（生物学专业论文）半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究.pdf

中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究 半红树植物黄槿的 群体基因组学和转录组研究 博士后：杨瑰丽 合作导师：吴伸义徐安龙 专业：海洋科学 摘要 半红树植物作为真红树植物与陆生植物过渡的中间类群，同时占据着海岸 潮间带和内陆两种截然不同的异质性生境，其对不同生态环境的适应反映了生物 进化的重要方面。近年来随着第二代测序技术的兴起，如i l l u m i n a - g a 平台一次 实验在几天之内就可以得到一千多万的7 5 b p 或更长的短序列，使得在群体水平 上检测大量基因的遗传变异，自组装转录组并在转录组水平上研究红树植物的耐 盐机制成为可能。 本文选取澳大利亚、泰国、和中国三个地点不同生境下( 海生和陆生) 共6 个居群( 每个居群大于8 0 个体) 对其3 个基因接近2 6 0 4 个碱基利用第二代测序 技术检测其核苷酸多态性。利用i l l u m i a - g a 测得黄槿3 个基因的平均测序深度接 近3 1 2 4x 。从遗传多样性来看，中国潭门海生群体种群表现出的遗传多样性最高， 多态性位点最丰富。本研究中全部黄槿居群的平均岛= o 2 0 3 。中国和泰国的不 同生境的种群间的分化比较显著，尤其是中国潭门黄槿海生种群与陆生种群分化 位点丰富。虽然在同一地点的两种不同生境的黄槿种群间的地理距离很小，但两 地的海陆明显的分化暗示生境对黄槿种群遗传分化的作用大于地理作用，种群可 能由于自然选择的作用而适应当地环境，产生了生态相关的遗传分化。而澳大利 亚的海陆种群间的分化很小，可能是因为陆生居群是有海生居群人工引种而来。 利用i l l u m i n ag a 测序技术自组装黄槿转组得到9 4 9 7 8 条比较可靠的序列， 平均长度达到6 8 2 b p 。两种软件拼接结果比较表明，a b y s s 和v e l v e t 都可用于转 中山大学博+ 后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 录本的自组装，但相比而言，v e l v e t 能够得到最多的序列，而a b y s s 拼接的序列 更长也可能更可靠。两种软件合并的结果使得拼接的结果更为丰富，平均长度也 得到明显的上升。利用b l a s t 2 9 0 对黄槿转录组序列进行功能注释表明，黄槿转录 组6 2 7 4 6 个c o n t i g s 得到g o 功能注释，2 9 7 4 6 个在k e g g 中涉及1 3 1 个通道， 黄槿与杨树的转录组的k e g g 通路整体比较相似。同时我们将此自然生境下陆一 生黄槿与盐激条件下陆生黄槿2 6 0 多个转录本进行功能注释比较。结果表明自然 状态下陆生黄槿和盐激条件下黄槿转录组还是存在一定差异。盐激陆生黄槿中涉 及生物和非生物刺激( r e s p o n s et ob i o t i ca n da b i o t i cs t i m u l u s ) 、胁迫响应( r e s p o n s e t os t r e s s ) 这几类基因所占比例远远比自然状态下陆生黄槿高，表明在盐刺激的条 件下黄槿的盐胁迫响应相关的基因转录明显偏多。在今后的研究中，我们将进一 步的获取自然状态下海生黄槿的转录组，并进行海陆黄槿的转录组比较，以期对 海陆生境不同来言的种群适应性差异分化机制更加深入地研究。 同时，我们在前期对黄槿耐盐适应性进化机制的研究中获得大量编码区序列 以及这些序列的表达量数据的基础上，利用这些序列数据对黄槿基因密码子的偏 性特征进行初步分析。研究初步发现，黄槿基因编码区以a t 碱基结尾同义密码 子使用频率较高；部分基因，如c 氧化酶、a t p 合成酶，光合作用碳固定过程中 r u b i s c o 、蛋白质降解过程的泛素等，表现出一定密码子偏好性，而且这些基因 高表达水平与g c 3 也表现出一定的相关性。 关键词：半红树，黄槿，第二代测序技术，群体基因组学，转录组自组装， 密码子偏好性。 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 p o p u l a t i o ng e n o m i c sa n dt r a n s c r i p t o m ea n a l y s e so f h i b i s c u st i l i a c e u s ，am a n g r o v ea s s o c i a t e p o s t d o e ：y a n gg u i l i s u p e r v i s o r s ：w uc h u n g i ，x ua n l o n g m a i j o r ：m a r i n eb i o l o g y a b s t r a c t m a n g r o v ea s s o c i a t e sa l et h ei n t e r m e d i a t et a x o nb e t w e e nm a n g r o v e sa n dt h e i r t e r r e s t r i a lr e l a t i v e so c c u p y i n gt h ed i v e r g e n te n v i r o n m e n t so fi n t e r t i d a lw e t l a n da n d i n l a n d t h el o c a l a d a p t a t i o no fm a n g r o v ea s s o c i a t e s t oc o n t r a s t e de n v i r o n m e n t s r e f l e c t so n eo ft h ei m p o r t a n ta s p e c t so fe v o l u t i o n r e c e n t l y , t h ed e v e l o p m e n to fn o v e l h i g ht h r o u g h p u tt e c h n o l o g i e sf o rd n as e q u e n c i n ga n dg e n o m i ch a sp r o v i d e da n o p p o r t u n i t yt o a d d r e s st h e s eq u e s t i o n s t h ei l l u m i n a - g as y t e m sc a np r o d u c ed a t a s e s t sc o m p r i s i n gt e n so fm i l l i o n so fr e a d s c u r r e n t l ya t 7 5o rm o r en u c l e o t i d e sp e r r e a d ，d u r i n gas i n g l er u n i nt h i ss t u d y , t h r e en u c l e a lg e n e s ( t o t a l2 6 0 4n t ) w e r es e l e c t e dt oa s s e s st h e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m so f6p o p u l a t i o n s ( m o r et h a n8 0i n d i v i d u a l sp e rp o p u l a t i o n ) 舶ma u s t r a l i a , t h a i l a n d ，a n dc h i n a t h ea v e r a g ec o v e r a g ed e p t ho ft h et h r e eg e n e si s 312 4x t h el i t t o r a lc h i n e s et a n m e np o p u l a t i o nd i s p l a y st h eh i g h e s tg e n e t i cd i v e r s i t y t h ea v e r a g ef s ta m o n gt h ep o p u l a t i o n si s 0 2 0 3 s i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a t i o n w a s r e v e a l e db e t w e e nt h et e r r e s t r i a lp o p u l a t i o na n dt h el i t t o r a lp o p u l a t i o nf r o mt h a i l a n d a n dc h i n a ，r e s p e c t i v e l y a l t h o u g ht h eg e o g r a p h i c a ld i s t a n c eb e t w e e nt w oe c o l o g i c a l c o n t r a s t i n gp o p u l a t i o n si sv e r ys m a l l ，t h es i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nt w o p o p u l a t i o n si n d i c a t e st h ee c o l o g i c a la d a p t a t i o nd u et on a t u r a ls e l e c t i o n t h eg e n e t i c d i f f e r e m i a t i o nb e t w e e na u s t r i a nt e r r e s t r i a lp o p u l a t i o na n dl i t t o r a lp o p u l a t i o ni st h e s m a l l e s t ，w h i c h1 1 1 i g h tb ea t t r i b u t e dt oa r t i f i c i a la s e x u a lr e p r o d u c t i o nf r o mt h el i t t o r a l p o p u l a t i o n s i i i 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 i nd en o v oa s s e m b l i n gt h et r a n s c r i p t o m eo fh t i l i a c e u s ，9 4 9 7 8c o n t i g sw i t ha n a v e r a g el e n g t ho f6 8 2 n tw e r ea c q u i r e db yc o m b i n i n gt h er e s u l t sf r o mt w os h o r t - r e a d a s s e m b l e r sa b y s sa n dv e l v e t t h ea s s e m b l i n gr e s u k so f t h et w os o f i w a r e ss h o w st h a t t h et w os o l , w a r e sc a nb o t hb ea p p l i c a b l ef o ra s s e m b l i n g i nc o m p a r i s o n , a b y s sc a n p r o d u c em u c hl o n g e rc o n t i g s ，a n dv e l v e tc a na c q u i r em u c hm o r ec o n t i g s t h e c o m b i n a t i o no ft h et w oa s s e m b l e r sc a nb es t r a t e g i ci ns h o r ts e q u e n c ea s s e m b l i n g o f t h e9 4 9 7 8c o _ n t i g si nt h et r a n s c r i p t o m eo fh t i l i a c e u s ，6 2 7 4 6w e r es u c c e s s f u l l y a n n o t a t e dw i t hg e n eo n t o l o g yt e r m s ，a n d2 9 7 4 6w i t hk y o t oe n c y c l o p e d i ao fg e n e s a n dg e n o m e s ( k e o g ) p a t h w a y s t h eg e n e r a lk e g gp a t h w a y so fh t i l i a c e u sa r e s i m i l a rw i t hp o p u l o u st d c h o c a r p a w ea l s oc o m p a r e dt h ek e g gp a t h w a y so fh t i l i a c e u si nt h i ss t u d yw i t ht h a to fs a l ts t r e s s e dp o p u l a t i o ni no u rp r e v i o u ss t u d y t h e r e s u l t sd i s p l a y e dt h a tt h ek e g gp a t h w a y si n c l u d i n gr e s p o n s et ob i o t i ca n da b i o t i c s t i m u l u sa n dr e s p o n s et os t r e s sw e r em u c hh i g h l yr e p r e s e n t e du n d e rt h es a l ts t r e s s e d c o n d i t i o n w ea l s ot a k eo ne x p l o r a t i o n si nt h ec o d o nu s a g eb i a sp a t t e r no fh t i l i a c e u sb a s e d o no u rp r e v i o u s s t u d yo fs a l t r e s p o n s i v eg e n e sa n d t h e i re x p r e s s i o nd a t a o u r p r e l i m i n a r ya n a l y s i ss h o w st h a tt h es y n o n y m o u sc o d o n se n d e dw i t ha tw e r eu s e d m o r e 丘e q u e n t l yi nh t i l i a c e u s a l t h o u g hm a n yc o d o ne n d e dw i t h 入ra l ef a v o u r e di n h t i l i a c e u s ，m a n yg e n e s ，s u c ha sc t y c h r o m eco x i d a s e ，a t ps y n t h e t a s e ，r u b i s c oa n d p o l y u b i q u i t i n , d i s p l a y e ds t r o n gc o d o nu s a g eb i a sa n dt h e i rh i g he x p r e s s i o nl e v e l sw e r e s i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dw i t ht h eg cc o n t e n ti nt h et h i r dp o s i t i o no fc o d o n s k e y w o r d s ：m a n g r o v ea s s o c i a t e ，h i b i s c u st i l i a c e u s ，n e x t g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g t e c h n o l o g y , p o p u l a t i o ng e n o m i c s ，t r a s n c r i p t o m ea s s e m b l i n g ，c o d o nu s a g e b i a s 1 v 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 目录 第一章前言1 1 1 半红树植物的遗传多样性以及耐盐适应性进化研究概况1 1 2 第二代测序技术在群体基因组学、转录组学的应用前景4 1 3 本文研究目的、意义6 第二章黄槿的群体基因组学8 2 1 实验材料与方法8 2 1 1 实验流程8 2 1 1 1 采样策略和样品采集。8 2 1 1 2 引物设计及合成。8 2 1 1 3d n a 提取与p c r 扩增及纯化。8 2 1 1 4s o l e x a 数据分析。8 2 1 2 采样9 2 1 3 提取混合居群样品总d n a 1 2 2 1 4 提取居群个体总d n a 1 3 2 1 5引物设计及参考序列测序13 2 1 6i u u m i n a 样品的准备1 4 2 1 7 混合样品的质量检测及上机测序1 4 2 1 8 利用比对软件m a q 检测s n p 位点1 4 2 1 9 群体遗传多样性指标15 2 1 9 遗传结构分析1 6 2 1 1 0 遗传距离与地理距离的相关性分析1 6 2 2 结果1 7 2 2 1 引物筛选，扩增产物电泳检测，及s a n g e r 测序1 7 2 2 2i l l u m i n a 测序数据及其与参考序列的比对17 2 2 3 黄槿种群s n p 分布及遗传多样性18 2 2 4 黄槿遗传多样性分析1 9 v 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 2 2 5 遗传距离和基因流2 1 2 2 7 遗传距离和地理距离相关性2 l 2 3 分析和讨论2 2 2 3 1 黄槿居群的遗传多样性2 2 第三章黄槿的转录组的自组装2 5 3 1 材料与方法2 5 3 1 1 材料及总r n a 提取2 5 3 1 2 样品处理及上机2 6 3 1 3i l l u m i n ar e a d s 碱基质量统计2 6 3 1 4 转录组的自组装2 6 3 1 5 比较并合并组装结果，去除冗余序列。2 7 3 1 6 对拼接结果的进行评价并移除认为不可靠的序列2 8 3 1 7 利用b l a s t 2 9 0 对自组装转录组进行功能注释及分类2 9 3 2 结果2 9 3 2 1i l l u m i n ar e a d s 数据的质量统计2 9 3 2 2 黄槿转录组的自组装3 0 3 2 2 1 两种软件自组装k m e r 优化3 0 3 2 2 2 比较合并a b y s s 和v e l v e t 自组装结果3 3 3 2 3 黄槿转录组g o 功能注释及分类3 4 3 2 4 黄槿转录组k e g g 功能注释及分类3 6 3 2 5 盐激与未盐激条件下黄槿转录组水平上的差异3 9 3 3 讨论4 0 3 3 1 利用i l l u m i n a 技术自组装转录组及软件拼接比较4 0 3 3 2 黄槿转录组比较4 2 第四章黄槿密码子偏好性研究4 4 4 1 密码子偏好性4 4 4 2 密码子偏好性研究用途4 6 4 3 衡量密码予偏好性的指标4 7 4 4 黄槿密码子使用偏好分析4 9 v i 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究 杨瑰丽 4 5 材料与方法4 9 4 6 结果与分析5 0 4 6 1 同义密码子的使用频率5 0 4 6 2g c l 2 、，sg c 3 5 1 4 6 3e n c 和g c 3 的关联分析_ 5 3 4 6 4 g c 3 和基因表达水平的关联分析一5 3 4 7 讨论。5 4 结语与展望5 6 参考文献一5 8 附勇乏6 5 在研期间发表的( 投稿的) 研究论文7 4 致谢7 5 v 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 第一章前言 红树林是自然分布于热带与亚热带潮间带的木本植物群落，生长在高温、高 湿、风浪拍击、盐渍、缺氧和淤泥深厚的环境中，对于防风消浪、促淤保滩、固 岸护堤、净化海水和空气具有重要作用。如何对现存红树林的进行有效的保护与 管理在全球得到广泛的关注，红树林各居群内及居群间遗传变异的研究对红树林 的保护有着重要的参考价值。红树植物对极端环境，如高盐、潮汐、强风、高温 及厌氧性泥土环境等有着高度的形态及生理适应( k a t h i r e s a n & b i n g h a m , 2 0 0 1 ) ， 在转录组水平上研究其对极端环境的适应机制，尤其是在高盐胁迫环境的适应对 解决土壤盐渍化有十分重要的意义。根据红树植物在潮间带的分布，可分为真红 树植物和半红树植物两大类( t o m l m s o n ，1 9 8 6 ) 。前者专一性生长在潮间带，在 陆地环境不能够繁殖，特征是胎萌、气生根、支柱根、泌盐以及高渗透压，如秋 茄( k a n d e l i ac a n d e l ) 、角果木( c e r i o p st a g a l ) 、木榄( b r u g u i e r a g y m n o r r h i z a ) 、桐花 树( a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ) 和海桑( s o n n e r a t i ac a s e o l a r i s ) 等；后者生长在真红树林 向陆一侧，既能在潮间带生存，又能在陆地环境自然繁殖，是两栖性的木本植物， 如黄槿( h i b i s c u st i l i a c e u s ) 、海漆( e x c o e c a r i aa g a l l o c h a ) 、银叶树( h e r i t i e r a l i t t o r a l i s ) 等等。红树植物适应于高盐土壤基质以及周期性的海水浸渍，在长期 的进化过程中发展出多样化的耐盐机制，不同红树植物之间对盐分的适应生理和 形态结构大相迥异( 茹巧美等，2 0 0 6 ；蒋巧兰等，2 0 0 6 ) 。目前对红树植物生理 生态特征的研究多集中在真红树植物，对半红树植物的相关研究较少。半红树植 物作为真红树植物与陆生植物的中间过渡类群，同时占据着海岸潮间带和内陆两 种截然不同的异质性生境。这些海陆两栖植物无疑是红树植物起源、发生和演化 研究中不可缺少的一部分，而它们对不同生态环境的当地适应( 1 0 c a la d a p t a t i o n ) 也反映了生物进化的重要方面。此外，获得的分子数据也将为红树林的保护和管 理提供理论依据。 1 1 半红树植物的遗传多样性以及耐盐适应性进化研究概况 由于半红树植物的特殊的生态适应性特征，对于其遗传多样性以及耐盐适应 性进化的研究也日益丰富。张志红等以半红树植物海漆作为研究对象，采用i s s r 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 分子标记技术，对不同地理位置、不同生境( 潮间带和陆生) 海漆居群的遗传多 样性及遗传结构进行研究，结果表明，在同一地点，潮间带居群的遗传变异水平 均高于其陆生居群；同时潮间带居群间的遗传分化水平略低于其陆生居群间的遗 传分化，表明潮问带居群间通过漂浮的种子进行的基因交流较陆生居群间频繁 ( 张志红，2 0 0 4 ) 。简曙光等用a f l p 分子标记方法分析了不同地理位置( 即中 国、泰国和澳大利亚) 和不同生长环境( 潮间带和陆地) 的银叶树遗传多样性进 行研究，发现银叶树种群间遗传分化很高，种群间基因流很小，以异交为主；同 时，海生和陆生银叶树亚种群间也有较明显的遗传分化( j i a ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 黄槿( h i b i s c u st i l i a c e u sl ) ，隶属于锦葵科木槿属，是泛热带分布的典型半 红树植物( t o m l i n s o n ，1 9 8 6 ) 。在红树林中，黄槿通常指示着高潮线或是海水渗 透区和淡水沼泽间的分界线。广东、海南等地的黄槿在土壤含盐量1 2 0 一 1 6 5 o 的红树林林缘可正常生长( 王荣钦等，1 9 9 9 ) 。黄槿还能生长于石灰石和火 山土的林地或山地，在内陆也广有栽培( 敖惠修等，2 0 0 0 ) 。黄槿对土壤盐度表 现出广泛的适应性，从完全盐度到完全淡水都能生长。以往的植物生理研究表明， 生长在不同环境的黄槿种群其耐盐性间存在显著差异，主要表现在光合作用被盐 抑制的程度与其原始生境的土壤盐度呈反比( s a n t i a g oe t a l ，2 0 0 0 ) 。研究海陆两 栖植物的亲缘地理格局、居群遗传结构、现有分布特征和居群进化历史，对阐明 红树植物起源、发生和演化具有重要意义。同时由于生态上特殊的适应意义，黄 槿的这些生境差异的种群对于植物适应性进化机制的研究也提供了很好的材料。 唐恬( 2 0 0 4 ) 利用a f l p 和s s a p 两种分子标记对中国境内5 个地区9 个黄槿自 然种群的遗传多样性研究的结果表明，黄槿居群存在较高的遗传多样性，而且绝 大部分位于种群内；同时，黄槿海生生境的居群的遗传多样性显著高于陆生种群； 由采样点海生和陆生生境差异造成的遗传分化占遗传多样性的1 0 5 2 ，是由采 样点间地理差异造成的遗传分化的两倍；表明海岸潮间带( 盐土) 和内陆( 甜土) 两种生境的黄槿种群已经出现了与生境相关的遗传分化( t a n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。吴令 辉( 2 0 0 5 ) 利用直系同源核基因g a p c 对来自6 个地理区域( 中国、日本、中南 半岛、澳大利亚、斯里兰卡和美国) 的黄槿居群进行亲缘地理学研究，6 个地理 区域的黄槿表现出了相似的遗传多样性，除了中国福建和马来半岛南端外，其他 地方的黄槿居群都表现出了很高的遗传多样性，同时黄槿g a p c 单倍型表现出明 2 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 显的亲缘地理格局。 红树植物盐适应性显示了不同红树物种对海岸潮间带生境的生态趋同性，当 然，不同的红树物种抗盐能力不同，它们适应环境的策略也有所不同( 梁山等 2 0 0 8 ) 。由于黄槿在生态上特殊的适应性，其生境差异的种群对于植物对盐适应 机制研究提供了很好的材料。在基因组水平上的研究红树植物的盐适应主要是通 过构建e d n a 文库或者盐激构建s s h 文库，通过芯片技术检测基因表达谱等 ( m i y a m ae ta l2 0 0 6 ；m i y a m aa n dh a n a g a t a2 0 0 7 ；b a n z a ie ta 1 2 0 0 2 ；w o n ge ta l 2 0 0 7 ；n g u y e ne ta 1 2 0 0 6 ；z e n ge ta l2 0 0 6 ；m i y a m a & t a 帆2 0 0 8 ) 。付新辉( 2 0 0 5 ) 构建了桐花树的s s h 文库，得到5 7 7 个e s t s ；白骨壤得到1 6 0 2 个e s t s ，其中 7 与以报道的胁迫相应的基因同源。杨瑰丽( 2 0 0 7 ) 以海生和陆生两种不同生 境的黄槿种群为材料，用e d n am i c r o a r r a y 来研究分析和比较两个种群在受到盐 胁迫后的基因表达水平的差异，海生种群在长期的对盐生环境的适应过程中，盐 激后表达谱与陆生种群已经出现明显差异，在基因组表达水平上对盐胁迫已经表 现出的一定适应。 3 中山大学博士后研究工作报告 半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 1 2 第二代测序技术在群体基因组学、转录组学的应用前景 传统的s a n g e r 测序法d n a 样品制备过程复杂，需要大量技术人员参与，局 限于对电泳分离技术的依赖，无法进一步扩大并行于微量化，因此在基因组水平 上进行测序的规模极为受限并且代价高昂，无法满足群体基因组学发展的需要。 最近几年开发的新一代高通量测序平台包括r o c h e 公司g sf l x ( m a r g u l i e s e ta 1 ，2 0 0 5 ) ，i l l u m i n a 公司的s o l e x a ( h t t p ：w w w i l l u m i n a c o r n ( b e n t l e y , 2 0 0 6 ) ， 和a b i 公司的s o l i d ( h t t p ：w w w a p p l i e d b i o s y s t e m s c o r n ) ( s c h u s t e r , 2 0 0 8 ) 等。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次可以对几十万到几百万条 d n a 分子进行序列测定。在新一代测序技术中，片段化的基因组d n a 两侧连上 接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的p c r 克隆阵列( p o l o n y ) ， 每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成，随后进行引物杂交和酶延伸反应。由 于所有的克隆都是在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行，每个延伸所 掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。新一代测序技术的 产生是对传统测序技术一次革命性的改变，使得在群体基因组学水平上检测物种 的遗传变异及其进化，以及转录组及基因组进行细致全貌的分析成为可能。 其中s o l e x a 因为通量高，精度高，耗时少，简单操作，成本低、可以进行 p a i r - e n d 双向测序以及数据分析相对容易得到了最广泛的应用，在不到5 年的时 间利用该技术发表的文章超过1 0 0 篇。i l l u m i n ag a 测序的核心专利是“d n a 簇 和“可逆性末端终结 。“d n a 簇”：在芯片表明有一层与接头互补的寡核苷 酸，d n a 片段通过接头与芯片固定，形成桥结构，以寡核苷酸为引物进行p c r 扩增，形成单克隆的d n a 簇群。“可逆行末端终结 ：带荧光标记的d n t p 的3 羟基端带有可被化学切割的基团，能够封闭d n p t 的3 端的黏性，阻止另一个 d n t p 与之相连。因此在测序的每个循环中只渗入单个碱基。另外在每次延伸前 都将上一步的反应试剂洗脱，并加入新的反应体系，4 种d n p t 的浓度均衡一致 等也有效的减少了错误的渗入。 s o l e x a 测序流程如下：1 ) 将d n a 样品打断成为1 0 0 2 0 0 b p 左右的小片段， 两端加接头。2 ) d n a 片段通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片 上，另外一端( 5 或3 ) 随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成 4 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 “桥( b r i d g e ) ”；反复3 0 轮扩增，每个单分子得到了1 0 0 0 倍扩增，成为单克隆 d n a 簇。3 ) d n a 簇产生之后被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的 通用序列上。4 ) 边合成边测序：加入d n a 聚合酶和带有4 种d n t p 进行扩增反 应，因为d n t p 的3 羟基末端被基团保护，因此每个循环只能延伸单个碱基；用 激光扫描反应板表面，读取信号；5 ) 将这些基团化学切割，恢复3 端粘性，继 续聚合第二个核苷酸；如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链( 图 1 - 1 ) 。 一 ：。缝c a c t c c 名g t c , g s e q u e n c e s 争 妄芏e 硝g l 鑫e 芸c c c f t c c a a c t c c t g t g 譬一 g 媳c 提g c c a c c t c 菇a c 二 。 6 c o b c c t c c t c c t o ，麓c t c c 纂g 了硌g 图1 is o l e x a 测序原理图 l 习 鑫i ，l f i g u r e1t h ew o r k i n gf l o wo fs o l e x a 现在一个s o l e x ar u n ( 含8 个l a n e s ) 至少可以测得4 0 0 0 多万条的7 5 b p 的序 列，因此其已更广泛应用在基因组测序与重测序、表达谱分析，小r n a 鉴定， d n a 甲基化分析以及m e t a g e n o m i c s 等各个领域( w i l h e l m e ta 1 ，2 0 0 8 ；l i s t e re ta 1 ， 2 0 0 8 ；c l o o n a ne ta 1 ，2 0 0 8 ；m o r i ne ta 1 ，2 0 0 8 ) 。该测序技术可以方便的应用到种 群基因组学研究中，其为系统和全面研究基因组水平生态适应过程中和地理分布 根据中的分子模式和形成机制提供了可能。利用第二代测序技术对红树群遗传多 样性的检测以及对这两个群体问强烈分化的格局形成机制深入研究，对探讨红树 植物对极端环境的适应机制，现存格局形成原因，及采用合理的保护措施等有着 厂邮 i 柏 a a 洲b l 柳啪l 岬训l p 打 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 重要的参考价值。陈素芳( 2 0 1 0 ) 利用新一代测序技术对红树植物杯萼海桑居群 7 1 个基因接近8 0 ，0 0 0 位点的遗传多样性以及杯萼海桑s o n n e r a t i aa l b a 、海桑s c a s e o l a r i s 的转录组进行测序并自组装，结果表明，在三亚与琼海居群内7 1 个基 因位点都没有任何多态性，认为在三亚与琼海的分化过程中，自然选择可能有发 挥了重要的作用。自组装转录组并在转录组水平上研究红树植物的耐盐机制目前 亦成为可能。d a s s a n a y a k e 等( 2 0 0 9 ) 利用4 5 4 测序技术得到3 0 万个大红树的 e s t s ，其中2 2 8 万的序列被拼接成3 1 5 4 8 长序列，平均长度达到3 6 0 b b ：并且 得到2 3 2 万的银叶树的e s t s ，其中1 7 8 万的e s t s 被拼接成2 5 3 8 6 个长序列， 平均长度达到4 3 3 b p 。 1 3 本文研究目的、意义 本研究拟采用新一代基因组测序技术( i l l u m i n a s o l e x a ) ，大规模比较研究不 同生态( 潮间带和内陆) 和地理( 印度洋西太平洋地区) 分布的半红树植物黄 槿的群体遗传结构。在多重地理和环境尺度下评估各种进化力量对黄槿种群进化 过程的影响；检测不同生境黄槿种群间的核苷酸变异模式。从基因组水平全面、 系统研究黄槿适应性分化的遗传基础和适应海岸潮间带极端生境的模式与机制， 深入探讨环境胁迫和地理隔离在红树植物发生和演化上的作用及意义。同时利用 新一代测序技术对自然状态黄槿的转录组进行分析，从而为转录组水平上进一步 探讨其对盐环境适应机制奠定深厚基础，为保护、管理和可持续利用这一宝贵的 海岸带木本植物遗传资源提供有意义的实例和重要理论依据。 选取黄槿在海南岛谭门、澳大利亚北部丹特里、和泰国尖竹汶的海陆居群各 1 0 0 个个体样本作为研究对象，从已构建好的黄槿的c d n a 文库挑选合适的核基 因，设计能够扩增出明亮且与其他条带明显分开或明亮单带的引物，对所有居群 等群体样本进行扩增，混合其扩增产物，利用第二代测序平台i l l u m i n a 居群的混 合扩增产物进行深度测序；利用m a q 比对软件检测i l l u m i n a 数据中黄槿居群的遗 传多样性及其遗传分化。 采取黄槿自然陆生生境下个体，取新鲜的叶组织提取其总r n a 。建库后 i l l u m i n ag a 对其转录组进行深度测序，并用多种自组装软件对其转录组进行自 组装，检测末端低质量碱基对拼接的影响，比较不同软件的组装效果并将几个软 6 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 件的拼接结果合并得到最完整的转录组库，与已知e s t s 序列比对，并用m a q 对 拼接进行评价等。同时利用b l a s t 2 9 0 对得到的黄槿转录组序列库进行功能注释并 分类。最后我们还对部分黄槿转录组编码序列进行基因密码子的偏好性特征进行 初步分析，以期进一步丰富植物密码子偏好性相关研究内容，加深我们对植物密 码子偏好性的认识。 7 中山大学博士后研究工作报告半红树植物黄槿的群体基因组学和转录组研究杨瑰丽 第二章黄槿的群体基因组学 2 1 实验材料与方法 2 1 1 实验流程 2 1 1 1 采样策略和样品采集。 在过去开展的黄槿种群研究的基础上，大规模采集印度一西太平洋地区的种群 样品。在当地和区域两种空间水平上，采取区分生境( 潮间带和内陆) 的集中采 样和印度洋一西太平洋地区内分散采样相结合的策略，每一地区采集至少2 个不 同生境的黄槿种群样品，每个种群不少于8 0 个个体。硅胶干燥叶片并防潮保存。 同时对种群生境进行实地考察和资料收集。 2 1 1 2 引物设计及合成。 根据我们过去已有的c d n a 文库利用p r i m i e rp r i m e r5 0 软件设计引物。结 合生物信息学手段和预备实验，筛选扩增稳定、条带大小适宜( 5 0 0b p - 2 ，0 0 0b p ) 且重复性好的引物对。 2 1 1 3d n a 提取与p c r 扩增及纯化。 每个群体选取至少8 0 个体，各选取硅胶干燥叶片0 0 0 2 9 ，等量混合后每个 群体所用叶片样品的总重为o 2 9 。提取总d n a 。选用t a k a r a 公司的高保真酶 p r i m e s t a r 进行目的片段的扩增，p c r 产物经割胶纯化后测定样品浓度，并送去 s o l e x a 测序。 2 1 1 4 s o l e x a 数据分析。 对原始数据进行处理，然后利用各种拼接软件将所获得序列与参考序列进行 比对，检测s n p ；进行遗传多样性和遗传结构的分析，基因流检测，揭