（光学工程专业论文）共焦扫描显微镜系统研究与信息量分析.pdf

重庆大学硕士学位论文中文摘要 摘要 激光共焦扫描显微镜是一种新型的显微设备，它以光学系统共焦成像为基础， 利用激光扫描技术和数字图像处理技术，可以对样品进行三维动态测量。与传统显 微镜相比，它具有较高的横向、纵向分辨率以及像对比度，在生命科学、材料科学 等领域中具有广泛的应用。对激光共焦扫描显微镜系统进行分析，促进分辨率的提 高，优化成像系统的质量是目前一个重要研究方向。另一方面，8 0 年代末发展起来 的光学信息论是一种全新的光学系统分析方法，但国内这方面的运用较少，近年来， 国内相关的报道也较少。论文以激光共焦扫描显微镜为研究对象，运用标量衍射理 论和光学信息论的方法分析和评价了激光共焦扫描显微镜系统。 论文主要开展了下面的工作： 首先，建立了共焦显微系统的光路模型，运用标量衍射理论，推导出共焦扫描 显微系统的成像公式和系统的相干传递函数，并对探测孔径半径对横向和轴向分辨 率的影响进行了深入的分析和研究，结果表明：系统限制孔径对系统成像有明显影 响，系统横向和轴向响应半高宽随孔径归一化半径的增加而增加，即分辨率随限制 孔径的增加而减小。论文基于数值模拟提出了最佳针孔归一化半径，并应用共焦显 微成像理论，通过数值模拟对共焦针孔的偏移、物镜的数值孔径和光瞳函数对成像 强度和分辨率的影响进行了仔细的分析和研究。这为系统的设计提供了坚实的理论 依据。 以标量衍射理论分析的结论为基础，论文着重运用光学信息论，得出激光共焦 扫描显微镜系统的信息量表达式，并结合自由度不变原理分析提高带宽实现超分辨 的理论依据；从信息量的角度，分析了激光共焦扫描显微镜的激光光源，探测针孔 等对提高分辨率的影响。( 1 ) 小尺度的针孔探测器，成为该成像系统的限制孔径， 由成像的共轭性可知，它减小了视场，从自由度不变原理，这会促使空间频率的提 高，从而实现高分辨。( 2 ) 采用激光光源后，激光聚焦光斑不仅起到了与物镜衍射 斑卷积作用，同时还起到了一个针孔的作用，即激光聚焦光斑在像面上相当于一个 针孔，实现高分辨。论文还分析了共焦荧光扫描显微镜的信噪比对信息量的影响， 与普通显微镜比较得出，探测孔径半径足够大时，共焦系统才能比普通系统传递更多 的信息量。论文的研究结果，对光学成像系统的优化提供了理论依据。 关键词：共焦显微术，高分辨率，数值模拟，信息量 重庆大学硕士学位论文英文摘要 t h ec o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e ( c t s w oi san e wk i n do fm i c r o s c o p et h a t b a s e do i lt h ec o n f o c a li m a g i n gt e c h n o l o g y t h r o u g ht h el a s e rs c a n n i n ga n dd i 西t a li m a g e m a n i p u l a t i o n ，i tc o u l dm a k et h e 3 一dd y n a m i cm e a s u r e m e n to ft h es a m p l e c o m p a r ew i t h c o n v e n t i o n a lm i c r o s c o p e ；i ti m p r o v e dr e s o l u t i o na n dc o n t r a s to fs a m p l ei m a g e n o w , i t h a sw i d ea p p l i c a t i o ni nb i o m e d i c i n ea n dm a t e r i a lp r o d u c t i o n - m a n u f a c t u r i n gf i e l d s t h e i n f o r m a t i o nt h e o r yi si m p r o v e da tt h ee n do f8 0 y e a r s ，a n di ti san e wm e t h o db yt h a tw e c a na n a l y z et h ei m a g i n gs y s t e m b u tt h e r ea r el e s s e rr e p o r t si no u rc o u n t r y t h ea r t i c l e a n a l y z e st h es t r u c t u r eo fc o n f o c a lm i c r o s c o p eo i lt h eb a s i so ft h es c a l a rd i f f u s i o nt h e o r i e s a n dt h ei n f o r m a t i o n t h e o r y t h ec o n t e n to f t h i sd i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h ef o l l o w i n gp a l 船： t h eo p t i c a lp a t hm o d e lo ft h ec o n f o c a li se s t a b l i s h e di nt h i sp a p e r ，a n dt h ei m a g i n g e q u a t i o n sa r ea l s od e r i v e do nt h eb a s i s o ft h es c a l a rd i f f u s i o nt h e o r i e s ；t h ec o h e r e n t t r a n s m i s s i o nf u n c t i o no ft h es y s t e mi sd e d u c e d ，a n df u r t h e r i ti ss h o w nt h a tt h el i m i t e d h o l e sr a d i u sh a sd i s t i n c ti m p a c to nr e s o l u t i o n ：t h eh a l f - w i d t ho f t h er e s p o n s ei n c r e a s e s w i t hh o l er a d i u si e t h er e s o l u t i o nd e c r e a s e s 、析t hh o l er a d i u st h eo p t i m u mn o r m a l i z e d p i n h o l er a d i u s a c c o r d i n gt ot h ec o m p u t i n gr e s u l t s ，t h eo p t i m i z a t i o na p p r o a c ho f t h e o p t i m u mn o r m a l i z e dp i n h o l er a d i u sa r ep r o p o s e di nt h i sp a p e r t h ei n f l u e n c eo f t h e o b j e c t i v en a a n dp u p i lf u n c t i o no nt h ei m a g i n gi n t e n s i t ya n dr e s o l u t i o ni ss i m u l a t e d b a s e do nc o n f o c a lm i c r o s c o p i ct h e o r y a c c o r d i n gt ot h ec o m p u t i n gr e s u l t s , t h e o p t i m i z a t i o na p p r o a c ho fa x i a lr e s o l u t i o ni sp r o p o s e di nt h i sp a p e r , w h i c hl a y as o l i d g r o u n d w o r ko nt h ef o l l o w i n gs y s t e md e s i g n b a s e do nt h ec o n c e p to fi n f o r m a t i o nc a p a c i t y , t h ei n f o r m a t i o nc a p a c i t ye x p r e s s i o no f c o n f o c a li sd e d u c e da n dt h ej u d g m e n t ss t a n d a r do fc o n f o c a la r ef o u n d ，a n dt h ei n f l u e n c eo f t h el i g h ts o u r c ea n dt h ep i n h o l ei sa n a l y z e d t h ec o n t e n to ft h i sd i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h e f o l l o w i n gp a r t s ：( 1 ) t h ep i n h o l eo fc o n f o e a lm i c r o s c o p yi st h el i m i t i n gp o r e ，a n di t s c o n j u g a t ei m a g el i m i t st h el i 曲t so fs y s t e m t h es p a c e b a n d w i d t hi se n l a r g e db e c a u s et h e f i e l do fv i e wi sm i n i s h e d w e 啪i m p r o v et h er e s o l u t i o no fs y s t e m ( 2 ) b e c a u s et h e d i f f r a c t i o ns p o to ff o c u s i n gs o u r c ei ss m a l la n dt h es p o tb e c o m ea p i n h o l e , t h er e s o l u t i o n o fc o n f o c a lm i c r o s c o p yi si m p r o v e d b a s e do nt h ec o n c e p to fi n f o r m a t i o nc a p a c i t ya n dt h e i l 重庆大学硕士学位论文英文摘要 r e s u l t so ft h ec a l c u l a t i o no ft h es i g n a l - t o - n o i s er a t i o ，t h ea r t i c l ep o i mo u tt h ed i f f e r e n t i n f o r m a t i o nb e t w e c nt h ec o n f o c a lm i c r o s c o p ya n dt h ec o n l l n o nm i c r o s c o p e t h er e s u l t o b t a i n e di sv e r ye f f e c t i v et 0o p t i m i z et h ec o n f o c a lm i c r o s c o p e k e y w o r d s ：c o n f o c a lm i c r o s c o p y ，h i g hr e s o l u t i o n ，n u m e r i c a ls i m u l a t i o n ，i n f o r m a t i o n c a p a c i t y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重废盔堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：娟审签字目期：删6 年j 硐，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 重庭盍堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重麽盍堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名： 签字日期：瑚占年，二月，日 导师签名： 辽 可5 ( 诈 签字日多年，夯月夕日 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 信息光学方法对光学系统研究的指导意义 1 1 1 光学信息量对光学系统的评价作用 光学仪器的迅速发展对光学系统的评价指标提出了越来越高的要求。自从五十年代 信息论和通讯理论引入后，光学信息量已经成为综合评价光学系统性能的重要指标。 成像自由度理论是在五十年代g t f r a n e i a 将s l e p i a n 、p o l l a k 和l a n d a u 的长椭 球波函数( p s w f ) 引入相干衍射受限系统的成像积分方程而建立起来的，它的建立 立即引起了国内外许多学者的重视。其后尤其引人注目的进展分别由p d es a t i n s 和 c p a l m a 和陶纯堪所取得，前者研究了受纯波象差影响的衍射受限系统的自由度问 题，后者对部分相干光照明下的衍射受限系统的成像自由度传递机理作了更为深入 的研究。1 1 - 1 0 对于成像系统，在景物反射( 或说发射) 的光信号到达图像采集系统的那一刻起， 信息传递、图像处理就开始了，直到系统获得的视频信息到达人的神经系统，信息传 递、图像处理过程结束。半个世纪以来，人们一直在研究成像系统，数字技术和计算机 技术诞生后，综合光电技术、模拟和数字技术的采样成像技术得到更大发展。基于信 息理论的采样成像系统的分析方法、评价方法和光电一体化优化设计方法研究属于 跨学科的科学研究，他把广泛应用于现代通信领域的信息理论和光电成像技术结合 在一起研究采样成像系统。他用新的思想方法、分析方法，新的评价指标进行系统评 价，因而，提出和解决了若干用传统理论无法解释和处理的问题，为系统光电一体化设 计、模拟，数字接1 2 1 处理、数字信号处理等问题，提供了新的研究思路。始于5 0 年 代的信息理论成像系统研究，随着信息技术的迅猛发展，在国际上这种研究呈爆炸性 趋势。最活跃的研究机构是美国航空航天局( n a s a ) ，国内少见报道。 1 1 2 基于信息理论的成像系统评价的基本思想 信息论是现代通信系统的基本理论。当面向输入输出信号研究通信系统时通信 系统的基本问题可视为信源与信宿之间最大的一致性，亦即无失真传输。从信息论角 度分析，通信的基本问题是追求输出信号中包含最大的输入信号的信息量，即信息的 无损传递。同样，采样成像系统也是物到像的输入输出过程，其模型如图1 1 所示。 r 1r _ 1r 。_ 1r 叫图像采集r 叫信号编码r _ 叫信号解码，图像再生r 叫图像显示r + 1 _ ji - j i 一i 一j 图1 1 采样成像系统 f i g1 1s a m p l e d i m a g i n gs y s t e m 重庆大学硕士学位论文1 绪论 从信息论出发，成像系统的基本问题是物与像的最大一致性，亦即，图像保真度。 可见，当忽略系统物理结构，面向输入输出信号研究系统时，采样成像系统和通信系统 面临的基本问题是一致的。l q 当把图像采集和图像恢复结合在一起分析时，采样成像系统里现通信信道性。 香农( s h a n n o n ) 的信息理论是基于信息理论的采样成像系统研究方法的理论基础。 把采样成像系统视为信息信道，信源是景物的光强分布，接收到的信号被存储为离散 数字阵列，这个阵列将被处理和显示。系统设计目标归结为使景物和图像之间的互信 息量最大【1 l 。根据信息理论，图像重建过程可视为接收到的信息再现入射辐射场信 息的过程，图像的衰减代表信息的丢失。因此在基于信息理论的采样成像系统评价方 法中，用信息率评价采样成像系统和各个子系统。信息率高的系统设计是优化设计， 能保证好的图像质量。不同的采样成像系统具有不同的系统设计参数，借助于信息理 论可方便的进行系统评价，如果用实验的方法做这种评价就困难多了。 从8 0 年代中期开始，这个领域的研究越来越活跃。到上世纪末，国际上这个领域 的研究呈爆炸性趋势。国际上最活跃的研究群体是以f o h u c k 为代表的研究组。 国内这方面的研究少见报道。1 9 4 8 美国科学家c e s h a n n o n 发表了著名论文通 信中的数学理论，从而奠定了信息理论基础。从信息论创立之日起，世界上光学界 的先驱者便致力于把信息论引入光学领域。 1 2 分析激光共焦扫描显微镜的现实价值 激光共焦扫描显微镜( c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e ) ，简称c l s m 。是我 们的研究对象。l c s m 的成像原理与普通光学显微镜完全不同，它通过减小光学显 微镜的视场来获得高分辨率，并引入扫描技术弥补视场小的缺点和普通光学显微镜 相比，l c s m 具有以下优点：( 1 ) 超高分辨率；( 2 ) 可对样品进行三维成像，获取样品内 部的三维精细结构；( 3 ) 具备的层析能加可对样品进行厚度小于l u m 的“光学切片”从 而避免机械切片以及由此造成的样品损伤；( 4 ) 共焦针孔可有效抑制杂散背景光，从而 使所成图像对比度高，成像质量好。 虽然l c s m 的分辨率低于扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，s e m ) 和扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e lm i c r o s c o p e 。s a w 0 ，但却具有二者所不具备的独 特优点。同s e m 相比的优点( 1 ) 样品预处理简单，甚至不需要预处理；( 2 ) 避免使用真 空环境，操作简单；( 3 ) 样品不会象电子显微镜那样吸附电荷产生图像失真；( 4 ) 绝大多 数情况下，人们对样品感兴趣的是其光学特性而非电学特性；( 5 ) 非接触式光探测可适 用于某些无法承受电子辐射损伤的样品。 同扫描隧道显微镜相比的优点：( 1 ) s t m 仅能获得样品表面起伏分布的信息，而 无法获取样品深层结构，l g s m 则可对样品表面以下成像，获得样品真实的三维结 构；( 2 ) s t m 要求样品具有一定导电性，当非导体样品表面覆盖导电层时，导电层的 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 粒度与均匀性等问题都将影响成像结果；l c s m 采用光束成像，对样品导电性无要 求；( 3 ) s t m 针尖形状的不确定给图像的认证和解释带来困难，而l c s m 图像接近人眼 直接观察结果；( a ) s t m 对生物样品来说，衬底难选择，导电性差等，而l c s m 贝j j 没有 上述影响。i l 卅 从以上共焦激光扫描显微镜的独特优点看出，对l c s m 的研究是非常必要的。 如何用最新的信息论理论分析l c s m 系统，使整个系统的景物和图像之间的互信息 量最大，从而改善系统各参数并实现系统的最大匹配是我们应该马上着手去做的事 情。本论文也是从这点出发对l c s m 做了一定的分析和研究。 3 重庆大学硕士学位论文2 共焦扫描显微镜系统 2 共焦扫描显微镜系统 2 1 共焦成像系统简介 显微镜是现代科学技术中常用的一种极为重要的物质表面形貌和特性检测工 具。尽管普通光学显微镜已有几百年的发展历史，然而由于光衍射效应的限制，高 分辨率的普通光学显微镜系统的迸一步发展在技术上遇到了极大的困难，已渐渐不 能满足对样品表面精细结构研究的需要。扫描电子显微镜( s e m ) 需要在高真空度状 态下测量样品，对于某些样品，特别是生物样品还需要进行复杂的样品处理，因此 样品测量的复杂性及昂贵的价格，使其在普及应用方面存在着一定的局限性，特别 是在生产中对样品进行在线实时检测方面显然是不合适的。近几年来人们进行了各 种尝试，企图找到一种既有光学显微镜的使用简单性，又具有高分辨率的新型表面 检测仪器。共焦激光扫描显微镜( c l s m ) 就是一种把激光光学技术与数字图像处理技 术相结合而产生的一种高分辨率显微镜。 共焦成像显微系统如下： 点光 图2 1 共焦显微系统 f i 9 2 1t h es y s t e mo fc o n f o e a lm i c r o s c o p e 探测器 图中，点光源s 经凸透镜a 成像于物面上一点o 照射物体，由此照射引起的 透射光( 也可为反射、荧光等光信息) 由0 点发出后被凸透镜b 会聚于探测针孔处p 并被其后的光电探测器所接收。由上面的介绍可知，点光源s ，被照物点0 、探测 针孔p 三者分别处于彼此对应的共扼位置处，这是共焦系统的基本结构特征。利用 光扫描技术，控制点光源s 在物面的像点0 对物体垂直于光轴的截面进行二维扫描， 则可以得到相应截面的二维信息。通过改变物体轴向位置，使o 点对物体垂直于光 轴的不同截面分别进行二维面扫描，就可以得到此物体的三维信息。将得到的信息 输入计算机，利用计算机图形、图象处理技术，便可重构出物体的二维、三维图像。 如果将光学显微技术引入到共焦成像系统中，便可得到共聚焦扫描显微镜。通 常共聚焦扫描显微镜采用激光作为光源，这是因为激光具有能量密度高、单色性好、 4 重庆大学硕士学位论文 2 共焦扫描显微镜系统 发散角小、聚焦性优良等特点。对于使用激光作为光源的共聚焦扫描显微镜，被称 为共聚焦激光扫描显微镜。 2 2 共聚焦扫描显微镜主要技术特点及关键技术 2 2 1 共聚焦扫描显微镜的主要技术特点如下： 1 、分辨率( r e s o l u t i o n ) 共聚焦扫描显微镜的系统点像能量分布等于物镜和聚光镜点像能量分布的卷 积，物镜相同时光学分辨率( x y 面) 比光学显微镜提高了1 4 倍，如l e i c a 公司的 t c s n t 分辨率为0 1 8 微米。该系统在激发光光路中引入一个针孔，有效调制了 点光源的束斑，使光束直径更细。从共聚焦扫描显微镜的原理我们知道，由于探测 针孔设置不仅有效的抑制了非层面像对检测平面像的干扰，而且抑制了同一层面非 探测点对探测点的干扰，因而极大的改善了图像的分辨率。此外为实现极限分辨率， 共聚焦扫描显微镜系统要求配备抗震工作台。 2 、灵敏度( s e n s i t i v i t y ) 在常规光学显微镜上常配备c c d 摄像头采集图像，由于c c d 的灵敏度比较低， 对于低照度的光如荧光无法探测到，在共聚焦扫描显微镜系统中使用光电倍增管作 为探测元件，其灵敏度大大超过c c d ，因而可对微弱的荧光信号呈现很高的灵敏度。 3 、放大倍数( m a g n i f i c a t i o n ) 共聚焦扫描显微镜系统所展现的放大图像要高于常规的光学显微镜。此处所说 的放大不是指物理上的放大，而是指在相同物镜放大的条件下，共聚焦扫描显微镜 所展示的图像形态细节是在光学显微镜下很难看到的，因而图像更清晰更微细。 4 对比度( c o n t r a s o 由于物体照明光仅是扫描中一个非常小的聚焦光点，且亮度、信噪比高，信号 光要比物体其他点要强。在像面上，点探测器只能接收通过针孔的光，而来自物体 其它部位的杂散光因在共焦针孔处不能聚焦而被滤除。这使得通过共聚焦扫描显微 镜得到的样品图像对比度比传统显微镜的要高。 5 、三维信息及其他o m r e e d i m e n s i o n a le t c 1 共聚焦扫描显微镜通过扫描可以得到物体的三维信息，具有层析本领，而传统 的显微镜所能观察的只是物体的表面图象，当焦点移动时，分辨率下降，不能观察 到物体的层析图象。因为光束的聚焦与波长有关，当共聚焦扫描显微镜用单色激光 作为光源时，可以减小聚焦光斑尺寸，从而进一步提高图象清晰度。由于共焦成像 系统采用近轴光束，因为像面没有因像差变化而产生像畸变。 2 2 2 共聚焦扫描显微镜有如下关键技术： 1 、共焦技术 重庆大学硕士学位论文2 共焦扫描显微镜系统 共聚焦扫描显微镜采用点源一点探测，探测针孔的大小起着关键作用，它直接 影响系统的分辨率和信噪比。如针孔过大，则起不到共焦点探测作用，既降低系统 的分辨率，又会引入更多的杂散光，使系统失去层析能力；如果针孔太小，则降低探 测效率。研究表明，当小孔直径等于爱嬲t ( a i r yd i s k ) 的直径时，探测效率可达8 5 以上，且满足共焦要求。由于针孔直径等于爱里斑直径，为微米量级，如果扫描光 束的会聚焦点与针孔位置存在偏差，将会产生信号失真，且容易引入轴外像差，影 响成像质量。 2 、扫描技术 由于共聚焦扫描显微镜是点物点成像，所以要获得物体的二维图像，需要借助 于x ，y 方向的二维扫描。不同的显微镜采用不同的扫描方式，归纳起来可以分为以 下几种：物体扫描，即物体本身按一定规律移动，光束保持不变。其优点是轴线平 直，光路稳定，充分发挥了光学系统中心无像差的优势。其缺点需要大幅度扫描工 作台，因而扫描速度受到制约，快速扫描有一定困难。利用反射振镜构成光束扫 描系统，通过控制扫描振镜将聚焦光点有规律的反射到物体某一层面，完成二维扫 描，其优点是精度较高，常用于高精度测量。扫描速度比物体扫描有所提高，但仍 然不快。使用声光偏转元件进行扫描，通过改变声波输出频率进而改变光波的传 输方向来实现扫描。其突出优点是扫描速度非常快，由美国研制的利用声光偏转器 产生实时视频图像的扫描系统，扫描一幅二维图像仅需1 3 0 秒，几乎做到了实时输 出。 n i p k o w 盘扫描，其扫描过程是通过旋转n i p k o w 盘而保持其他元件不动完成 的，可以一次成像，速度非常之快，但是由于成像光束是轴外光，所以必须对透镜 的轴外像差进行校正，并且光能利用率很低。 3 、层析技术 共聚焦扫描显微镜是把光束聚焦到样品的某个层面，而把该层面前后的离焦光 束阻挡掉。通过改变聚焦深度而获得样品一个个层面的光学切片图像。在利用共焦 技术进行细胞或生物体的结构分析时，其主要的信息来源是收集从细胞或生物体表 层进入内部所产生的散射光信息。如果被观察样品被进行了荧光着色，那么就可以收 集到不同激光照射截面的荧光信息。与电子显微镜相比，无须进行超薄切片，从而可 以对活体进行动态层析观察，这正是生物、医学研究方面十分希望实现的新技术。 2 3 共聚焦扫描显微镜常见类型简介 随着共焦技术的不断发展和完善，耳前已经研制出许多类型不同的共聚焦扫描 显微镜，虽然都以共焦技术为基础，但它们却都有着各自的特点。其中比较常见的 有：共聚焦荧光扫描显微镜、共聚焦扫描光纤显微镜、共聚焦彩色激光显微镜、共聚 焦光栅光学显微镜等。 6 重庆大学硕士学位论文2 共焦扫描显微镜系统 2 3 1 共聚焦荧光扫描显微镜： 共聚焦荧光显微镜目前被主要应用在生物医学领域，其主要特点体现在光电转 换器件所收集的光信号为样品所发出的荧光，通常为反射荧光。 日本奥林巴斯光学公司研制的共聚焦荧光显微镜以向+ 激光器输出的4 8 8 n m ， 5 1 4 5 r i m 激光为光源，光谱接近各种荧光燃料的吸收波长。激光束经光电计，在x y 方向用反射镜进行扫描，再经物镜照明样品。来自样品的荧光返回扫描光学系统， 经分色镜、针孔进入光电倍增管。最后，在计算机的显示器上可以得到十分清晰的 样品三维图象。 德国的欧洲分子生物实验室h e l l 等提出的知共聚焦荧光显微镜是以h e n e 激 光器为光源，以两个对置的显微物镜共焦来增加显微镜的孔径。通过用相干波前照 明物体，点探测器接收来自两侧的荧光，使轴向孔径增加，激光束经分束器分为等 光强的两束平行光，经反射镜反射，分别进入两侧的显微物镜并聚焦在一个共用焦 平面上，照明荧光样品，通过机械系统对样品x ，y ，z 三维扫描。此共焦荧光显微 镜系统的轴向分辨率比一般的共焦荧光显微镜高约四倍。 2 3 2 共聚焦扫描光纤显微镜： 将光纤技术与共聚焦扫描显微镜结合，可使整个系统紧凑、体积减小、造价降 低、便于调准定位、易于被各种激光源和探测方法所接受，为光电硬件的布置提供 了极大的灵活性。 光纤不仅对激发光和共焦信号( 荧光或样品反射光) 提供了柔性光路，光纤芯的面 积等效空间滤波器的针孔，实际起到了共焦针孔和探测器的作用，因此光纤的应用 提供了共焦成像的一种新手段。通过光纤对激光束投影面积的缩小，可实现小于1 p m 光斑的精细光学测量。 美国得克萨斯大学的z e n g 在19 9 3 年激光与光电子国际会议上介绍了一种共聚 焦扫描光纤显微镜。该系统是用连续a r + 激光器4 8 8 1 u n 激光，经单模双向祸合器进 入6 p m 直径的光纤，光纤末端起共焦针孔和点探测器的作用，光束经显微物镜准直 和聚焦后照明物体( 层状样品) ，样品的反射荧光经光纤传入光谱计。此系统的轴向 分辨率为3 7p m 。它能帮助医生确定组织的层状结构和诊断反常皮肤生长，能分辨 样品的分层结构、各层厚度和各层荧光相关浓度，而常规方法却不能分辨。 澳大利亚的墨尔本大学g h i g g i n o 等把共聚焦显微镜的高空分辨与时问分辨相结 合，研制了一种非常紧凑小巧的共聚焦扫描光纤显微镜。此系统用单模光纤连接两 个系统，一是激光器和共焦探测器；二是扫描系统的小型盘式读出头，它包扩了激光 源、准直透镜、显微物镜、分束镜和用来接收来自体信号的四个探测器。此系统读 出头总高仅为3 0 r a m ，总重量仅为2 0 9 。该显微镜能测量物体的光振幅和相位变化， 并能够自动对焦。 7 重庆大学硕士学位论文2 共焦扫描显微镜系统 此外，根据不同用途，共聚焦扫描光纤显微镜还有其它多种形式，如：利用单模 光纤研制出的用于作内诊镜的共聚焦扫描光纤显微镜，横向分辨率为0 8 微米。使 用光纤传像束的新型共聚焦扫描显微镜，使样品成像的灵活性大大提高。用双模光 纤的差分共聚焦扫描显微镜和用半导体激光器和检测的共聚焦扫描光纤显微镜等。 2 3 3 彩色共聚焦激光扫描显微镜： 彩色共聚焦激光扫描显微镜以红、绿、蓝色激光为光源，用声光偏转元件进行 激光扫描，可在电视监视器上观察至超过常规光学显微镜0 3p m 以下分辨率的彩色 图像。因三色激光均为单色，故扩大了应用范围，如在使用硅膜的场合，可根据氧 化膜或抗蚀膜的厚度变化映出鲜艳的莫尔条纹，还可以对薄膜的下层进行观察。这 种共焦显微镜多采用h e - n e 激光器输出的红光和+ 激光器的蓝、绿光，也有系统 使用的是h e g d 激光器输出的蓝光。 最近，美国一项专利报道了用特定频率的光激发涂有荧光染料样品的彩色共聚 焦激光扫描显微镜。美国技术仪器公司推出的新产品k m s 一3 0 0 彩色共聚焦激光扫 描显微镜使用全光谱白光获得高分辨像。此系统可使用双目镜直接进行实时观测， 通过软件系统还可以进行半导体和光电子加工的无损检测。此外，日本自动控制公 司、日本激光泰克公司、美国激光技术公司均推出了各自的彩色共聚焦激光扫描显 微镜，已经在陶瓷、金属、半导体材料的生产检测等方面得到了广泛的应用。 2 3 4 共聚焦光栅光学显微镜： 与普通光学显微镜相比，光栅光学显微镜有较高的横向分辨率。其共聚焦型光 栅光学显微镜在6 3 2 8 n m 波长上分辨率为3 0 0 - 1 0 0 n m ，数值超过了经典衍射极限。 此种共聚焦显微镜能够传递两倍的极限空间频率，并能逐层使物体成像，结合轴向 扫描，从而获得大景深清晰图像，其纵向分辨率为钠米级，可以使用从红外到紫外 波段的激光光源，从而大大扩展了系统的功能和应用范围。 除了上面介绍的四种常见的共聚焦显微镜系统外，在实际应用当中，还存在着 许多不同的类型。据有关文献报道：1 以特殊的全息掩膜、傅氏透镜和针孔取代了共 聚焦显微镜的探测器针孔的超分辨率共聚焦扫描显微镜：2 内置傅立叶光学处理系 统的超短光脉冲照明共聚焦扫描显微镜；3 通过在光路中加如环形掩膜和探测器来 改善轴向分辨率的共聚焦扫描显微镜：4 对样品的三维吸收结构成像的共聚焦激光 诱导吸收显微镜；5 胄高速扫描样品的数字扫描激光显微镜；6 在显示器上显示干涉 条纹的激光反馈显微镜等等。p 2 1 1 2 2 1 2 4 共聚焦扫描显微镜的应用 目前，对共聚焦扫描显微镜的应用主要集中在生物医学研究以及材料的生产检 测两个领域中。 重庆大学硕士学位论文2 共焦扫描显微镜系统 2 4 1 共聚焦扫描显微镜在生物医学研究中的应用 传统的光学显微镜( c m ) 被大量地应用于生物医学研究领域中，但却受到了其分 辨率的限制。虽然使用大孔径物镜可以在一定范围内提高其分辨率，但由于衍射极 限的存在，这种传统的光学显微镜始终不可能突破某一个分辨率极限。而且大孔径 物镜还会使c m 具有较大的像差以及像对比度的明显下降，以至于在不对生物样品 进行染色的情况下，几乎不可能观察到细菌，细胞等生物体的影象。但由于染色会 杀死生物活试样，这便使得c m 不能对生物样品进行实时的动态观测。由于c m 不 具有层析成像特性，所以要想对生物体进行层析观察，必须将生物体做成超薄切片。 由于共聚焦扫描显微镜具有超衍射极限的高分辨率、高成像对比度以及能够层 析成像等特点，自从其问世以来，便被应用于生物医学研究领域中。在不对生物样 品进行染色，不做超薄生物切片的条件下，共聚焦扫描显微镜可以实现对自然状态 下活生物体的三维无损检测。通过检测，用户能够在计算机的显示器上直接观察到 被检测生物体的二维( 层析) 或三维重构图象。 随看共焦显微技术的不断发展和完善，目前共聚焦扫描显微镜已经渗透到细胞 生物学、胚胎学、神经病学、病理学、分子生物学、流行病学、免疫学、皮肤病学、 细胞学、组织生物学、肿瘤，细菌学、基因、病毒学等生物医学的分支领域，通过 它可以直接观测到细胞形态学的组织、细胞之间的相互作用、伤口的愈合和组织重 建、紫外光对细胞的作用、细胞对过敏和刺激作用的反应、细胞的光学老化过程、 组织微环境、真菌感染、药物扩散等生物医学现象。 2 4 2 共聚焦扫描显微镜在材料生产检测领域中的应用 除了在生物医学研究领域，共聚焦扫描显微镜在陶瓷、金属、半导体、芯片等 材料的生产检测领域中还具有广泛的应用。这主要依赖于共聚焦扫描显微镜具有较 高的分辨率、像对比度等特点，以及对样品表面形状进行三维成像等功能。例如： 1 、使用配有光纤定位和数字图象处理系统的扫描光纤显微镜，以、a r 和y a g 激光器为激发光源，采用芯径为8 0 p m 的梯度折射率多模光纤，用脉冲马达使光纤 在样品像平面上扫描，激光光斑直径小于1p m ，获得了多晶硅太阳能电池和半绝缘 体未掺杂的l e c g a a s 中缺陷的高分辨率光诱导电流图像。 2 、日本激光泰克公司的共聚焦激光扫描显微镜，用1 0 0 倍物镜，以h e 。n e 激 光( 6 3 3 n m ) 为光源测量磁头，通过彩色共焦显微镜的三维彩色图象显示，可观察半 导体激光器中折射光栅，并测量出其0 4 啪大小的凸凹形状。 2 - 5 共聚焦扫描显微镜研究进展和展望 共焦显微术自2 0 世纪8 0 年代实用化以来，发展迅猛。随着一些新兴技术的发 展，出现了各种新型的l c s m ，如多光子激发荧光扫描显微术、内窥式共焦扫描显 9 重庆大学硕士学位论文2 共焦扫描显微镜系统 微术等。随着共聚焦扫描显微镜的发展的应用表明，它能获得优于传统光学显微镜 衍射极限的分辨能力，可以广泛的应用在对各种物体的表面及亚表面特性的研究中， 特别是在微电子学、光电子学和分子生物学领域，己经成为对超大规模集成电路芯 片的实时检测和对基因及d n a 分析的重要工具。今后的发展方向是通过硬件和软 件的结合，进一步提高分辨率和图像处理能力，特别是向着能适应于某一领域样品 检测要求的专业化系列的方向发展。这样能有针对性的开发适应于某类图像处理的 高性能软件及与该领域表面分析数字化设备的接口软件。随着共焦显微技术的不断 发展，共聚焦扫描显微镜的应用范围必将越来越广泛，应用前景越来越广阔，在科 学技术的各个领域发挥重要的作用。 1 0 重庆大学硕士学位论文3 共焦扫描显微镜成像原理及参数分析 3 共焦扫描显微镜成像原理及参数分析 3 1 共焦扫描显微镜成像原理 3 1 1 共焦扫描显微镜系统的光路模型 反射式共焦扫描显微镜光路如图3 1 所示。图3 2 为透射式光路的展开的情况。 图3 1 反射式共焦扫描显微镜光路图 f i 9 3 1t h el i g h tp a t ho ft h ec o n f o c a lr e f l e c t i o nm i c r o s c o p e yo)(x y ) 伍蚰 图3 2 反射式共焦扫描显微镜等效光路图 f i 9 3 2t h ee q u i v a l e n tl i g h tp a t ho ft h ec o n f o c a lr e f l e c t i o nm i c r o s c o p e 重庆大学硕士学位论文 3 共焦扫描显微镜成像原理及参数分析 ( x i ，y i ，萄。假设使用点光源，且点光源置于光轴上，则光振幅分布可写为t j o ( r o ) - - d ( r o ) 。 【，_ 厶6 瓴) 矗“，m ，) 如 ( 3 2 ) m 。 mm 一研 。3 ， 鸟( 五y - , z ) = rr 户( 宇，r ，z ) e x p 号( 譬+ 卅d 亭砌 ( 3 4 ) 重庆大学硕士学位论文 3 共焦扫描显微镜成像原理及参数分析 品的振幅反射率。设样品被扫描位置为r l ，则被样品反射后的光场分布为： 毗) = 【户如) 鸟“+ m ，) 如 她一，) ( 3 5 ) 二 根据透镜成像理论，探测空间的光振幅分布为： 酞，) = j 二匝。故毛油编+ 如】旺一，) 包( ，+ 心) 出 ( 3 6 ) 其中，h 2 表示集光镜的三维振幅点扩展函数，m 2 是集光镜的放大因子，其定 义为： f 1 鸩一ii ( 3 7 ) i一噬i 3 1 3 探测光强 一般情况，反射式共焦激光扫描显微镜的物镜和集光镜相同，但光线却反向， 因此矩阵元m 2 = i m l = d o d i ，若将点探测器放置在r i o 处，则其接收的光强为： 2 她) _ 臼阮，】配一弛 ( 3 8 ) 将式3 6 带入有： 媳) 瓤6 阮汕如+ 旺一，) 鸟( ，+ 心) 6 魄t 域魄t 叫，矿 一j j ) 吃( ，十 绍t ) 淝一厶) 如d 甜毋西 3 9 若令也0 = 冉( i ! j 迎( ，+ 乏移，则： 她) = 阮g ) 木酝】表示三维卷积 ( 3 1 0 ) 上式表示光场是振幅的迭加，它意味着该共焦扫描显微成像系统相当于一个振 幅点扩展函数为h a 的相干系统。 以上分析表明，点探测器接收的光振幅是样品各点贡献的振幅迭加。也就是说， 只要是点探测器，不管是否有偏移，系统是否有像差，其成像仍然是相干的，故使 用点光源和点探测器的共焦明场显微系统是相干成像系统。当探测器的偏移为零时， 即r i = o ，则h 。可变为： 危( ，) = 白- ) 岛 ( 3 1 1 ) 该式是完全对齐方式下的共焦扫描显微成像系统的点扩展函数。 3 i 4 成像系统圆域描述 对于圆形物镜和集光镜，引入坐标变换： 重庆大学硕士学位论文 3 共焦扫描显微镜成像原理及参数分析 加 y 2 s l r e z( 3 1 2 ) a 口：挈z s l n z s l n ：竺( 3 1 3 ) 口= 一 一 ( 31 3 ) a 2 它们分别为横向和轴向光学坐标，也可称为归一化的横向和轴向坐标。式3 1 1 写为如下形式： 忽( k 国= j ! i ( k 吣哇( w 磅 ( 3 1 4 ) 其中：玩( k ) = e x p ( + 豌嘣p o ( p ，u ) s o ( v p ) p d p ( 3 1 5 ) 其中，n = l ，2 上式中：厶( 两= 1 2 w , f e x p ( a c o s 0 ) d 0 是零阶贝塞尔函数 s o = 1 4 s i n 龟2 ) 】为轴向空间频率的位移常量 只( 岛国：只( 力e x p 芒箬) n ：1 ，2 ( 3 1 6 ) 驰，2 岳巍 式中，p = r a 表示透镜的归一化半径，a 为透镜的半径。式3 1 4 表明，系统的 点扩展函数是照明系统和接收系统点扩展函数的乘积，而不象串级系统那样是两个 点扩展函数的卷积，这是共焦扫描显微术相比普通显微术的一个重要优点：点扩展 函数的相乘可以改善总的点扩展特性。 3 2 成像系统的传递函数 3 2 1 相干传递函数