（机械电子工程专业论文）实时pcr聚合物芯片的总体结构和控制电路设计.pdf

摘要 摘要 聚合酶链式反应( p c r ) 是一种体外模拟自然d n a 复制过程的核酸扩增技 术。它属于无细胞核酸扩增范畴，通过引物延伸核酸的某个特定区域而进行重复 双向d n a 合成，它具有灵敏度和特异性高，操作简便、快速的特点，并且反应 体系有多种应用方式，能够适用于不同的核酸样品。聚合酶链式反应自从诞生之 日起，就在基因工程和分子生物学方面展现了巨大的潜力，成为生物学实验室不 可缺少的手段。 本课题在前人研究的基础上设计了实时p c r 聚合物芯片。首先介绍了p c r 技术的变性、退火和延伸三个主要反应过程以及生化反应步骤，然后在生化反应 步骤的基础上对p c r 聚合物芯片进行了总体结构设计。选择了结构简单易与集 成的驱动单元电磁微泵，改进了人字形混合器结构，采用了铂电阻温度传感器和 制冷装置，利用荧光对最终的扩增结果进行检测。 本文的重点是设计适用于p c r 反应的高密封性微阀。目前p c r 系统中的微 阀大都是微流控系统的通用阀，一般情况下不能满足p c r 反应密封性高、温度 承受性好和结构简单易于集成的要求。为了满足p c r 聚合物芯片对微阀的要求， 本文设计了一种适用于p c r 反应的高密封性微阀。该阀的主体结构是一个长方 体阀头连接着两个圆柱形阀杆共同组成的阀芯结构，其中阀头尺寸大于阀芯能够 对流体进行二次密封，另外在盖片上还具有与阀杆结构尺寸相对应的通孔。阀芯 在电机的驱动下能够与盖片上的通孔配合。该阀的结构简单，仅靠一个伺服电机 就能够实现阀的打开和关闭。利用a n s y s1 1 0 对所设计的电机伺服式微阀进行 了热结构分析，最终得出结论，此电机伺服阀的密封性与柱塞式微阀相当，适 用于p c r 反应。 论文还在以上设计的基础上设计了聚合物芯片的控制系统，它包括硬件设计 和软件设计。其中硬件设计部分选用a t 8 9 c 5 1 作为主控芯片，设计了泵和电机 驱动所需的p w i v l 信号。软件设计介绍了整个p c r 控制的时序，利用v c + + 6 o 提供的a c t i v ex 控件m i c r o s o f tc o m m u n i c a t i o nc o n t r o l 编写设计了上位机界面。 最后论文利用p r o t u e s 软件对设计的控制系统进行了仿真，仿真结果表明所设计 的控制系统能够完成对泵和阀的控制。温度控制部分最大误差拟合后的测量值与 山东大学硕十学位论文 温度计的实测值的偏差o 0 5 c 。 关键词：p c r ；驱动单元：微阀；密封；控制 n a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) h a sb e e nap o p u l a rt e c h n i q u ef o rd n a a m p l i f i c a t i o nw h i c hi sak i n do fd n aa m p l i f i c a t i o nt e c h n i q u eo u t s i d et h eb o d y a m p l i f i c a t i o no fn u c l e i ca c i d si se s s e n t i a lf o rm a n yb i o l o g i c a la p p l i c a t i o n s as i n g l e d n am o l e c u l ec a nb ec o p i e dab i l l i o nt i m e st oa l l o we a s yd e t e c t i o n p c rm i c r o c h i p s a l ep o t e n t i a l l yl o wc o s t ，d i s p o s a b l ea n dp o s s i b l ef o rh a n d h e l di n s t r u m e n t st ob e m a n u f a c t u r e d o w i n gt ot h ep r o g r e s s i v ed e v e l o p m e n to fp c ro v e rt h el a s tt w o d e c a d e s ，i th a sb e c o m eac e n t r a lt e c h n i q u ef o rn u c l e i ca c i da n a l y s i sa n di st h em o s t w i d e l yu s e dm e t h o df o rd n aa m p l i f i c a t i o ni nl a b o r a t o r y c o m b i n i n gt h er e s e a r c hf r u i to ft h ed o m e s t i ca n do v e r s e a s ，t h i sp a p e rs t u d i e st h e r e a l i z a t i o no ft h ep c ro nam i c r o c h i p f i r s tw ei n t r o d u c e dt h ep r o c e s sd e n a t u r a t i o n , a n n e a l i n ga n de x t e n s i o no fp c ra n db i o c h e m i c a lr e a c t i o ns t e p s ，a n dt h e nd e v e l o p e da s i m p l ep o l y m e r i cp c rm i c r o c h i p i nt h ep c rm i c r o c h i p ，w ei n t e g r a t e dam i c r o e c t r o m a g n e t i cp u m p ，i m p r o v e dt h es t a g g e r e dh e r r i n g b o n em i x e rw h i c hw a sd e s i g n e d b ys 仃o o c k a tl a s t , w ea d o p t e dm i c r o h e a t e ra n df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nm i c r o a p p a r a t u sd e p a r t m e n t t h em a i nr e s e a r c ht o p i co ft h ep a p e ri sd e s i g n i n gas u i t a b l em i c r o v a l v ef o rp c r c u r r e n t l yt h em i c r o v a l v e su s e di np c rw e r ec o m m o nv a l v e sw h i c h w e r en o tm e e t i n g t h er e q u i r e m e n t so fp c i t , s u c ha sh i 【g hs e a l i n g s ow ed e s i g n e dam i c r o v a l v ew h i c h s p e c i f i c a lf o rp c r t h em i c r o v a l v e ，诵t l lt h e s t u b a n ds t e mc o m p o n e n t s ，w a s p o s i t i o n e dd i r e c t l ya b o v et h ep l a t e 、 ，i t l ld r i l l e dh o l e si d e n t i c a lt os t e m t h em o t o r p r o v i d e dt h ef o r c en e c e s s a r y t oa c t u a t et h ev a l v e i ti n c o r p o r a t e di nt h ei n t e g r a t e dc h i p c o n c e p t u a l l yu t i l i z e s a l la i r t i g h t p l u g g i n gm e c h a n i s mt op r e v e n tf l u i dl o s sf r o m o p e n - t o - a m b i e n td r i l l e da c c e s sh o l e so nt h eu p p e rs u b s t r a t eo ft h ec h i p i na d d i t i o nt o t h es n u gf i t ，a p p l i c a t i o no ft h r u s ta b o v et h es t u bo ft h em i c r o v a l v ew i l la l s oe n s u r ea t i g h ts e a li n s i d et h ea c c e s sh o l e s a tl a s t ，w ed e s i g n e dt h e r m a l - s t r u c t u r a la n a l y s i sf o r t h em i c r o v a l v eu s i n ga n s y s11 0a n dc o n c l u d e dt h a tt h em i c r o v a l v ew a sm o r e s u i t a b l et h a np a s s i v ep l u gm i c r o v a l v e n 1 山东大学硕士学位论文 t h eh a r d w a r ec o n t r o lc i r c u i ta n ds o t t w a r ec o n t r o ld e s i g n 砌ei n t r o d u c e da c c o r d i n g t ot h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ep c rm i c r o c h i p i nt h eh a r d w a r ed e s i g n , w eu s e d a t 9 9 c 51a st h ec e n t e rc o n t r o l l i n gp a r t ak i n do fp w m p o w e ru s e di nm i c r o p u m p a n dv a l v ew e r ed e s i g n e d i nt h es o f t w a r ed e s i g n , w ei n t r o d u c e dt h et i m i n go ft h ep c r c o n t r o ls y s t e r ma n du s i n gm i c r o s o f tc o m m u n i c a t i o nc o n t r o ld e s i g n e dt h ep c i n t e r f a c e , w h i c hw a sp r o v i d e db yv c + + 6 0 f i n a l l y , w es i m u l a t e dt h ed e s i g n i n g c o n t r o ls y s t e mb yp r o t u e s e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt h ec o n t r o ls y s t e ms a t i s f i e d t h ed e s i g nr e q u e s to fm i c r o p u m pa n dv a l v e ，a n dt h el a r g e s tm e a s u r e m e l l te r r o ro f t e m p e r a t u r ec e n t r e lss0 0 5 k e y w o r d s ：p c r ；m i c r o p u m p ；m i c r o v a l v e ；s e a l i n g ；c o n t r o l w 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题的研究背景与意义 微流控系统是2 0 世纪9 0 年代发展起来的一项高新技术，是一项将化学、生 物学所涉及到的样品制备、生物和化学反应、分离和检测等过程集成到一块几平 方厘米的芯片上，并对其结果进行检测和分析的技术【1 】。与传统的生化检测手段 相比，微流控芯片具有高效、快速、试剂微耗量以及可以实现自动化等优点。 从1 9 9 0 年瑞士m a n z 与w i d m e r 首次提出微全分析系统的概念，到美国橡树 岭国家实验室b a m s e y 等改进了芯片毛细管电泳的方法，再到首台微流控芯片商 品化仪器开始在欧美市场销售，微流控芯片获得了快速的发展。目前，微流控芯 片主要包括微混合芯片、微分离芯片( 毛细管电泳芯片) 和微反应芯片( p c r 微流控芯片) 三大类【2 l ，其中以微反应芯片的发展最为迅速。 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是1 9 8 5 年由美国的 m u l l i s 等人提出的是一种在体外模拟自然d n a 复制过程的核酸快速扩增技术， 其原理类似于天然d n a 的复制，是体外酶促反应选择性地合成特异性d n a 的 方法。其灵敏度和特异性高，操作简便、快速，反应体系的设计十分简单，并且 有多种应用方式，适用于各种不同的核酸样品。 p c r 是一个在热循环条件下的酶催化过程，通过高温变性、低温退火和适 温延伸循环进行【3 】，使目的d n a 片段得以迅速扩增。其中变性将反应混合液加 热到9 4 左右，并维持较短的时间，使目标d n a 双螺旋的氢键断裂，形成两条 单链d n a 作为反应模板。退火将反应混合液冷却至5 5 附近，引物与单链模板 通过碱基配对，互补结合在扩增区域的两侧，形成模板引物复合物。延伸将反 应混合液的温度提高到7 2 附近并维持一段时间，引物在耐热d n a 聚合酶的作 用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸( d n t p s ) 作为底物，合成新的d n a 链。 p c r 扩增过程的基本原理如图1 1 所示。重复循环变性一退火一延伸三过 程，就可获得更多的“半保留复制链一，而且这种新链又可成为下次循环的模 板，因此p c r 技术可以使d n a 的合成量呈指数增长。每完成一个循环需2 一分 钟，2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倒4 1 。 山东大学硕士学位论文 2 p c r 技术越来越多的应用于各个领域。在病原体的检测方面，p c r 技术在 临床上的主要是用来检测病原体，包括患者受到某种病原体的感染和食物中病 原体的含量超标检测。其敏感性和特异性都要优于传统的生物测定和免疫测定 方法。可以使用p c r 技术检测的病原体包括各种细菌和寄生虫，并且p c r 技 术使肝炎病毒的诊断从血清抗体检查进入到了d n a 和r n a 诊断的分子生物学 阶段。利用p c r 技术能够对一些遗传性基因进行检测，包括遗传性乙肝、血友 病的产前诊断，从而减少患病胎儿的出生。p c r 技术已经广泛应用于肿瘤的病 因与发病机制研究，以及肿瘤诊断与治疗的研究，包括肿瘤细胞的染色体异常 研究、体细胞中肿瘤基因和肿瘤抑制基因突变的研究、检测r n a 或d n a 肿瘤 病毒等。另外一些非医学领域，包括动植物标本和生物化石的研究、伪造产品 的检测和污染源的追踪调查等方面，都可以通过p c r 技术来鉴定。所以，研制 开发适合国情、功能比较齐全和性价比高，能为我国广大中小用户所接受的p c r 微流控芯片，对促进我国医学的发展和其它研究领域的应用具有现实和深远的 意义。 v加热至9 4 c ，使双髓d n a 变性为单链 - s ，t 、9 。一一一，：，一s 尊 、， -_， - ， 、-，- ，- j 一 tgac agct v 降温至5 5 c 使引物与愎板退火结合 ctg = 亨不r ，s 鸟 ， tgac i - _ 催化新_ 生的d n a 睫延伸l 、i 合成新的d n a 分子 图1 1p c r 基本原理 第1 章绪论 1 2 国内外的研究现状 1 2 1p c r 系统的研究现状 目前，p c r 芯片主要分为静态微腔式和动态连续流式两类。国外对于两类 芯片的研究相对较多，国内在p c r 芯片方面的研究则刚开始起步，清华大学、 浙江大学、大连理工大学和上海微系统与信息技术研究所等都在进行这方面的研 究。当前微流控芯片还处于基础研究未到产品开发的阶段。 静态微腔式p c r 芯片反应混合液通常被固定在微腔内，通过在外部或内部 控制加热器的温度，实现快速升降温，完成温度循环。p o s e r 等人最早讨论了静 态微腔式p c r 芯片上的热传导和温度分布问题，他们通过集成在基底上的薄膜 电阻加热器实现加热，通过风扇完成冷却，这种装置比常规p c r 热循环仪的热 响应速度快，反应时间短【5 】。l a g a l l y 等人在玻璃上集成了p c r 芯片，最后还使 用了荧光检测，该集成芯片反应迅速，仅在3 0 s 内就能够完成一次d n a 复制【6 l 。 x i a n g 等人将p d m s 基片与玻璃盖片键合在一起，构成具有多个不同容积微反应 腔的p c r 芯片，以薄膜加热器进行接触式加热，采用空气制冷方式，在扩增过 程中利用荧光显微镜进行实时检测，其扩增时间比较长【7 】。赵燕青和崔大付将热 电材料依照帕尔帖模型排列组合制作于p c r 芯片的反应室底部，实现对反应室 升温及降温的操作，制作出集成了微反应室p c r 芯片嗍。 动态连续流式芯片反应混合液在p c r 微流控芯片的微通道中反复流经三个 不同温度的恒温区，实现温度循环，从而达到d n a 扩增的目的。k o p p 等人首 次提出连续流式p c r 扩增的概念【9 】。k i m 等人在p d m s 基片上利用软光刻方法 加工出微通道，并采用等离子键合方式将p d m s 与玻璃盖片键合在一起，加工 出3 0 循环的连续流式p c r 微流控芯片，在3 0 r a i n 内扩增出4 3 0 b p 的d n a 模板 0 0 。f u k u b a 等人采用软光刻与热压工艺，在p d m s 基片上加工出微通道，制作 成3 0 循环的连续流式p c r 微流控芯片，将流速控制在8 - - 4 0 n l s ，在1 h 内扩增 出5 8 0 和1 4 5 0 b p 的d n a 模板【l l 】。c r e w s 等人在玻璃基片上分别加工出3 0 和4 0 循环的连续流式p c r 微流控芯片，并分别扩增出1 0 8 和1 8 1 b p 的d n a 模板，进 行4 0 循环扩增时，反应时间大约为9 m i n 1 2 】。 静态微腔式p c r 芯片，结构简单，试剂消耗量少，但因温度循环仍然依赖 于温控系统的加热冷却速率，所以扩增速度仍然相对较慢。连续流p c r 芯片反 山东大学硕士学位论文 应速度不再受温控装置的温度转换速度所限制，而是由p c r 混合液在微通道内 的流动速度所决定。 1 2 2 徽阀的研究现状 作为p c r 反应一个必不可缺少的控制元件，国内外对于微阀的研究越来越 深入。s o b o c i n s k i 设计了一种压电微阀，共包括6 层结构，分为微反应腔、流体 通道和阀座，它具有灵敏度高，反应迅速，死体积小等优点【13 1 。b y u n g h o o n 设计 的静电微阀使用时间长，平均使用寿命在四千七百万次和四千八百万次之间【1 4 1 。 k o h l 设计的智能形状记忆合金微阀，结构简单、紧凑，具有较高的输出功率， 并且能够控制压差和流量【15 1 。石蜡相态之间的变化也被应用到微阀中，b o z l f i 设 计的石蜡微阀利用一层p d m s 薄膜把石蜡与流体隔开，其原理新颖，结构简单， 不需要外围辅助器件【1 6 1 。m a r c 设计的气动式微阀一直被认为是气动式微阀中最 成功的例子，它共分为3 层，自上到下分别为气体通道、p d m s 薄膜和流体通道， 它的死体积小1 7 1 。p r a k a s h 和k a l e r 设计的柱塞式微阀机械性能好，强度高，结 构比较简单【1 引。p i l a r s k i 等设计了外伺服电机驱动微阀，主要是由玻璃基底、 p d m s 微流体通道、阀针和外部驱动电机所组成，其机械强度高，互换性好，密 封性高【1 9 1 。 除了上面提到的微阀以外，常用的微阀还包括电磁阀【2 0 1 、热气驱动微阀1 2 l 】、 凝胶阀【2 2 1 和毛细管微阀f 纠等。其中外电机伺服微阀和柱塞阀的密封性较好，但 是它的结构复杂，因此设计一种适用于p c r 反应的高密封性微阀具有一定的实 际意义。 1 3 主要研究内容 本文针对微流控系统的p c r 反应系统进行了研究，在此基础上设计了容量 为3 0 “l 的p c r 芯片，具体的研究内容如下： ( 1 ) 实时p c r 聚合物芯片的总体结构设计 p c r 聚合物芯片运用微电子机械系统( m e m s ) 技术在选取的基片材料上加工 一系列的功能器件，利用芯片集成度高和比表面积大的特性，在芯片上实现快速 的目的基因扩增。 芯片的总体结构介绍了驱动单元、混合单元、温度控制单元和荧光检测等。 第1 罩绪论 驱动单元利用的是哈尔滨工程大学裴志设计的一种新型无阀电磁泵，其在输入电 压9 v ，频率3 5 h z 时，可以达到流量0 6 m l m i n 。混合器采用人字形混合器，它 能使流体在管道内螺旋流动，混合效果明显。为了能够应用于本文设计的芯片， 对混合器尺寸进行了一定的改进。温度控制单元选用了铂电阻温度传感器和散热 装置。荧光检测具有高灵敏度，高检测范围和易于实现等诸多优点，最终利用荧 光对反应结果进行检测。 ( 2 ) 适用于p c r 反应的高密封性微阀设计 p c r 在热循环的过程中需要一个严格的密封环境，对控制阀提出了很高的 要求。结合p i l a r s k i 等设计的外伺服电机驱动微阀制动力大，反应灵敏的特点以 及p r a k a s h 和k a l e r 设计的柱塞阀密封可靠结构简单的特点，设计了一种新型电 机伺服式阀。 芯片选用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 。微机械加工方法有多种， 目前国内比较成熟的是激光刻蚀，p m m a 对准分子激光的光波吸收率高，容易 实现准分子激光的微刻蚀加工。 p c r 反应腔设计为圆形结构，可以使反应液体很容易充满整个腔室，方便 进样及提样，而且能够避免气泡产生。流体通道的横截面为矩形结构，它利用激 光刻蚀易于加工，而且流体高速流量要大于圆形结构。混合通道是夹角6 0 0 的y 型混合样式，采用竖插式进样结构，盖片与微流体通道通过热压法键合在一起， 使微芯片成为密封结构。 阀芯是新型微阀设计的主要结构，它是由一个长方体阀头结构和两个圆柱形 阀杆结构组成。其在电机的拖动下进行上下运行，从而对芯片进行密封。驱动电 机选用佳美系列j r s 3 6 5 1 5 8 5 电机。滚珠丝杠为电机和阀芯之间的传动装置。 最后利用a n s y sll 。0 对设计的阀结构进行了仿真，为了进一步验证阀密封 的可靠性，同时仿真了p r a k a s h 和k a l e r 设计的柱塞式微阀，通过两者之间的比 较最终得出结论。 ( 3 ) 聚合物芯片控制系统设计 控制系统包括硬件和软件的设计。其中硬件主控芯片选用a t 8 9 c 5 1 ，主要 输出对泵和阀的控制信号。系统的软件设计部分主要是对软件流程的总体设计。 控制系统输出了幅值和频率可调的p w m 泵控制信号，还控制了电机的转向和转 5 山东大学硕十学位论文 速。另外还利用v c + + 6 0 提供的a c t i v ex 控件m i c r o s o f tc o m m u n i c a t i o nc o n t r o l 编写设计了上位机界面。 ( 4 ) p r o t u e s 仿真 利用p r o t u e s 的电路仿真功能对泵和电机的控制进行了仿真，泵仿真系统在 输出终端连接了虚拟示波器，对p w m 结果进行了显示。电机仿真系统选用的电 机能够直观的显示电机的运行状况。 6 第2 章p c r 聚合物芯片总体结构设计 第2 章p c r 聚合物芯片总体结构设计 近几年来，微流控技术迅速发展，不仅因为其价格便宜，还由于其具有在微 尺度下进行精确生化分析的能力。p c r 是微流控技术发展的产物，从诞生之日 起，就在基因工程和分子生物学方面展现了巨大的潜力，成为生物学实验室不可 缺少的手段。 2 1 聚合酶链式反应 2 1 1p c r 技术的基本原理 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是由美国的m u l l i s 等人 提出的一种体外模拟自然d n a 复制过程的核酸快速扩增技术2 4 1 。它的原理类似 于天然d n a 复制，是酶促反应选择性地合成特异性d n a 的方法1 2 5 】。 p c r 是一个热循环条件下的酶促反应过程，通过高温变性、低温退火和适 温延伸三个过程循环进行，使目的d n a 片段得以迅速扩增。工作原理是以拟扩 增的d n a 片段为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在d n a 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸，直至完成新的d n a 合成1 2 6 1 。不断重复这一过程，可使目的d n a 片段得到扩增。它的主要反应过程 如下： ( 1 ) 变性( d e n a t u r a t i o n ) ：将反应混合液加热到9 4 左右，并维持一定的 时间，使目标d n a 双螺旋的氢键断裂，形成两条单链d n a 作为反应的模板。 ( 2 ) 退火( a n n e a l i n g ) ：将反应混合液冷却至5 5 附近，引物与单链模板 通过碱基配对，互补结合在扩增区域的两侧，形成模板引物复合物。 ( 3 ) 延伸( e x t e n s i o n ) ：将反应混合液的温度加热到7 2 附近并维持一段 时间，引物在耐热d n a 聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸 ( d n t p s ) 作为底物，合成新的d n a 链【2 7 1 。 将以上三步作为一个循环重复进行，前一循环得到的产物作为下一次循环的 模板，就能够得到大量的d n a 链。p c r 合成的特定d n a 序列数量随着循环次 数呈指数增加。经过扩增后的d n a 产物大多是介于引物与原始d n a 相结合的 位点之间的片段，而在反应开始产生的超过引物结合位点的较长链d n a 比率将 7 山东大学硕+ 学位论文 随着循环次数的不断进行而稀释，最后到达可以忽略的程度。 p c r 技术灵敏度和特异性高，操作简便、快速，反应体系的设计十分简单， 并且有多种应用方式，适用于各种不同的核酸样品。它在基因工程、分子生物学、 疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药开发和工农业制品开发等方面 显示了巨大潜力和广泛用途，成为分子生物学实验室不可缺少的手段，被广泛用 于与基因有关的领域，包括基因合成、测序、分离、克隆等。 2 1 2p c r 反应生化分析步骤 p c r 芯片的目的是为了完成d n a 样本的扩增，这一功能的实现通常要牵涉 到一系列的生化分析操作，主要包括试剂引入、p c r 反应和检测三个步骤1 2 引， 如图2 1 所示。在这个过程中要对不同的试剂进行操作，而且这些操作都是不连 续的，为了减少人工操作对p c r 反应的影响，完成快速、精确和自动的生物化 学分析，芯片上必须具有流体驱动、混合、密封控制、温度控制和检测等单元。 图2 - 1p c r 生化分析步骤 本文采用先进的m e m s 加工技术，设计了单片微型结构的集成微流控芯片， 它包括微泵、微阀、微混合器、加热和荧光检测单元，能够完成样本的驱动、混 合、控制、加热和检测等一系列操作。下面将对芯片的各个单元进行逐一介绍。 2 2p c r 芯片驱动单元 泵是实现流体控制的核心部件，是输送流量和控制流体流动的主要动力元 件。微泵有多种分类方式，依据驱动系统有无活动部件，可以分为机械驱动和非 8 第2 章p c r 聚合物芯片总体结构设计 詈曹墨量墨置量量毫詈皇量冒量量| 量皇鼍曾置曼置詈置皇量一1 机械驱动泵：按照微泵中控制部件的不同，可以分为有阀泵和无阀泵两类【2 9 1 。有 阀微泵种类很多，可以适用于各种液体，但是其结构复杂，具有活动部件，不宜 集成，因此在微流控芯片中还没有得到广泛的应用。与有阀结构相比，无阀泵结 构比较简单，没有活动部件带来的沿程压力损失，因此目前驱动单元常采用无阀 型微泵。 最常见的一种无阀微泵的驱动方式为扩散口喷嘴结构的整流特性【3 0 l 。扩散 口喷嘴的结构原理如图2 2 所示。扩散口喷嘴结构无阀微泵的工作原理是通过 驱动膜片发生形变来引起反应腔体积的变化从而驱动流体流动。扩散口是横截面 面积在流体流动方向上逐步扩大的微流通通道；喷嘴是横截面面积在流体流动方 向上逐步缩小的微流通通道。其工作原理主要包括“吸入 和“泵出两个工作 模式。 泵体体积增大 a ) 泵“吸入”模式 泵体体积减小 b ) “泵出”模式 图2 - 2 无阀微泵工作原理 ( 1 ) “吸入”模式：当阀膜往上移动时，泵腔的体积增大，扩散口和喷嘴 分别从进水口和出水口吸入液体。由扩散口和喷嘴的位置可知，扩散口吸入的液 体量要大于喷口吸入的液体量。 ( 2 ) “泵出 模式：当向下运动时，泵腔的体积减小，扩散口和喷嘴分别 从进水口和出水口释放液体，此时，扩散口释放的液体量要小于喷口释放的液体 量。 由“吸入 模式和“泵出 模式可知，在吸入时，扩散口吸入的液体量大于 喷口吸入的液体量；在泵出时，扩散口释放的液体量要小于喷口释放的液体量。 如此经过一个周期，一定流量的液体靠微泵振动膜片的驱动从进水口到达出水 口。泵依次运动，就能够使液体流动。 哈尔滨工程大学的硕士研究生裴志设计了一种新型无阀微泵，它具有集成 9 山东人学硕十学位论文 化、小型化、结构简单和控制方便等特点，并于2 0 0 7 年申请了中华人民共和国 专利。该无阀泵主要是由泵体和驱动器两部分组成，其结构如图2 3 所示。泵体 主要有上中下三部分组成，上下泵体上分别开有泵腔，泵腔的尺寸为1 2 m m 6 m mx2 m m ( 长宽高) ，驱动腔的尺寸为6 m m 6 m mx5 r a m ( 长宽x 高) 。泵 体的三个部分由塑料螺丝、螺母固定，泵体四周用密封胶做密封处理。微泵外形 的整体尺寸为4 5 m m 1 6 m mx2 3 m m ( 长宽高) ，无阀微泵扩散口和喷嘴的管 角为1 5 0 ，管长为8 m m ，驱动薄膜面积为3 6 m m 2 ，总重量为3 2 9 。微泵的泵体材 料为有机玻璃，驱动薄膜材料为硅橡胶。驱动器是由电磁线圈、永磁体与驱动薄 膜组成。 a ) 微泵零件图b ) 微泵整体结构图 图2 3 微泵结构图 带有扩散口喷嘴结构的微泵的运动过程为：电磁线圈通电后产生电磁场， 该磁场通过微泵壳体与磁铁产生电磁回路，电磁回路是逐步封闭的，磁感应强度 逐渐增强。由于磁铁与外壳端面之间存在上腔体，使得磁铁与端面产生电磁力， 从而使磁铁带动驱动薄膜与上腔体端面吸合，吸合的过程也就是泵上腔体的排出 过程，下腔体的吸入过程。当改变电流方向以后，电磁线圈产生的电磁场方向发 生改变，因此磁铁与上腔体端面产生斥力，使磁铁带动驱动薄膜向下腔体端面吸 合，此过程为泵的吸入过程。改变通入电磁线圈中电流的方向，使电磁线圈产生 的电磁场方向发生交替变化，进而就会使磁铁在泵的驱动腔中往复直线运动，上 下两个泵腔就可以交替的工作【3 1 i 。 该无阀微泵当电磁线圈中通入的电流电压为9 v ，频率3 5 h z 时能够达到最 大的流量0 6 m l m i n 。本文选用该无阀微泵作为芯片的驱动单元。 j 0 第2 章p c r 聚合物芯片总体结构设计 2 3p c r 芯片混合单元 微流体系统中所涉及到的微通道的尺寸基本上都在微米量级，且流速较小， 因此液体处于层流状态。由液体力学理论可知，层流状态下流体主要是通过流体 分子的自由扩散和对流传质完成混合的 3 2 】。通常情况下，微通道中的流体是靠两 接触面上的流体分子的自由扩散来进行混合的。这种混合效率低，需要很长的混 合通道才能够达到满意的效果。为了减小混合时间和混合通道长度，在p c r 芯 片中选用了混合器。 混合器主要分为主动式和被动式两大判3 引。主动式微流体混合器是靠借助外 界能量的输入，通过活动部件的运动或者改变压力梯度的方式对微通道中的流体 进行扰动。这种混合器包括压力驱动、动电驱动、磁驱动和声波驱动等方式。被 动式微混合器主要靠改变通道内部结构和形状，尽可能增大混合面积来达到混合 效果的。目前被动式混合器主要分为t 形混合器、分流混合器、注射式混合器和 馄饨混合器。其中馄饨混合器是一种通过改变通道内流体的层流状态，使液体处 于杂乱无章的馄饨状态来进行混合的，这种混合器不需要外部驱动场，结构简单， 易于集成，适用于p c r 反应。因此选用s t r o o c k 等设计的人字形馄饨式混合器对 p c r 反应中的流体进行混合【川。 该混合器在流体通道底部具有人字形凹槽结构。当流体流过时，人字形凹槽 给流体一个垂直于流速方向的作用力，使部分流体垂直于原来的流动方向流动， 这样就形成了两股液流的剪切运动，改变了流体的层流状态，使流体在馄饨状态 下混合。 人字形混合器结构如图2 - 4 所示，主要包括上部流体通道和底部人字形凹槽 结构两部分。其中，人字形结构在水平方向上倾斜4 5 0 ，它们在结构上是非对称 的，并且半个周期交替排列。通道的宽度w 为2 0 0 9 m ；流体通道高度h 为7 7 t a n ； a 为人字形结构高度与流体通道高度的比例系数，一般情况下a 6 0 0 ，等到一个周期，流体混合的更 加充分。 山东人学硕士学位论文 、 0 圈 、 1 2i i t 1 圈 l r t ： 2 0 0 p n 、 1 5 圈 因l 二 15 图 图2 - 4 人字形混合器混合效果幽 这种人字形馄饨混合器可以使流体快速变形，拉伸流体界面，增加界面的面 积，从而加快混合，减少流体之间分子扩散距离，在3 c m 的长度内就能够完成 混合l5 次，达到流体之间的完全混合。s t r o o c k 设计的人字形馄饨混合器应用于 本文所设计的聚合物芯片需要在结构上做一些调整。取流体通道1 4 ，为7 0 0 9 m ， 高度h 为3 0 0 m 。人字形结构高度与流体通道高度的比例系数a 为0 2 3 ，因此底 部加工的人字形凹槽的深度为6 9 9 m 。人字形结构在水平方向上倾斜4 5 。，它们 在结构上是非对称的，并且半个周期交替排列。 第2 章p c r 聚合物芯片总体结构设计 2 4p c r 芯片温度控制单元 p c r 芯片最主要的核心工作是温度控制，其中主要包括加热和散热过程。 p c r 芯片的加热器和温度传感器是都是利用热阻效应进行工作的。金属铂( p t ) 是制造加热器和温度传感器的理想材料，它对酸的化学稳定性很高，不溶于一般 的强酸和强碱。物理特性方面，金属铂制造的电阻在一定温度范围内具有线性， 且阻值稳定，比较容易实现补偿，精度较高。p t l o o 热电阻根据封装的不同可分 为普通、铠装和薄膜三种类型。本系统采用的是德国贺利氏原装进口p t i 薄膜 电阻1 3 5 】。 作为执行机构，半导体制冷器必须与被控对象微流控芯片相结合，才能实现 温度的改变。由于t e c 半导体制冷器工作过程中是一面处于制冷状态，另一面 处于发热状态，如果长时间工作过程中未能把发热面的热量及时散发出去，必然 会导致发热面的热量向制冷面传递，这样就会造成制冷面的制冷效率下降。因此 在设计制冷系统过程中也必须要考虑到t e c 半导体制冷器制的散热问题【3 6 1 。图 2 5 为本系统半导体制冷器散热装置图。 半导体制冷器散热装置是以具有较高导热系数的铜为热沉，微流控芯片反应 腔就安放在铜热沉的一个面上。半导体制冷器位于散热片和铜热沉之间，微流控 铜熟沉 风扇 图2 5 半导体制冷器散热装置 反应腔 山东大学硕士学位论文 芯片反应腔的温度就是通过改变热沉的温度去控制的。温度传感器在安装时，既 要紧贴热沉安装同时还需要尽可能的靠近反应腔。散热片上安装了风扇，以利于 散热片上的热量能快速的释放，从而保证长时间稳定的工作。另外为了最大限度 的减小制冷器与散热片、制冷器与热沉端面的热阻，在各端面上还涂敷导热硅脂。 在涂敷导热硅脂时要保证各接触面的平整。 2 5p c r 芯片检测单元 p c r 反应完成以后，必须通过检测技术才能获得它所包含的信息。迄今为 止，已经发展出十几种检测技术，根据检测方式的不同，可以分成光学检测、电 化学检测、质谱检测和其它检测四大类。各种检测技术的特点如表2 1 所示。 表2 1 各种检测方法的特点 荧光检测的灵敏度高，检测浓度能够达到1 0 9 l o _ 2 m o l l ，另外，它还具有 良好的选择性、线性范围宽和非破坏性检测等特点，已逐渐成为微流控领域应用 最广泛的测试技术。因此本文中选用荧光检测。 目前普遍使用的基于荧光能量传递技术的检测技术有：t a q m a n 技术、 a m p l i s e n s o r 技术、分子信标技术、l i g h t c y c l e r 技术和复合探针技术。虽然上述几 种p c r 定量检测技术在技术层面上的原理和方法各不相同，但是它们的荧光发 光机理以及发光目的却是相同的，都是通过破坏两个荧光分子间的f r e t 来发 出荧光，荧光强度与溶液中d n a 模板量成正比。根据荧光的强度以及强度相对 变化的信息，就可以对p c r 产物进行定量分析。其中f r e t 是指通过供受体发 色团之间偶极偶极相互作用，能量从供体发色团传递至受体发色团，传递效率 与两个发色团之间距离的6 次幂倒数成比例【”l 。改变f r e t ，两个荧光分子就能 1 4 第2 章p c r 聚合物芯片总体结构设计 发出荧光。冈此，以量值溯源的要求对p c r 定性、定量分析的荧光检测，将从 根本上提高p c r 测量技术的i j 丁靠性和准确性。 荧光基团通常拥有单一的光吸收峰值，在光的刺激下，荧光基团吸收的光能 以光能、热能和转移给临近分子能量的三种形式释放。其中，光能占据了释放的 大部分能量，其发射光的峰值要大于吸收峰。荧光标记基团在某波长的激发光刺 激下，能产生一个更长波长的发射光。 荧光检测的工作原理为：光源发出的激发光经过激发光分光系统和激发光光 纤传导系统，到达指定的荧光检测区进行荧光激发。被激发出的荧光为发射光， 经光纤传导系统和分光系统，被光电检测器( p m t ) 接受并进行光电转换，最后进 入到计算机进行检测数据处理。检测点在指定的荧光检测区进行荧光激发和检 测，由计算机进行控制工作38 1 。 微流控p c r 技术检测是一个非常庞大的研究项目，由于时间有限，只是简 单的概括其中的一些关键点。第一，散热。p c r 反应需要进行三个阶段的高温 变化，其中变性需要把反应溶液加热到9 4 。c ，而荧光光谱检测系统中的光电元 器件最佳工作条件是常温，约为2 5 ，因此荧光系统要处理排热降温的问题。 第二，避免杂光。荧光基团通过吸收光能释放出更高波长的能量，在实验过程中 不可避免的有很多杂光，要避免杂光对检测的影响。第三，集成和微缩。整个荧 光检测系统要尽量的体积微小，易于集成。只有克服了以上几点，荧光检测才能 够成功的应用于p c r 系统。 l 矧2 7 荧光激发及检测系统示意图 山东大学硕士学位论文 2 6 本章小节 本章首先介绍了p c r 技术的基本原理和所需的生化分析步骤。然后根据所 需生化分析步骤，选择了聚合物芯片的驱动单元电磁微泵，改进了人字形馄饨混 合器，选择了芯片的温度采集电阻和散热器，最后介绍了系统的荧光检测。 第3 章适用于p c r 反廊的高密封性微阀设计 第3 章适用于p c r 反应的高密封性微阀设计 微阀是p c r 微流控芯片中的关键执行部俐3 纠，在聚合酶链式反应中为d n a 的复制提供密闭环境，是p c r 高效快速反应的必要条件。本章结合密封性较高 的柱塞式和电机伺服式微阀，设计了一种新型的适用于p c r 反应的高密封性电 机伺服阀。 3 1 适用于p c r 反应的微阀研究 目前微阀的种类繁多，它们各有各的优缺点。其中，压电微阀灵敏度高，反 应迅速，死体积小，但是行程短，密封性差【舭2 】；磁微阀结构比较复杂【4 3 刖】；形 状记忆合金微阀结构简单、紧凑，具有较高的输出功率【4 5 删；相变微阀在一次性 生物芯片中广泛使用，但是打开时间缓慢【4 7 4 9 】：毛细管微阀结构简单易于