（急诊医学专业论文）辛伐他汀对脓毒症肝功能的影响.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要3 研究论文辛伐他汀对脓毒症肝功能的影响 前言6刖舌 材料与方法：6 结果1o 附表”1 l 讨论”12 结论17 参考文献19 综述他汀类药物对脓毒症休克肝功能的影响2 3 致谢3 4 个人简历- 3 5 中文摘要 辛伐他汀对脓毒症肝功能的影响 摘要 目的：脓毒症( s e p s i s ) 是由感染引起的炎症反应综合症，最终导致器 官功能障碍。严重脓毒症在i c u 及其他危重病人中很常见，每年临床大 量病人因脓毒症而死亡。最近十多年尽管新的抗生素不断问世，重症护理 也不断改进，但脓毒症的死亡率仍居高不下。从2 0 世纪7 0 年代开始，对 脓毒症的主流观念认为其是失控的炎症级联反应，最终导致器官衰竭及死 亡，而随后的研究主要集中在炎症的目标上。最近，可通过抑制h m g c o a 还原酶达到降脂目的的他汀类药物因为他的免疫调节效应以及抗炎作用 受到了关注。本研究应用盲肠结扎及穿孑l ( c l p ) 方法制作大鼠脓毒症模型， 进而观察辛伐他汀在脓毒症治疗方面的有效性的情况，以期对临床诊断和 治疗提供帮助。 方法：清洁级健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科大 学实验动物中心，合格证编号：9 0 9 0 4 3 ) 。随机分为4 组，i 组：正常对照 组( 8 只) ；i i 组：假手术组( 2 4 只) ；i i i 组：脓毒症模型组( 2 4 只) ；i v 组： 辛伐他汀干预后造模组( 2 4 只) 。除正常组外各实验组按处死大鼠留取标本 时间点( 6 小时、2 4 小时和4 8 小时) ，分为3 组，每组8 只。本实验采用 应用盲肠结扎及穿孑l ( c l p ) 方法制作大鼠脓毒症模型，以大鼠出现精神倦 怠、躁动、寒战、腹胀、眼角分泌物增多、竖毛等表现，直肠温度较造模 前升高或降低l 视为造模成功的标志。给药方法如下：i 组：正常对照 组( 经大鼠灌胃针饲入l m l 生理盐水) ；i i 组：假手术组( 1 m l 生理盐水) ；i i i 组：脓毒症模型组( 1 m l 生理盐水) ；i v 组：辛伐他汀干预后造模组( 辛伐 他汀2 0 m g k g d ) 。给药时间为1 4 天。正常对照组大鼠给药1 4 天后即留取 血液标本。脓毒症模型组、假手术组及辛伐他汀干预后造模组大鼠分别在 制模及手术成功后6 h 、2 4 h 、4 8 h 留取血液标本。应用酶联免疫吸附试验 ( e l i s a ) 的方法检测血液标本中谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 及谷氨酸脱氢酶 ( g l d h ) 水平。 结果： 1 大鼠一般表现： 中文摘要 脓毒症模型组及辛伐他汀干预后造模组在手术后2 3 h 后大鼠可自由 饮水，6 8 h 出现精神倦怠、躁动、寒战、腹胀、眼角分泌物增多、竖毛 等表现，用电子体温计测直肠温度较造模前升高或降低l 。假手术组在 手术后2 3 h 后可自由饮水及活动，未再表现出任何异常状态。 2 谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) ： 造模后i i i 组及i v 组g s t 均进行性升高；造模后按6 h 、2 4 h 、4 8 h 各 时间段进行各组间比较，i 组与i i 组差别不显著( p o 0 5 ) ；i i i 组较i 组 g s t 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i i i 组较i i 组g s t 显著升高 ( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i v 组较i 组g s t 显著升高( p o 0 5 ) ，差 别有统计学意义；i v 组较i i 组g s t 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意 义；i v 组较i i i 组g s t 降低( p o 0 5 ) ；i i i 组较i 组 g l d h 显著升高俾 o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i i i 组较i i 组g l d h 显著 升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i v 组较i 组g l d h 显著升高( p o 0 5 ) ， 差别有统计学意义；i v 组较i i 组g l d h 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计 学意义；i v 组较i i i 组g l d h 降低( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义。 结论： 1 应用盲肠结扎及穿孔的方法可制造出大鼠脓毒症的模型。 2 脓毒症大鼠血清谷氨酸脱氢酶及谷胱甘肽硫转移酶水平均明显升 高，提示脓毒症导致肝脏微循环灌注不足，引起肝细胞的缺血、缺氧而发 生肝细胞及线粒体损伤。 3 辛伐他汀可降低脓毒症时血清谷氨酸脱氢酶及谷胱甘肽硫转移酶 水平。进而我们可以认为辛伐他汀可改善脓毒症时肝脏微循环灌注情况。 但其并不能从根本上对脓毒症起到治疗的作用。 关键词：辛伐他汀；脓毒症；盲肠结扎穿孔；谷氨酸脱氢酶；谷胱甘 肽硫转移酶 t h ei n f l u e n c eo fs i m v a s t a t i no ns e p t i cl i v e rf u n c t i o n a b s t r a c t o b je c t i v e s ：s e p s i si sa ni n f e c t i o n i n d u c e di n f l a m m a t o r ys y n d r o m et h a t u l t i m a t e l yl e a d st oo r g a nd y s f u n c t i o n s e v e r es e p s i si sv e r yc o m m o ni ni c u a n do t h e rc r i t i c a l l yi l lp a t i e n t s ，al a r g en u m b e ro fc l i n i c a lp a t i e n t sd i ee a c hy e a r f r o ms e p s i s i nr e c e n tt e ny e a r sd e s p i t en e wa n t i b i o t i c sc o n t i n u o u s l ya p p e a r ， i n t e n s i v ec a r ec o n t i n u o u si m p r o v e ，s e p s i si ss t i l lh i g hm o r t a l i t y f r o mt h e 19 7 0 s ，m o s ti n v e s t i g a t o r sw o u l da g r e et h a ts e v e r es e p s i si sa c c o m p a n i e db y t h ei n a b i l i t yt or e g u l a t et h ei n f l a m m a t o r yr e s p o n s e ，e v e n t u a l l yl e a d st oo r g a n f a i l u r ea n dd e a t h r e c e n t l y ，s t a t i n s ，i n h i b i th m g c o ao x i d o r e d u c t a s er e a c h e s t h eo b j e c t i v eo fc h o l e s t e r o l l o w e r i n g ，h a v ea l s ob e e nc h a r a c t e r i z e db yt h e i r i m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t s ，a sw e l la sa n t i i n f l a m m a t o r yp r o p e r t i e s i no u r t e s t s s i m v a s t a t i ni sp r e t r e a t e do nt h er a ts e p t i cm o d e lw h i c hi sm a d eb y c a e c u ml i g a t e da n dp u n c t u r ( c l p ) ，i no r d e rt oo b s e r v es i m v a s t a t i n c u r a t i v e e f f e c ti ns e p s i s ，t h e np r o v i d eh e l pf o rc l i n i c a ld i a g n o s i sa n dt r e a t m e n t m e t h o d s ：e i g h t y c l e a na n dh e a l t h yf e m a l ew i s t a rr a t sw e i g h t2 0 0 - 2 5 0 9 ， ( s u p p l i e db y t h ee x p e r i m e n t a la n i m a lc e n t e ro fh e b e im e d i c a lu n i v e r s i t y ) w e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p s g r o u pi ：h e a l t h yc o n t r o lg r o u p ( 8r a t s ) ；g r o u p i i ：s h a mo p e r a t i o ng r o u p ( 2 4r a t s ) ；g r o u pi i i ：m o d e lg r o u p ( 2 4r a t s ) ；g r o u pi v ： m o d e l g r o u pp r e - t r e a t e db ys i m v a s t i n ( 2 4r a t s ) e x c e p th e a l t h y c o n t r o l g r o u p ，o t h e rg r o u p sw e r ed i v i d e di n t ot h r e es u b g r o u p sa c c o r d i n g t ot h et i m eo f d r a w i n gb l o o d ( 6 h ，2 4 ha n d4 8 h ) ，t h en u m b e r o f e a c hs u b g r o u pi s8 t h es e p t i c m o d e l sw e r em a d eb yc a e c u ml i g a t i o na n dp u n c t u r ea f t e rt r e a t m e n tf o r2 w e e k s r a t sa p p e a r e dm e n t a lb u r n o u t ，t h ea b d o m i n a ld i s t e n s i o n ，r e s t l e s s n e s s ， s h i v e r , c a n t h a ls e c r e t i o ni n c r e a s e d ，h a i r si nd i s o r d e r , r e c t a lt e m p e r a t u r er a i s e o rl o w e r1 a st h es y m b o lo fs u c c e s s t h er a t si ng r o u p i v w e r ea d m i n i s t r a t e d w i t hs i m v a s t a t i n ( 2 0 m g k g d a y ) b yc o n t i n u o u s l y , o n c ead a y t h eo t h e rt h r e e g r o u p sw e r eg i v e nn o r m a ls a l i n eo ft h es a m ev o l u m ev i ag a s t r i ct u b ef o r2 w e e k s t h eb l o o ds p e c i e m e n so fg r o u p1w e r et a k e na f t e rs i m v a s t a i nf o r2 3 英文摘要 w e e k s t h eb l o o ds p e c i e m e n so fg r o u pi i ，g r o u pi i ia n dg r o u pi vw e r et a k e n a f t e ro p e r a t i o nf o r6 h ，2 4 h ，4 8 hr e s p e c t i v e l y t h ev a l u e so fg s ta n dg l d hi n t h eb l o o ds p e c i e m e nw e r em e a s u r e db ym e a n so fe n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) r e s u l t s ： 1t h eg e n e r a lp e r f o r m a n c eo fr a t s ：t h er a t so fg r o u pi i ia n dg r o u p i v c o u l dd r i n kw a t e rf r e e l ya f t e ro p e r a t i o nf o r2 - 3 h ，r a t sa p p e a r e dm e n t a l b u r n o u t ，t h ea b d o m i n a ld i s t e n s i o n ，r e s t l e s s n e s s ，s h i v e r , c a n t h a ls e c r e t i o n i n c r e a s e d ，h a i r si nd i s o r d e rf o r6 8 h ，m e a s u r i n gr e c t a lt e m p e r a t u r eb y e l e c t r o n i ct h e r m o m e t e r , t h e s ew e r er i s e no rr e d u c e d1 t h er a t so fg r o u pi i c o u l dd r i n kw a t e rf r e e l ya f t e rs h a mo p e r a t i o nf o r2 - 。3 h ，w i t h o u ta n ya b n o r m a l c o n d i t i o n 2g s t ：b o t ho ft h ev a l u e so fg s ti ng r o u pi i ia n dg r o u p1 vp r o g r e s s i v e l y i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rc l p ；c o m p a r i s o no f e a c hg r o u pb yt h et i m eo f d r a w i n gb l o o d ，t h ed i f f e r e n c eb e t w e e ng r o u pia n dg r o u p1 1w a sn o ts i g n i f i c a n t g s ti ng r o u p1 1 1w a sh i g h e rt h a ng r o u pi ( p o 0 5 ) ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t ；g r o u p1 1 1w a sh i g h e rt h a ng r o u pi i ( p o 0 5 ) ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t ；g r o u pi vw a sh i g h e rt h a ng r o u pi ( p 0 0 5 ) ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t ；g r o u pi vw a sh i g h e rt h a ng r o u pi i ( p 0 0 5 ) ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t ；g r o u p1 1 1w a sh i g h e rt h a ng r o u pi v ( p 0 0 5 ) ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t 3g l d h ：b o t ho ft h ev a l u e so fg l d hi ng r o u pi i ia n dg r o u pi v p r o g r e s s i v e l yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rc l p ；c o m p a r i s o no f e a c hg r o u pb y t h et i m eo fd r a w i n gb l o o d ，t h ed i f f e r e n c eb e t w e e ng r o u pia n dg r o u pi iw a s n o ts i g n i f i c a n t g l d hi ng r o u p1 1 1w a sh i g h e rt h a ng r o u pi ( p o 0 5 ) ，t h e d i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ；g r o u p1 1 1w a sh i g h e rt h a ng r o u pi i ( p o 0 5 ) ，t h e d i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ；g r o u pi vw a sh i g h e rt h a ng r o u pi ( p 0 0 5 ) ，t h e d i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ；g r o u pi vw a sh i g h e rt h a ng r o u pi i ( p o 0 5 ) ，t h e d i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ；g r o u p1 1 1w a sh i g h e rt h a ng r o u pi v ( p o 0 5 ) ，t h e d i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t c o n c l u s i o n s ： 4 英文摘要 1t h e s e p t i cr a tm o d e lc o u l d b em a d es u c c e s s f u l l yb yc l e 2t h ev a l u e so fg s ta n dg l d ho ft h es e p t i cr a t si ns e r u mi n c r e a s e s i g n i f i c a n t l y i tp o i n t et h a ts e p s i s c a u s e sl i v e rm i c r o c i r c u l a t i o np e r f u s i o n i n a d e q u a c y , c a u s e sl i v e rc e l li s c h e m i aa n dh y p o x i a ，e v e n t u a l l yd a m a g e sl i v e r c e l la n dm i t o c h o n d r i a 3s i m v a s t a t i nc o u l d1 0 w e rt h ev a l u e so fs e r u mg s t a n dg l d ho fs e p t i c r a t s t h e nw ec a np r e s u m et h a ts i m v a s t a t i nc a ni m p r o v et h es e p t i cl i v e r m i c r o c i r c u l a t i o np e r f u s i o n b u ti tc a n n o tc o m p l e t e l yt r e a t m e n to fs e p s i s k e yw o r d s ：s i m v a s t a t i n ；s e p s i s ；c a e c u ml i g a t e da n dp u n c t u r ；g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e ( g l d h ) ；g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) 研究论文 辛伐他汀对脓毒症肝功能的影响 - ! 鱼 翮青 脓毒症( s e p s i s ) 是由感染引起的全身炎症反应综合症，最终导致多器 官功能障碍。严重脓毒症在i c u 及其他危重病人中很常见，在美国，每 年有7 5 0 0 0 0 例病例，其中6 8 需要在i c u 治疗。而在世界范围内住院病 人死亡率一直维持在3 0 5 0 ，而因为脓毒症每年死亡5 0 0 0 0 0 人。与急 性心肌梗死患者的死亡率相当，而且这个数字在以每年1 5 的比例增加 f 。很早以前对脓毒症患者就开始使用抗生素和支持治疗，而结果难以有 所改善。在大量对脓毒症病人的临床研究中，稳定循环、小潮气量通气、 小剂量糖皮质激素、严格控制血糖等，虽然在一定程度上减低了死亡率， 但总体结果并不理想。从2 0 世纪7 0 年代开始，对脓毒症的发病机制主要 认为是失控的炎症级联反应，最终导致器官衰竭及死亡，而随后的研究主 要集中在对炎症反应调控。人们普遍认为，脓毒症反映了微生物的入侵与 机体防御机制之间的失衡。正常情况下炎症反应能清除入侵的微生物而不 造成持续的损害。若在脓毒症发生时宿主炎症反应不适当的放大，则会导 致机体一系列的病理生理紊乱，之后出现异常【2 1 。最近，具有降脂作用的 他汀类药物因其免疫调节效应以及抗炎作用受到关注。美国学者在第3 8 届美国重症医学会年会上报告，用中至大剂量他汀类药物，可使脓毒症患 者的死亡率下降2 0 。本研究应用盲肠结扎及穿孑l ( c l p ) 方法制作大鼠脓 毒症模型，进而观察辛伐他汀在脓毒症治疗方面的有效性以及对肝功能的 影响，以期对临床脓毒症防治提供理论依据。 材料与方法 1 实验材料 1 1 实验动物： 清洁级健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科大学实验 动物中心，合格证编号：9 0 9 0 4 3 ) 。饲养于恒温( 2 0 ) 清洁饲养室，喂养普 通大颗粒饲料，给予充足水分，通风良好，温度适宜，所有大鼠实验前均 研究论文 于饲养室适应性饲养一周。实验前禁食1 2 h ，自由饮水。 实验分组：8 0 只大鼠随机分为4 组，i 组：正常对照组( 8 只) ；i i 组：假 手术组( 2 4 只) ；i i i 组：脓毒症模型组( 2 4 只) ；w 组：辛伐他汀干预后造 模组( 2 4 只) 。除正常组外各实验组按处死大鼠留取标本时间点( 造模后6 小时、2 4 小时和4 8 小时) ，随机分为3 组，每组8 只。 1 2 主要仪器： 动物手术操作台、手术器械、离心试管、注射器( 1 m l 、2 m l 、5 m 1 ) 、 2 4 静脉穿刺套管针、动脉夹、纱布等。 大鼠灌胃针( z h 0 6 1 6 ) 电子体温计( 欧姆龙m c 1 4 0 ) 酶标仪( b i o t e ke l x 8 0 0 美国) 微量振荡器( 无锡县金城仪器厂w e s i l i a 型) 扭力天平( t n 1 0 0 f 扭力) 台式高速冷冻离心机( n e o f u g e l 3 r ) 电热恒温水浴箱( 6 0 c m ) 超低温保存箱( d m 8 6 l 39 6 ) 制冰机( a f l 0 0 ) 三通及测压装置等。 1 3 主要药品及试剂： 水合氯醛( 天津市大茂化学试剂厂) 大鼠谷氨酸脱氢酶e l i s a 检测试剂盒( r d 美国) 大鼠谷胱甘肽硫转移酶e l i s a 检测试剂盒( r & d 美国) 辛伐他汀片( 杭州默沙东制药有限公司国药准字h 1 9 9 9 0 3 6 6 ) 2 实验方法： 2 1 药物干预： 2 1 1 药物及剂量：所有大鼠实验前于饲养室适应性饲养一周后，经大鼠 灌胃针按如下剂量给药：辛伐他汀干预后造模组每只老鼠按辛伐他汀 2 0 m g k g d 将辛伐他汀片碾碎后溶于l 毫升生理盐水灌胃，其余各组给予 等量生理盐水，给药时间为1 4 天。 2 1 2 给药方法：将动物放置鼠笼盖或其他惰性台面，用左手拇指和食指 抓住动物双耳及头部皮肤，将头部提起向右上倾，使动物口腔朝上，前肢 研究论文 抬起，后肢接触台面。右手持注射器，先将灌胃针从大鼠门齿与臼齿间的 裂隙插人口腔内，再沿上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针继续经口进入时， 稍感有抵抗，此位置相当于食道通过膈肌的部位。灌胃针进入深度为5 c m 左右。如此时动物安静，呼吸无异常，可将药物注人。 2 2 大鼠模型制作： 2 2 1 麻醉：1 0 水合氯醛3 5 0 m g k g 腹腔麻醉，腹腔注射时将大鼠头部 放低，尾部抬高，选择在下腹部靠外侧进针，针尖通过腹肌抵抗力消失后 回抽无回血注射麻醉药，大鼠麻醉后仰位固定于手术台上。 2 2 2 盲肠结扎穿孔：刮除腹部毛发，消毒，腹部正中切口，约2 3c m ， 逐层打开腹腔，找到盲肠，用4 号丝线在距离回盲瓣l c m 处，避开盲肠 动、静脉，在血管弓内侧结扎，以1 8 号针头在距盲肠末端约l c m 处穿刺 3 次，见少量肠内容物流出，留置一条宽2 r a m 的橡皮条贯穿盲肠，防止 针孔闭合。将盲肠放回腹腔，关腹。术毕在股部皮下注射生理盐水2 m l 1 0 0 9 抗休克。之后将动物放回饲养笼中，麻醉清醒后自由活动、进食、饮水。 假手术组仅开腹后翻动盲肠，而不行盲肠结扎穿孔，然后关腹。术毕 同样在股部皮下注射生理盐水2 m l 10 0 9 抗休克。之后将动物放回饲养笼 中，麻醉清醒后自由活动、进食、饮水。 2 2 3 造模成功标志：大鼠出现精神倦怠、躁动、寒战、腹胀、眼角分泌 物增多、竖毛等表现，直肠温度较造模前升高或降低l 视为造模成功的 标志。观察期间出现死亡的动物将其排除，并重新造模补充。 2 3 标本收集： 2 3 1 颈动脉插管：剪去大鼠颈部被毛后，在颈中部作一皮肤切口，用血 管钳逐层钝性分离颈部肌肉。分离出颈动脉后，用动脉夹将近心端及远心 端夹闭，用2 4 # 静脉穿刺套管针行颈动脉穿刺，穿刺成功后拔出针芯，用 1 0 号丝线将外套管固定。 2 3 2 血液标本：从颈动脉抽取2 3 m l 血液，离心机3 0 0 0 r p m ，10 m i n 取上 清液，并放于7 0 冰箱保存。正常对照组大鼠给药1 4 天后即留取血液标 本。假手术组、脓毒症模型组及辛伐他汀干预后造模组大鼠分别在制模及 手术后6 h 、2 4 h 、4 8 h 留取血液标本。 2 4 实验指标： 应用酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 的方法检测血液标本中谷胱甘肽硫转 研究论文 移酶( g s t ) 及谷氨酸脱氢酶( g l d h ) 水平。 2 5 实验原理及步骤： 2 5 1 实验原理：g l d h g s t 试剂盒采用固相夹心法酶联免疫吸附试验。 已知g l d h g s t 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行 检测。先将g l d h g s t 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲 和素标记过的h r p 。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后 加入底物a 、b ，和酶结合物同时作用，发生变色。颜色的深浅和样品中 g i ，d h ，g s t 的浓度呈比例关系。 2 5 2 检测步骤： 2 5 2 1 使用前，将所有试剂充分混匀。 2 5 2 2 按比例依次稀释标准品。 2 5 2 3 取出酶标板，依照次序对应加入5 0 u l 的标准品于空白微孔中。 2 5 2 4 分别标记样品编号，加入5 0 9 l 待测样品于空白微孔中。 2 5 2 5 在标准品孔中和样品孔中加入5 0 m 生物素标记的抗体。 2 5 2 6 轻轻摇荡混匀，3 7 水浴孵育反应4 5 分钟。 2 5 2 7 洗板机清洗5 次，每次静置1 0 2 0 秒。3 7 水浴孵育反应3 0 分钟。 2 5 2 8 在标准孔中和样品孔中加入1 0 0 山的亲和链酶素h r p 。洗板机清 洗5 次，每次静置1 0 2 0 秒。 2 5 2 9 轻轻摇荡混匀，3 7 。c 水浴孵育反应3 0 分钟。 2 5 2 1 0 洗板机清洗5 次，每次静置1 0 2 0 秒。 2 5 2 1 1 每孔加入底物a 、b 各5 0 山。每孔加入5 0 1 a l 的终止液，终止反应。 2 5 2 1 2 轻轻摇荡混匀，3 7 水浴孵育反应5 分钟。避免光照。 2 5 2 1 3 每孔迅速加入5 0 9 l 的终止液，终止反应。 2 5 2 1 4 将标准品及样品置于波长为4 5 0 n m 的酶标仪上读取各孔的o d 值。 2 5 2 1 5 以吸光度o d 值为纵坐标( y ) ，相应的g l d h g s t 标准品浓度为 横坐标( x ) ，做得相应曲线，根据o d 值由标准曲线换算出相应样品 g l d h g s t 的浓度，再乘以稀释倍数，得出样品的实际浓度。 3 统计处理：全部数据采用s p s s l 0 0 统计软件包进行统计，计量资料数 据以均数4 - 标准差( s ) 表示，组间差异采用单因素方差分析及q 检验，p o 0 5 ) ；i i i 组较i 组 g s t 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i i i 组较i i 组g s t 显著升高 伊 o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i v 组较i 组g s t 显著升高( p o 0 5 ) ，差 别有统计学意义；组较i i 组g s t 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意 义；i v 组较i i i 组g s t 降低( p o 0 5 ) ；i i i 组较i 组 g l d h 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i i i 组较i i 组g l d h 显著 升高( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义；i v 组较i 组g l d h 显著升高( p o 0 5 ) ， 差别有统计学意义；i v 组较i i 组g i _ d h 显著升高( p o 0 5 ) ，差别有统计 学意义；i v 组较i i i 组g l d h 降低( p o 0 5 ) ，差别有统计学意义。 研究论文 附表 t l b l e1r e s u l t so fg l d hi ne a c hg r o u p ( x + s p g m l 1 ) c o m p a r e dt og r o u pha p 0 0 5 ；c o m p a r e d t og r o u pi i ：p o 0 5 ；c o m p a r e d t og r o u pi i i p o 0 5 。 i i i i i i v 8 2 5 16 士2 6 4 2 4 3 3 士2 5 8 2 6 8 6 士1 4 0 8 5 0 6 士3 0 7 a 7 1 5 3 士5 3 4 a # 1 0 2 4 8 士5 2 8 a # 83 8 2 9 士4 6 5 a * * 4 9 4 1 士5 9 5 a * * 7 2 7 4 士7 4 1 c o m p a r e d t og r o u pi ：a p 0 0 5 ；c o m p a r e dt og r o u pi i ：p o 0 5 ；c o m p a r e d t og r o u pi i i ：p o 0 5 。 研究论文 讨论 1 模型制备方法的选择： 目前，临床上较常应用的动物脓毒症模型主要分为以下几类：施加 外源性毒素或有活力的病原菌，例如：脂多糖( c p s ) 、内毒素、细菌等； 改变动物内在的保护屏障，例如：盲肠结扎穿孑l ( c l p ) 。 在施加外源性毒素或有活力的病原菌的造模方法中，以使用l p s 最 为多见。l p s 是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，而革兰氏阴性菌是目前引 起脓毒症休克的主要致病因素。这种方法操作简单，便于控制。 但是，采用小剂量内毒素攻击，动物受到的打击是短暂、一过性的， 像啮齿类动物这种对内毒素敏感性不强的种属极易耐受【6 】。 而大剂量内毒素攻击，动物在没有充分液体复苏和其他支持治疗情 况下表现的是低血流动力学状态，血中促炎因子大量释放，持续时间短， 内毒素及促炎因子升高幅度远远高于临床患者r 7 1 。动物在短时间内死于内 毒素休克，没有充分的时间发展成为持续的促炎、抗炎反应并表现出脓毒 症的临床特征性变化。若给予动物充分的支持治疗，可将低动力循环转变 为高动力循环，但操作繁琐，需要较高的实验条件，用于样本较大的有关 防治研究存在一定困难。 持续小剂量门静脉输入内毒素，可模拟人类脓毒症时内毒素从感染灶 持续小剂量释放入血的特点，动物可表现出高动力循环、持续高代谢和全 身炎症反应，但动物创伤大，需要长时间麻醉，对实验条件要求高，且啮 齿类动物同样易耐受，因此也有一定局限性。 应用c l p 的方法穿孔后是否盲肠包裹关系到动物的预后，并受施术 者手法( 穿孔大小、盲肠结扎程度) 和动物个体差异( 动物年龄、性别、种系) 等影响，不易人为控制。 但是模型操作简便，通过外科处理使动物腹腔少量持续溢入混有多种 细菌的肠内容物，引起腹腔感染，这与临床上阑尾炎或憩室炎穿孔的病例 极为相似。这种模型最初用于大鼠，目前已可在多种属动物身上成功复制， 可模拟出早期高代谢、高血流动力学状态和晚期低血流动力学状态【8 1 3 1 ， 血中内毒素检出率及细菌培养( 包括g + 菌和g - 菌) 阳性率高，促炎因子 升高持续时间长且幅度相对平缓。 研究论文 有研究对比了c l p 模型和内毒素中毒模型的病理生理反应，结果二 者细胞因子反应的数量级差别极为显著 1 4 】，这显示出c l p 模型在临床相 关性方面的优势。从本项试验中造模组与正常对照组及假手术组的显著差 异可以说明，使用盲肠结扎穿孔的方法可成功制造出脓毒症模型。 2 谷氨酸脱氢酶( g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ，g l d h ) 及谷胱甘肽硫转移 酶( g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e ，g s t ) 在脓毒症发生发展中的变化及意义： 目前常规检测肝功能损害的酶学指标如天冬氨酸转氨酶( a s t ) 、乳酸 脱氢酶( l d h ) 、碱性磷酸酶( a l p ) 、丫谷氨酰转移酶( g g t ) 、5 核苷酸酶 ( 5 ，n t ) 、亮氨酸氨基肽酶( l a p ) 等不仅存在于肝脏中，还存在于心脏、肾脏、 胰腺、骨组织等全身各器官及组织中。因此，仅测定这些酶学指标不能完 全反映肝脏功能在脓毒症期的变化。 g l d h 存在于人体细胞线粒体中，主要分布于肝脏、小肠、胰腺、心 肌、脑等器官，尤以肝脏含量最丰富，为胰腺的2 0 倍，心肌的1 7 倍，骨骼肌 的8 0 倍；同时，它又是肝线粒体的特异性酶，在肝线粒体外的含量几乎为 零；正常血清中的g l d h 含量很低，有文献报道约为0 1l p g m l 。该酶主 要存在于肝线粒体中，是肝线粒体特异性酶，故可作为肝损害的特异性指 标。一旦肝细胞发生病变累及线粒体时，g l d h 即有显著性升高，g l d h 在肝细胞坏死时大量释放入血液，是肝实质损害的敏感指标。 急性肝炎活动期明显升高，由于g l d h 分子质量较a s t 大，血中半衰 期较a s t 长，故恢复正常较a s t 为迟。肝胆疾病时血清中g l d h 的升高 幅度均高于a s t 。而对于晚期重症肝病患者，由于肝细胞的绝对数量减少， g l d h 的活性迅速下降。故检测g l d h 活性对肝病的早期诊断及预后判 断有独特的临床意义，可作为诊断肝细胞病变特别是坏死性肝病的主要指 标12 1 。 g s t 是一组具有解毒和结合功能的同工酶，在肝细胞中主要分布于胞 浆。人肝至少含8 型( a 、p 、丫、1 ( 、队兀、0 和( o ) 以上g s t ，研究最多的 主要是0 【g s t 、1 3 - g s t 、“g s t 、7 c g s t 和0 g s t 。g s t 曾有y 蛋白( y p r o t e i n ) 、连接蛋白或配体素( 1 i g a n d i n ) 之称，它具有谷胱甘肽过氧化酶活性， 可保护细胞免受氧化损伤，借助反应性氧类媒介物( o x y g e n r e a c t i v e i n t e r m e d i a t e s ) 参与细胞解毒。g s t 可与胆红素、胆汁酸、靛青绿( i c g ) 等 结合通过摄取和转运参与机体正常生理活动。 研究论文 g s t 分子质量较转氨酶小，更易透过肝细胞膜，肝脏损伤时血清峰值 出现比转氨酶早，因此血清g s t 是反映急性肝细胞损伤的极敏感指标。又 由于其半衰期短( 1 8 h ) ，所以峰值出现后迅速下降，比转氨酶早降至正常， 这有助于识别肝细胞损伤的终止，即当g s t 活性下降时，即使转氨酶仍高， 肝细胞损伤不再继续。目前认为血清g s t 活性是反映肝细胞坏死最敏感 的指标，其敏感性优于转氨酶【l 训。 本项研究结果提示，造模后6 小时g s t 即明显升高，说明脓毒症早 期即发生肝细胞损伤。而由于致病因素持续存在，随着时间的延长，g l d h 和g s t 进一步升高。提示肝细胞损伤随脓毒症进展进一步加重。线粒体 发生损伤的主要原因为缺氧。而肝线粒体的特异性酶g l d h 升高则说明 脓毒症导致肝脏微循环灌注不足，引起肝细胞的缺血、缺氧而发生损伤。 3 辛伐他汀对脓毒症的作用： 脓毒症时肝脏是炎症反应最为剧烈和最容易受到损伤的器官之一，急 性肝损伤可以发生在脓毒症的任何阶段，肝功能障碍是脓毒症发展为多器 官功能衰竭的标志之一。脓毒症导致肝脏损伤的机制十分复杂。 在脓毒症期间，微循环的病理生理变化主要包括改变小动脉的紧张度 而影响血压；血管内皮细胞的完整性受损而导致蛋白质及大分子的漏出而 丢失；白细胞通过粘附和迁移穿过血管内皮等。这些过程造成广泛的组织 损伤。脓毒症所致的肝脏急性微血管反应包括黏附、聚集于肝窦壁的白细 胞、血小板数目增加，滞留于肝窦或黏附于窦后静脉壁，导致肝窦内血流 下降、细胞流速减慢阻塞血管，以及肝窦内皮细胞肿胀损害、表达黏附分 子和k u p f f e r 细胞吞噬功能下降等【1 6 1 ，严重者可出现肝脏出血性坏死，病 理检查可见肝窦内纤维性血栓形成、红细胞淤积等。内毒素血症时，肝脏 内皮细胞血栓调节蛋白表达和巨噬细胞组织因子活性增加，使凝血系统的 平衡被破坏，导致纤维蛋白沉积于肝窦【1 7 】。近年来亦有研究提出，肝脏微 血管的变化不仅是肝纤维化和肝小叶结节形成的结果，而是与细胞损害和 纤维形成同时发生，肝纤维化早期即可出现，表现为肝窦毛细血管化、肝 窦密度下降、扩张的窦后静脉周围无肝窦间隙等【3 】。此外，肝脏有门静脉 和肝动脉两个输入系统，由于血流从门静脉和肝动脉到中央静脉的特殊性 以及沿着肝窦内皮细胞的耗