（分析化学专业论文）甜菊糖甙的分析方法研究及其应用.pdf

摘要 摘要 甜菊糖甙，是从菊科草本植物甜叶菊( s t e v i ar e b a u d i a l l a ) 的叶子中提取的含8 种双萜糖苷 的混合物。作为一种新型的天然甜味剂，它以高甜度、低热量、安全无毒等特点逐渐受到 人们的青睐，是一种可替代蔗糖非常理想的天然甜味剂。由于每种糖苷具有不同的味质和 甜度，因而建立一套快速、高效、准确的甜菊糖苷组分测定方法对于甜菊品种改良和甜菊 糖苷的生产与应用具有重要的意义。本文主要研究了甜菊糖甙的分析方法，利用毛细管电 泳技术建立一套新的甜菊糖甙分离检测方法，并将此分析方法应用于纳滤浓缩甜菊糖工艺 的研究以及甜菊叶絮凝工艺条件的研究。主要内容如下： 1 、利用毛细管电泳法分离检测了甜菊糖甙中两种主要组分莱鲍迪苷( r a ) 和斯替维 苷( s t ) ，探讨了分离电压、进样量、缓冲液的种类、离子浓度、p h 以及有机添加剂的种 类和比例对分离检测的影响。在用单因素实验确定主要影响因素的基础上，用中心复合设 计实验和响应面分析的方法对主要影响因素的取值进行了优化，得到了最佳分离检测条 件：分离电压为2 0k v ；温度为2 5 ：电泳介质为5 0m m o l l 硼砂缓冲液( p h = 1 0 1 0 ) 、2 3 乙腈、7 甲醇。 2 、在优化条件下，分离检测了甜菊糖样品中的r a 和s t ，r a 和s t 在1 5m i n 内得到良好 的分离。r a 和s t 分别在o 0 5m g m l 1 0 om m l 和0 0 6m m l 1 0 om 咖l 的范围内浓度 与电泳峰面积呈良好的线性关系，检测限分别为o 0 1 m m l 和o 0 2m 咖l 。样品测定结果： 甜菊叶样品中r a 的含量为2 8 ，s t 的含量为1 0 2 ，三次平行测定的回收率为9 5 2 ( i 认) 和1 0 1 7 ( s t ) 。天王甜菊糖样品中r a 的含量为1 3 1m g ，s t 的含量为3 5 7m g ，三次平行 测定的回收率为9 8 2 ( r a ) 和9 6 3 ( s t ) 。甜菊普洱茶样品中s t 的含量为1 5 3m g ，三次平 行测定的回收率为9 7 5 ，r a 可检出。 3 、研究了纳滤浓缩甜菊糖工艺的特点，首次将纳滤技术应用到甜菊糖的浓缩分离工 艺中，并对现有的工艺进行了改进。实验采用截留分子量为2 0 0 的纳滤膜对甜菊糖洗脱液 进行了浓缩分离，透过液可不经任何处理回收利用作为洗脱液，浓缩液则继续进入后续生 产工艺。在0 2m p a o 7m p a 下，膜对甜菊糖平均截留率为9 9 8 ，对甲醇的平均截留滤 为1 6 。在o 7m p a 下，1 的甜菊糖甲醇水溶液可浓缩至2 1 2 ( 浓缩液和透过液体积比 为l ：1 时) ，平均透过通量为1 9 5l m 2 h ，甲醇的回收率为4 5 。 4 、将毛细管电泳技术应用到甜菊糖絮凝工艺的分析中，选择氯化铁为絮凝剂，探索 了絮凝剂用量，搅拌时间，静置时间和温度对絮凝效果的影响。最佳絮凝条件：絮凝剂的 用量为5 2 m m l ，p h = 5 o ，絮凝温度为7 0 ，静置时间为4 0m i n ，搅拌时间1 0m i n 。 关键词：毛细管电泳；甜菊糖甙；中心复合设计；莱鲍迪苷；斯替维苷；纳滤浓缩；絮凝 a b s t r a c t a b s t r a c t s t e v i ag l y c o s i d e s ，ak i n do fm i x n l r ew h i c hc o n t a i n se i g h td i t e 印e n e9 1 y c o s i d e sp r e s e n ti n s t e v i ar e b a u d i a n ab e r t o n i a san e wn a n j r a ls w e e t e n e r ，i ti sl o wc a l o r i c ，h i g hs 、v e e ta n dn o t o x i c 田， s oi ti sav e r yp e r | e c ts u b s t i t u t ef o rs u c r o s e r e l i a b l es e p a r a t i o na n dd e t e m l i n a t i o no ft h es t e v i a 9 1 y c o s i d ei sc t l l c i a l ，b e c a u s et h et a s t eo fe a c h 龇v 砌g l y c o s i d ei sd i 饿r e n t 1 1 1 i sp a p e rs t l l d i e dt h e m e t h o dt od e t e c ta n ds e p a r a t et h es t e v i a9 1 y c o s i d e s ，an e wc 印i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) s e p a r a t i o nm e t h o d 、v a sd e v e l o p e df - o rd e t e 肌i n a t i o na n du n d e rt h ec l p i u a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) m e t h o dd e v e l o p e d ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs t e v i ae l u t i o nb yn a n o f i l t r a t i o na n dt h ef o c u l a t i o n o fs t e v i al e a v e sw e r es t u d i e d t h em a i nc o n t e n t so ft h es d u t vw e r eg i v e na sf o l l o w s ： 1 ac a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) s e p 删i o nw a sd e v e l o p e df o rs i m u l t a n e o u s d e t e r n l i n a t i o no fr e b a u d i o s i d eaa n ds t e v i o s i d ew h i c ha r et h em a i nc o m p o n e n ti ns t e v i a g l y c o s i d e t h ee f f e c t so fs e p a r a t i o nv o l t a g e ，e c t i o nt i m e ，t h ek i n do fm r m i n gb u f 诧r ， c o n c e n t r a t i o na n dp ho ft h eb u f f e ra n dm o d i f i e r sw e r ei n v e s t i g a t e d s i n g l e f a c t o rt e s t sw e r e c a r r i e do u tt os c r e e nt h ec r i t i c a li n n u e n c i n gf a c t o r sf o rt h es e p a r a t i o na 1 1 dt h eo p t i m a lc o n d i t o n s w e r eo b t a i n e db yac e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n t h eb e s ts e p a r a t i o no fr e b a u d i o s i d eaa n d s t e v i o s i d ec o u l db eo b t a i n e du s i n g5 0m mb o r a t eb u f f e r ( p h = 1o 1o ) ，c o n t a i l l i n g2 3 a c e t o n i t r i l e a n d7 m e t h a n o la sm o d i f i e r s 2 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，r aa n ds tc o u l db es e p a r a t e dw i t h i l l15m i n t h e c a l i b r a t i o nc u n ，e sh a dg o o d1 i n e a r i 付i nt h er a j l g eo fo 0 5 l0 0m g m lf o rr aa n do 0 6 10 o m g m lf o rs t ，w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i t so fo 0 1m m lf o rr aa n d0 0 2 m m lf o rs t t 1 1 e m e t h o dw a ss u c c e s s 如l l yu s e dmt h ea n a l y s i so ff o o ds 锄p l e s t h er e s u l t sw e r eg i v e na sf o l l o w s ： 2 8 r aa u l d1 0 2 s ti nt h es t e v i al e a v e s ，t h ea v e m g er e c o v e r y ( n = 3 ) i s9 5 2 f o rr aa n d 1 0 1 7 f o rs t 。t h et i a n w a u l gs t e v i as a m p l ec o n t a j n s1 3 1m g 儋r aa j l d3 5 7m gs t ，t h e a v e r a g er e c o v e 巧( n 2 3 ) i s9 8 2 f o rr aa i l d9 6 3 f o rs t t h ep u e rs t e v i as 锄p l ec o n t a i n s1 5 3 m gs t ，t h ea v e r a g er e c o v e 巧( n 2 3 ) i s9 7 5 f o rs t 3 t h ec o n c e n t r a t i o no fs t e v i ae l u t i o nb vn a n o f i l t r a t i o nw e r es t u d i e d t h en a n o f i l t r a t i o nw a s u s e df i r s t l yt o 锄e l i o r a t et e c h n i c so fs t e v i ag l u c o s i d e m w c 02 0 0n a n o f i l t r a t i o nm e m b 砌ew a s u s e dt oc o n c e n 缸a t es t e v i ag l y c o s i d e s ，t h ep e n n e a t i o nc a nb er e c y c l e dt oe l u t es t e v i ag l y c o s i d e si l l t h ea d s o r p t i o nc o l u m n ，a n dt h ei n s p i s s a t i o ng ot om en e x tt e c c s t h ea v e r a g er e t e n t i o n c o e f j f i c i e n to fs t e v i ag l y c o s i d e si s9 9 8 a n do fm e t h a i l o li s1 6 ，w i t hm ep r e s s u r e sv a r yf r o m o 2 m p at o0 7 m p a t h es t e v i ae l u e n tc o n t a i l l i n g1 ( w ) s t e v i aw a sc o n c e n t r a t e dt o2 1 a to 7 m p a w i t h 锄a v e r a g ep e n n e a t i o nn u xo f 19 5l m z h t h er e c o v e r yo fm e t h a n o l i s4 5 4 t h ec a p i l l a d rz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) m e t h o d 、v a su s e dt od e t e c ts 锄p l e si nt h e p m c e s so fn o c c u l “o n f e 仃i cc h l o r i d ew a s u s ea sf l o c c u l a n t ，t h eb e s tf l o c c u l t a t ec r a ri s ：7 0， 4 0m i ni nh e a t e dw a t e r p h = 5 o ，t h ed o s a g eo f f e r r i cc h l o r i d ei s5 2m m l k e y w o r d s ：c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ； s t e v i ag l y c o s i d e s ；r a ； s t ；c e n t r a lc o m p o s i t e d e s i g n ；n a n o f i l t r a t i o n ；n o c c u l a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日期：a 硝0 7 、 岁 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 翮熊 童尘互丝趁，日 期： 第一章绪论 第一章绪论弟一早殆下匕 1 1 研究背景 近年来，由于食糖量热量大、后味发酸、可至龋齿、肥胖、血糖高，因而食糖摄入量 过多被当代人认为是一个重要的不健康因子。无论是发达国家还是发展中国家，在其提出 的“国民健康指南 中，无一例外地劝告国民限制对蔗糖的摄入。科学家们也在不断致力 开发低热量、高甜度的功能性甜味剂。目前，被我国批准的甜味剂有2 0 种，它们分别是： 非能量型天然甜昧剂甘草；人工提取的非能量型天然甜味剂甜菊糖甙、罗汉果甙；人工生 物合成的能量型甜味剂山糖梨醇、d 甘糖露醇、赤藓糖醇；人工合成的非能量型甜味剂： 糖精钠、甜蜜素、安赛密、阿思巴甜、阿力甜、甘草酸一钾、甘草酸三钾、甘草酸胺、三 氯蔗糖。甜菊糖是一种高甜度、低热值的非发酵性的天然甜味剂。其甜度为蔗糖的2 0 0 一 3 0 0 倍，而热量却只有蔗糖的1 3 0 0 ，儿是能用蔗糖的地方都能应用甜菊糖，是目前世界己 发现，并经我国卫生部、轻工业部批准使用的最接近蔗糖口味的天然低热值甜味剂，是继 甘蔗甜菜糖之外第三种有丌发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第 三蔗糖”【l 捌，因此，其分析方法和生产工艺也日益备受人们日益关注。 1 1 1 甜菊糖甙的组成与结构 糖苷，又称糖甙，是糖分子半缩醛羟基与醇化合物发生反应失去一个水分子，生成具 有缩醛结构的衍生物。它具有原来糖分子的环形结构，但在特殊情况下也可以生成具有开 链结构的缩醛。糖苷分子中的非糖部分称为配基( a g l y c o n e ) ，配基的原化合物称为配糖 体。因配基的不同，有烷基糖苷、芳香基糖苷、 双贴糖苷及三贴糖苷等。跟据糖分子的不同，又 有葡萄糖基、鼠李糖基等。甜菊糖甙，又名甜菊 糖苷，简称甜菊糖，是从菊科草本植物甜叶菊 ( s t e v i ar e b a u d i a n a ) 的叶子中提取的含8 种成分的 双萜糖苷的混合物，按照天然植物化学的划分， 属于四环二萜的糖苷类，各组分的结构式见图1 1 及表- 1 【4 卅。 f 培烹五k 詈霎慧釜嬲y c 。；d e 。 1 1 2 甜菊糖甙的性质 糖苷一般不具备甜味，多少还带点苦味。具有较高甜味的糖苷在自然界中的数量不多， 可作为甜味剂资源加以开发的种类就更少了。而甜菊糖苷作为是一种天然的甜味剂，它以 高甜度、低热量、安全无毒等特点逐渐受到人们的青睐。在甜菊糖己知的8 种糖甙中，各 种成分的含量、口感和甜度各不相同，其中斯替维甙( s t ) 、莱鲍迪甙a ( r a ) 、莱鲍迪甙c ( r c ) 的含量较高，共占9 0 以上。r a 甜度最高，相当于蔗糖的4 5 0 倍，甜味特性也与蔗糖相接 近，是理想的甜味成分，含量最高的s t 甜味相当于蔗糖的3 0 0 倍，但具有一定的苦味和不愉 江南大学硕+ 论文 快的后味，严重影响了甜叶菊糖的味质。从目前国际国内大面积种植的甜叶菊品种分析来 看，绝大多数甜菊叶中相对含量占前三位的糖甙顺序都为s t ，r a ，r c ，详情见表1 1 【7 。9 1 。 表1 1 甜菊糖甙各组分结构 1 a b l e1t h es t m c t u r eo fs t e v i ag l y c o s i d e s g ，葡萄糖基；r h 锄，鼠李糖基；x y l ，木糖基( g l c ，g l u c o s e ；鼬锄，r h 锄n o s e ；x y l ，x y l o s e ) 1 1 3 甜菊糖甙的应用 甜菊糖原产地的人们将这种植物添加于茶叶中以增加茶叶甜度，这是甜菊糖苷最初的 用途。近些年来，由于大规模的商业化生产以及安全毒理方面详细的研究结果，使得这种 天然甜味剂在国内工业上的应用日趋广泛，并已取代了一些人工合成的甜味剂如甜蜜素、 阿斯巴甜等，广泛为糖尿病、肥胖症患者及中老年人们所食用，是一种可替代蔗糖非常理 想的甜味剂。甜菊糖色泽纯白，口感适宜，无异味，可广泛用于食品、饮料、医药、日用 化工、酿酒、化妆品等行业，用其制成的食品饮料长期食用不会使人发胖，特别适宜肥胖 病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者食用，而且物理、化学性能稳定，无发酵性， 可延长甜菊制品保质期。利用甜菊糖替代部分蔗糖加工食品饮料可降低用糖成本，也符合 低糖化要求，因此，甜菊糖是发展前景广阔的新糖源【l 眦0 。 1 1 3 甜菊糖甙的分离检测方法研究概况 因为每一种糖苷的味质都不相同，各组分比例的不同决定了甜菊糖品质的好坏，所以， 建立一种可靠的分析甜菊糖甙组分的方法至关重要，但由于各组分的分子结构和极性极为 相似，难用常规手段将其分离，因此这一课题引发了许多科学工作者的兴趣和关注，近年 来，越来越多的科学工作者们参与了甜菊糖分离检测方法的研究，并取得了一定的成果。 目前关于甜菊糖甙含量的化学分析方法主要有重量法、碱量法、分光光度法、薄层色谱法、 超临界萃取法、化学发光法、毛细管电泳法和高效液相色谱法【2 。 1 1 2 1 重量法 甜菊糖苷在酸性溶液中加热水解产生糖和甜菊糖醇，甜菊糖醇受热后发生分子重排转 2 第一章绪论 变成异甜菊苷元【2 2 1 ，如图1 2 。异甜菊苷元是一种f 酮酸，有羧基和羰基，其具有的羰基特 性可使其在酸性溶液中与2 ，4 二硝基苯肼反应，生成苯腙衍生物从水中析出，干燥称重后 可换算成总苷含量，结果计算公式为：甜菊糖苷含量= 沉淀物重量1 6 1 1 ( 1 6 1 1 = 甜菊糖 苷分子量( 8 0 4 8 6 ) 2 ，4 二硝基苯肼分子量) 【2 3 1 。该法可用于成份单一样品中甜菊糖苷和 总糖苷含量的测定。 霄 o r o h o 甜菊糖甙 甜菊醇 异甜菊醇 图1 2 甜菊糖甙水解反应方程式 f i g 1 - 2t h eh y d r o l y z a t i o ne q u a t i o n0 fs t e v i ag l y c o s i d e s 1 1 2 2 碱量法 甜菊糖甙的酸解产物异甜菊醇具有羧基和羰基，异甜菊醇不溶于水，但溶于乙醇， 利用其具有羧基的特性可用酸碱滴定法测定水解后异甜菊醇的含量，然后再换算成甜菊糖 甙的含量【2 4 1 。张雪颖等口5 1 采用碱量法对甜菊叶中甜菊糖苷的总含量进行了测定：取1 0 0m l 浸提液，置于2 5 0m l 的磨口三角瓶中，加入5m l 浓硫酸，装接冷凝管。置于可调电炉上 加热、回流，水解3 0m i n ( 内容物保持微沸计时) 。冷却，用单层慢速定滤纸过滤，沉淀用 水洗涤至p h = 7 。再用9 5 乙醇5 0m l 溶解，加1 酚酞2 3 滴，用o 0 5m o l l 氢氧化钾乙醇 标准溶液定至粉红色为终点。同时做一空白实验。甜菊糖甙的含量用下式计算：甜菊糖甙 的含量用下式计算： 黝d 盟黧掣酒o o l u u 吼 式中：c 一氢氧化钾乙醇标准溶液的浓度，m o l l ；v 氢氧化钾乙醇标准溶液消耗的体积， m l ；v l 一空白实验氢氧化钾乙醇标准溶液消耗的体积，m l ；8 0 4 8 6 一s t 的分子量； m 原 料的质量，g 。该法同样可用于成份单一样品中甜菊糖苷和总糖苷含量的测定。 1 1 2 3 分光光度法 分光光度法是根据被测物质在特定波长处或一定波长范围内具有光的吸收的特点，对 该物质进行定性和定量分析的方法。在酸性溶液中，甜菊糖苷易水解脱掉基团上的葡萄糖 基，剩下的苷元( 异甜菊醇) 不溶于水，可过滤分离。在相同的水解条件下，一定量的甜菊 糖苷可以脱落相同数量的葡萄糖，它与葸酮试剂反应生成稳定的有色化合物。由于甜菊糖 易溶于水、甲醇和乙醇，而不溶于乙醚，项秀珠等【2 6 j 采用乙醚萃取去除甜菊叶中的脂溶性 杂质，然后用乙醇提取通过硅胶层析柱去除醇溶性杂质，以达到提取分离之目的。再将所 得甜菊甙在酸性溶液中进行水解，水解产生的葡萄糖与蒽酮实际反应显色，在波长6 2 0 哪 比色测定。用乙醇提取甜菊糖甙可防止叶中的淀粉、果胶等杂质随甜菊糖甙一起进入溶剂， 江南人学硕士论文 消除了因淀粉水解产生的葡萄糖使测定值偏高而带来误差，由于甲醇沸点低、毒性大，因 此选用无水乙醇作洗脱剂避免了其他洗脱剂进入层析液所产生的干扰。该方法灵敏度高， 重现性好、结果准确，普通实验室均可应用，可用于甜菊叶中总糖苷含量的测定。 甜菊糖苷在酸性蒽酮试剂中定量水解成葡萄糖，后者与葸酮反应，在乙醇介质中生成 黄色络合物，在波长4 4 5 眦l 处有最大吸收，在这个波长下，葡萄糖浓度在1 3 8 劫咖l 范 围内与吸光度呈线性关系。黄海水等【27 j 利用上述特性以不同浓度的葡萄糖溶液做出工作曲 线，乘以一个校正系数后，即可直接得到样品中总糖苷的含量。本反应易受加热时间、酸 度、温度的影响。 1 1 3 4 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法是将样品点于薄层版上，经展开后在薄层扫描仪中进行扫描，用以进行甜 菊叶中各种苷类物质的分离、鉴别和含量测定。施荣富等1 2 3 j 以氯仿甲醇水( 3 0 ：2 0 ：4 ) 为 展开剂，以5 0 h 2 s 0 4 喷雾为显色剂，在波长3 5 01 1 i n 用薄层扫描仪进行分析，可将甜菊苷 中主要组分( d a ，r a ，r c ，s t ) 分开，其各组分的位置的排列顺序与用乙腈做流动相的 液相色谱法所得到的色谱峰一致。陈慕英等【2 2 】将甜菊提取液点样于硅胶板上，经氯仿甲 醇水( 3 5 ：2 0 ：1 ) 展开，洗脱，用葸酮硫酸显色在6 2 0 眦1 处测定甜菊糖苷含量。2 0 0 7 年 藤祥金等【2 8 】采用m e r c k 公司硅胶，以正丁醇：乙酸：乙醚：水= 9 ：6 ：3 ：1 为展丌剂，以 5 0 的硫酸喷雾为显色剂，建立了一种定性分析鉴定甜叶菊糖苷两种成分( s t 和r a ) 的薄 层层析方法。用本方法能够灵敏区分出两种甜叶菊糖苷s t 和r a 以及麦芽糖和葡萄糖。 1 1 2 5 高效液相色谱 二十世纪七十年代随着高压液相色谱( h i 曲p e r f o m l a n c el i q u i dc h r o m a t o g r 印h y ， h p l c ) 技术的快速发展，h p l c 技术成为国内外用于分离分析甜菊糖苷的重要方法之一， 并为甜菊糖苷成分分析研究提供了丰富的经验。高效液相色谱法是利用物质在不同的两相 中溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异，使混合物中各组分达到分离拉圳。 它是目前最常用的分析方法，还可以与其他技术联用，而且可配备不同的检测器，如：紫 外可见吸收检测器( u v d ) 、二极管阵列检测器( p d a d ) 、脉冲电流检测器( p a d ) 、蒸发 光散射检测器( e l s d ) 、示差折光检测器( r i d ) 和质谱检测器等( m s ) 。 紫外可见吸收及二极管阵列检测器是目前高效液相色谱法中应用最广的检测器。l i u 等【3 0 】利用固相萃取( s p e ) 技术以w h a t m a n 公司的s p ec 8 柱对样品中的甜菊糖苷进行富集， 再以“c h m s p h e rn h 2 柱为分离分析柱，采用紫外检测器在2 1 01 1 l n 处对富集后的样品进行分 离测定，该方法可以获得甜菊糖中4 种主要苷类( r a 、s t 、d a 、r c ) 的良好分离与鉴定， 但由于当时r a 、d a 、i 比的标准品暂未商业化，只有s t 的标准品，故只局限于s t 的定量测 定。t o m a sv 觚e k 等【3 l 】以价格较便宜的c 1 8 柱为分离检测柱，利用甜菊糖苷在2 0 5 衄处有紫 外吸收的特性，采用二极管阵列检测器，在3 0m i n 内完成了对甜菊水果茶中s t 的分离分析， 但该方法未检测分离出r a 。 示差折光检测器主要根据连续测定色谱流出物光折射率的变化来测定溶质浓度，原则 上凡是与流动相光折射率有差别的样品都可以用其来检测。黄晓兰等1 3 2 j 用示差折光检测器 对甜菊饮料中的甜菊糖苷进行测定，色谱条件：b o n d a p a l 【n h 2 柱，柱前加b o n d a p a ka x 4 第一章绪论 c o r a s i l 预柱，乙腈：0 0 2m o l l 州h 4 ) 2 h p 0 4 水溶液= 7 5 ：2 5 作为流动相，流速为2 om l m i n ， 该方法的最低检测浓度为o 0 2 ，标准偏差为o 2 9 9 ，回收率在9 0 以上，且该方法能在5m i i l 内将甜菊糖的4 种成分分开，并能同时与蔗糖、果糖、葡萄糖等糖类分离，便于测定富含 糖分的甜菊食品中的甜菊糖苷，简便快速，效果良好。但因折射几乎是任何有机物溶液都 存在的现象，检测器的响应只是基于溶质和缓冲液之间折射率的差别，因此此方法的灵敏 度较低。 脉冲电流检测器是利用组分的氧化还原反应产生电流的变化来进行检测，可用于具有 氧化还原性化合物的检测。由于甜菊糖属于四环二萜的糖苷类，具有氧化还原性质，故可 采用脉冲电流检测器进行检测。j a i i l a l u d d i n 灿l m e d 等【3 3 】以脉冲电流检测器( p a d ) 对甜菊叶 中的甜菊糖苷进行测定，该方法的标准曲线线性范围为1 1 0 0m l ，检出限为o - 3m g l 。 可见该方法比使用紫外检测器具有更好的灵敏度和选择性。 蒸发光散射检测器( e l s d ) 是一种质量型检测器，由于溶剂在分析中会挥发，可以有 效去除溶剂峰干扰，可以用来检测任何不挥发性化合物，尤其对于无紫外吸收或低紫外波 长吸收的化合物具有高效液相色谱其他检测器无法比拟的优越性。t a t e o 等1 3 4 j 用蒸发光散 射检测器测定新鲜甜菊叶中的甜菊糖苷，由于甜菊糖苷的紫外检测波长较低吸收较弱，因 此e l s d 对甜菊糖苷的检测灵敏度与紫外和示差折光检测器相比有明显提高。 质谱检的测器一般采用高速电子束撞击气态分子，将分解出的离子导入质量分析器 中，然后按照荷质比的大小顺序进行收集和记录下来，既得到质谱图。根据质谱图的峰位 置，可以进行定性和结构分析；根据峰强度，可以进行定量分析【删j 。j a r o s l a vp 0 1 等【3 5 j 利 用液相色谱( l c l c ) 一电喷雾离子化一时间飞行检测器( e s i t o f m s ) 分析了甜菊糖 水提取液中甜菊糖苷各组分，研究了强型阳离子交换( s c x ) ，n h 2 柱和c 1 8 柱相互结合的 时候对已知甜菊糖甙组分的分离效果。结果发现，当使用c 1 8 作为一维柱，n h 2 作为二维 柱能够将对已知甜菊糖甙组分全部分离。按3 倍噪声计算，干燥甜菊叶中s t 的捡出限为 4 3 4n g ，保留时间的r s d 中性离子 负离 子。影响毛细管电泳技术分离检测效果的因素主要有电泳模式、毛细管的尺寸，缓冲液的 种类、缓冲液的离子浓度和p h 值，有机添加剂的种类及比例、分离电压以及进样量大小 岭0 。5 3 j 。本章节利用毛细管电泳技术建立一种新的检测体系分离检测甜菊糖，探讨了毛细管 电泳分离检测条件，采用中心复合设计试验优化了分离检测条件，并将用该方法得到的实 验分离效果和已有的h p l c 法和c e 法进行了比较。 中心复合设计( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s 适n s ) 又称二次回归旋转设计，用非线性数学模型进 行拟合，应用各影响因素的二次多项式来预测其对评价指标的作用，具有试验次数少、精 江南人学硕十论文 密度高、预测性好等优点【5 4 5 卯。本章节将中心复合设计运用于毛细管电泳实验条件的优化， 比较了优化前后的分离效果，效果较好。 2 2 实验部分 2 2 1 实验材料 甲醇色谱纯 江苏汉邦科技集团有限公司 乙腈色谱纯 江苏汉邦科技集团有限公司 硼砂 分析纯国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司 r a标准品 o s a k a ，j a p a n s t标准品 o s a k a ，j a p a n 2 2 2 实验仪器 c a p e l1 0 5 毛细管电泳仪 ( 配有j 下离子高压电源，紫外检测器) 石英毛细管( 有效长度5 0c m ，内径5 0 m ) p h s 2 5 型酸度计 r 心0 0 4 电子天平 w a t e r sp 1 a t f o mz m d4 0 0 0 高效液相 色谱一质谱联用仪( 配带二极管陈列检测器) n o v a - p a r kc 1 8 色谱柱( 3 9m m 1 5 0m m ，4 m ) 俄罗斯刘梅克斯公司 河北永丰毛细管厂 上海分析仪器厂 上海精密科学仪器厂 美国w a t e r s 公司 美国w a t e r s 公司 2 2 2 溶液的制备 2 2 2 1 电泳介质溶液的配置 准确称取硼砂试剂，用水配制成不同浓度的硼砂溶液，再用0 1m o l l 的n a o h 溶液 调节到所需要的p h 值，再按照一定的比例添加乙腈和甲醇，从而可得到实验用的电泳介 质溶液。 2 2 2 2 标准溶液的配置 将标准样品置于1 0 5 干燥烘箱中，烘两小时，分别准确称取s t 和r a 标准品，用水 溶解配制，使质量浓度均为l o o om 咖l ，室温保存。使用时，根据需要用水稀释成不同 浓度的标准液。 2 3 实验方法 2 3 1 毛细管电泳条件的选择和优化 通过单因素实验探索毛细管电泳方法初步条件，确定主要影响因素及其取值范围，在 此基础上，再利用中心复合设计对实验条件进行优化，得到最佳实验条件。 1 2 第二章高效毛细管电泳分离检测甜菊糖方法的建立 2 3 2 结果比较 2 3 2 1 色谱及质谱条件 色谱条件：色谱柱为n o v a p 酞c 1 8 柱( 3 9n m 1 5 0 衄，4 m ) ；流动相为v ( 甲醇) ：v ( 水) = 6 5 ：3 5 ；柱温为室温；流速为1 oi i l l ，i i l i n ；进样量为2 咄l ；d a d 检测( 2 0 0 4 0 0n m ) 。 质谱条件：e s i 离子源电离；毛细管电压为4 0 6k v ；锥孑l 电压3 6v ；离子源温度：1 0 0 ； 脱溶剂温度：2 5 0 ；干燥器流量为4 2l 1 1 ；扫描质量范围：2 0 0 1 6 0 0 ；负离子模式；m a s s l y i 4 o 色谱工作站。 2 3 2 2 国内已有的毛细管电泳法： 毛细管电泳条件：分离电压为2 8 k v ，分离温度为3 0 ，运行缓冲液：6 0 删m o l lt r i s 一硼酸缓冲液( p h = 8 o ) ，检测波长为2 1 0 呦。 2 3 2 3 新建立的毛细管电泳法 运行缓冲液为5 0m m o l l 的硼砂缓冲液( p h = l o 1 0 ) ，加入2 3 乙腈和7 甲醇作为 有机添加剂，分离温度为2 5 ，分离电压为2 0k v ，检测波长为2 1 0 衄。 2 4 数据处理方法 实验结果用s a s 软件处理进行数据处理。 2 5 结果与讨论 2 5 1 分离模式的选择 毛细管电泳有许多不同的模式，因而再分离样品前必须很好的选择分离模式，以达到 最佳的分离效果。毛细管电泳模式的选择，可以有不同的原则，比如简单性、目的性、普 适性、选择性、样品特异性等，根据甜菊糖样品溶于水的性质，我们以简单、普适性为原 则，首先考虑自由溶液分离模式，即毛细管区带电泳模式。 2 5 2 毛细管尺寸的选择 本实验选择毛细管内径为5 毗m ，有效长度为5 0c m 作为分离分析柱，效果较好。 2 5 3 分离介质种类的选择 毛细管区带电泳介质实际上是一种具有p h 缓冲能力的均匀的自由溶液，通常称为电 泳缓冲液( r 啪n i n gb u 髓r ) ，简称缓冲液( b u 脓) ，由缓冲试剂、p h 调节剂、溶剂和添加 剂组成，缓冲液的选择，可分为p h 与缓冲试剂选择、添加剂选择和溶剂选择等部分。 2 5 3 1 p h 调节剂及缓冲试剂 缓冲体系由缓冲试剂和p h 调节剂两部分组成。利用毛细管电泳分离糖首先必须解决 电荷问题。除糖醛酸、唾液酸、氨基糖及一些硫酸化糖外，天然糖是不带电荷的，不能在 电场中迁移。但由于糖属于多羟基化合物，能和硼酸根形成带负电的络离子，如图l ，其 中b c 一和c b c 一动态共存，其比率取决与糖和硼酸根的摩尔比( c b ) ，在高c b 下，c b c 一占多数，反之，b c 一占多数。在c e 中，硼酸根的浓度多在1 0 0 舢m o l l 以上，而样品浓 度多在o 1m o l l 以下，c b 很小，所以b c 一占主导地位并控制了分离的选择性。但图中平 1 3 江南大学硕十论文 。，、，。一m 一罕一硇o d 一卒一 硪。礅一+ 畔) n 专土 三聋+ 幽 间【5 0 】。我们考察了缓冲液体系p h 值在8 0 0 1 1 o o 之间对分离检测的影响。p h 的取值对体系 酸根的络和程度增大，所带负电荷也随之增加【5 0 1 ，从而样品电泳速度加快。因此，样品的 1 4 第二章高效毛细管电泳分离检测甜菊糖方法的建立 衄o n ，6 0m o l l 之间，分离效果较好。 2 5 4 3 有机添加剂比例的影响 乙腈单独做为有机添加剂加入时，随着乙腈的比例增加，分离度也明显得到改善。当 乙腈的比例超过3 0 时，两峰能得到较好的分离，但峰拖尾较严重，体系易导致硼砂在缓 冲液中结晶，堵塞毛细管柱。由于甲醇和乙腈的极性较为相似，且硼砂在甲醇中的溶解度 较好，不易导致缓冲液结晶，甲醇还可起到降低电渗流，进一步改善分离度的作用，故为 了得到更稳定的体系，实验尝试将有机添加剂的比例控制在3 0 ，通过改变乙腈和甲醇的 比例来达到预期目的，效果较好。随着甲醇比例的增加，分析时间延长，分离度增大，但 甲醇比例太大时，分离度又明显下降，且噪音增大。 2 5 4 4 分离电压和进样量的初步选择 试验了分离电压对被测组分迁移时间和分离度的影响。随着电压的增大，由于分析时 间的减小，两峰宽也随之变窄，故分离度降低不是很明显。实验发现，分离电压在1 2k v 一15k v 间r a 和s t 都能达到良好分离。 分离电压为1 5k v ，选择进样时间为4 、6 、8 、1 0 、1 2 、1 5s ，考察进样量的影响。随 着进样量的增大，灵敏度增大，当进样时间超过1 0s 时，峰高增加不明显，却引起峰展宽 和峰拖尾等负面影响，故选择进样时间选择为1 0s 。 2 5 5 中心复合设计优化 2 5 5 1 实验方案设计 选取影响较为显著的三个因素( 离子浓度，乙腈和甲醇的比例，p h ) 进一步进行中心 复合设计试验，考查各因素的交互效应，以得到最佳分离检测条件。试验设计原理： n = 2 p + 2 p + m o ，其中n 为试验次数，p 为因素个数，m o 为在中心试验点重复试验次数。对 于每一个因素蜀( j = 1 p ) ，如z 2 为因素上限，z 1 为因素下限，则该因素的o 水平为： z o = ( z l + z 2 ) 2 ，设j 为某个因素水平变化区间，则j = ( z 1 + z o ) y ，其中y 为星号臂，由正 交性确定。对于p 个因素，如果在一次正交回归部分安排了2 p 次试验，则称为全面实施， 三因素五水平完全试验y = 1 6 8 2 。参考单因素实验，实验设置的因素及编码水平见表一， 其中编码水平+ y = z 2 ，+ 1 = z o + j ，o = z o ，一1 = z o 一j ，一y = z l 。 表2 2 实验的因素与编码水平 t a b l e2 21 1 1 ep a r 锄e t e rv a l u e sa n dt h e i rl e v e l su s e df o rc e n 仃a lc o m p o s i t ed e s i g n 实验方案设计需要1 5 个实验，8 个三因素全面实施试验( 2 3 ) ，在全面实施的基础上 增加6 个星号试验( 2 3 ) 以及一个中心试验作二次回归。为了评估整体误差，我们增加 五个中心试验，即在中心试验点重复6 次( m o = 6 ) 。2 0 个试验( n = 2 0 ) 随机安排以避免 1 5 江南大学硕+ 论文 系统误差【5 4 】。实验设计及结果见表2 3 ，其中1 8 号为三因素五水平的全面实施试验，9 1 4 号为星号试验，1 5 2 0 号试验为中心试验。 表2 3 二优化三冈素的实验设计和结果 t a b l e2 - 3d e s i g n0 fe x p e r i m e n ta n di t sr e s u l t s 运用s a s 软件对表2 2 实验数据进行归分析，得响应曲面二次多元回归模型为： y 1 ( 分离度) = 8 1 3 6 9 + o 0 0 5 5 7 8 母x l - 1 4 3 4 6 3 2 木x 2 + 1 6 6 0 1 5 8 木x 3 0 o 0 0 0 2 5 ，i c x l 幸x 1 0 0 0 1 1 4 6 幸x 1 ，| x 2 + o o 0 0 5 2 1 母x 1 串x 3 0 0 1 2 4 5 6 母x 2 木x 2 + 0 1 5 6 2 5 木x 2 水x 3 0 8 4 1 7 3 乖x 3 宰x 3 ( r 2 = 9 3 2 ) y 2 ( 迁移时间) = 2 2 1 7 6 8 4 + 2 1 4 2 8 0 l 木x l - o 2 0 1 7 5 9 木x 2 + 0 。2 4 2 3 3 8 木x 3 + 0 4 4 5 9 5 4 木x l 木x 1 0 4 2 1 2 5 母x 1 母) ( 2 o 2 3 3 7 5 枣x 1 x 3 0 1 2 1 4 9 9 木) ( 2 木) ( 2 + o 2 5 3 7 5 木) ( 2 木x 3 0 4 0 2 5 7 5 枣x 3 枣x 3 ( r 2 = 9 0 1 4 ) 2 5 5 2 响应面分析及最佳条件的确定 根据响应曲面模型法分析数据可以绘出三因素影响趋势预测图及响应面图，以确认 x 1 、) ( 2 和x 3 对分离度和迁移时间的影响及其最佳取值范围。图2 2 为三因素影响的预测 模型，与单因素实验各