（分析化学专业论文）水中典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究.pdf

| 1 山大学硕士学位沦文 水中典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 专业：分析化学 姓名：刘玉春 导师：邹世春副教授 摘要 论文详细总结了抗生素在环境中的存在、归宿及其对环境的影晌等国内外研 究现状，通过优化固相萃取、液相色谱质谱质谱等相关条件，建立了水中磺胺 嘧啶、痕量红霉素、脱水红霉素和罗红霉素等几种典型大环内酯类抗生素的分析 方法，并成功地应用该方法初步探索了几种抗生素在珠江水环境中的存在及其变 化规律。本研究的主要内容及结论包括： 1 ) 考查了9 种萃取小柱对磺胺嘧啶、红霉素、脱水红霉素和罗红霉素的萃取回 收率。结果表明，9 种吸附小柱中，除c 1 8 对几种抗生素的萃取率为5 0 - 7 5 ， h l b 小柱在8 5 7 1 0 1 之间，其它7 种小柱的回收率难以满足分析要求； 2 ) 利用l c - m s m s 作为检测平台，建立了水环境中几种典型的、微量抗生素的 分析方法，即，水样经h l b 固相萃取柱富集净化，以多反应检测方式( m r m ) 对待测物进行定性和定量分析。实验表明，磺胺嘧啶、痕量红霉素、脱水红 霉索和罗红霉素等四种抗生素在0 - 2 0 0 0n g l 浓度范围内具有良好的线性；加 标纯水和实际水样的回收率在7 1 4 7 1 1 0 7 之间，相对标准偏差( r s d ) 为3 7 8 。6 之；磺胺嘧啶检测限可低至2n g l ，三种大环内脂类抗生素检 测限可低至5n g l 。该方法灵敏度高、选择性好、准确度高，适合实际水样 中痕量的磺胺类和大环内脂类药物的检测。该方法的建立，为我国开展环境 中微量抗生素( 药物) 污染具有重要意义。 3 ) 使用该分析方法测得珠江广州河段某水样中磺胺嘧啶，红霉素，脱水红霉素 和罗红霉素的浓度分别为3 2 3 ，1 6 4 ，2 9 1 和1 3 4r i g l ；而珠江广州河段某近 排污口处水样中磺胺嘧啶、红霉素、 为2 1 8 2 ，8 4 8 2 ，4 8 8 6 和6 9 7n g l ， 脱水红霉素和罗红霉素浓度平均值分别 可见，近排污口的抗生素药物浓度明显 刘采春：水r l 典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 高于其它采样点的浓度，表明城市污染排放是珠江河水中抗生素污染的主要 束源。与其它国家的相关研究数据相比，在国内水环境中的抗生素污染情况 要严重得多，值得引起重视。通过考查抗生素的浓度随时间的变化规律，发 现感潮作用( 水位变化) 对其浓度影响较大，其影响可能与感潮作用引起的 底质再悬浮，并使底质中的污染物重新进入水体有关。 4 ) 与国外相关文献报道不同，本初步研究结果还表明，在珠江河水中除可检出 平均浓度分别高达2 9 1 和4 8 8n g l 的脱水红霉素成份( 红霉素经人或动物酸 性胃液作用后的代谢产物) 外，还检出了较高浓度的未脱水红霉素原药成份 ( 分别为1 6 4 和8 4 8n g l ) 。该数据显示，河水中抗生素除了来源于人或动物 服用后的排泄外，还可能有相当的抗生素来源于诸如水产养殖过程中的直接 投放和制药厂的直接排放。该初步结论与珠三角发达的水产养殖业和制药业 似有因果关系。 关键词：固相萃取；液相色谱质谱质谱；抗生素分析；河水 l i ! 生查兰堡主兰堡堡苎一 d e t e r m i n a t i o no fs e v e r a lt y p i c a lm a c r o l i d ea n t i b i o t i c s a n dt h e i ro c c u r r e n c ei np e a r lr i v e rw a t e r m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e ：l i uy u c h u n s u p e r v i s o r ：z o us h i c h u n ，a s s o c i a t ep r o f e s s o r a b s t r a c t t h ee n v i r o n m e n t a lp r o b l e m sc a u s e db ya n t i b i o t i c sp h a r m a c e u t i c a la n dp e r s o n a l c a r ep r o d u c t s ( p p c p s ) ，e s p e c i a l l yt h o s ei nt h ea q u a t i ce n v i r o n m e n t ，h a v eg a i n e dm o r e a n dl n o r ei n t e r e s t s p p c p sa se n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t sh a v eb e e ns t u d i e dw i d e l y h o w e v e r f e wd a t aa r ea v a i l a b l ef o rc h i n a , w h i c hi sb e l i e v e dt ob eo n eo ft h en l a i b p r o d u c e ra n dc o l l s i h t l e rc o u n t r i e s i nt h i sw o r k ，s e v e r a lt y p i c a la n t i b i o t i c s ，i n c l u d i n g s u l f a d i a z i n e ( s d ) ，e r y t h r o m y c i n ( e t m ) ，c r y t h r o m y c i n - h 2 0 ( e t m - h 2 0 ) a n d r o x i t h r o m y c i n ( r t m ) w e r ea n a l y z e di nw a t e rs a m p l e sf r o m p e a r lr i v e ri ng u a n g z h o u u s i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) w i t hap o r o u sp o l y m e ro a s i sh l b a n dq u a n t i f i e d u s i n gc o m b i n e dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( l c ) w i t ht a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( m s m s ) u n d e rt h em u l t i - r e a c t i v em o d e l t h eo c c u r r e n c ea n dh o u r l yv a r i a t i o n so f t h e s ea n t i b i o t i c sw e r ea l s od i s c u s s e di n t h i ss t u d y s e v e r a li m p o r t a n tr e s u l t sw e r e o b t a i n e d 勰f o l i o w s ： 1 ) e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) c o l u m np a c k e d p o r o u ss t y r e n e - d i v i n y l b e n z e n ec o p o l y m e r h a st h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o n e f f i c i e n c i e sr a n g e df r o m8 5 7 t o1 0 1 a m o n g9t e s t e dc o l u m n s 2 ) t h ed e v e l o p e dm e t h o di se f f e c t i v ef o rt h ea n a l y s i so ft h e s et y p i c a la n t i b i o t i c si n r i v e rw a t e r t h el i n e a rr a n g ew a sf r o m0t o2 0 0 0n g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i t s w e r e2n g lf o rs da n d5n g lf o re t m ，e t m - 1 - 1 2 0a n dr t m t h es p i k e d 1 i i 刘玉春：水中典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 r e c o v e r i e si nr e a lw a t e rs a m p l e sf o rt h e s ea n t i b i o t i c sr a n g e df r o m7 1 5t o110 7 a n da l lt h er e l a t i v em a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d ) w e r el e s st h a n8 6 ； 3 ) t h ea v e r a g ec o n c e n t r a t i o n so fs d ，e t m ，e t m - h 2 0a n dr t mm e a s u r e di nt h e p e a r lr i v e rw a t e ra tu r b a ng u a n g z h o ul o c a t i o n sw e r e3 2 3 ，16 4 ，2 91a n d13 4n g l ， r e s p e c t i v e l y w h e r e a st h ea v e r a g ec o n c e n t r a t i o n so fs d ，e t m ，e t m - h 2 0a n d r t mc l o s et ot h es e w a g ed r a i nt op e a r lr i v e rw e r eu pt o2 1 8 2 ，8 4 8 2 ，4 8 8 6a n d 6 9 7n e g l r e s p e c t i v e l y t h eh i g h e rc o n c e n t r a t i o n si nt h es a m p l e sn e a rs e w a g e d r a i np r e s e n t st h a tt h es a n i t a r yw a s t ei st h ed o m i n a n ts o u r c ef o rt h ea n t i b i o t i c s p o l l u t i o n 。c o m p a r e dt ot h eo t h e rc o u n t r i e s 。t h ec o n c e n t r a t i o n so ft h e s ea m i b b t i c s i np e a r lr i v e rw a t e rw e r es u r p r i s i n g l yh i g hp r e s e n t i n gt h ep o l l u t i o nf r o mp p c p s s h o u l dn o th eo v e r l o o k e d ； 4 ) d i f f e r i n gf r o mo t h e rs t u d i e s ，h i g hc o n c e n t r a t i o no fe t m ，w h i c hh a sn o tb e e n m e t a b o l i z e db yh u m a na n da n i m a l s ，c o u l db eo b s e r 、枷i no u rw o r k i tc o n c l u d e s t h a td i r e c te m i s s i o a so ft h e s ea n t i b i o t i c sf r o mp h a r m a c e u t i c a la n dl i v e s t o c k b r e e d i n gf a c t o r i e so c c u ri np e a r lr i v e rd e l t ar e g i o m k e yw o r d ：d e t e r m i n a t i o n ；m a c r o l i d ea n t i b i o t i c s ；s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ；l c m s m s ； r i v e rw a t e r 中山大学硕士学位论文 第1 章前言 人类己生活在一个充满化学品的世界。目前我们日常生活和工农业生产所使 用的化学品己多达1 0 0 ，0 0 0 万种以上。近3 0 年来，环境中的化学品及其危害， 已引起国际环境科学界乃至公众的广泛关注。随着环境科学的发展，这种认识不 断加强和深化，经历了多个阶段。1 9 6 0 年代，卡尔松的“寂静的春天”，最早唤 起世人对环境中农药带来的生态与人体健康负面影响的正视；1 9 8 0 年代，美国、 欧洲、世卫组织先后公布的环境中需优先控制的污染物中( 即所谓“黑名单”) ， 均主要以化学品为主：1 9 9 0 年代，国际社会投入大量人力、物力，研究和治理 环境中的持久性有机污染物( p o p s ) ，并最终于2 0 0 1 年5 月通过了1 2 7 个国家 联合签署的旨在全面禁止和限制p o p s 的嘶德哥尔摩公约( 或p o p s 公约) ”。 这些已引起广泛关注的化学品污染物，大多具有毒性大、含量微、易生物富集的 特点。 与此相对照，对于我们在日常生活中接触最为频繁、用量最大的化学品一药 物与个人护理品( p h a r m a c e u t i c a l sa n dp e r s o n a lc a r ep r o d u c t s ，w c p s ) 在环境中的 行为，及其可能造成的负面影响，则一直被忽视，直到1 9 9 0 年代后期才开始得 到关注【l 】。药物均是直接以获得显著生物效应为目标开发的。在生物体内，药物 与许多有害的外源性物质( x e n o b i o t i e s ) 如p o p s 具有相似的理化行为。例如， 许多药物均具亲脂性基团，能穿过细胞膜；都有一定的稳定性，以避免在产生治 疗效应前失活等。因而，很多药物也容易产生生物累积，并对水生或陆生生态系 统产生负面效应【心】。虽然有限的研究表明药物在环境中的浓度在p p t - p p b 级，与 其显著作用浓度相差甚远，但对p o p s 的研究提示我们，简单外推化合物在高浓 度下的急性毒理特征，是不能说明其在低浓度下的生物效应的【l 】，化学品的低剂 量、长周期暴露也可以在个体或生态层次中起负面效应1 3 4 。 近年来，抗生素所造成的环境问题越来越受到人们的关注。抗生素能使细菌 产生耐药性，而且能让耐药性基因在生物体内和环境中产生选择性进化，因此人 和动物体内一些本来很容易以常用抗菌药物治愈的细菌性感染会发展成为难治 刘蕞春：水中典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 的耐药菌感染。从传染理论可知，对抗生素的耐药性可以从非致病细菌传到致病 细菌，这种传递耐药性的特点已在实验室得到了证实。尽管抗生素在环境中的含 量极微( 通常在p p t 或p p b 级) ，远未达到可以抑制细菌生长的最小浓度( m i c ) ， 但细菌能在此环境中重新恢复并开始增长，并产生耐药性口7 1 。 1 1 抗生素类药物目前的使用状况 1 1 ，1 抗生素简介 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 是生物，包括微生物、植物和动物在内，在其生命活动过 程中所产生的( 或由其他方法获得的) ，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它 种生物功能的有机物质【8 ”。自1 9 4 0 年青霉素应用于临床以来，人类开始广泛使 用抗生素。很多抗生素在各种常见细菌性疾病的治疗中，发挥了重要的作用。目 前抗生素的种类已达几千种，在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的 培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。目前主要的抗生素类型包括， ( 1 ) 大环内酯类抗生素：以大环内酯为母体，通过羟基以苷键和1 3 个糖分子 相连的抗生素，通常按内醋环的组成分为1 4 元环和1 6 元环等。临床常用的有红霉 素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素和交沙霉素等； ( 2 ) 磺胺类药物：为氨苯磺胺( 简称磺胺) 的衍生物。磺胺的分子中含有一 个苯环，一个对位氨基和一个磺酰胺基。各种化学基团来取代磺酰胺基上的氢原 子，合成了大量有效的衍生物。临床常用的有磺胺嘧啶、磺胺甲嗯唑和甲氧苄啶 等： ( 3 ) 四环素类抗生素：具有共同的基本母核( 氢化骈四苯) ，仅取代基有所 不同一类化合物。它们是两性物质，可与碱或酸反应而成盐。通常在碱性水溶液 中易降解，在酸性水溶液中则较稳定，故临床一般用其盐酸盐。临床常用的有四 环素、土霉素、金霉素和强力霉素等。 ( 4 ) p 内酰胺类抗生素：是指化学结构中具有p 一内酰胺环的一大类抗生素，是 抗生素中使用量最大的一类。该类药物的化学结构，特别是侧链的改变形成了许 多不同抗菌谱和抗菌作用以及各种临床药理学特性的抗生素。临床常用的有阿莫 2 p 山大学硕士学位论文 西林、安苄西林、青霉素和头孢氨苄等。 1 1 2 抗生素的使用 我国是抗生素使用大国，表1 粗略统计了我国抗生素市场销售情况1 1 0 o 表l中国抗生素的国内市场销售情况 由表l 可以看出，抗生素的销售额占全部药品的1 4 以上，而且目前仍然呈 上升趋势。例如，1 9 9 7 和1 9 9 8 年的销售金额增长率分别是7 o 和2 9 8 。据上 海药物管理局统计，2 0 0 3 年上海人服食的抗生素费用占所有药物的3 5 ，大约 8 0 的当地居民家里存放有抗生素。当地的药物局官员称抗生素在诊所和药店销 售上位居榜首【“】。 在我国农村，由于广大农民对农作物病虫害防治知识的不足，普遍存在着滥 用农用抗生素的现象。在选用抗生素种类、施用剂量及用药时间等环节上存在着 很多问题。其中，突出的问题是施用抗生素种类多、剂量大。多数农民认为这样 做保险系数大、防治效果好。 农村畜禽及鱼类等养殖业，滥用抗生素的问题则更严重。为数众多的养殖户 为了预防畜禽及鱼类疾病的发生，一劳永逸地发挥其预防作用，因此在饵料中加 入一定量或过量的一种或多种抗生素并长期使用。这种滥用抗生素作为畜禽及鱼 类生长保护剂行为使整个养殖业抗生素使用量十分巨大。据统计，我国喹诺酮类 抗生素年产量约7 0 0 吨( 如p p a 和氟哌酸等) ，其中一半以上用于养殖业。再加 上其他种类的抗生素，总用量十分惊人，其中绝大部分是不当使用。 抗生素的大量滥用，不可避免地会蓄积残留在畜禽及鱼类的肌体内，甚至残 留在相应的蛋、奶里。人们食用它们时，残留的抗生素和耐药菌就会进入人体， 从而影响人类健康1 1 2 l 。 在国外，抗生素的使用也极为广泛。据丹麦药物管理局称，1 9 9 5 年，丹麦有 刘玉春：水中典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 5 2 万人共使用t 3 7 7 吨抗生素【2 1 。在1 9 8 8 至u 1 9 9 3 年删，瑞典的抗生素用量保持在 3 5 吨年【l ”。瑞士人每年服用的抗生素约3 4 吨，并由1 9 9 2 年丌始维持这个数量， 其中1 3 内酰胺类抗生素( 包括青霉素类和头孢菌素类) 所占比例最大，接近1 8 吨年，其次分别是磺胺类( 5 5 吨年) 、大环内酯类( 4 3 吨年) 和氟喹诺酮类( 3 9 吨年) 【1 ”。 由于抗生素具有广泛的抑杀菌能力，除了用于治疗人类疾病以外，5 0 年代开 始，抗生素也被普遍用于家畜、家禽和水产品的饲养过程以及肉品加工过程中。 丹麦每年都有总数超过l l o 吨抗生素用作家禽生长素和鱼饲料添加剂。计算结果 表明，渔场中7 0 8 0 的抗生素最终将进入环境。研究也发现，渔场底部沉积物 己具有一定的抗生素浓度和抗菌活性【1 5 】。在美国，每年生产的抗生素中有4 5 用 于动物，其中8 0 的禽类、7 5 的肉牛以及7 5 的奶牛在生长过程中均使用过抗 生素。此外，为了保鲜，在肉品加工过程中也添加一定的抗生素用来抑制细菌的 生长繁殖t ”1 。 欧洲在2 0 世纪8 0 年代，抗生素加入家禽饲料中的用量达到高峰。1 9 8 4 年，瑞 典有3 0 吨抗生素加入饲料中1 3 】；1 9 9 5 年丹麦有4 9 6 8 7 吨用于家禽的生长素，另外 2 4 9 1 吨作为家禽的食物添加剂【2 l 。由于抗生素的滥用，使得环境中的抗生素浓度 越来越大，细菌的耐药性开始通过食物链传递给人类。据目前的研究，对环境产 生影响的主要是家禽生长索和鱼饲料添加剂。 目前，越来越多的国家已经意识到滥用抗生素对人类和环境的危害，并开始 立法限制抗生素在家禽中的使用。1 9 8 6 年起，瑞典政府立法规定抗生素只作为 治疗家禽疾病之用，禁止抗生素和化学药物常规地加入饲料；到1 9 9 5 年，只有 3 吨的抗生素用于家斜13 1 。 至今为止，人们关心的首要问蹶是抗生素在低浓度下是否会对不同地理区域 的生态系统构成影响以及它们在自然中是稳定的还是容易被微生物矿化。e u 在 19 9 8 年1 月已经开始执行一项技术指导，评估家禽抗生素对环境的危害，并且 起草了评估人类抗生素危害性的技术指导草案。美国食品及药物管理局( f d a ) 也已经出版环境评估技术手册，要求在开发新药物时必须评估其对环境的危 害性。 4 中山大学硕士学位论文 1 2 抗生素进入环境前的药理学归宿 人和动物服食的抗生素在进入环境之前，有其自身的药理学归宿。方面， 相当数量的抗生素会以原药的形式随着粪便和尿液排出体外，进入污水和有机肥 料。有文献研究了在六天常规服用抗生素期间人类粪便中几种抗生素的浓度，其 中甲氧苄氨嘧啶和强力霉素浓度范围在3 - 4 0m g k g 之间，红霉素的浓度范围在 2 0 0 - 3 0 0m g k 9 2 _ n 【i ”。磺胺类抗生素如磺胺甲嗯唑，在有机肥料中相当稳定， 当伴随有机肥料一起施放于土壤时仍可保持活性。也有文献报道了在养殖场的家 禽排泄物中检测到了四环素类及磺胺类药物1 1 8 1 ；另一方面，肝脏代谢产生的抗生 素代谢物的数量也很大。部分有些抗生素在体内会代谢为两种类型的代谢物，其 中第一类代谢物较原药活泼，是抗生素经过氧化、还原、水解等反应生成的物质， 毒性有时比原药更大；第二类代谢物较不活泼，由抗生素通过共轭反应而形成。 因为代谢反应总是使代谢物水溶性增强，这两类代谢反应都会引起抗生素本体物 理化学性质的改变【2 】。 在一定条件下，代谢物也可以转化为原药本体。例如，在尿液中的氯霉素葡 糖苷酶和n 4 - 乙酰化磺胺脒分别转化成葡糖昔酶和磺胺脒，它们都是第二类代谢 物，被活化后又重新转化成原来的物剧”1 。 由此可见，抗生素本体及其代谢产物都应成为环境危害的评估对象1 2 】。 1 3 抗生素及代谢物在水环境中的存在及其归宿 1 3 1 抗生素及代谢物在水环境中的存在 抗生素及其主要代谢物在不同的水环境，如污水处理厂入水口和出水口、地 表水、地下水甚至饮用水中以很低的浓度( n g l - p g ，l 级) 存在。国外科学家特 别是欧洲及美国的科学家对此进行了一系列的研究。h i r s e h 首先研究了有代表性 的抗生素在德国某污水处理厂的出水口和地表水中的存在1 2 0 m 1 ，分析了大环内酯 类、磺胺类、青霉素类和四环素类等1 8 种抗生素的浓度，在河水中检测到浓度为 刘玉春：水中典型抗生素测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 0 6 2 g l 的红霉素，0 1 9o g l 的罗红霉素和克拉霉素等，而四环素类和青霉素类 的浓度相对较低，分别为5 0 f 1 1 2 0n g l 左右。这可能是由于这类抗生素分子结构 中的b 内酰胺环的不稳定性，使它们在水环境中易于降解所致。 1 9 8 5 年，有人发现在英国李河有接近1 7 0 种残余药物，预计抗生素的总浓度 超过0 1 , g l 【2 2 】。在德国巴登符腾堡州的1 0 8 个地下井水样品中共检出6 0 种药物， 其中8 种药物可在至少三个样品中同时检测到，而这8 种药物中就有红霉素和磺胺 甲噫唑两类抗生素障”。1 9 9 9 和2 0 0 0 年，在美国1 3 9 条江河中检测到包括抗生素在 内的9 5 种有机废水污染物【5 l 。其中包括四环素类、大环内酯类、磺胺类和氟喹诺 酮类等3 1 种抗生素，红霉素和磺胺甲嚼唑的浓度分别达n 1 7 和1 9u g l 1 4 1 。在瑞 士的g l a t t 峡谷和污水处理厂排出水中检测到大环内脂类抗生素浓度最高达0 3 u g l ，而检测到的喹诺酮类药物中环丙沙星和诺氟沙星的浓度分别为0 4 , g l 和 o 1 2 嵋l 【2 4 】。在巴西的污水处理厂排出水、污水和河水中存在浓度在0 1 1o g l 范围类的四环素及磺胺类抗生素伫5 】：在英国地表水和污水处理厂的排出水中检测 到甲氧苄啶( 0 2 7p g l ) 、红霉素( o 1 8 g l ) 和磺胺甲嗯唑( o 0 5 , g l ) 2 6 1 ； 在西班牙污水处理厂进水和出水口以及地下水中检测到了痕量的四环素和喹诺 酮类药物。其中环丙沙星浓度最高达0 6 0 嵋，l 【2 7 】；在意大利的养殖场的污水中， 检测到了恩诺沙星的浓度高达0 5 1m g l r 吼，在河水中检测到了痕量的阿莫西林 和青霉素i v l 2 9 j 。瑞典有报道，在医院的排放的污水中检测到较高浓度的抗生素 药物，如环丙沙星1 0 0 , g l 、磺胺甲嗯唑1 2 8 嵋l 、甲氧苄啶7 6p g l 、氧氟沙星 7 6 嵋，l 1 3 0 。 目前我国尚无相关的环境中残留抗生素类药物的报道，但有少量其它药物的 报道。常红等报道了杭州地区水环境中检出痕量的雌激素，炔雌醇浓度为3 3 5 n g l 、雌而醇浓度为o 3 2n g l t a l l 。 1 3 2 抗生素类药物在环境中的归宿 图1 展示了抗生素进入环境的途径、环境归宿及对环境的作用瓯抗生素可 粗略地分为人用抗生素( f 1 ) 和家禽用抗生素( f 2 ) 两类。后者可进一步分为 为三类：家禽饲料和家禽生长素( f 3 ) 、治疗家禽疾病的抗生素( f 4 ) 和鱼饲料 6 中山大学硕十学位论文 添加剂( f 5 ) 。而入用抗生素会以粪便和尿液的形式排入下水道( f 6 ) 和污水处 理厂( f 7 ) 。 图1 抗生素类药物在环境中的归宿 在环境中，抗生素主要有三种可能的归宿：( 1 ) 最终转化成二氧化碳和水， 如阿斯匹林；( 2 ) 具亲脂性且不易降解的部分抗生素本体留存在污水中( f 8 ) ； ( 3 ) 代谢为较为亲水的、稳定的物质，通过污水处理厂( f 9 ) ，排入江河( f i o ) ， 如果这些代谢物具有生物活性，将影响水生生物( f 1 1 ) ，如稳定的安妥明。抗生 素也可能残留在有机肥料里，如进入土壤，将影响微生物和有益生物( f 1 2 ) 。另 刘玉春：水中典型抗生紊钡4 定及其在珠江广辨持可段的污染现状研究 外，家畜饲料和家畜生长素伴随着粪便和尿液进入有机肥料( f 1 3 ) ，也会影响土 壤微生物( f 1 4 ) 。有机肥料中亲水性的抗生素及其代谢物经雨水冲刷后会在土壤 中流失( f 1 5 ) 。家禽饲料和家禽抗生素会形成有机肥料直接排放在土壤上( f 1 6 ) ， 由于局部浓度高，可能会影响土壤生物( f 1 7 ) 。排放在土壤的抗生素可能在土壤 相中转化，本体或代谢物进入地下水。鱼饲料中的抗生素则宜接排放到江河中。 然而，大部分的饲料不是被鱼消耗，而是通过网箱积聚在渔场底部，并作用于水 中生物( f 1 8 ) 。另外，还有未知量的人用抗生素由于药厂生产过剩，成为废物排 放到下水道( f 1 9 ) 。 1 4 环境中抗生素药物的分析方法 环境中抗生素药物的分析方法主要包括检测方法及样品的富集预处理方法 两部分。国内在抗生素药物生产过程中的质控分析、食品中的残留分析上经常有 报导，而对于抗生素药物在环境中的存在及其检测则鲜有报导。而国外特别是欧 美发达国家对这方面的研究则有一定基础，其分析方法也较多。 1 4 1 环境中抗生素药物的检测方法 由于环境介质中微量抗生素等污染物具有种类繁多、含量低、基体复杂等多 方面的特点，因此，发展和建立灵敏度和准确度高、快速有效的分析方法是本研 究能否成功的关键之一。目前环境中抗生素含量的检测方法通常包括微生物法、 紫外光度法( u v ) 、荧光法( m r s ) 、电化学方法、t l c 、毛细管电泳法( c e ) 、气 相色谱质谱( g c m s ) 和高效液相色谱( h p l c ) 燃关仪器联用方法【9 3 2 删。其 中，以g c m s ，h p l c m s 或h p l c m s m s 较为常用。但g c m s 要求对待测 物进行衍生化处理，而且也很难找到对具有功能团种类或数量不同的抗生素均适 用的衍生化试剂，例如，以红霉素、麦迪霉素和乙酰螺旋霉素为代表的大环内酯 类抗生素是以1 2 1 8 元环骨架大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和几个分子的 糖或二甲氨基糖相联结的一类抗生素，没有合适的紫外吸收及衍生化方法，因此 中山大学硕士学位论文 很难以u v 或g c m s 方法进行检测；h p l c m s 由于具有分析速度快、灵敏度 高、应用范围广，一般不需衍生化处理等特点而成为抗生素分析最为有效的检测 手段( 3 7 j 。 液相色谱法多应用于抗生素生产过程中的质控分析、食品中的残留分析以及 血药浓度分析 3 8 - 3 9 】，有关此类分析的报道在国内经常出现。如王超等应用高效液 相色谱柱前衍生法，以乙腈：磷酸缓冲盐溶液( 4 3 ：5 7 ) 为流动相测定了牛奶中5 种青霉素的残留量1 4 0 1 。王蕾等应用高效液相色谱法，以甲酸乙腈0 0 1 m o l l 草 酸混合溶液为流动相，采用梯度洗脱法同时测定了7 种四环素类药物f 4 l 】。徐维海 等应用高效液相色谱法，以乙腈3 冰醋酸为流动相，采用梯度法同时测定了水 产品中1 4 种磺胺类抗生素的残留量【4 2 1 。但这些方法仅用于基体相对简单的物质 的测量检出限及灵敏度较商，水体环境中由于所含污染物多、含量低、基体复杂， 很难应用此方法准确检测水体环境中的痕量抗生素残留。 目前检测环境中的抗生素残留的比较成熟的方法是h p l c - m s 联用法。最近 1 0 年由于l c m s 联接口技术的日益成熟，特别是e s i 及a p c i 接口的出现大大 扩宽了l c m s 的应用领域【4 3 4 4 1 。h i r s c h 等应用h p l c e s i m s m s 技术，以乙腈 和2 0m m o l l 醋酸氨为流动相以及不同类型的反相色谱双柱( m e e kl i c h r o s p h e r r p - 1 8 和m a c h e r e y a n d n a g e ll i c h r o s p h e rr p - 8 ) ，采用梯度洗脱方法，流速为0 4 m l m i n ，进样量为5 0 止，成功的检测了河水中的大环内脂类、磺胺类、四环素 类和p 内酰胺类四大类1 8 种抗生素，检测限低至n g l 级【2 l 】。g i g e r 等应用 h p l c e s i ( + ) _ m s _ m s 技术，以乙腈和2 0m m o l l 醋酸氨为流动相以及反相色谱 柱( m a c h e r e y a n dn a g e ln u c l e o s i l1 0 0 - 5c l sh d e n d - c a p p e d ) ，采用梯度洗脱方法， 流速为o 1 5m l m i n ，柱温为3 0 c ，进样量为5 0 皿，成功的检测了污水处理厂进 水口和出水口水中的大环内脂类抗生素残留【1 4 1 。r e v e r t e 等应用h p l c e s i m s 技术，以乙腈和1 乙酸溶液为流动相以及反相色谱柱( k r o m a s i l1 0 0c 1 8 ) ，采 用梯度洗脱方法，流速为1 0m l m i n ，柱温为3 5 c ，进样量为5 0 止，成功的检 测了污水处理厂进水口和出水口水中的四环素类及喹诺酮类抗生素残留【2 ”。j z h u 等应用h p l c e s i - m s 技术，以水5 甲酸乙腈甲醇( 2 3 ：4 0 ：2 5 ：1 2 ) 混合溶 液为流动相以及反相色谱柱( b e t a b a s i cc 1 8 ) ，采用梯度洗脱方法，流速为o 2 m l m i n ，柱温为2 0 c ，进样量为2 5 止，成功的检测了地下水和养殖场污水中的 9 刘玉春：水巾典型抗生素测定及其在珠江广势轻可段的污染i 魁状研究 四环素类抗生素残留【4 5 1 。l i n d s e y 等应用h p l c e s i ( + ) a p c i ( + ) m s 技术，以甲 酸和1 0m a m l l 甲酸氨为流动相以及反相色谱柱( l u n ac 8 ) ，采用梯度沈脱方法， 流速为0 6m l m i n ，柱温为2 0 。c ，进样量为2 0 止，成功的检测了地下水和地表 水中的四环素类和磺胺类抗生素残留”1 。 1 4 2 环境中抗生素药物的富集预处理方法 如前所述，环境介质中各种抗生素的结构和性质( 如极性) 不同且含量极低 ( 通常为p p t 级或更低) 。为获得可靠的分析结果，除了选择合适的仪器以及优 化仪器本身的工作条件外，更为重要的是发展和建立样品分离、富集和净化等前 处理过程。目前，国内外大量的研究报道多集中于药品质量分析、生物体( 如奶、 血液和肉品) 以及饲料等样品中抗生素的残留【4 ”，以及受到局部污染的微环境或 污染源，所研究和分析的对象通常是含量较高( 数百p p b ) 而且基体相对单一的 体系，因此对样品前处理过程和仪器性能要求不高。相对而言，有关环境介质中 微量抗生素分析报道并不多见 3 7 , 4 8 - 5 0 1 ，尤其在国内，相关报道更少。溶剂萃取阢 5 1 1 、加速溶剂萃取 4 9 , 5 2 、固相萃取 5 3 5 5 1 和冷冻浓缩方法即冻干法口o 。2 1 1 是环境样品 中抗生素分离富集常常采用的方法。 冻干法是指在真空状态下，将冷冻样品中的水分等溶剂通过升华的方式除 去，从而使目标物得以富集。在整个冻干过程中，抗生素分子结构较少改变，极 易重新溶解，从而保证了样品的活性。冻干法被广泛用于生物制品、酶、药和微 生物等方面【5 6 】。固相萃取法采用高效、高选择性的固相萃取荆，使一定体积的样 品溶液通过装有固体吸附剂的小柱，样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸 附；然后，以合适溶剂将被吸附的组分洗脱出来。使用固相萃取法，可以使样品 中的组分得到浓缩，同时初步除去干扰成分。固相萃取不仅可用于色谱分析中的 样品预处理，而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分 析方法的样品预处理 5 7 l 。快速溶剂萃取h 9 1 是指在一定的温度( 5 0 c 一2 0 0 c ) 和压 力( 1 0 0 0 3 0 0 0p s i 或1 0 3 2 0 6m p a ) 下用溶剂对固体或半固体样品进行萃取的方 法。使用常规的溶剂、利用增加温度和提高压力提高萃取的效率，其结果大大加 快了萃取的时间并明显降低萃取溶剂的使用量。增加温度和提高压力对溶剂萃取 的作用在于可以提高被分析物的溶解能力、降低样品基质对被分析物的作用或减 1 0 - 山大学硕十学位论文 弱基质与被分析物间的作用力、加快被分析物从基质中进入溶剂、降低溶剂粘度 有利于溶剂分子向基质中扩散、增加压力使溶剂的沸点升高，确保溶剂在萃取过 程中一直保持液态。 h i r s c h 等使用冻干法 2 0 - 2 1 】，在2 5 0m l 水样中加入1 0 0m ge d t a 钠献，在3 0 条件下冻干1 5h 后用lm l2 0m m o l l 的磷酸缓冲液定容，浚方法对四环素类 抗生素的回收率在7 0 以上。同时h i r s c h 也使用混合填料固相萃取法1 2 1 1 ，在3 m l 的固相萃取小柱内填入1 0 0m gl i c h r o l u t ee n 和2 5 0m gl i c h r o l u t ec 1 8 ，过柱前依 次用2m l 正已烷冲洗3 次，2m l 甲醇冲洗3 次，用2m l p h 3 0 的水冲洗6 次。 过滤后的1l 水样用3m l 萃取柱过柱萃取( 控制流速5 2 0m l m i n ) 。固相萃取 柱在氮气保护下干燥6 0m i n ，用lm l 甲醇冲出被测物4 5 次，并收集在6m l 的锥形瓶中。室温且少量的氮气流下浓缩到5 0 2 0 0r t l ，转移到1m l 的容量瓶中， 用2 0m m o l l 的磷酸缓冲液( p h 6 ) 定容。该方法对大多数大环内脂类、磺胺类 和b 一内酰胺类抗生素的回收率在8 0 以上。 s a c h e r 等使用固相萃取法 ：2 3 1 ，将5 0 0m l 水样用盐酸调节p h 值至5 ，再加 入1 3ge d t a 二钠盐，过s p e ( 填料为o 1gi s o l u te n v + ) ，然后将s p e 小柱用 氮气吹干。依次用5m l 的乙膪和5m l 乙腈水三乙胺( 体积比为9 0 ：9 5 ：o 5 ) 混合液洗脱s p e 小柱，用氮气将洗脱液吹干，再加入1 0 0l a l 乙腈和2 0r a n t 醋酸 胺的混合液( 体积比为5 ：9 5 ) 。该方法对磺胺类抗生素的回收率仅为1 1 5 0 ， 对罗红霉素、克拉霉素及氯霉素的回收率在8 2 1 0 3 之间。t e m e s 等使用超声 波萃取加固相萃取法富集河水底泥中的抗生素f 5 3 1 ，5 0g 底泥依次用4 x 4 5m l 的 有机溶剂( 首先用两次甲醇，接着丙酮，然后乙酸乙脂。) 在p p c o 烧瓶中超声 波萃取，溶剂和底泥的混合物先用手摇，然后超声波萃取1 5m i n 。混合物以3 4 0 0 0 转m i n 离心旋转7r a i n ，上层溶剂相用滤纸过滤，置于旋转蒸发嚣中，在4 0 c ， 15 0 - 2 0 0m b a r 条件下旋转蒸发至仅剩水相。将底泥萃取物溶于5 0 0m l 无有机污 染的地下水中，旋转蒸发的烧瓶用3m l 的甲醇润洗并混合在地下水溶液中。s p e 小柱依次用6 m l 正己烷、2m l 丙酮、1 0m l 甲醇、1 0 m l 地下水预处理。5 0 0m l 溶液中加入1 2 5m g l 的腐植酸，过s p e 小柱( 1 0 0m gl i e h r o l u t ee n 和2 5 0m g l i e h r o l u t ec 1 8 ) ，用4 x lm l 的丙酮洗脱，然后用氮气吹干，再加入5 0 此甲醇和 4 5 0i t l 磷酸缓冲液。该方法对大环内脂类抗生素回收率在9 2 1 0 3 之间，对磺 刘玉春：水叶典型抗生索测定及其在珠江广州河段的污染现状研究 胺类抗生素回收率在1 0 0 1 0 8 之间。 r e v e r t e 等使用固相萃取法富集了污水厂进水口和出水口的水中的抗生素 【2 7 】，水样用盐酸调节p h 值至2 8 ，s p e 小柱( 5 0 0m g ，o a s i sh l b 柱，w a t e r s ) 需先用5m l 甲醇和2m lm i l l i q 水预处理。水样过s p e 小柱流速为1 5m l m i n 。 过柱后用5m l 甲醇洗脱。沈脱液用氮气吹干，并溶于1m l 的甲醇水( 5 0 ：5 0 ) 溶液中。同时他们使用了2 0 0 m g i s o l u t e e n v + ( i n t e r n a t i o n a ls o r b c m t e c h n o l o g y , m i d g l a m o r g a n ，u k ) s p e 小柱做固相萃取回收率的效果对比。使用h l b 固相 萃取小柱对四环素类和喹诺酮类抗生素的回收率在8 6 以上，相比而言使用 e n v + 固相萃取小柱时，过小体积1 0 0m l 水样时的回收率在7 8 以上，而过大 于5 0 0m l 体积水样时的回收率低至1 8 7 1 之间。通过比较得出h l b 固相萃 取小柱对大体积水样中四环素类和喹诺酮类抗生素的萃取效率远高于e n v + 固 相萃取小柱。 j z h u 等也使用固相萃取法对地下水样品中的四环素类抗生素进行富集处理 m l ，他们也使用了两种不同类型的固相萃取小柱。1 0 0m l 地下水水样用磷酸将 p h 值需调到2 5 。水样过2