（机械电子工程专业论文）多功能微流控芯片测试与控制系统的设计与构建.pdf

摘要 微流控芯片技术是近几年发展起来的一种全新的分析技术，它是基于微电子 机械系统( m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 技术在玻璃、硅片、有 机聚合物等材料上制作出微通道、微反应腔、微混合器、微泵微阀等多种微细结 构，把常规生物化学分析过程中样品采集、处理、反应和检测等一系列不连续过 程集成在个芯片上完成，达到分析设备的微型化、集成化，从而实现“微全分 析系统”( m i c r ot o t a ja n a l y s i ss y s t e m s ，b t t a s ) ，其具有分析速度快、污染小、并 行处理等优点，正逐步应用于临床检验、环境监测、法医鉴定等领域。 微芯片是微全分析系统的核心部件，其性能极大影响着系统。目前针对微芯 片性能的检测方法、设备相对有限，还没有一套较全面的微芯片性能测试与控制 系统。为此，本论文根据微流控芯片的特点和功能要求，开发了一套多功能微流 控芯片测试与控制系统，实现了对微流体进样、迁移、分离等过程的精确自动控 制，具有温度控制和微结构形貌实时监测等多种功能。 1 根据微流控芯片的功能要求，基于c 8 0 5 1 f 0 2 0m c u 设计了多功能控制 板，实现了电泳模块精确自动控制、检测灵敏度的智能调节、温度的p i d 控制，关键技术申请了专利，具有创新性。 2 采用1 2 位高精度a d 数据转换，对信号进行了硬件滤波与软件滤波处 理，实现了数据高精度快速自动采集，并直观图形界面显示。 3 完成了整个系统搭建及程序编写工作，并进行了微流体控制、温度控制 及尿蛋白检测等实验，获得了满意的结果。 通过本论文的实验表明，系统实现了复杂微流体控制、p i d 温度调节、微结 构形貌实时监测等功能，可阻根据要求对芯片进行性能测试并获得可靠直观的数 据，这对实验现象结果的分析及系统结构的设计均具有理论指导作用。但由于微 流控芯片驱动、结构的复杂性，要实现微流控芯片的真正全性能分析，系统还需 进一步的改进，实现系统的小型化、功能多样化发展是最终目标。 当前微流控芯片分析技术正飞速发展，芯片性能检测就成了芯片发展必须走 的一步。而此系统的出现正好满足了这一需求，有着广阔的应用前景，也是微流 控芯片的发展( 产业化) 不可少的一环。 关键词：微流控芯片、智能控制、p i d 温度控制、多功能控制系统 a b s t r a c t m i c r o - f l u i d i ce l e c t r o p h o r e s i sc h i pi sar a p i d l yd e v e l o p i n gf i e l di nr e c e n ty e a r s t h em i c r o c h a n n e ln e t w o r ko nt h ec h i pi sm a n u f a c t u r e db yt h et e c h n o l o g yo fm i c r o e l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ( m e m s ) o nt h es u b s t r a t eo fg l a s s ，f u s e ds i l i c a ，p d m se t c s a m p l es e p a r a t i o ni sp e r f o r m e d i nt h em i c r o - c h a n n e la n dd e t e c t e db yo p t i c a lo r c h e m i c a lm e t h o d s b a s e do nc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ( c e ) ，m f ec h i p i sa m u l t i d i s c i p l i n a r yt e c h n o l o g y , w h i c hh a sr o o t si nm i c r oo p t i c a le l e c t r om e c h a n i c a l s y s t e m ，b i o c h e m i s t r ya n da n a l y t i c a lc h e m i s t r y i tb e c a m ean e wp l a t f o r mi nt h ef i e l d o fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y , e s p e c i a l l yi nt h el i f es c i e n c e ，d r u gd i s c o v e r ya n dm e d i c i n e m i c r o f l u i d i cc h i pi st h ei m p o r t a n ts e to fi a t a s ，w h o s ep e r f o r m a n c ew i l lm u c h i n f l u e n c et h er e s u l to fp , t a se x p e r i m e n t b u tn o wt h em e t h o do fd e t e c t i n gc h i pi so f n og o o de f f e c t ，a n dw ec a l l tf i n dc e r t a i ns p e c i a le q u i p m e n t sw i t hw h i c hw ec a l ld e t e c t t h ep a r a m e t e ro fm i c r o c h i p ，s u c ha sv e l o c i t y , t e m p e r a t u r e i tc a n tm e e tt h e r e q u i r e m e n to fm i c r o - c h i pd e v e l o p i n g s o ，t h et o p i c so ft h i sd i s s e r t a t i o n i sr e s e a r c h i n ga n dd e v e l o p i n gan e wa n d s p e c i a ld e t e c t i n gs y s t e mp l a t f o r m t h es y s t e mc a l la c c u r a t e l yc o n t r o la n dd r i v et h e m i c r o - l i q u i d ，a n dh a sas t e a d yw o r k i n ge n v i r o n m e n t 1 d e s i g n i n gt h em a i nc o n t r o l l i n gb o a r d ，w h i c hh a sm i c r o l i q u i dc o n t r o l l i n g m o d u l e ，p i dt e m p e r a t u r ec o n t r o l l i n gm o d u l e 2 u s i n gt h e12 b i t sa dc i r c u i tt og e tt h ed a t a ，a n dq u i c k l yd a t ap r o c e s s i n ga n d a n a l y z i n g ， 3 t ob u i l dt h ew h o l es y s t e m ，d os o m ee x p e r i m e n tt ov a l i d a t et h es y s t e m t h em a j o rw o r ki sb u i l d i n gs y s t e m ，p r o g r a n m f i n gt h es o f t w a r eo fs y s t e ma n d a n a l y z i n gt h eq u a l i t yo fm i c r o c h i p k e yw o r d s ：m i c r o - f l u i d i cc h i p ；i n t e l l i g e n tc o n t r o l ；p i d - t e m p e r a t u r ec o n t r o l m u l t i f u n e t i o n a ld e t e c t i n g & c t r o n l i n gs y s t e m 独创性声明 y 92 869 6 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：抽巽签字日期：上的苫年6 月以日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌太学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。本人授权南昌文学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 、。 学位敝储躲糊臭导师躲泸刁 i 签字日期：二年易月f 6 日 签字日期： 扩g 年参月膨日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章绪论 1 1 课题的背景与意义 2 0 世纪9 0 年代初，m a n z 等【l 】人首次提出了微全分析系统( m i n i a t u r i z e d t o t a l a n a l y s i ss y s t e m ，i t t a s ) 的概念，其理念是基于微电子机械系统技术( m i c r oe l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) ，在玻璃、硅片、有机聚合物等材料制作微管道、微 泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元器件，最大 限度地把分析实验室的功能转移集成到方寸大小的微芯片上完成，实现分析设备 的微型化、集成化、便携化。 分析系统的小微化、微型化发展，这就对系统的检测和控制提出了更苛刻的 要求。首先，由于系统小型化使得检测信号更微弱，更容易受到干扰后淹没在噪 声中，故对系统抗干扰能力有着更进一步的要求。其次，分析过程中，样品的反 应、分析都在都在一块芯片上完成，或是说它们都处于同一微环境下进行下，这 就对系统的可重复性提出了更高的要求。总的说来，就是要求测定方法更灵敏， 获得数据更准确、快速，涉及的时空间尺度更广阔，得到的信息更多维，测定的 体系、环境更微小，所用的样品更微量等等；而且还要求在极端条件下或现场、 在体、在线、无损检测等等。而其中灵敏、准确、快速、自动、智能则是任何时 刻都追求的永恒主题。 p t a s 是一个物理、电子和计算机以及生物等多学科交叉渗透领域的系统， 它的整体性能受着众多因素的影响，例如系统外界的干扰、环境温度及芯片材质 等因素等都会对系统或芯片的性能产生影响。而微芯片性能是一个关键影响的因 素，它的性能直接地影响到整个系统的性能好坏。 近几年来，国内外相继有一些肌a s 系统出现。国外m a s ss e n s o r s 公司的微 型质谱仪、m e e c o 公司的腔衰荡光谱仪、m e r c kk g a a 公司的c h r o m l i t hh p l c 柱等都标志着不少技术上的突破；图内大连化学物理研究所在2 0 0 3 年研制了 s a r s 病毒的微流控芯片实验系统。但纵观整个i x t a s 发展过程，还尚无一套完 整的微芯片性能检测系统出现。 因此，开发一套可以在各种条件下检测微芯片性能参数，同时又能检测分析 样品的系统是很必要的。它可以为实验室制造的芯片提供性能验证，也为仪器开 发过程中提供芯片功能及仪器性能验证；同样地，对实验现象、结果的分析及系 统结构的设7 t 1 均具有理论指导作用，是微：芯片产业化发展的必不可少的一个环 节。本论文正是基于此目的，以微流控芯片作为切入点而展开的。 1 1 微流控芯片分析系统的现状与发展趋势 随着电子计算机集成电路的高度发展，超微加工技术获得了飞速的发展，这 也使得微流控j 苍片加工技术获得了极大的提高，极大地改善了微流控芯片分析系 统性能，有力地向微型化、集成化迈出了一大步。 1 2 1 微流控：芯片分析系统的现状 2 0 世纪9 0 年代中后期，美国在微全分析领域投入了大量人力物力，并取得 了相当可观的研究成果。而我国是从2 1 世纪初才开始进入这个领域的，很多方 面都落后于国外，下面就是最近几年在微流控分析系统方面发展的一些现状。 ( 1 1 仪器小型化 微流控芯片一般仅有几平方厘米大小，厚度也不超过几个毫米，因而具有使 系统进一步小型化和微型化的潜力。美国加卅i 大学伯克利分校w h g r o v e r 等【1 5 】 人研制的微型芯片毛细管电泳系统，不仅仪器整体体积小，而且具有厚度仅为4 f i n n 的4 层芯片的复杂分析系统，微阀的动作时间不超过l o o m s ，使用激光诱导荧光 进行检测，具有灵敏度高、分析速度快及功能多样等显著优点。 ( 2 ) 系统集成化 微流控j 占片分析系统发展十多年来，其集成化程度越来越高，很多研究小组 在这方面己经取得了很大成就。 图1 1 多功能集成微流控芯片 2 在1 9 9 8 年，m a r ka b u r s 掣1 6 铡用光刻技术将进样器、微通道、样品混合 器、加热器、温度传感器以及荧光传感器待集成到一个微芯片上( 如图1 1 ) ，无 需要外部的光学无件、加热器、机械泵等就能实现试剂的混合，d n a 扩增、降解、 分离以及在线检测，真正实现了微全分析。 在2 0 0 1 年，英国的m i c h a e lc m i t c h e l 等【1 4 】人也研制了微芯片合成一全分 析系统( u s y n t a s ) ，该系统可以实时的平行处理多个合成反应，而不需要任何 样品制备及处理过程。2 0 0 4 年，日本的h i d e l e a k ih i s a m o t o 等1 人则研制了一个 将各种化学功能都集中到一个微芯片上的毛细管电泳体系。它是一种新颖的以 p d m s 为材质的网格状结构，镶嵌到p d m s 微孔槽网络里面的正方形毛细管，可以有 混合、反应、化学修饰等多种功能。 随着微加工水平的提高，我国在集成化方面也有较大的提高，罗国安等【1 7 】【1 8 1 人在微流控芯片上制作了超微电极，具有较好的性能。但在微泵、微闷、微反应 及微检测装置等方面和国外些研究相比还存在着较大的差距。美国j o s e p h w a n g 等研制的用于恐怖分子武器检测的微芯片装置有体积小、功耗低、集成度高、 分析速度快，可实现在线分析检测的优点，并且可以对化学、生物及爆炸物等多 种样品实现同时快速检测。 ( 3 ) 微加工技术 微加工技术水平从某种程度来说限制着微流控分析系统的发展。它不仅包括 微芯片的加工制作，更重要的还在于将各种附属设备都集成到小小的芯片上。随 着微加工技术的发展，对微流控芯片的加工制造国内外都已经有了多种方法，并 且很多方法都已经比较成熟，可以加工出很复杂的微通道结构，而液流的控制是 微全分析系统性能中的一个关键因素，微泵、微阀的制作则体现了微加工水平的 高低。h e r bh a r t s h o r n e 等人研制的微泵和微阀体现了当今微加工领域的先进水 平，促进了芯片的集成化。c h i h h a ow a n g 等t 伸1 人研制的微泵与微流控芯片很好 的结合在一起，它比般的微芯片体积稍微小一点，却具有复杂的结构，以电能 为驱动源驱动液流运动。d i n od ic a r l o 等人研制的细胞机械溶胞装置采用离子 刻蚀过程得到的纳米尺度的小钩，使得溶胞过程简单、高效，并且自动化程度高， 无需化学试剂。 ( 4 ) 多种检测技术 微全分析系统的检测技术也多种多样，起初多采用激光诱导荧光检测法，直 到现在此法的应用也仍相当广泛。它最初多采用氯离子激光器作为激发光源，现 在用得越来越多的则是半导体激光器而发光二极管也逐渐得到了一定的应用， 但多用于吸收光度法的检测。随着微加工能力的提高电化学检测法近年来取得 了迅速的发展。m a r l i np u m e r a 等1 8 1 人研制了一种非接触式电极，它是将两层铝 质薄膜置于微芯片出口处用来检测通道内溶液的电阻，但并不与溶液接触，从 而避免了电极与溶液接触所带来的诸多问题，并且使检测及微加工过程大大简化 了。其它一些常见的检测方法有化学发光检测、紫外吸收等。 i 2 2 微流控芯片分析系统的发展趋势 下面就是一些当今微流控芯片分析系统的发展趋势： ( 1 ) 继微阵列芯片后，微流控芯分析芯片已成为当前g t a s 发展的前沿； ( 2 ) 朋1 a s 与微流控芯片已经从毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液一液 萃取、过滤、无膜扩散等多种分离手段； ( 3 ) 瞰s 从以电渗流为主要液流驱动手段发展到包括流体动力、气体动力、 气压、重力、离心力、剪切力等多种手动： ( 4 ) 吧s 微流控分系统从单道检测发展到多重平行检测。阵列通道数最多时 已高达3 8 4 道： ( 5 ) 朋1 a s 已从以激光诱导荧光为主要检测器发展到多种检测手段，如光度 法、电化学、质谱、原子光谱、化学发光等： ( 6 ) 町a s 已从开始的毛细血管电泳分离、检测发展到包括复杂试样前处理的 高功能全分析系统。 ( 7 ) 微流控芯片已开始从进行一般成分分析发展为单分子、单细胞分析。 1 3 微流控芯片分析系统的流体的驱动与控制 微流控芯片分析在结构上的主要特征是各种构型的微通道网络，通过对通道 内流体的操作，完成样品的分离分析功能。理想的微流控分析系统，应该可以实 现全部分析操作，包括试样的引入( 试样贮存、注入) ，前处理( 预处理、浓集、稀 释、混和、反应) ，最后的试样分离分析。 因此，与微通道相适应的微流体驱动技术是实现微流休控制的前提和基础， 与其它流体驱动技术相比，它具有相对的独立性，自成一体系。如今，基于不同 致动力与驱动原理的新方法层出不穷。 1 3 1 微致动器 致动器的功能就是能产生机械部件的运动( 包括位移或变形) 。它的致动力 类型大致有：压电( p i e z o e l e c t r i c ) 动力、电磁动力、静电动力、气( p n e u m a t i c ) 动力、利用形状记忆合金或材料热变形产生致动力等。 1 3 2 微流体驱动系统 依据不同的要素，微流体驱动系可有多种分类方式。依据驱动系统有无活动 的机械部件，可分为有活动机械驱动部件和无活动驱动机械部件的微驱动系统 ( 泵) ，简称有机械和非机械驱动系统( 泵) 。依据微驱动系统所用驱动( 致动) 动力的不同，可分为电渗动力、电磁动力、重力、气动动力、离心力等。 微流体分析系统中各种常见的微流体驱动系统分类表，如图l - 2 。 微流体机械驱动系 压电微泵 热气动微泵 静电微泵 气动微泵 微流体驱动系统 电化学致动微泵 “无阀”往复式微泵 离心力驱动系统 剪切力驱动系统 微流体非机械驱动系 电渗流微流体驱动系 电流体动力微泵 磁流体动力微泵 重力驱动系统 非机械气动微泵 热毛细作用微泵 图1 2 常见微流体驱动 离心力驱动系统 离心力驱动是微流控驱动技术中较为独特的一种技术，其系统利用：苍片在微 电机带动做圆周运动时所产生的离心力作为液流的驱动力。通过改变芯片旋转速 度和设计不同的通道构型则可调节和控制流体的流速。而对芯片上流体的限流和 切换控制则需要微阀的配合使用才能完成。通常离心力驱动的芯片为圆盘形，一 般可在芯片上集成数十至数百个呈辐射状分布的结构单元阵列，有利于实现微芯 片的高通量分析。系统工作时，被驱动液体放置于靠近芯片圆心的贮液池中，芯 片旋转时在离心力的作用下液流通过微通道网络流向芯片外周。1 9 9 9 年，d u f r y 等【45 】报道了一种在芯片上集成加工有4 8 个酶分析结构单元的离心式微流控芯片 分析系统，如图1 3 。 图1 3 离心力驱动芯 离心力驱动微泵的特点是：设备较简单，微泵本身不需控制阀，仅靠一台调 速微电机即可实现对流体的驱动和控制，驱动和控制设备一体化；j 吝片上没有可 活动的机械部件，加工工艺要求不高：流体流动无脉动；驱动系统与被驱动系统 不直接接触，因此对流体的种类没有特殊要求。离心力驱动的一个特点是其动力 施加于芯片上的所有液流，所带来的优点是以单一微电机可同时提供芯片上所有 结构单元中液流的驱动力：所带来的问题是芯片内所有液流同时受力如无外加微 阀的配合使用，则无法完成复杂的微流控操作。离心式微流控芯片通常综合采用 离心驱动系统和微通道上的控制微阀实现对流体的控制。目前离心力驱动芯片存 在的主要问题是，旋转的：甚片不易于与外部的试样引入系统、联用的检测系统等 设备进行耦联，在一定程度上限制了这一技术的应用。 微流体电渗驱动系统 电渗驱动属于致动力直接作用于流体的 驱动方式。目前，电渗流是微流控芯片分析 系统中使用最广的驱动和控制技术，尤其在 目前发展较为迅速的芯片毛细管电泳中是占 主导地位的驱动技术。电渗驱动的原理是利 用微通道表面存在的固定电荷进行驱动。如 图1 4 电渗示意 玻璃基质微芯片，在中性或碱性p h 值下，玻璃通道表面通常带负电荷，液流中 与其相邻的部分形成沿通道壁的带正电荷的界面双电层由此形产生。在通道 两端施加电压，带正电荷的界面在电作用下产生迁移，继而带动通道内界面包裹 的液流产生电渗流液体的流动。双电层厚度通常只有数十纳米，电渗泵因此 可在极小的微通道内工作( 如图1 4 ) 。 影响电渗流大小的因素众多，包括通道表面的组成、缓冲液性质( 如浓度、 p h 值、离子强度、黏度、介电常数等) 及纵向电场强度等。一般情况下，可通过 向缓冲液中加入填充物，变换缓冲液p h 值、浓度、组成，或进行微通道内表面 涂覆、改其表面结构等方法来改变电渗流。其定量关系可用式1 1 来表达 1 ) e o = 号e 们 ( 1 1 ) 式中，1 ) e o 为电渗速度；为液固界面双电层的z e t a 电势，由通道内壁的表面 电荷密度决定；为介质的介电常数：e 为外加电场强度：t 1 为介质黏度。 作为现今流行的毛细管驱动技术，电渗驱动有着自身的优势： 直接驱动液流，微芯片上的微通道作为泵的组成部分，系统结构简单， 无需活动的机械部件 液流流动呈扁平流型，可降低驱动过程中的分散效应，是进行塞状试样 传输和试样分离的理想方法； 可以实现无阀无机械部件的微流控操作，电渗驱动可同时施加于作用通 道内的所有流体，因此可在相互连通的微通道网络中，实现无阀的液流的切换， 这是电渗泵区别于机械微泵的独特优势，也是电渗泵成为目前使用最多的驱动技 术的主要原因之一； 7 微流控操作方便易行，多数简单的微流控操作可通过改变通道端点的电 压即可完成；通过设计各端点施加的电压及电压变换程序，可完成较复杂的微流 控操作。 但同时，电渗驱动也有其不足之处： 驱动需高压，旌加的电场强度通常在5 0 5 0 0 0 v c m ( 通道长度) 之间： 电渗过程伴随着带电粒子的电泳，在某些情况下，可能影响通道内溶液 的组成，或对不同电荷粒子产生歧视效应； 只能驱动可产生电渗流的介质；且流量与介质性质有关： 依靠通道双电层的存在进行驱动，而双电层易受多种因素变化的影响， 如外加电场、通道壁性质、介质解离性、离子强度、黏度等，甚至试样中组分的 吸附，因此电渗流对通道表面性质的变化较为敏感：系统在长时间工作中的稳定 性有等提高； 通道中不能有大气泡，否则将造成电流中断，流速剧减，甚至完全停止 流动； 泵压与通道内壁性质有关，在粗通道内内阻较小，微泵所能达到的泵压 较小，小的流体静压力变化可使电渗泵驱动的液流流速发生变化，甚至流逆转： 在细通道内内阻较大，微泵所能达到的泵压较大。通常泵压较小，但可采取适当 的方法( 如填充的电渗泵) ，可获得很高的泵压。 电渗作为驱动力，对于石英材质的微芯片，与毛细管电泳中使用的石英 毛细管相似，性质较为稳定，而采用玻璃材质的微芯片，则电渗流性质不如石英 稳定，且不同组成的玻璃电渗流性质也有差异。高分子材质的芯片的表面电渗流 性质变化较为复杂，尚需深入研究。 根据实现微流体控制时使用方法的不同，基本微流控技术可分为：驱动( 微 泵) 控制、微阀控制、芯片微通道构型控制、通道表面性质控制。在这些控制方 法中，微系统中显著的层流效应起着重要的作用。 微流控分析系统对其驱动系统微泵，主要有体积、流速、泵压有三方面 的要求。体积方面要求微泵尽可能小，易与：芯片上其它系统实现集成化，为此通 常需采用微加工技术；流速方面的性能要求包括流速范围、流速的重现性、流速 脉动性等；微泵的泵压则对不同的微系统有不同的要求。 1 3 3 微流体的进样系统 在微流控芯片电泳分离、流动注射分析等系统中，均需要进行进样操作，即 将一段试样以塞状流形式注射到分析通道。通常进样操作包括充样和注样两个过 程，它需要通过复杂的驱动控制操作来实现。如采用压力驱动方式进样，则必须 使用阀进行微流体流向的切换和注样体积的控制，因为微通道和试样体积微小， 设计加工能完成以上操作的阀的难度很大。采用电渗驱动方式进样，则可以实现 无阀的微流体切换操作。其进样器可用于芯片毛细管电泳、流动注射、连续流动 分析中试样的进样中，也可用于某些试剂的进样。进样方法包括连续进样法、切 换进样法( 时间迸样和体积迸样) 。 目前微流控芯片上主要得进样方法是基于时间和基于体积的进样方法。 1 3 3 i 基于时间的进样方法 基于时间的进样方法，类似流动注射分析中的时间进样法。常见的有“t ” 形通道进样法和门式进样法。 “t ”形通道进样法 b s 震 + + 磺黼】 b s 充样 图1 5t 形通道时间进样法 d s 试样；b 缓冲液池；d 分离通道；箭头表不流体流动方向 其中小直径圆点表示电场迁移速度快的离子，大直径原点表示电场下迁移速度慢的子 此方法所用通道构型和进样操作如图1 _ 5 所示。样品从专用的试样通道，以 电动注样的方式向分析通道内注入一定体积的试样，试样体积由注样电压和注样 时间决定。这种方法的优点是流路设计和操作简单，注样体积灵活可调，可引入 比较大量的试样。缺点是采用这种基于时间的电动进样，会出现不同荷质比组分 的歧视效应问题，迁移速度快的进样量大，而迁移速度慢的进样量小，且这一歧 视效应亦有可能随试样基体组成的不同而发生变化。此外，时间进样法在进行小 体积注样时，对注样时间控制的精确度要求较高，否则将严重影响系统的分析精 密度。 门式进样法 注样 图1 6 门式进样法示意图 s 试样；b 缓冲液；d 分离通道：w 废液：箭头表示流体流动方向 图中小直径圆点表示电场下迁移速度快的离子，大直径圆点表示电场下 1 9 9 4 年，j a c o b s o n 等提出了另外一种时间进样法一门式进样法。其原理 如图1 6 所示。在换样阶段，在试样和分析流体交汇区域，即“十”字通道的交 叉区，两液流在同一通道内同时流动，相互间互不干扰，这种液流共用一个通道 的操作方式只有在两流体显现层流状态下方可实现。在充样阶段，则采用分流的 方法，分出一部分试样液流进入分离通道。通过控制充样电压和时间，可以控制 进样量。这种进样方式在注样一分离阶段，试样通道和分离通道内流体可同时保 持连续流动的状态。但电动进样歧视效应在此种进样方法中依然存在。 13 3 2 基于体积的迸样方法 基于体积的进样方法，其通道构型通常为“十”字形或双“t ”形。此进样 方法优点在于在用电动力驱动流体进样的方式下，亦可消除注样过程中歧视效 应。原理如图1 7 和图1 8 。 在充样的初始阶段，仍然存在电动驱动的歧视效应，当进行一定时间后，试 样中迁移速度慢的组分也通过了采用通道，即采用通道内试样的组成与原始试样 完全一致，此时再进行注样操作，即可基本消除电动进样的歧视效应。 ( a ) s s b 二二二二； 。b 三牛。 ( b ) w 充样 s w 注样 s b 二二二三三二忙。b 三j 三二二二 。 a ) 鋈 i d 。 镬黼 w w 图1 8 取t 通道体积进样法 ( a ) 普通进样法；( b ) 夹流进样法： s 试样：b 缓冲液；d 分离通道；w 废液；箭头表示流体流动 双“t ”形通道构型与“十”字形通道构型相比，具有更大的进样体量，改 变双“t ”形通道的间距可改变进样体积。体积进样法的一个特点是进样体积( 进 样量) 固定，如需在一个分析系统中变换多个进样体积，采用上述的流路则不易 实现。在使用体积进样法时，目前多数系统是采用只有一个进样体积的芯片，需 变换体积时通常采用加工不同进样体积芯片的方法来实现。 1 3 4 微流体的监测技术 在微流控系统的设计、测试、优化、应用过程中，微流体在管道中的信息是 非常重要的。为了获得原始的信息，我们通常需要对流体的流动状态进行监测， 以获得微芯片管道及流体在微通道内的流动信息。随着微流控技术及理论研究的 进一步深入，对微系统内流体的监测技术提出了更高的要求。不仅需要定性观测 流体流动，还需要对其流动状态进行定量描述，包括测量微流体的各种流体力学 参数及其在微通道内的时空分布变化。这些定量测量数据，是微流控技术和理论 研究深入化的必要基础。 对于微流体的定性监测，通常使用的观测设备有显微镜、c c d 显微摄像设 备等，运用它们可以直接对通道网络内流体的流动状态进行观测。为使流体流动 可视化，多采用在流体中加入有色物质或荧光染料作为示踪物质的方法。而进行 微流体的定量监测，其观测内容不仅包括流体的流动参数，如流速、压力等，还 包括各流体单元的相关参数及其在流场内空间和时间上的分布，它对观测设备有 着更高的要求，观测的方法也更加多样化。 微流体流速监测技术 测定流体的整体流速和压力参数，可采用通道旁路加工微微测量器件的方 法，也可采用示踪物的方法。如在运行缓冲液中加入荧光染料的方法，利用门控 光漂白方法在液流中产生一段“印记”( 液流荧光强度的倒峰信号) 然后在与其相 距一定距离的下游通道上检测液流荧光强度变化。上述系统初被用于电渗流驱动 的毛细管内液流流速测定，可达到很高的测定精定和较宽的测定范围。 如进行流体流速和流型的观测，通常采用的方法是在液流中引入不同大小的 微粒作为示踪粒子来测量流体参数。 微流体温度监测技术 微流控分析系统的微流体温度监测，对流体进样分离过程及和某些芯片反应 过程( 如芯片内的酶激活反应、p c r 扩增反应等) 的影响都十分重要。通过温 度监测可能了解体系在运行过程中的温度分布和变化情况，这对现象、结果的分 析及系统结构的设计均具有理论指导作用。依据测量原理及方式的不同它可分 为：外部测温技术、热色液晶测温技术、吸收光谱法测温技术等。目前，微流 控系统采用的最多还是外部测定的方法，它有着操作简便，测量快速等优点，但 由于体系内外温度存在梯度差，使其不能真实地反映腔体内的液体温度，测量的 精确度不高。 1 4 微流控芯片检测器m 】 微流控芯片检测器的作用是测定被分析样品有关组分的组成及其含量。按其 检测检测原理进行分类，大致可以分为光学检测器、电化检测器、质谱检测器等。 图1 9 为微流控芯片检测器的分类。 图1 9 微流控芯片检测分类 1 4 1 激光诱导荧光检测器 到目前为止，在微流控芯片分析系统中应用的荧光检测器主要是激光诱导荧 光( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 检测器。l i f 检测器具有极高的灵敏度，般 可达1 0 9 m o l l 1 0 “2 m o l l 。对于某些荧光效率高的物质，通过采用光子计数、 双光子激发等一些改进得技术甚至可以达到单分子检测，可以部分弥补由于微流 控系统检测体积小、光程短所导致吸收光度检测相对灵敏度低的缺点。此外l i f 检测方法还具有良好的选择性和较宽的线性范围，并且许多如氨基酸、d n a 等重 要的生化物质样品均可以用荧光试剂进行标记，因此，在微流控芯片分析中l i f 检测器是一种应用最早、并且至今仍然应用较多的光学检测器，也是目前商品化 微流控芯片分析系统中采用的检测器。l i f 检测器多数用于毛细管电泳芯片，其 性能既影响检测的灵敏度，又决定系统的分离效率。 由于在选择的条件下，并非所有的化合物都能产生荧光，同时也受到激发光 源波长及荧光试剂的限制，l i f 检测器的通用性较差。此外，通常的l i f 检测器 体积较大，结构复杂、成本较高。 1 4 2 吸收光度检测法 吸收光度检测是种应用广泛的通用光学检测方法，吸收光度检测器具有可 测定的物质种类多、结构较简单的优点。特别是紫外吸收检测，是目前普通毛细 管电泳仪上应用最多、技术上较成熟、价格相对较低的检测方法，由于多数有机 生物分子对2 1 0 h m 左右紫外光都有很强的吸收，因此该方法具有广泛的适用性。 朗伯一比耳定律是紫外吸收检测系统的依据和基础，用式1 2 表达为： 4 = l 。8 i i o = l 。g 产1 舰 加 它表明：当入射光强度一定时，溶液的吸光度a 与溶液的浓度c 和液层的厚度b 的乘积成正比。利用光学检测元件( n p m t ) 、光电二极管等对样品吸收后的光强 i t 进行检测，再计算吸光度，换算出所检测的样品浓度。但在紫外吸收检测方法 应用于芯片时，灵敏度还较低，主要是检测光程短，而且非相干光很难聚焦成很 小的光斑，已有采用延长检测光程、激光增强和在柱浓缩等办法，来提高检测灵 敏度的研究报道。 1 4 3 电化学检测法 同较小尺寸的芯片相比，较大的检测器显得极不适应，有违町l a s 的初衷， 因此检测器的微型化，将成为未来一段时间里该领域的一个重要研究课题。虽然 已有把荧光检测器集成到芯片上的报道，但对于具有一次性使用前景的塑料芯 片，在其上集成检测元件，则显得有些浪费。而电化学检测的方法非常符合微流 控分析系统微型化、集成化的要求，它采用电极作为传感器，直接将溶液中待测 组分的化学信号转变为电信号。通过m e m s 技术在芯片上制作微电极比在芯片 上加工微光学器件容易的多，且其灵敏度不会因为通道几何尺寸的微型化而降 低，信号处理系统等外围设备也比较简单，易微型化。 1 5 微流控芯片的应用 微流控芯片在分析仪器微型化、集成化和便携化方面的巨大潜力，其在生物 医学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境监测与保护、卫生检疫、 司法鉴定和天体生物学研究等众多领域的应用提供了广阔的前景。 1 6 本工作的研究思路 自从t t t a s 系统概念提出以来，各种微流体芯片装置已引起了研究人员的广 泛重视，尤其最近几年来，在各种芯片上完成的分析方法，实验手段层出不穷， 对微流体芯片的原理也作了大量的研究，它已经成为分析科学一个极其引人注目 的前沿。 本论文的工作主要是以微流控芯片作为切入点，研制一套微芯片性能检测系 统，它包括控制系统的电路设计、整个系统的控制软件的设计，以及相关数据处 理方法的研究。 具体的工作思路为： ( 1 ) 采用电泳控制原理，设计出控制电路； ( 2 ) 根芯片性能要求，编制出相应的检测控制程序： ( 3 ) 进行系统验证实验； ( 4 ) 系统尿蛋白检测仪实验； 在本论文过程中，完成了控制电路设计制作、程序的编写及系统搭建等工作， 并且成功移植于尿蛋白检测仪，实现了临床尿液中蛋白质的快速分离和分析。 1 7 本章小结 论述了课题的背景意义。阐述了研制一套能够进行微流控芯片芯性能检测 系统的意义，以及对产业化的影响。 概述了当前国内外微全分析系统的一些现状及发展趋势。 概述了微流控芯片分析系统的一些原理与方法。 简要介绍了微流控芯片的应用场合。 介绍了本课题的主要研究工作。 第二章系统总体方案 本论文的目标是开发出一种既可进行微流控芯片性能参数检测，又可进行微 量样品的分析系统，为微全分析系统中芯片性能提供可靠的测试数据，同时，也 为其它微流控或其它相关实验提供一个可靠、稳定的运行环境。这对实验现象和 结果的分析及系统结构设计均具有理论指导作用。下面就系统方案的设计作详细 的论述。 2 1 系统的功能 根据微流控芯片的特点及微流控分析系统的要求，微流体的驱动与控制是系 统的核心与重点，因此微流体的驱动与控制模块是必须的；其次，微流控芯片流 体性能受影响因素众多，它需要一个稳定可靠的工作环境，故环境( 温度) 控制 模块也是必须的。除此之外，还有微流体形貌监测模块及生物样品检测和信息处 理模块。下面就一一展开详细说明。 2 1 1 微流体的驱动与控制模块 在技术高速发展的今天，微流体的驱动技术也迎来了蓬勃发展的局面，有离 心力驱动系统、机械微泵微阀驱动控制系统、电渗驱动控制系统等，它们各有自 己的优劣，可相互结合运用于各种不同的场合。其中电渗驱动是最常用的一种驱 动控制方法，它无须机械泵阀等复杂设备就可以实现微流体的进样分离控制，因 此它有着简单、方便等优点，有利于系统进行微型化设计。最后系统采用电渗驱 动方式来设计微芯片的驱动控制系统。其方案如图2 1 。 图2 1电渗驱控制动方案 ( s ：样品池，s w ：样品废液池，b ：缓冲液池，b w ：废液池) 微流体的驱动控制通过高压电源来实现控制。进样时，在s 、s w 池两端加 上高压，图2 1 实箭头方向所示，样品从s 流向s w ；分离时，在b 、b w 池加 上高压，同时在s 、s w 加一定的偏压，图2 1 虚箭头所示，十字交叉处的样品 进入分离管道，而进样管道中的样品收缩到样品池s 及废液池s w ，待检测样品 晟终流向检测点d 处，从而实现样品的分析检测。 图2 2 为高压模块的实物图，左图为0 - 5 0 0 0 v 输出，右图0 - 1 0 0 0 v 输出，它 们都是d c d c 模块，输入高阻抗，输入输出高效隔离保护，采用0 - 5 v 直接线 性控制，因此控制简单。其体积仅为5 0 3 8 2 5 m m ，适于系统小型化应用。 图2 2 高压模块实物图 2 12 系统环环境( 温度) 控制模块 对于微流控芯片实验来说，温度是实验结果的一个重要影响因素，温度的变 化直接影响微管道的缓冲体系，对流体的流型、流速也有影响。而对于一些必须 在芯片上进行生物混合、反应实验来说，温度要求就更高了，如聚合酶链式反应 ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) ，它的酶化过程要在三个不同温度下进行并 周期性重复。因此系统设计了一个温控模块以实现稳定的检测环境( 温度) 。 系统的加热制冷装置采用帕尔贴( p e l t i e r ) 实现。1 8 3 4 年，法国科学家帕 尔贴发现了热电致冷和致热现象，即金属温差电逆效应。由两种不同金属组成 对热电偶，当热电偶输入直流电流后，因直流电通入的方向不同，将在电偶结点 处产生吸热和放热现象，称这种现象为帕尔贴效应。 应用帕尔贴效应，可以制成既可加热又可制冷的温度装置，这为实验的升温 与降温提供了极大便利。它的原理如图2 3 ，把一只n 型半导体元件和一只p 型半导体元件联结成热电偶，接通直流电源后，在接头处就会产生温差和热量的 转移。在上面的一个接头处，电流方向是n p ，温度下降并且吸热，这就是冷 端。而下面的一个接头处，电流方向是p n ，温度上升并且放热，因此是热端。 图2 3 帕尔贴制冷加热原理图 图2 4 侧是帕尔贴的结构示意图与实物侧视图。根据帕尔贴的特性，帕尔贴 不仅可以作为加热器件，而当改变电流方向时，可以成为高效的冷凝器件。 图2 4 帕尔贴的结构示意图与帕尔贴散热片侧视图 2 1 3 光源系统模块 在微流控芯片分析系统中应用的荧光检测器主要是激光诱导荧光( l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 检测器。根据其光学系统不同，可分为共聚焦与非共聚 焦型l i f 检测系统。 非共聚焦型检测系统中，激光束经过透镜聚光和反射镜反射，以适当的入射 角度照射芯片的检测区域，激发产生的荧光经物镜收集聚光，并由滤光片滤除激 发光和其他杂散光后，用光电倍增管、c c d 、l e d 等光检测元件进行检测。这种 检测器结构简单，易微型化但激发光和杂散光的干扰大，导致检测信号的信噪比 很低，如图2 5 所示。 共聚焦型l i f 是微流控毛细管电泳芯片分析系统中最常用的检测系统，优点 是对荧光与激发光、反射光、杂散光的分离更完全，改善了检测的信噪比，提高 了检测的灵敏度。激光经扩束准直，由二向色镜反射并由显微镜聚焦后垂直照射 到芯片的检测区域，激发产生的荧光经二向色镜投射，并由与显微镜同轴且共焦 的显微目镜聚焦，再经干涉滤光片进一步滤除干扰光后成像在光检测元件上进行 检测如图2 6 所示。 暑遗雌，e 片 图2 5 非共聚焦型l i f 检测 图2 6 共聚焦型l i f 检测器 2 1 4 形貌监测与信息采集模块 形貌模块由c c d 组成，可以方便地进行拍照、录相、存档；信息采集模块 则由光电倍增管( p m t ) 及滤波采集电路组成。 2 2 系统的总体方案 c 图2 7 系统方案 根据系统功能要求，最后方案设计如图2 7 ，它包含了多维可动平台模块、 光源系统模块、形貌监测模块( c c d 摄像头、显微镜) 、信息采集模块( 光电倍增 9 管( p m d 、信号采集控制电路) 及