western-blot 通用配方.doc

1.Western Blotting 相关溶液及抗体1) 转膜缓冲液（running buffer）(10)(1L)Tris 30.3g甘氨酸 144g不调pH转膜工作液（1)(1L)（现配现用） (10)转膜缓冲液（running buffer） 100ml 无水乙醇 100ml 水 800ml2) TBS 缓冲液(5)（1L） Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine) 4） Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5） Western Blotting 第二抗体 辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶 70V，30-40min；分离胶 120V，1h)12%分离胶配方:5ml10ml15ml水1.63.34.930%丙烯酰胺2461.5M Tris pH8.8 1.32.53.810% SDS0.050.10.1510% 过硫酸铵（最后加）0.050.10.15TEMED0.0020.0040.0065%浓缩胶1ml2ml3ml4ml水0.681.42.12.730%丙烯酰胺0.170.330.50.671.0M Tris pH6.8 0.130.250.380.510% SDS0.010.020.030.0410% 过硫酸铵（最后加）0.010.020.030.04TEMED0.0010.0020.0030.0045loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油 1ml 10%（w/v）SDS 0.8ml-巯基乙醇 0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1)转膜工作液 (10)转膜缓冲液（running buffer） 80ml 无水乙醇 80ml 水 640ml 800ml（4）将胶泡在（1)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1)转膜工作液中。（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7） 将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板 海绵 两层滤纸-PDVF膜（靠正极）-胶（靠负极）（用小试管排气泡）-两层滤纸海绵（用小试管排气泡）-夹住放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）-在胶槽中加入转子倒入（1)转膜工作液在胶槽中放入冰袋80V100V恒压，60min(该条件可以转移25kD90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4静置过夜。（9）漂洗：将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次，每次10 分钟；(10)一抗：适量的一抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1% Gelatine) 室温摇1h.(11) 漂洗：将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次，每次10 分钟(12) 二抗：适量的二抗加到TBST+脱脂奶粉(或者是TBST+1% Gelatine) 室温摇1h.（13）漂洗：将PVDF 膜在TBST 缓冲液中漂洗3 次，每次10 分钟两种显带方式：曝光法（14）用纸将PVDF 膜上的水分吸干，然后将将PVDF 膜放在保鲜膜上，将ECL试剂盒中的A液和B液按照1：1的比例混匀（见说明书）后均匀覆盖到PVDF 膜上1min,然后用纸将PVDF 膜上的溶液吸干，放入X光片的暗盒中。（15）在暗室中，使用红光灯，将显影液，水，定影液分别倒入三个盘子中，然后取出X光片剪成合适大小，放入含有PVDF 膜的暗盒中，曝光一定时间后取出X光片，放入显影液中显影，检测显影的情况，当发现X光片中有条带时，放入水中清洗光片，然后在定影液中定影。然后在黑暗情况下将光片和显影液定影液收好。显影液和定影液应为无色透明，若发现颜色异常、有沉淀或长菌需重配。 膜上显色法：（14）增强型HRP-DAB底物显色试剂盒；包括1HRP缓冲液，试剂A，试剂B和试剂C，三者添加的体积比为1ml 1HRP 缓冲液 + 50l 试剂A