（生物化学与分子生物学专业论文）甘蔗锌指蛋白正反义基因遗传转化甘蔗的研究.pdf

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片段，分别以正向和反向插入到中间载体p c r b i 的p r d 2 9 a 启动子和n o s 终止子之间， 构建了其正义植物表达载体p c r b i s h z p 和反义植物表达载体p c r b i a n t i s h z p ，该植物 表达载体的抗性标记基因为b a r 基因。采用冻融法分别将p c r b i s h z p 和p c r b i a n t i s h z p 导入农杆菌菌株e h a l 0 5 中，通过农杆菌介导法对甘蔗愈伤组织进行遗传转化，经分化 培养及连续抗性筛选，获得4 3 株转正义基因抗性植株和4 1 株转反义基因抗性植株，对 这些抗性植株进行b a r 基因的p c r 检测，获得1 0 株转正义基因的阳性植株和8 株转反 义基因的阳性植株。对这些阳性植株进一步进行了启动子区和目的基因区之间的一个特 异片段的p c r 检测，获得6 株转正义s h z p 基因的阳性植株和8 株转反义s h z p 基因的阳 性植株，初步证明正义反义甘蔗锌指蛋白s h z p i 基因已成功整合到甘蔗基因组中。为之 后的s h z p 功能分析打下了基础。 关键词：转录因子；甘蔗；锌指蛋白；s h z p ；干旱；转基因 a b s t r a c t s u g a r c a n e ( s a c c h a r u mo f f i c i n a r u ml ) i so n eo f t h em o s ti m p o r t a n ts u g a rc r o p s ，a l s oi ti s a ni m p o r t a n tc h e m i c a lm a t e r i a lf o rg r e e ne n e r g ys o u r c eo fe t h a n o l ，f i b r e ，s u g a rc h e m i c a l ， f e e d s t u f f i nt h el o n g - t e r me v o l u t i o n , p l a n t sg e n e r a t eas e r i e so fs t r e s sr e s p o n s e m e c h a n i s m s p l a n te n g i n e e r i n gs t r a t e g i e sf o ra b i o t i cs t r e s st o l e r a n c er e l yo nt h ee x p r e s s i o no f g e n e st h a ta r ei n v o l v e di ns i g n a l i n ga n dr e g u l a t o r yp a t h w a y so rg e n e st h a te n c o d ep r o t e i n s c o n f e r r i n gs t r e s s t o l e r a n c eo re n z y m e sp r e s e n ti np a t h w a y sl e a d i n gt ot h es y n t h e s i so f f u n c t i o n a la n ds t r u c t u r a lm e t a b o l i t e s t h ef i r s tg e n et y p ei sr e g u l a t o rg e n e ，w h i l et h et w o b e h i n db e l o n gt oe f f e c t o r g e n e r e g u l a t o rg e n ec a na c t i v a t e t h ee x p r e s s i o n o fe f f e c t o r g e n e a b i o t i cs t r e s sc a na c t i v a t et h ee x p r e s s i o no fs o m et r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( t f s ) r e l a t e dt o r e s p o n de n v i r o n m e n tp r e s s u r e ，w h i c hc a ne v o k et h ee x p r e s s i o no fas e r i e so f e f f e c t o rg e n e s ， s ot h a t sh o wt h ep l a n t sf a c et h ea b i o t i cs t r e s s z i n cf i n g e rp r o t e i nb e l o n g st oa ni m p o r t a n t t r a n s c r i p t i o nf a c t o rf a m i l yt h a tw i d e l ye x i s t si nb o t hp r o k a r y o t i ca n de u k a r y o t i co r g a n i s m t h i sk i l l do ft f sp a r t i c i p a t ei nal o to fl i f ea c t i v i t y , i n c l u d e sg e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ，c e l l d i f f e r e n t i a t i o n ，e m b r y od e v e l o p m e n t ，e n h a n c et h ep l a n t sr e s i s t a n ta b i l i t yt oa b i o t i cs t r e s s a c c o r d i n gt o t h es e q u e n c eo fs h z pc l o n e df r o ms u g a r c a n eb yo u rl a b o r a t o r y , w e d e s i g n e ds p e c i a lp r i m e r so u t s i d eo p e nr e a d i n gf r a m e ，i n t r o d u c e dt h ec l o n e dr e s t r i c t i o ns i t e t h r o u g hp c rw h i c hr e s p e c t i v e l y f o r w a r d l ya n dr e v e r s e l yi n s e r t e db e t w e e np r d 2 9 a p r o m o t e ra n dn o st e r m i n a t o ro fi n t e r m e d i a t ev e c t o rp c r b i ，c o n s t r u c t e dt h ee x p r e s s i o n v e c t o ro ft r a n s s e n s ep c r b i s h z p a n da n t i s e n s ep c r b i a n t i s h z p ，t h er e s i s t a n c em a r k e r g e n e so ft h i sp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r i sb a rg e n e t h et w ov e c t o rw a st r a n s f e r r e di n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e r f a c i e n se h a l 0 5 u s e dt ot r a n s f o r ms u g a r c a n ee m b r y o n i cc a l l u sb y a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d ，a f t e rd i f f e r e n t i a t i o n c u l t u r ea n dc o n t i n u o u s r e s i s t a n c es c r e e n i n g ，t h e r ew e r e4 3t r a n s - s e n s er e s i s t a n tp l a n t sa n d4 1a n t i s e n s er e s i s t a n t p l a n t s ，t h e ng o t1 0t r a n s s e n s er e s i s t a n tp l a n t sa n d8a n t i s e n s er e s i s t a n tp l a n t st h r o u g hp c r t e s t i n go fb a rg e n e 6t r a n s - s e n s er e s i s t a n tp l a n t sa n d8 - a n t i s e n s e r e s i s t a n tp l a n t sw e r et e s t e d t h r o u g hp c rt e s t i n gb e t w e e np r o m o t e rr e g i o na n dt a r g e tg e n e ，w ep r i m a r i l yp r o v et h a t s e n s es h z pa n da n t i s e n s es h z ph a db e e ni n t e g r a t e di n t ot h es u g a r c a n eg e n o m e ，a l lt h i sl a i d f o u n d a t i o nf o rt h el a t t e rf u n c t i o n a la n a l y s i s k e y w o r d s ：t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( t f s ) ；s u g a r c a n e ；z i n cf i n g e rp r o t e i n ；s h z p ；d r o u g h t ； t r a n s g e n 目录 1 引言与文献综述1 1 1 甘蔗概述1 1 1 1 甘蔗的生物学特性1 1 1 2 甘蔗的经济价值1 1 1 2 1 甘蔗是重要的糖料作物1 1 1 2 2 甘蔗作为生物反应器的优点2 1 1 2 3 甘蔗副产品的利用2 1 1 2 4 甘蔗是重要的能源植物2 1 2 甘蔗转基因技术3 1 2 1 农杆菌介导法3 1 2 1 1 农杆菌介导的转化机理3 图1 - 1 农杆菌t - d n a 转化植物细胞的过程4 f i g l 一1t h ep r o c e s so fa g r o b a c t o r i t i mt d n ai n t op l a n tc e l l s 4 1 2 1 2 农杆菌转化系统的特点4 1 2 1 3 质粒载体系统的构建4 1 2 1 4 农杆菌介导植物转化技术在禾本科植物中的应用5 1 2 2 其他转化方法5 1 2 2 1 基因枪法5 1 2 2 2 电激法5 1 2 2 3 脂质介导法6 1 2 2 4p e g 介导法6 1 2 2 5 微注射法6 1 2 2 6 超声波介导法6 1 2 2 7 脉冲电泳法6 1 2 2 8 病毒介异法6 1 2 2 9 染色体直接介导转化法7 1 2 3 筛选标记基因的研究进展7 1 2 4 甘蔗遗传转化的研究进展7 1 2 4 1 甘蔗抗虫转基因研究7 1 2 4 2 甘蔗抗病毒转基因研究7 1 2 4 3 甘蔗抗菌转基因研究8 1 2 4 4 甘蔗抗除草剂转基因研究8 1 2 4 5 提高甘蔗抗逆性的转基因研究8 1 2 4 6 甘蔗作为生物反应器的研究8 1 2 4 7 提高甘蔗蔗糖含量和改良蔗糖色泽的转基因研究9 1 3 锌指蛋白的研究进展9 1 3 1 锌指蛋白的分类1 0 1 3 2 锌指蛋白调控基因转录的功能1 0 1 3 2 1 锌指蛋白的d n a 识别作用1 1 1 3 2 2 锌指蛋白的r n a 识别作用1 2 1 3 2 3 锌指蛋白与蛋白质的作用1 2 1 3 3 植物c 2 h 2 型锌指蛋白1 3 1 3 3 1 植物c 2 h 2 型锌指蛋白的结构1 3 1 3 3 2 植物c 2 h 2 型锌指蛋白对靶d n a 的识别1 4 1 3 4 逆境胁迫相关的锌指蛋白1 5 1 4 反义r n a 研究进展16 1 4 1 反义r n a 作用机制1 6 1 4 1 1d n a 复制水平上的调控1 6 1 4 1 2 转录水平上的调控1 7 1 4 1 3 翻译水平上的调控1 7 1 4 2 反义r n a 在植物基因工程中的应用1 7 1 4 2 1 控制果实性状1 7 1 4 2 2 雄性不育的控制1 8 1 4 2 3 植物抗病性的研究1 8 1 4 2 4 对植物性状的控制1 8 1 5 植物逆境生理及其耐( 抗) 性机制19 1 5 1生物膜及一些保护酶系统1 9 1 5 2 活性氧的产生与清除2 0 1 5 3 渗透胁迫及其调节2 0 1 5 4 光合作用减弱2 0 1 5 5 激素水平的变化2 1 1 5 6 胁迫蛋白的合成2 1 1 5 7 胁迫诱导基因的表达及调控2 1 1 6 本研究的目的、内容和技术路线2 2 1 6 1 研究目的2 2 1 6 2 研究内容2 2 1 6 3 技术路线2 2 2 材料和方法2 3 2 1 材料与试剂2 3 2 1 1 质粒及菌种2 3 2 1 2 试剂2 3 2 1 3 主要仪器设备2 3 2 2 1引物设计及基因扩增2 4 2 2 1 1 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因c d n a 引物的设计2 4 2 2 1 2 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因正义反义目的片段的扩增2 4 2 2 1 3 电泳检测p c r 产物2 5 2 2 2p c r 扩增产物的克隆与测序2 5 2 2 2 1 目的片段的回收2 5 2 2 2 2 目的片段与p m d l 8 一tv e c t o r 的连接2 6 2 2 2 3 感受态细胞的制备2 6 2 2 2 4 连接产物的转化2 7 2 2 2 5 重组质粒d n a 的小量提取2 7 2 2 2 6 电泳分析2 8 2 2 2 7 重组质粒的酶切鉴定2 8 2 2 2 8 重组菌p m d s h z p 和p m d a n t i s h z p 的保存2 8 2 2 2 9p c r 产物的测序2 9 2 2 3 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因植物表达载体的构建2 9 2 2 3 1 质粒载体的小量提取及纯化2 9 2 2 3 1 1p c r b i 中间载体质粒的小量提取与纯化2 9 2 2 3 1 2 中间载体p c r b i 的保存2 9 2 2 3 1 3p m d s h z p 和p m d a n t i s h z p 质粒的小量提取与纯化3 0 方法同2 2 2 5 3 0 2 2 3 2 中间载体p c r b i 的酶切3 0 2 2 3 3 克隆载体p m d s h z p 和p m d a n t i s h z p 的酶切3 0 2 2 3 4 目的基因与中间载体的连接反应3 0 2 2 3 5 连接产物的转化3 1 2 2 3 6 重组质粒d n a 的小量提取3 1 2 2 3 7 重组质粒的电泳分析3 1 2 2 3 8 重组质粒的酶切鉴定3 1 2 2 3 9 重组菌p c r b i s h z p 和p c r b i a n t i s h z p 的保存3 2 2 2 4 植物表达载体转化农杆菌3 2 2 2 4 1 农杆菌感受态细胞的制备3 2 2 2 4 2 农杆菌感受态细胞的转化3 2 2 2 4 3 重组子p c r 鉴定3 3 2 3 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因正义反义基因遗传转化甘蔗3 3 2 3 1 甘蔗转化材料的准备3 4 2 3 1 1 甘蔗培养基的成分3 4 2 3 1 2 甘蔗转化愈伤的诱导3 4 2 3 1 3 甘蔗分化苗b a s t a 筛选浓度实验3 4 2 3 1 4 甘蔗生根苗的b a s t a 筛选实验3 4 2 3 1 5 甘蔗组培苗的生根实验3 5 2 3 1 6 农杆菌菌液的准备3 5 2 3 2 农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养3 5 2 3 2 1 侵染3 5 2 3 2 2 农杆菌浸染后的愈伤组织分化成苗3 5 2 3 2 3 甘蔗小植株的筛选培养及定植3 6 2 4 转化植株的分子检测3 6 2 4 1 植物总d n a 的小量提取3 6 2 4 2 转化植株的p c r 检测3 6 2 4 2 1b a r 基因的检测3 7 2 4 2 2 启动子连接目的基因区间一个特异片段的检测3 7 3 结果与分析3 8 3 1 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因正义反义目的片段的扩增3 8 3 2 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因的序列比较3 9 3 3 甘蔗锌指蛋白s h z p 基因植物表达载体的构建4 0 3 4 植物表达载体导入农杆菌4 0 3 5 农杆菌介导的甘蔗转化4 1 3 5 1 甘蔗转化材料的选择4 1 3 5 2 甘蔗分化苗b a s t a 筛选浓度实验4 2 3 5 3 甘蔗生根苗的b a s t a 筛选实验4 2 3 5 4 甘蔗组培苗的生根实验4 3 3 5 5 农杆菌介导的甘蔗遗传转化4 3 3 6 转基因植株的分子检测4 5 3 6 1 植物总d n a 的提取4 5 3 6 2 抗性植株的b a r 基因p c r 检测4 5 3 6 3 启动子连接目的基因的一个特异片段p c r 检测4 6 4 讨论4 7 4 1 关于甘蔗锌指蛋白s h z p 基因4 7 4 2 关于反义r n a 抑制基因的表达4 7 4 3 关于干旱诱导启动子4 7 5 结论4 8 6 本试验研究的后续工作4 9 参考文献4 9 缩写词5 6 1 引言与文献综述 1 1 甘蔗概述 1 1 1 甘蔗的生物学特性 甘蔗是禾本科甘蔗属植物，单子叶，一年生或多年生草本植物。常用茎埋植繁殖也 可用茎顶芽、侧芽进行人工离体组织培养繁殖。 甘蔗根分种根和苗根，属须根系。种根又叫临时根，苗根又叫株根、永久根，种根 从种苗节上的根点萌发生长，寿命不长，较纤细，分枝较多。苗根是由新蔗株基部节 上的根点长出的根，生长粗壮，在幼苗长出3 片真叶时开始发生，色白富肉质，分枝 少，生长旺盛。 甘蔗的茎由节和节问组成，分主茎和分蘖茎，。茎内部为维管束和薄壁细胞，圆柱 形，实心。节包括叶痕、芽、根带和生长带。是下自叶痕起上至生长带部分，节间是生 长带以上，叶痕以下的蔗茎部分。 甘蔗叶由叶片、叶鞘和叶环三部分组成。；叶环由叶舌、叶耳、叶喉和肥厚带等部 分构成。肥厚带的主要功能是调节叶片伸展的角度，位于叶环上方的两旁，具有弹性和 伸缩性；叶片着生于叶环上方，展布于空中，因肥厚带的大小、厚薄、形状和叶片中脉 的发达程度而呈各种等姿态。 甘蔗的花为顶生圆锥花序，由主轴、支轴、小穗梗和小穗组成。甘蔗的子实为颖果， 成熟时为棕色，长卵圆形，长约1 5 r n m ，宽约0 5 r a m 。从颖果的纵切面可见到果皮、种 皮、胚乳和胚四部分。胚由胚芽、胚根、胚轴和子叶4 部分组成。 1 1 2 甘蔗的经济价值 1 1 2 1 甘蔗是重要的糖料作物 甘蔗盛产于热带及亚热带，是世界和我国最为重要的糖料作物之一。世界上甘蔗种 植面积最大的国家是巴西，其次是印度，另外世界上甘蔗种植面积较大的国家还有南非、 印尼、古巴、墨西哥、美国、澳大利亚等，中国在近二三十年来甘蔗种植面积发展较快， 现在的中国甘蔗种植面积已达到1 3 5 万多公顷。在世界上位居第三，主要分布在广西、 福建、海南、广东、云南等省。食糖是一种甜味剂，同时也是一些食品工厂和药工厂的 l 必需品，食糖是人体的三大营养之一，为人体提供能量，蔗糖就是食糖的主要来源之一， 因而，甘蔗生产对人民生活水平的提高、农业的发展都具有重要的意义。 1 1 2 2 甘蔗作为生物反应器的优点 ( 1 ) 容易种植：甘蔗宿根性强，生长的有效温度在1 5 以上，是热带、亚热带地区 生长最为迅速的一种植物，一次种植可多次收获； ( 2 ) 光合效率高：甘蔗是一种典型的碳四植物，其光饱和点较高。而光合作用二氧化 碳的补偿点则较低，当环境中二氧化碳的浓度低于5 以下，光饱和点在1 0 0 千勒克斯 以上，气温4 0 0 c 时仍能进行光合作用，在正常的生长条件下，平均亩产可达1 0 吨以上： ( 3 ) 甘蔗易于转化：甘蔗可通过胚状体途径获得转化体，有利于外源基因的稳定表达， 现在通过载体法和非载体法均获得了甘蔗的转基因植株； ( 4 ) 转基因安全性好：糖蔗是非直接食用的作物，其产品是经过提炼分离后使用，甘 蔗又是一种无性繁殖植物，转基因植株所带有的抗性基因不会随花粉发生“基因漂流” 而对环境造成危害。，因此转基因甘蔗有可能产生的有毒物质对人类的危害可以避免： ( 5 ) 易于纯化外源蛋白：在甘蔗的主要成分中，蛋白质仅占o 1 2 、其他成分约为 o 9 ，可见甘蔗本身所含有的蛋白质的量是比较少的，如果用其表达外源蛋白，其产物 的分离纯化应该容易得多。 1 1 2 3 甘蔗副产品的利用 蔗渣可用于生产各种各样的产品如纸、纤维板、糠醛、动物饲料，木质素，纤维素 等；糖蜜用于生产化学添加剂，动物饲料、肥料、乙醇、赖氨酸、柠檬酸、酵母粉、和 其他的有机酸等。 1 1 2 4 甘蔗是重要的能源植物 甘蔗是c 4 植物，可更有效地积累干物质，另外，其光合作用的效率也比较高。和 别的作物相比，它的光饱和点比较高，净光合速率高，能在土壤水分不太理理的条件下 比其他栽培作物更有效地利用太阳能，有很大的生产潜力。甘蔗每平方米叶片比其他 c 3 植物如水稻、小麦等高出约1 倍以上。大田甘蔗每平方米每周干重增加也多于水稻 和小麦的l 倍。甘蔗的生物产量比其它作物高出1 1 7 倍，酒精产量可达到4 9 0 0 l 2 年b a n 2 ( 蔡文燕等，2 0 0 6 ) ，也是最高的，。 利用甘蔗生产的燃料乙醇是一种清洁的能源，是经济可持续的能源动力。利用甘蔗 渣分解生产燃料酒精的技术也日益成熟( 黄祖新等2 0 0 7 ) ，巴西是利用能源甘蔗生产无 水酒精作为汽车燃料最成功的一个国家。从1 9 7 8 年起巴西全国开始用1 0 酒精、9 0 汽油混合燃料供作汽车燃料；随着酒精产量的增加，1 9 8 1 年将混合燃料中酒精的比例提 高到2 0 ，并且出现了全部用酒精作燃料的各类大、小型汽车( 吴松海等，2 0 0 6 。虽然 我国还处在初期发展阶段，但发展速度很快。因此，在我国用甘蔗生产乙醇，发展燃料 乙醇产业，缓解石油供需矛盾，是非常有现实意义的。 1 2 甘蔗转基因技术 植物细胞遗传系统可分为两大类：载体基因转化和d n a 直接转化。目前基因转化 的载体主要包括有质粒、叶绿体及病毒；d n a 直接转移法主要有：基因枪法、电击法、 i 多聚物介导法、花粉管通道法等( 陈英等，2 0 0 5 ) 。甘蔗目前常用的遗传转化方法有：、： 农杆菌介导法、基因枪法和电击法。 1 2 1 农杆菌介导法 农杆菌介导的遗传转化方法是将目的基因导入根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 的t i 质粒或者发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 的砌质粒的t - d n a 中，利用农杆菌感染受体植物。最常用的是根癌农杆菌及其t i 质粒的转化。 1 2 1 1 农杆菌介导的转化机理 植物在受伤情况下，一些酚类物质就在伤口周围产生。这些酚类物质对植物有一定 的刺激作用，由于趋化作用，农杆菌就在伤口周围聚集，它可以吸附在细胞表面上，并 对植物细胞有一定的识别作用，由于酚类物质的诱导，农杆菌的t i 质粒中的v i r 区基因 被表达，这些表达蛋白受到功能蛋白的作用被加工成t - 复合体，t 复合体是t - d n a 的 转移形式，此复合体可以通过细胞壁、细胞膜、和核膜等进入植物细胞核，利用和转座 类似的机制被整合进受体基因组中。 与转化过程有关的遗传位点有三个：染色体毒力位点，毒性区基因，和t - d n a 边 界序列。( 王关林等2 0 0 2 ) 。 3 图卜1 农杆菌t - d n a 转化植物细胞的过程 f i g l 一1t h ep r o c e s so fa g r o b a c t o r i u mt d n ai n t op l a n tc e l l s 1 2 1 2 农杆菌转化系统的特点 农杆菌介导的转化系统成功率高，效果好。它是一种生物转化系统，具有主动性， 能选择性地转移t i 质粒上以2 个2 5 b p 重复序列为两端的t - d n a ；在v i r e 2 ，v i r d 2 的 帮助下，它可以主动地插入到植物染色体上。t - d n a 上含有引导d n a 转移和整合的序 列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，促使插入到 t - d n a 区的外源基因能够随同t - d n a 一道在植物细胞中表达。整合进植物基因组中的 t - d n a 和插入其间的外源基因能够在再生植株的各种组织器官中特异性表达，也就是说 可进行人为的控制。农杆菌t i 质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，并且多 数符合孟德尔遗传规律，转基因植株能较好地为育种提供中间选育材料( 王关林和方宏 绮等，2 0 0 2 ) 。 1 2 1 3 质粒载体系统的构建 因为野生型的t i 质粒对植物有毒性，同时由于它的分子量大，难找到单一的酶切 位点，所以需要对其进行改造，现在建起了共整和载体系统和双元载体系统，共整合载 体系统是先把无毒的t i 质粒中的t d n a 区断由大肠杆菌中的常用质粒( 一般是 b r 3 2 2 ) 所取代，改造后的t i 质粒作为供体主要是能提供v i r 区，而v i r 区的功能是用 于t _ d n a 的转移，先把外源基因克隆到b r 3 2 2 质粒上，再把这个中间载体和根癌农 4 杆菌同源重组，从而构成质粒共同体，因为此系统可把全部中间质粒区断转移，所以以 后就构造了隔端载体系统以克服此缺点，因为隔端载体系统在中间载体上安置了左右两 个t - - i ) n a 边界区断，以及l b 和r b 区断，所以就只有外源基因被转移，双元载体系 统主要由辅助载体和转移载体组成、辅助载体为包含v i r 区的质粒，转移载体是含有t _ d n a 区段的质粒，此系统容易操作，方法简单，寄主范围广。 1 2 1 4 农杆菌介导植物转化技术在禾本科植物中的应用 g r i m s l e y 等最早利用农杆菌转化植物获得成功，他于1 9 8 7 年以根癌农杆菌为载体， 将玉米条纹病毒的c d n a 转入玉米，继之，m o o n e y 等于1 9 9 1 以根癌农杆菌为载体感染 小麦获得成功，r a i n e d 等( 1 9 9 0 ) 和c h a n 等( 1 9 9 2 ) 分别用根癌农杆菌转化未成熟水 稻胚获得成功，这些为禾谷类转基因研究奠定了基础，c h a n 又于1 9 9 3 年同样以农杆菌 为载体转化水稻开花授粉后的幼胚获得成功。h i e i 等1 9 9 7 对农杆菌介导法转化水稻的 影响因素进行了详细研究，这样就建立了一套比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系。 另一方面，农杆菌转化小麦取得了更大的成就，己经成功转入小麦的目标基因有抗病性 基因、抗衰老基因、抗除草剂类基因、嵌合雄性不育类基因、抗盐基因、胆碱脱氢酶基 因、甜菜碱醛脱氢酶和胆碱单加氧酶基因。禾本科中还有许多种植物的农杆菌转化获得 了成功。 1 2 2 其他转化方法 1 2 2 1基因枪法 通过利用一些技术手段：如高压气体、火药以及高压放电，以此驱动金粒和钨粒， 把其射入受体植物细胞，而这些金粒与钨粒包被着有生物活性的d n a ( 目的d n a ) ， 这些d n a 在植物细胞内被释放出来，从而在植物细胞中被整合表达。此法的优点是：1 、 导入外源基因不依赖植物的基因型；2 、克服了植株再生的困难。影响基因枪法转化的 因素有：1 、外植体的种类；2 、轰击前后的培育条件；3 、细胞是否处于感受态；4 、细 胞的生理状态；5 、细胞潜在的再生能力。 1 2 2 2 电激法 此方法主要是利用高压电激。而高压电脉冲可使细胞质膜形成瞬时的小孔，而d n a 就可以通过微孔及某闭合时产生的膜组分重新分布进入细胞，从而整合其中，此方法的 优点是受体细胞限制性不强，缺点是需要做大量的前期工作，以确定特点宿主细胞的最 5 佳电场强度和电激时间。 1 2 2 3 脂质介导法 此方法是首先合成磷脂双分子的人工液泡，而这些液泡内则包被着供体目的d n a 然后把这些脂质体在培养基中与质生质体混合，利用细胞的吞噬和融合作用，脂质体内 部包被的d n a 就被整合进细胞，此方法需要高c a 2 + 高p h 值，并且需要p e g 等条件。 1 2 2 4p e g 介导法 此方法主要是借助一些细胞融合剂对细胞表面的干拢，使细胞间的识别发生困难， 从而偶尔可使外源遗传物质进入原生质体。这些干拢剂主要有p e g ( 聚乙二醇) 、p v a ( 聚乙烯醇) 和l o ( 多聚氨酸) 等。 1 2 2 5 微注射法 此法将细胞固定后，把遗传物质直接注射入细胞，细胞固定可以用微吸管吸持，聚 赖氨酸粘连或者用琼脂糖包埋等方法，对于子房等较大的细胞，无需包埋，田间都可注 射。 1 2 2 6 超声波介导法 利用频率在5 0 - - 2 0 0 0 0 h z 的超声超的冲击，细胞膜就有可能被激穿、或发生变形， 从而产生空化作用，在空泡的湮灭过程中，细胞的壁或者膜的渗透性就发生改变，这就 可能使外源基因进入细胞，影响其转化效果的因素主要有：1 、超声波的强度；2 、处理 时间；3 、有无保护剂，保护剂主要是用二甲亚酚和鲑鱼精d n a 。 1 2 2 7 脉冲电泳法 此方法是利用脉冲电泳对细胞膜产生的可修复损伤，使外源d n a 进入原生质体： 影响此方法转化成功的因素主要有：1 、脉冲的电压；2 、脉冲时间；3 、外源d n a 的预 处理等。 1 2 2 8 病毒介异法 此方法是先把外源基因整合进病毒遗传物质上去，再利用病毒对植物细胞的感染能 力，把外源d n a 整合进宿主细胞，此方法需用无衣壳重组病毒d n a 或r n a 分子作为 6 传染载体，有衣壳包被的病毒用为传导载体。 1 2 2 9 染色体直接介导转化法 此方法是先用秋水仙素处理分裂中期的细胞，使其分裂受阻，染色体皱缩，然后再 分离染色体。使其与受体细胞混合就有可能使染色体被吞噬，进而有小段被整合。 1 2 3 筛选标记基因的研究进展 目前，甘蔗转化体的选择压以h p t 基因介导的潮霉素抗性及b a r 基因介导的b a s t a 抗性为佳；c a r m o n a 等证实，由于甘蔗基因组的异源性，组培过程中会产生较大的变异， 抗生素及除草剂作为转基因筛选压，可进一步加大这种变异；为了减少这种变异所带来 的不利影响，开发新型的正向筛选标记很有必要；e l l i o t t 等证明可用绿色荧光蛋1 刍( g f p ) 基因可作为甘蔗转化的正向筛选标记。坳珊基因介导的卡那霉素抗性不宜做为选择标 记，但如在强启动子下，该基因介导的g 4 1 8 抗性可做为选择压。 1 2 4 甘蔗遗传转化的研究进展 1 2 4 1 甘蔗抗虫转基因研究 甘蔗抗虫转基因的研究：1 9 9 6 年，a r i e l a r e n c i b i a 将c a m v 3 5 9 启动子与c r g l a ( b ) 基因连接转化甘蔗。2 0 0 2 5 年s c t a m o u 用甘蔗品种c p 6 5 - 4 5 7 作受体，将u b i - - g n a 基因 进行转化，获得成功，转基因植株对墨西哥稻螟有一定的毒性。2 0 0 0 年，新加坡科学家 用抗钻心虫的基因转化甘蔗获得成功；2 0 0 0 年d a n i e l l a p v 将c r y l a b 基因和渤启动子和 磷酸烯醇和丙酮酸羧化酶启动子相连，转化甘蔗品种s p 8 0 - - 3 2 8 0 和s p 8 0 - - - 1 8 4 2 。转化 植株对甘蔗螟虫有毒性。2 0 0 3 年f a l c o 。m c 把u b i 启动子和大豆蛋白酶抑制剂基因连 接转化甘蔗获得成功，转基因植株可有效防治甘蔗钻心虫。 1 2 4 2 甘蔗抗病毒转基因研究 i n g e l b r c c h t 等( 1 9 9 9 ) 将高粱花叶病病毒s c h 株系的c p 基因转化甘蔗，获得转基因 植株；m c q u a l t e r ( 2 0 0 4 ) 将连接有玉米u b i 启动子的甘蔗斐济病毒( f d v ) 的9 号片断阅 读框1 的可译区段转化甘蔗q 1 2 4 品种，获得6 4 个转基因植株系，其中有一个株系对 f d v 具有明显的抗性；b u t t e r f i e l d 等( 2 0 0 2 ) 将抗除草剂的b a r 基因和抗高粱花叶病病毒 7 的h u t 基因导入甘蔗，转基因甘蔗后代性状发生分离，分析认为h u t 基因转录后沉默的 原因可能是减数分裂时基因重排的缘故。国内