 肚 ees u b s ection as fou 。 ， 八 n g : 1 . ac h e 而】 u m i n e 别 笼 n c e s u p p r e s sion m e th od for 此 d e l 即 面 。 时 i o n ofas c o 比 ic acid in vc切 面 l et b 别 姆 d o n l uj n 访 0 1 . 1 开净书盛 伪一 叨比ic acid syst e m 俪th 运 叻 曲 ilize d 翻 叼 叨 e was d e v e lo 侧 泪 . 丁 五 e lmearr an g e fo : as co rbic 解 id is 4. 。 劝 护 4 .0 、 1 0 月 m o 比 耐 d ete比 o n lim it is l .6 x 1 0- 、0 比j 、 e ， ” 力 p ling 丘 e q u e ncr w as 50， ” n p l比. t b e rela ti v e 幼 ad 山 盯 d d eviati on(n- 10) 152.4 %for 4.0: 1 、。 厂 切 工 朋 加比 icacid . a， 戒 1 5 压 c t o ryr e s u l t co u 1 d beo b ta in e d usin g the n o v e l m e th o d for the d e t e rm i n at i on of a 名 c o r b l c 朗i dinvc 切 lb l d， 2 .h emo gl o b in w a s u s e d as a m 如e t l c per o 石 d 出 姆 恤 thcca t al 州c 比 e m l l 切 m in e s c e n c e re a c t l ono f l 切 m 让 io and h y d ro g e n p eroxi d e t 五 e 址 m o gi o b in at al 邓 edre 朗 t l onwas cou p l ed初ththe 喇 dati onr e a c t i onofc h o l e st e r o l 份 t al y 浏 byc o a ( c b o l e s t e ro l o x y da 那， c o a .) tod e t e m 血e t o talc h 0 1 e st e ro l ( tc ) 阳 d丘 ee c b o l e 成 er o l 伊c) inh 山 m an s e n 刀 刀妙 幻 。 winje c t i o nc h e 而】 侧 m l n e sc e n c . m 川 五 ed. t 五 e ” 刀 p l 吨 份 视 u e n c y was 3 0 此. t 五 e l 划 。 灯 “ 口 g e fo r 五 e c h o l e st erol is 5 . 6 x l o 刁 m o 比一3 . s x l o ， m o 讥 胡 d the d e t e ct i o nl i 而t i s 3 .0 、 1 0 7 moljl. t b c l l n 已 对 n 口 g e rorto 园比 。 l e stero l is l .l x l o 石 m o 比 4 .3 x l o-s m o 比and奴d e te c ti o n l 加 it 七 1 . 5 、 1 0 j xn o 比. 3 .a s e q u e n l i al 坷e cti onrene w able s ur fa ce h e t e r o gen e o u 5 e 瓦 比 切 ce c h e m i l um ines ce nce 叮 口 m u n o as s ay sy st e m wi th n o w . th r o u gh ti o ncolu ll l nwas d e v e l o p e dfo rth ed etermi n at i o no fh 切 口 an 兹 田 m u n o g l o b ul in g o g g) in s e n 妇 n . in u n obili zed 幼t i b 。 勿was p 茂 p ar e d 衍co nj ugatio n o f s h e e p an ti 七 u m anlg g antibody ( the 五 r s t an石 h 刁 y )top ro te in a coa t e d s ep h 出 ” ，4b bea d s . h o r s e r a d l shpe r o 石 d as e ab s t r 朗t 肠 比l ed s h c 印 如t l 七 劝 m 明 igg ant 1 body w a sused as thesecon dant i body. t w o 即石 伙 记 y “ 泊 c t e d 俪thh 切 叮 anlg gant i g e d an d fo n n e d a ， 山 d wic h e d anti 伙 记 y 一 胡6 g en conj u g at ew hi ch inthe flow . thro u gh 代 朗 t i o ncolunull g ginh 川 的 an s e n ” nwas d e 忱 ” t ed别 义 劝 r d 吨 tothe c h e 而1 翻 m l n e s c e n c e s y s t e mofl 切 m l n o i 一 圣 压 p 一 h z 伍 w hi 比15 b as edona c atal yt l c e 伤 因 t ofh r 卫 bo und edinthe co nj ugate. a n e r a m ” u r e m en 仁 the b 汾 山(4 5 一 165 脚) 叭 吧 邝di sc harg ed丘 o mthe co 】 umn ， 助d the co l 切 m o was 二 a d y for the o e x t d et e n 刀 in 川 l o n 动e r n us h l n g 幼thb u ffer. u n d e r the opt油泳d co nditi o ns ， a d e t 。 眺 i on li 面tof o. olm g/l 犯 gwas鱿场 e v e d江 七 el inear d yn别 盯 i c介 山 g eof c al l b r 如on c 切 ， eis inthe o. 053.0m 目 1殆 qt h e m e th o d w a s a p p l i edsuc cess 甸lyto d et er m in e ig g in b u tr . 口 砂s amp le s. k e y w o r ds: 加招 e r a d i shpe r o x l ds 阴担rp) ; hemogl 比i n 任 几 ) ; n o winje c t i o n c h e m l l 坦 五 比 e sc e n ce ; m u 力 。 bili ze d e 守 m e ; 加w . th m u gh北 即 t i o n co l umn ; 彻 e w abl e 刚而c e 让 尤 h 苗 q 此 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的 学位论文是本人在导师指导下进行的 研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了 文中 特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人己 经发表或撰写过的 研究成果， 也不包含为获得 南昌或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同 志对本研究所做的任何 贡献均己 在论文中作了明确的 说明 并表示谢意. 学位论文作者签名( 手写) : 签 字 赚州年 月 日 学位论文版权使用授权书 本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解通遏 人兰. 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 ， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅 和 借 阅 . 本 人 授 权 直星 人 堂可 以 将 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进行检索， 可以 采用影印、 缩印 或扫描等复制手段保存、 汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 。手 写 ): 吴 奏 悔 导师签名 ( 手写):碱、 签 字 日 “ :朔年 ” 沙 签字日期: 年了月 / 了日 学位论文作者毕业后去向 工作单位: 通讯地址， 电话: 邮编 : 第一章综述 第一章 综述 1 . 1引言 发光作为一种生命现象，即发光生物，早在希腊文明时 代已 经被人们发现. 而“ 人工斤的化学发光直到1 8 7 7 年凡 此 血欢 ， 昭 匕观察到洛粉碱在碱性乙醇介质 通氧时可产生绿光。 1 8 88年德国 科学家e 进 团 dtwe i d 已 江 阳 口 叮 首次提出了化学发光 ( 仆。i1 ，in e “ 笼 n c e cl)这个专业术语，自 此化学发光才有了 一个明 确的定义。 化学发光是化学反应所释放的能量激发体系中某种化学物质分子由 基态跃迁至 激发态， 并由电子激发态的最低振动能缀返回基态时所产生的光辐射。 根据化学 发光反 应产生的 光辐射强度或发光总量来确定反 应中 相应组分的分析方法叫化 学发光分析法. 化学发光分析法突出的特点是不需要任何光源， 避免了瑞利散射和拉曼散射 等噪音， 没有空白， 因而光电倍增管在高压下工作时具有比 荧光法更高的信噪比。 这种方法具有灵敏度高、 线性范围宽和仪器简单等优点. 将它与流动注射、 微透 析、 毛细管电泳、 传感器技术和芯片技术等结合可以建立许多高灵敏度的、 微型 化的和高度自 动化的分析方法和器件， 而化学发光成像技术可以提供许多丰富直 观的信息来研究各种体系的特性。 化学发光分析法已 广泛地应用于环境化学、 临床检验、 药物分析和工业分析 等 领 域 11 月 . 近年 来， 化学 发 光 分 析 法的 发 展 呈 现以 下 三 个 主 要 特点: 一 是 化学 发 光新体系研究活跃; 二是化学发光与其他分析技术联用多样: 三是化学发光分析 应 用范 围 广 泛 同 . 化 学 发 光 分 析 法的 应 用 领域 不 断 扩大 ， 合 成 新 的 高 效能 的 发 光 试剂、 开发新的发光体系以 及与其他技术联用仍将是今后发 展的 趋势. 可以 预见， 随着性能更优良的化学发光试剂的开发， 并结合其他技术， 化学发光分析法的应 用范围将会更加广阔。 1 . 1 . 嘴化学发光分析法的原理 化学发光(ch e 面i l lm l n ， c e n c e ) 是指某些化学反应中发出可见光的现象。 其发 光机理 是: 反应体系中的某些物质分子， 如反应物、 中间体 或者荧光物质吸收了 反应释放的能量而由基态跃迁至激发态， 然后再从激发态返回基态， 同时将能量 以 光辐射的形式释放出 来， 产生化学发光， 其过程主要有图 1所示的两种可能: 物质 a和 b 反应， 产生激发态 c*，c*为发光物质直接发出 可以 测量的 光: 物质 a和 b反应，同样产生中间体 c * ，当体系中存在另一种易于接受能量 第一章综述 如抗坏血酸、 肌酸醉、 谷耽甘肤、乳糖、 葡萄 糖等. 巍从 图1 . 4光 泽精的 化学发光反应 过程 f ig l .4s c h e m e o f l u 幼 g e n in c he m il uml n e 别 沁 n c . 代 泊 c t 沁 n 3 . 过氧草酸盐类 草酸盐类化学发光反应大都生成 过氧草酞中间 体， 因 此这类反应亦称过氧草 酞类化学发 光反应。 过氧草酞 类化合物被过氧 化氢氧化时 会产生 化学发光， 这个 氧化反 应所产生的 高能中 间体不具有荧 光性， 因 此它本身不会发光， 而必须经历 一个 把能量 转移至荧光物质并使之激发 到激发态的过 程。 过氧草酸盐类化学发光 分析 应用的 推广还有赖于新的 衍生试剂的开 发。 4 . 洛粉 ( 切p 址 n c ) 洛粉是 文献上记载最早的 化学发光 试剂， 但却迟迟未 得到应用， 直到1979 年m耐n o 等人将它应用于co 的测定后 才得到重视。 此试 剂已 被用于多种金属离 子的测定。 5 . 叮吮醋 叮咙酷类化合 物是一 类很 有前途的非放射 性核酸探针 标记 物， 用作d na 的 发 光探针发光量子产 率高， 稳定性好， 标记物对杂 交反应的动力学和 杂交体的 稳定 性无影响，可以 直 接在碱性介质中 进行化学发 光反应。 6 . 钉 ( 11) 一联毗陡配合物 在 稀 硫 酸 溶 液 中， 钉 毗 吮r u (b ip y ) 3升 与。 环或 脐 反 应 可 生 成 化 学 发 光， 草 酸 亦 有 类 似 反 应 . 但 是r u (b ipy)33+ 在 水 溶 液 中 的 稳 定 性 差 ， 而r u (b 初扩 十 具 有 较 好的 化学 稳定性、 氧化还原性、 激发态性质和发 光特性. 从原理上讲， 获得激发 态r u (b ip y) 3 2+ 有 两 种 方 法: ( 1) 用 还 原电 势 大与0. 84 v 的 氧 化 剂x 氧 化ru脚州3 3 + : (2) 用 氧 化电 势小 与 一 0. 8 6v 的 还 原 剂y 还 原r u (b i py 扩 +. 在 实 验 应 用中 ， 先 用电 化 学 方 法 将r u ( b ipv扩 氧化 成ru(b ipr)3 2+ ， r u (b ip y )， 2+ 与 合适 的 有机 酸 反 应 产生 化学 发 光 。 发 光 体 是 激 发 态 的r u ( b ip y ) ，2+ . 第一章综述 2酶联化学发光分析 酶联化学发光分析是指 将酶促反 应与 化学发光反 应相偶合的一 种化学发光 分 析方法。 其较早见于bosti ckand h e r c ul es关于血清 和尿液中 葡萄糖含量测定的 报道 因 . 酶联化学发光分 析不 仅具有酶促反 应的高效、 专一的 特性， 而且具有化 学 发 光 反 应高 灵 敏 度 的 优 点 。 分 析 过 程 tg 可 采 用 静 态 式， 也 可 采 用 流 动 式: 可 将 酶固定化，也可不固定化。 2 . 1酶概述 酶 是由活 细胞产生的一类具有高度专一性 和催化效率的蛋白 质， 又称为生物 催 化 剂 伪 ioc at al y s t) ， 生 物 体内 几 乎 所 有 的 生 化 反 应 都 是 在 酶 催 化 条 件 下 进 行的 11 0 。 酶以 催 化的 专 一 性 、 特效 性、 良 好 的 催 化 活 性 和 温 和 的 反 应 条 件 在 生 物 体内 的各种 新陈代 谢过程中 起着重要的作用。 而人工 提取的酶在 合适的 条件下能够在 试管中 对其特殊底物起催化作用。 因 此， 用化学方 法对酶促分 析进行研究在理论 和实际 应用上都有 十分重要的意义11 11. 酶作为催化剂普 遍存在于动物、 植物、 微生物中， 目 前已 工 业化生产出多 种 酶制品应用于食品工 业、 医 学领域、 分析领 域、 化工生产以 及废物处理过程。 近 年来研究较多的有: 用淀粉 酶、 脂肪酶、 蛋白 酶等 去处各种有 机物 ( 如碳水化合 物、 蛋白 质、脂肪和 油等) : 利用辣根过氧化物酶， 在有过氧化 氢存在时， 催化 氧化多种有毒的芳香 族化合 物: 利用氰化物酶 和氰化物水合 酶处理氛化物， 等 等。 1 .过氧化物酶 过氧化物酶是一 种从 包括植物 ( 辣根、 芜著、 无花果树汁) ， 动物 ( 甲 状腺 碘 过 氧 化 物 酶) 和 微 生 物( 酵 母 中 的 细 胞 色 素c ) 中 提 取的 氧 化 还 原 酶 11 21 。 它 能 催化珑仇后氧化其他底物 ( 以s h z 表示， 称为氢 供体) 产生水， 反 应式如式1 2 所示。 占 月 玉+ 场 岛 5+ 凡口 ( 1 . 2 ) 第一章综述 图l s过氧化物酶辅基血红 素结 构 f 够1 .s s ubgr o u p of此 讲r o x i d 叹 天然过氧化物酶蛋白 质结 构含有辅基血红素 ( 或 称高 铁原血n 卜 琳) ，即是酶 的 主要活性部位. 辅基结构如图1 . 5 所示.以 辣根过氧 化物酶伽rs er 碱sh p e ro 石 dase ， h r p ) 为 代 表 的 过 氧 化 物 酶 及 模 拟 酶 在 其 结 构、 化 学 性 质 及 应 用 研 究 方 面多 有报道113 1 51. 辣根过氧化物酶是一种含有 铁叶 琳的 血红素蛋白 ， h r 卫 的催化中心为铁 ( n ) 叶琳结构， 结合部位为 对底物有亲和性和包合作用的 氨基酸多 肤中 心.由 于 来源方便、 提纯容易和结构已 知， h r p 经常作为典 型代表用于研究过氧 化物 酶 分 子 的 结 构、 动 力 学 和 热 力 学 性 质 p 刃 。目 前圣 仅 p 更 是 被 应 用 于 有 机 合 成、 生 物 转化、 相关酶检测、 发光检测、 免疫测定、 废水处理、 临床化学、 环境化学和 食品工 业等领域1 2 卜 ” . 2 . 过氧化物模拟酶 过氧 化物模 拟酶主要包括自 然酶和 化学合 成酶。自 然酶有模拟h r 卫催化活 性 的 血 红 蛋 白 124、 肌 红 素、 漆 酶 、 叶 绿 素 、 维 生 素b 、 细 胞 色 素c 及 生 物 小 分 子 氛 化 血 红 素 四 ( he m in ) 或 高 经 氯 化 血 红 素 脚 l(h e m at in ) 等 : 化 学 合 成的 过 氧 化 物 酶 网主 要 包 括 可 溶 性 金 属 叶 琳 化 合 物 1281、 金 属 酞 普 化 合 物 12n、 席 夫 碱 金 属 络 合 物 和 化 学 修 饰 的 过 氧 化 物 模 拟 酶 129 1等 。 血红蛋白( hb) 是 一种寡居蛋白 质，为动 物体内 氧传递的载体蛋白 质， 其分 子 结构的 催化辅基为铁 ( 11 ) 叶琳。 hb 也具 有过 氧化物酶活性。 在体内主 要起 着0 2 和c 仇的转运等作 用， 作为一种氧载体本身又具 有过氧化物酶活性.一 直 以 来人们对hb 的 研究主 要集中 在其结构、 输氧功能、 电子传 递特性等方面， 而 对 其 所 具 有 的 酶 催 化 性 能 研究 不 多。 最 近 蔡 汝 秀 ， li ul3 0-3 2 等 研究 了hb 的 过 氧 化 物 酶活 性， 发现在他们的催 化体系中 ，hb 具有较高的 催化活性。 第一章综述 2 . 2酶的固定化技术 白图 隐 督 吸附法包埋法共价法交联法 图 1 . 6酶的固定化方法示意图 f ig . 1 . 6 sc比m at i c d l 叫 犷 日 mo f e 守 m 翻c l m m o b i l izatio m 酶作为专一、 高效的生物催 化剂具有非常广泛和良 好的 应用前景. 由 于酶的 价格昂 贵， 游离酶难以回 收利用， 将酶进行有效的固定 化一直是酶工程领域的研 究热点。 若将酶固 定于各种载体 上， 可以 很方便地分离和重复利用， 对提高酶的 利用效率， 延长使用时间 具 有重 要意义。 酶的固 定化在生物工 程技术、 医学、 食 品、 环保以 及酶生物 传感器等领域具有重要的作 用田 1 ， 如图1 . 6 所示， 传统的固 定化酶技术主要包括吸附 法、 包埋法、 共价法、 交联等1341。 1 . 吸附法 吸附 法是通过酶分子极 性键、 氢键、 疏水键以 及静电 等作用， 将酶吸附于不 榕性载体 上. 吸附法 具有酶活性中心不易 被破坏和酶高级结构变化少的 优点， 因 而酶活力 损失少， 但是它有酶与 载体相互作用力弱、 易脱 落等缺点， 若能找到适 当的载体， 这是很好的固定 化酶的 方法1341. 2 . 包埋法 包埋法 是指将酶包埋在凝胶 / 聚 合物的 细微格子里。 此法多以 天然或合成的 聚合物凝胶为 载体， 如: 树脂、 藻酸盐、 聚丙烯酞胺、 聚乙 烯醇等。 包埋法一般 不需要与酶蛋白的 氨基酸残基 进行结合反应， 几 乎不改 变酶的 高级结构， 酶活回 收率较高。 但是在包埋时 发生化学 聚合反 应， 酶容易失活， 必须巧妙设 计反 应条 件。 溶 胶 一 凝 胶 (s of 一 ge l) 包 埋 法 是 物 理 包 埋 过 程 ， 凝 胶网 络 是围 绕 酶 逐 渐 形 成 的 ， 对酶的 尺寸无特殊要求; 温和的反 应条 件和凝 胶的 非晶态结构都有利于保持 酶 的结构完整性和表面微观结 构的各向同性; 常用的 基质材料如二氧化硅比有机 聚 合物材料更具有化学和热 稳定 性、良 好的坚固性 和抗磨性。 另外，由 于基质含 有 足够的 水， 生物酶处于水 溶液的 微环境中， 保持了 它的 活性和稳定性， 与在水 溶 液中 有 相 似 的 行 为 13 ， 刁 叼 . 因 此， 此 法 被 广 泛 应 用 于 酶 的 固 定 . 3 ， 共价键合法 共价键合法是酶与载 体以 共价键结合的固 定化方法。 归纳 起来有两类: 一 是 第一章综述 将载体有关基团活化， 然后与酶 有关基团 发生偶联反 应: 另一种是在 载体上接上 一个双功能试剂，然后 将酶 偶联上去。共价 键合法的优点是酶与载体结合牢固， 但是该方 法操作复杂， 反应 条件苛刻， 会引起酶蛋白 高级结构变化， 破坏部分活 性中心，因此往往不能得到比 活力高的固定 化酶。 酶活回 收率一般为30 % 左右， 甚至底物的专一性等酶的性 质也会发生变化。 4 . 交联法 通过借助交联剂在酶分子、 酶分子与载体之间 交联 形成网 络结构而使酶固定 化的方法称为交联法. 常用的 交联剂是 戊二醛， 交联法中 最常 用的固 定化酶载体 是牛血清白 蛋白 田s a)，也 有人用酩蛋白 代替b s a. 2 . 3酶联化学发光分析的应用 酶联化学发光分析可用于 酶活性的测定以 及酶 底物含 量的 测定13 5. 1 . 酶活性的测定 利用偶合反应化学发光分析 法测酶活性的范例 是黄嗦吟 氧化酶活性的测定。 该方法是基于黄嗦吟 氧化酶对次 黄嗦吟氧化生成尿酸反应的 催化作用， 在这一反 应过程伴随 着过氧化氢的 产生. 生成的 过氧化氢利用铁( n ) 催 化的 鲁米诺化学发 光反应加以检测. 酶 联化学 发光分 析还可用于辣根 过氧化物酶， 脂肪氧化物酶，乙 醇脱氢酶， 乳酸脱 氢酶， 异柠檬酸脱氢酶， 丙 酮酸激酶， 肌氨酸酶， 肌氨酸激酶同 工酶， 葡 萄糖 一 6 一 磷 酸盐烯 醇酶等 酶的 活性测定13 ， 确 9 . 2 . 酶底物的 测定 许多重要的化学发 光反 应都能用于测定 过氧化氢。 许多产生过氧 化氢的 酶促 反应都 可以与 这些化学发光 反应相偶合， 进行多 种重要生化物质及其 它物质的化 学发光测定。 基于生成过氧化氢的酶 联化学发光分析已 用于 葡萄搪， 乳糖， 氨基酸， 尿酸， 胆固醉，丙三醇，胆碱，乙 酞胆碱，细胞色素c ， 3 一 经基丁酸， 苹果酸，甲醇， 磷 酸 盐 ， 亚 硫 酸 盐以 及 草 酸 盐 等 物 质 的 分 析 测 定 ， “ 31 . 3化学发光免疫分析 化学发光免疫分析包含两 个部分， 即免疫反 应系统和 化学发 光分析系统【 641 。 化学发 光分析系统是 利用化学发 光物质经催化剂的 催化和 氧化剂的 氧化， 形成一 个激发 态的中间 体，当 这种激发 态中间 体回到稳定的 基态时，同 时发射出 光子， 利用发 光信号 测量仪 器光量子产 率16 习 . 免 疫反 应系统是将 标记 物质直接标记在抗 第一章综述 原或 抗体上， 经过特异 性反 应后， 形成抗原一 抗体复合物。 然后 进行相 应标记 物 的检测方法进行检测。 3 . 1免疫分析概述 免 疫 分 析 法 ( 扮 皿 助。 as s ar)是 利 用 抗原 一 抗 体 反 应 而 建 立 起 来 地 一 种 高 选 择 性 的 分 析 方 法 圆. 免 疫 分 析 根 据 标 记 与 否 可 分为 标 记 免 疫 分 析 法 和 非 标 记 免 疫 分 析 法。 抗原和抗体直接结 合之后， 理化性质有一定变化， 如产生 沉淀， 利用这种性 质 的 变 化 可以 检 测 抗 体 或 抗 原， 即 实 现 非 标 记 免 疫 分 析。 但 是 利 角 此 方 法 难以 进 行痕量检 测. 按标 记物有无放射性将免疫分析方 法分为放射免 疫分析 法和非放射 免疫分析法. 标记免 疫分析法中， 最为成熟的方 法是 放射免疫分析法， 但由 于放 射性物质的毒害， 限 制了 它的 应用。 非放 射免 疫分 析法包括酶联免疫分析 法、 荧 光免疫分析法、 电 化学免疫分析法、 电 化学发光免疫分 析法和化学发光免疫 分析 法等16 刀 . 由 于标记物的引 入， 不可避免 地带来了 结合的抗原一 抗体 与过量的 抗原 或抗 体的 分离问 题， 因而标记 免疫分 析法根据分离与否又分为 均相免疫分析法和非 均 相免疫分析法。 非均相免 疫分析 法是 将标记的抗原和抗原 样品 加入到含有一定 抗 体的固 相中， 发生竞争性反应， 洗去 游离的抗原后对免 疫复 合物进行测定。 均相 法无需 分离， 这种方法操作简单， 但灵 敏度受到限 制。 同时因 为没有经过分离步 骤， 样品中的杂质 对发 光的影响 较大。 而异相法就大大减少了 样品中的 杂质对发 光反 应的 干扰， 提高了灵敏度. 化 学发 光 免 疫 分 析 (c h e m ilumin e sc ence玩 助 unoassay c l ia ) 是 化 学 发 光 与 免 疫分析相结合的产物， 它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择 性. c l ia是用化学发光反应的 试剂 ( 可以 是发光剂或 催化剂等) 标记抗原 或抗体， 标 记 后 的 抗原 和 抗 体 与 待 测 物 经 过 一 系 列 的 免 疫 反 应 和 理 化步 骤 ( 如 离心 分 离， 洗涤等 ) ，最 后以 测定发光强度形式 侧定 待测物的 含量. 化学发光免疫分 析根据标记物的 不同 分为以化学发光试剂为标记物的 化学 发光标记免疫和以 酶为 标记物的化 学发光酶联免疫。 3 ， 2化学发光免疫分析方法的建立 1 . 抗体的 制备 任 何一种c l ia法都需要使用抗体， 所以 在建立c li 人 法时 必须先制得满足方 法中所需的抗 体。 抗体的 制备是 利用动物对外来异己 物质的 排斥效应， 在体液( 血 液) 中产生针对该 异己 物的免疫 球蛋白 i g g ， 即抗体。 提取 这些动物的 体液便可 第一章综述 得到所需的抗体。 抗体制 备时， 只有抗原分 子量较大的化合物( s 0 0 0 d)注射到动物体内 时才 能 诱导动物体内产生抗体。 如果 是小分 子激素， 如雌二醇，分 子量仅二三百( 这 类化合物叫半抗原， h 即t en) ， 它不能直接诱导动物产生抗 体，为了 制得它的 抗 体， 需将它偶联于大分子 载体( 如牛 血清白 蛋白， bs a)上制 得抗原， 再将其用于 免疫动物， 制备抗体。 一些载 体激素 和药物的抗体都需 经这一方法制备哪 1 . 抗体 的 纯化方 法有: 中性盐 沉淀法， 亲和层析法等。 制备的 抗体一般需进 行亲和力和特 异性的鉴定。 近 来 ， 在cl ia法 中 越来 越多 地 应 用 单 克 隆 抗 体 侧。 单 克 隆 抗 体 是 利 用细 胞 杂交技术， 通过杂交细胞的不断分 裂繁殖 产生 抗体。 这种方法产生的 抗体 特异性 强， 而且抗体的性能绝 对均一。 它的应用提高了方 法的 选择性， 同时它也是大量 提供标准化 抗体的一个 途径1701. 2 . 化学发光免疫分析的 标记技术 抗原和抗体的标记是 化学发光免疫分析中 十分关 键的 一个环节. 标记免疫步 骤不 仅要求标记产物不易 脱落， 性质稳定， 更主要的是 标记后标记物 应保持原抗 原 或 抗 体的 活 性， 保持 标 记 基团 的 发 光 活 性 17l j . 韩 刚 毅 圈以 蛋 白 质 为 标 记 对象 列举了 一些常用的方法， 方 法见表 1 . 1 (a、 b 分别为参与 偶联的两种物质所具有的 反应基团) 。 表1 . 1参与标 记的 双方结构特点及标记方 法的 选择 标记方法主要偶联方式 - 洲2碳二亚胺法 一 乙卜 组氨酸、色氨 酸残基 n二n c 棍合酸配法 n 一 轻基玻泊酞亚氨活化法 环内酸酥法 硫氛酸醋衍生物法 0- (， 甲 基 )。 胺 法 二 noc、 艺 ， -nh2硼-nh2-nh2讹 1 . 3 . 3化学发光免疫分析的主要类型 化学发光免疫分析法 根据其标记物的不同可 分为 三大类， 即化学发 光免疫 分 第一章综述 析、化学 发光酶免疫分析和电化学 发光免疫分析法。 1 . 化学发 光免疫分析 化学发光免疫分析是用化学 发光试剂直接标记抗体或抗原的一 类免疫测定 方法。用于标记的化 发光试剂应符合以 下几个条 件:( 1) 偶联后能保持光试剂高 的量子效 应和反 应动力; ( 2)与 抗原或抗偶联后能形成 稳定的 结合物; ( 3)在很少 程度的改被标记 物的 理化特性， 尤其是其免疫活性。 鲁米类和叮睫 酷类化学发光 试剂是最常用的标记发光剂。 2 . 化学发 光酶免 疫分析 从 标 记免 疫 分 析 角度 ， 化 学 发光 酶 免 疫 分 析 ( c h e m il ummescenc e e 几 卿 m e 玩 叻助。 as say ，c l e 认) ，应属于酶免疫分析， 只是酶反应的底物是 发光剂， 操作 步骤与酶免疫分 析完 全相同: 以酶 标记生物活性物质进行免 疫反 应， 免疫反应复 合物上的酶再作用于 发光底物， 根据测定的发光 信号进行定量分 析。目 前， 常用 的 酶 标 记 物 有 辣 根 过 氧 化 物 酶 ( 印 汗 ) 73和 碱 性 磷 酸 酶 ( 肛p ) 【741 ， 它 们 有 各自 的 发 光底物。 以 酶为标记物的 化学发 光酶免疫分析 特异性强， 但灵敏度不 够高。 人们在研 究中 发现， 向 化学发光反应系统中加 入某种化学试剂， 这种 试剂可显著 地增强 酶 催化的化学发光反应，使化学发光信号提高并可使发光信号持续几十分钟至 24 小时， 根据这一特性， 将传统的 酶免疫分析与化学发光免 疫分析相结合， 建立了 一种完全新型的 “ 杂交”标记免疫分析技术，即增强化学发光酶联免疫分析 正 汕 助 c edc h 。 1耐 ne s cenceln li n un o as say， e clia) 方 法 1均 . 将 加 入 的 化 学 试 剂 统 称为 增 强 剂 伍 汕 胡 沈 r ) . 利 用 增强 剂 可以 提 高 发 光 信 号、 增 加 发 光 信号 的 稳 定 时间， 克服仅有酶催化的化学发 光体系几秒内 瞬时闪光、 发 光强 度低、 不易测量 等 缺点【 周. 自 八十年代中后期出 现以 来， 增强化学发光酶联免 疫分析已 经在免疫 分 析、 分子杂交、 蛋白 质印迹、 基因 检测等诸多领域得到了 广泛的 应用。 3 . 电 化学发光免疫分析 电 化学发 光( e c l)是指由电 化学反应引起的化学发光过 程。 在电 极上施加一 定的电压或电 流时， 电极上 发生电 化学反应， 在电 极反应产物之间 或电 极反应产 物与溶液中 某种组 分之间 发生化学反 应而产生 激发态， 当 激发态返回 到基态时产 生发光现象。 从整体上讲， 电 化学发光免疫 分析是化学发光和免疫测定的 结合， 它包括了 电 化学和化学发光 两个过程， 故是化学发光免疫 分析的 一种发展。目 前， 在实际 应 用 中 的电 化 学 发 光 体 系 主 要 是 钉 联 毗 陡 ru帅y) 31 2+ 体 系 . 它 可 以 通 过 活 化“ 手 臂” 实 现与蛋白的 连接。 这种 标记物非常稳定 ， 且由 于分子量小( 1 000)， 可实现 一 分 子 蛋白 标 记 多 个【r u (b p y )3 2+ . 第一章综述 电化学发 光免疫分析有其突出的 优点: 标记物稳定， 灵敏度高， 可实 现多 元 检测， 可实现 均相免疫分析， 可实 现全自 动 化。 由 于电化学发 光免 疫分 析具有优 越性，是一 种很有发展前途的免疫 分析法，日 益受到人 们的重 视. 3 . 4化学发光免疫分析研究展望 随着化学发 光免 疫分析方法的日 趋成熟，各 种技术与 化学发光免 疫分析的 联用成为一 种发 展趋势。 例如， 化学 发光免疫 分析与流动注 射技 术联用可以实 现 化学发光免疫分析的自 动化; 化学发光免疫分 析与高效液相色谱( h p lc) 、 毛细 管电 泳( c e ) 等技术联用， 可以 使免疫分析的选择 性和灵敏度得到完美体现， 同时， 也可以提高方法的检测速度。 c l ia 除具有灵敏 度高、 特异性强等优点，日 益受到 人们的 青睐。 c l ia 分 析方法多样， 适用面 广， 广泛地用于抗原、 抗体 和半抗原的免疫 测定， 其线性范 围也较宽， 符合临 床检验的需要。 c l i a技 术为临 床诊断和科学研究提供了一种 超微量的非同 位素免 疫检测手段， 其在医学、 食品 分析、 环境等方面具有广阔的 应用前景. c l ia技术的 发展趋势在于合成新的发 光标记物、优化抗体制备、标 记技术以 及建立新的免 疫分析方法等; 在新的 分析原理上 力求创新， 追踪生命科 学和环境科学发展的 前沿领域， 建立 对生命过程和 环境毒理有重要内源性和外源 性物质分析的新方 法， 促进生命科学、环境科学的 研究和发展。 4流动注射化学发光分析 4 . 1流动注射化学发光概迷 化学发光 ( c h e m i l . 旧 i ne sc e nc e ， c l )分析大多是基于物质间的 氧化还原反 应产生激发态发光体， 进而产生发光 现象 等分析 特征为基础的发光分析方法。 该 现象往往是一个短暂、 发光信号随时间变化较大的两组动态进行化学反应的过 程; 此外， 相关化学反 应所产生的 激发态发光体的形 成和发光信号的产生空间 区 域，是在两 个进行化学反应的质粒相的反应界面、 介观 区域， 化学发光反应 的这些 特点 就决定了 化学发光反 应的 反应器与 信号检测 器是一 个有机的 整体。 因 此， 当 早期使用间隙式手工 操作获得化学发光和 对相应的发光信号检测时， 就 很 难取的良 好的 精度。 流动注射分析比 传统的 常规手工分析、 程序分析器、 连续流 动分析 等有更多 的优点: ( 1) 操作简便 第一章综述 ( 2 ) 分析速度快 (3) 重现性好 ( 4 ) 节省试剂和样品 ( 5 ) 分析系 统封闭 (6) 容易实 现自 动化 ( 7 ) 应用范围 广泛 为 此，在流动注射分析技术建立之后不久 ( 即 19 79 年) ， 美国分析化学家 w.凡 seitz教授率先将 f ia 技术引入到化学 发光分析领域， 成功的实现了 流动注 射技术与化学发光分析技术的结 合。 流动注射化学发 光分 析技术保存了 一般 c l 法的 优点而同时 也具备了f i a的一般 优点。 曰 a是 从实验室操作中的最基础部 分 入手来提高整个化学分析过 程的 效率及改善提 供信息的能 力。 流动注射一 化学 发 光 ( fl一c l )的 应用主要包括对水体及大气中 无机金属离子、 无机非金属离 子、 有机化合物以 及生物大分子的 测定m 侧. 流动注射化学发光分 析法的应用领域不断 扩大， 合成新的发光试剂， 建立新 的发 光体系， 以 化学 发光试剂标记 核酸分 子， 制备基因探 针， 并 运用化学 发光分 析 进行核酸分子杂 交分析， 这是流动注射化学发光 分析的 前沿， 其发展将为基因 工程、 基因诊断和治疗提供有效的检测手段， 对于推动生命科学的发展具有重要 的理论意义和应用价值。 4 . 2鲁米诺化学发光体系 鲁 米诺是人们最早了 解的 流动注射化学 发光化合物之一。它的发光 机理 甲公丫犷一甲 以井 于卿 一忧 灌 夔 互 1 . 7辣根过氧化物酶催化 鲁米诺化学发光反应机理 f i g l .7 s c h e m e o f l umi n o 1 c h e m i l u m ince r e a c t ionw ithh r p 咔 翔 t a l ys i n g 应 条 件有 很 大 关 系 18 刀 . 辣 根 过 氧 化 物 酶 可以 催 化 鲁 米 诺 过 氧 化 氢 反 应， 其 催 第一章综述 化机理如图1 ， 7 所示。 髻米 诺体系 化学发 光反 应有一个决定性的 氧化步骤， 辣根过氧化 物酶标 记到 抗原 或抗体上时， 由于蛋白 质大分子的空间位阻 作用， 往往使氧化步骤受到抑制。 所以， 鲁米诺体系化学发光反 应通常需要在强碱 性介质中 进行， 而强的碱性对酶 的 活性会产生一定的 抑制作用，因 此利用鲁米诺一 过氧化 氢一 辣根过氧化物酶直接 测定生 物大分子灵敏度低。 增强剂的出现，使得鲁米 诺化学发光体系在免 疫领域得到更加 广泛的 应用。 t b o rpe阅等 使 用了 对 碘 苯 酚 及 对 苯基 苯 酚 作 为 化 学 发 光 增 强 剂， 用h ri，作 为标记 物， 鲁米诺为发光剂， 对绒毛膜人促性腺激 素， 地谷新等进行了测定， 并 与不加 增强剂的 化学 发光酶免疫分 析方法 进行对照，灵敏 度提高 至少1000倍。 章 竹 君【州 等 采 用 对 碘 苯 酚 增 强 的 鲁米 诺 化 学 发 光 体 系， 对 铁蛋 白 及甲 胎 蛋白 进行了定量测定，方 法的 线形范围 宽、灵 敏度很 高， 比酶联免 疫吸附 测定高 1 -2 个数量级。 章竹君 阅等以 对碘苯酚为 增强剂 对血清中麻疹 病毒 抗体进行检测， 方 法简便、快速、 经济、灵敏 度高。 4 . 3流动注射化学发光免疫分析 流动注射免疫分析通过非平 衡态条件进行测定， 不仅可以 大大 缩短免疫分 析 时间， 减少珍贵的免疫试剂的 用量， 而且还可以 实 现免 疫分析自 动化。 均相 和非 均相免疫分析均可以 在流动体系中 实现. 非均相免疫 测定根据实验中是否使 用固 相支持物作为吸附抗原或抗体的载 体， 分为固相 免疫和液 相免疫 测定， 其中以固 相免疫法用得最多。 固相免 疫分析与流动注射技 术的联用， 可以 提高固相免疫的 分析速度和自 动化程度， 同时因 其具有使分析时间 大大缩短、 分析试剂用量减少、 易于实现自 动化、 可进行在线检测 等优点 而成为化学发 光免 疫分析的发展趋势。 流动注射化学发光免疫分析多 采用非 均相免疫法， 将抗体或抗原以 物理或化 学方 法固定到固 相载体表面上， 装 填于一个体积很小的 流通池内 ， 制成免疫反应 柱. 免疫柱是流动注射分析系统的 重要组成部分， 也是影响流动 注射化学发光免 疫分析准确度和精密度的关键因素之一。 在流动注射免疫分析完成一次测定之 后 ， 用p h 值 约 为2 的 酸 性 洗 脱 溶 液 将固 相 载 体 上 的 抗 体 和 抗 原 之 间 分 离 ， 可以 实现