（理论物理专业论文）低强度激光对人红细胞变形性的影响.pdf

摘要本文研究了不同功率的低强度h e _ n e 激光对正常人体红细胞流变学特性影响。以正常人体红细胞为研究对象，测量了低强度h e n e 激光在不同照射时间、不同功率条件下红细胞的变形指数、取向指数、红细胞膜流动性、膜的微粘度和渗透脆性的变化情况。结果表明：正常新鲜血液照射后红细胞的变形性和膜流动性、渗透脆性等无明显变化。但对放置4 8 小时后红细胞的物理特性已经发生变化，偏离正常值的血液经激光照射后，发现红细胞流变学特性显著改变，其中激光照射功率2 m w ，照射时间1 2 0 分钟、照射血样为2 m l 时取得的照射效果最佳。关键词低强度氦氖激光红细胞变形性膜流动性渗透脆性a bs t r a c tt os t u d yt h er h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fe r y t h r o c y t e si r r a d i a t e db yl o w p o w e rh e n el a s e r ，w em e a s u r e ds o m ep a r a m e t e r so ft h er h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fe r y t h r o c y t e si r r a d i a t e dw i t hd i f f e r e n td o s e so fe n e r g y ，s u c ha sd e f o r m a t i o ni n d e x ，m i c r o v i s c o s i t y ，m e m b r a n ef l u i d i t y ，o s m o t i cf r a g i l i t ye ta 1 a sf o rh u m a n sn o r m a le r y t h r o c y t e s ，t h eo p t i c a le f f e c to fi r r a d i a t i o no ne r y t h r o c y t e so b t a i n e dw a s 2 m w ，1 2 0m i n u t e si n2 m 1 a f t e ri r r a d i a t i o n ，t h ed e f o r m a t i o ni n d e xa n dt h em e m b r a n ef l u i d i t yo ft h ee r y t h r o c y t e si n c r e a s e d ，h o w e v e ro s m o t i cf r a g i l i t yd e c r e a s e d o u rs t u d yi n d i c a t e dt h a tt h el o w - p o w e rh e - n el a s e ri r r a d i a t i o nh a ss t a t i s t i c a l l ye v i d e n te f f e c t so nt h er h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fh u m a n sr e dc e l l sk e yw o r d sl o w p o w e rh e n el a s e r ；r h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fe r y t h r o c y t e s ；m e m b r a n ef l u i d i t y ；d e f o r m a b i l i t y ；、1 一日【舌血液循环的主要功能是向人体组织输送氧和营养物质，满足细胞的代谢需要，同时清除代谢终产物。红细胞是氧的携带者，红细胞的变形性降低后，通过毛细血管时所受的阻力增加，从而阻止血液与组织之间的气体和物质交换。变形性增加还可以引起血液表观粘度升高，血流阻力增加，引起人体组织缺血缺氧。另外，在一些溶血性贫血病人中，红细胞变形性异常导致核膜稳定性降低，是引起红细胞破坏性增加、寿命缩短等致病因素之一。由此可见，红细胞变形性对于血液流变学有重要的生理和病理意义。血液流变学是生物流变学的一个分支，近二十年来才发展成为一门独立的新兴的边缘学科。红细胞占血液中有形元素总体积9 9 以上，血液体积的4 0 - - 4 5 【l 】o 红细胞的结构和功能是影响血液流动性和粘性的最主要因素。红细胞变形性是指红细胞能自由通过比自身直径小的微血管的能力。红细胞变形性降低会导致全血粘度，特别是高切变率下全血表观粘度升高，加大血流阻力。因此研究红细胞变形性对揭示某些心脑血管疾病( 心肌梗塞，中风，高血压等) 的发生、发展有着重要意义和临床价值。红细胞的变形能力的研究是血液流变学的重要研究课题。迄今为止，医学界的研究人员，从临床的角度总结出红细胞变形能力由以下因素决定：( a ) 红细胞膜的粘弹性，它主要受脂双层的组成与结构、膜骨架结构及其动态调节的影响；( b ) 红细胞的几何特性，取决于细胞表面积s 与容积v 之比( s v ) ；( c ) 红细胞胞浆粘6度，主要受血红蛋白浓度影响。而粘弹性、几何特性、黏度等都是物理量，它们是由于哪些因素，通过怎样的机制受到影响的? 这些问题引起物理学家的极大兴趣。近年来，一些物理学家在软凝聚态物理研究领域，对蛋白质折叠、生物大分子结构、生物膜等复杂体系问题开展研究并取得有意义的结论。本文研究了不同功率的低强度h e n e 激光对正常人体红细胞流变学特性影响。以正常人体红细胞为研究对象，测量了低强度h e n e 激光在不同照射时间、不同功率条件下红细胞的变形、取向、膜流动性、膜的微粘度和渗透脆性的变化情况。并试图通过定性的实验研究确定激光与红细胞作用的宏观效应，进而为物理学者们从膜结构和膜通道的角度研究大分子层面上的物理提供实验资料。第一章引言血液( b l o o d ) 约占体重的7 ，成年人体内循环血容量约5 l 。血液由血浆( p l a s m a ) 和血细胞( b l o o dc e l l ) 组成。从血管取少量血液加入适量抗凝剂( 如肝素或枸橼酸钠) ，有形成分经自然沉降或离心沉淀后血液可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板( 图5 1 ) 。血浆相当于结缔组织的细胞间质，约占血液容积的5 5 ，其中9 0 是水，其余为血浆蛋白( 白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原) 、脂蛋白、脂滴j 无机盐、酶、激素、维生素和各种代谢产物。血液流出血管后，溶解状态的纤维蛋白原转变为不溶解状态的纤维蛋白，于是凝固成血块。血块静置后即析出淡黄色清明的液体，称为血清( s e r u m ) 。血液保持一定的比重( 1 0 5 01 0 6 0 ) 、p h ( 7 - 3 7 4 ) 、渗透压( 3 1 3 m o s m ) 、粘滞性和化学成分，以维持各种组织和细胞生理活动所需的适宜条件。血液是流体状的结缔组织，充满于心血管系统( 循环系统) 中，在心脏的推动下不断循环流动。血浆基本上是晶体物质溶液加上血浆蛋白，故也可认为血液由血细胞、晶体物质( 例如n a ，k ，c a 等离子成分) 与血浆蛋白三种成分组成。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。与贫血关系最密切的是红细胞。运输是血液的基本功能，自肺吸入的氧气以及由消化道吸收的营养物质，都依靠血液运输才能到达全身各组织。同时组织代谢产生的二氧化碳与其他废物也依赖血液运输到肺、肾等处排泄，从而保证身体正常代谢的进行。血液的运输功能主要是靠红细胞来完成的。贫廊时，红细胞的数量减少或质量下降，从而不同程度地影响了8血液这一运输功能，出现一系列的病理变化。正常成人每毫升血液中红细胞的平均值，男性约4 5 x 1 0 3 个，女性约3 5 4 5 x 1 0 3 个，居各类血细胞之首，如果将全身的红细胞一个个连接起来，能环绕地球赤道4 5 圈。正常状态下红细胞胞体为双凹圆盘状，直径约7 5 微米，中央较薄，周边较厚。新鲜的单个红细胞呈浅黄绿色，多个红细胞常叠连在一起，稠密的红细胞使血液呈红色。双凹圆盘状的红细胞胞质中含有大量血红蛋白而显红色，血红蛋白具有运输氧及二氧化碳能力。与氧结合的血红蛋白称为氧合血红蛋白，色鲜红。动脉血所含的血红蛋白大部分为氧合血红蛋白，所以呈鲜红颜色；与二氧化碳结合的血红蛋白称为碳酸血红蛋白。氧及二氧化碳同血红蛋白的结合都不牢固，很易分离。在氧分压较高的肺内，静脉血中的碳酸血红蛋白解离，并与氧结合转变为氧合血红蛋白；而在氧分压较低的组织内，动脉血中的氧合血红蛋白解离，并与二氧化碳结合转变为碳酸血红蛋白。红血球依靠其血红蛋白的这种特殊性而完成运输氧及二氧化碳的任务。红细胞内主要含血红蛋白。溶血时，血红蛋白从细胞内逸出，溶于血浆中，此时血红蛋白携带氧气的能力丧失。溶血的发生或因红细胞膜破裂，基质溶解；或因红细胞膜孔隙增大，以致血红蛋白逸出而留下双凹圆盘形状的细胞膜，这个空壳医学上叫做“血影细胞”。正常红细胞在渗透压逐渐减低的溶液( 如氯化钠溶液) 中表现有一定抵抗低渗( 或低张) 溶液的能力，也即抗张力强度，它与脆性相对。换言之，红细胞抵抗表面张力能力越低就愈易溶血，也即是脆性越大。因此，红细胞在低渗盐溶液中出现溶血的特性，叫做“红细胞渗透脆性”。正常红细胞一般于0 4 2 0 4 6 氯化钠溶液中开始出现溶血，并于0 3 2 0 3 4 氯化钠溶液中完全溶血，故以0 0 0 4 2 0 0 0 3 5 氯化钠溶液浓度代表正常红细胞的渗透脆性范围，与成熟红细胞作对比，网织红细胞与初成熟红细胞的脆性较小；衰老红细胞的脆性较大。实验证明，红细胞在脾脏内停留一段时间后，其脆性大大增加。临床上红细胞脆性特别增大的见于遗传性球形红细胞增多症，球形红细胞与双凹盘形的正常红细胞相比，由于球形的容积增大，其红细胞表面积s 容积v 的比值显著变小，红细胞的几何特性发生变化，导致脆性增加；循环着的血液中红细胞悬浮于血浆中而不下沉。这种悬浮稳定性取决于红细胞膜和血浆的特性，当用抗凝剂防止血液凝固，并将抗凝的血液放在一定的刻度管中，观察一定时间内红细胞下沉的速度( 用下沉距离表示) 叫做“红细胞沉降率”，简称“血沉”( e s r ) 。通常以第1 小时末血沉管内血浆高度为标准，血沉愈快则表示红细胞的悬浮稳定性愈差。血沉测定所得数据将随仪器与试剂的不同而变化。临床上通常采用魏氏法，其正常值成年男子为0 1 5 m i i 】第1 小时末，成年女子为0 2 0 m m 第1 小时末。血沉快慢的主要原因，在于红细胞是否易于发生叠连现象。红细胞叠连指红细胞彼此以凹面相贴而重叠成串钱状。由于红细胞与血浆间的摩擦力为红细胞下沉的阻力，而叠连红细胞的表面积与容积比减小，也即是和血浆接触面积减小，彼此摩擦力也就减小，叠连红细胞就随单位面积的重量增大而加速下降。当正常人的红细胞放置在m 沉增快的患者血浆中，红细胞叠连度和血沉加快。由此证明，影响红细胞叠连的主要因素在血浆中。进一步研究又证明这与血浆蛋白总量无关，而当球蛋白、纤维蛋白原等f 带正电荷) 增多时会促进叠连【。有人分析红细胞表面存在带负电荷的唾液蛋白、白蛋白增多，会促使叠连减慢1 1 。由于同号电荷相斥，致使红细胞保持悬浮稳定性，当某些因素使血浆中带正电荷的蛋白质增多或降低红细胞表面负电荷量时，则见叠连增快，其详细机理还不清楚。另外，血浆脂类中胆固醇增多时，可使叠连和血沉加速，卵磷脂则阻止叠连而使血沉减慢。一、红细胞变形的生理意义图1 红细胞的正常形态红细胞的形状与红细胞所处的环境有关，随着体内外红细胞电解质溶液浓度和p h 值的变化，红细胞形状亦发生变化。另外，红细胞在低渗溶液中可膨胀变形，而当渗透压接近于1 3 1 m o s m k g 时，红细胞将膨胀为球形，并处于破裂边缘。红细胞并非刚性粒子，它在切应力的作用下很容易变形。一般将红细胞在外力作用下其形状的变化能力称为红细胞变形性。近年来许多研究人员对红细胞的变形在生理，病理上的意义，以及红细胞变形的特点和影响因素等进行了深入的科学研究。红细胞的变形性在血液循环以及保证组织和器官的代谢活动中，具有重要作用。特别是在微循环中，构成为循环的毛细血管，其直径2 - - 8 u m ，一般小于红细胞本身直径，然而正是红细波所显示的惊人变形能力，在正常情况下可以自由通过比自身直径小的多的毛细血管及血都裂隙。红细胞变形性的重要意义在于：1 ) 红细胞变形性是影响血液粘度的重要因素之一。血液粘度受血浆、红细胞及它们之间的相互作用的影响。变形性主要影响高切变率下血液粘度。这一方面是由于正常红细胞在流场中容易变形并随流线取向，另一方面红细胞膜能围绕着红细胞内容物作“坦克履带样运动”，将外部流场的速度梯度传递到塑堕内流体，这样红细胞更能适应外部流场变形，从而使血液内摩擦力减小，血液表观粘度下降从而使血流通畅。血液粘度是影响血流阻力的重要因素之一，血流阻力与血液粘度成正比。因此，若红细胞变形性降低，血流阻力将增加。2 ) 红细胞变形性是决定红细胞寿命的因素。红细胞的变形性不仅影响它从骨髓到循环血液的释放过程，而且决定老化、病态的废红细胞从血液中被清除的过程。红细胞寿命与红细胞变形性有很好相关性，红细胞变形性越差，其寿命越短。老化、病态的红细胞，由于变形性较差而被网状内皮系统清除。红细胞在衰老过程中发生一系列变化，包括表面积和体积之比下降，血红蛋白浓度升高及红细胞膜组分变化等，致使红细胞变形性降低。在一些溶血性贫血中，由于红细胞膜性质、胞浆粘度或细胞表面积与体积之比的改变从而引起变形性降低。血红蛋白病、遗传性球形红细胞增多症、免疫性溶血性贫血等，由于红细胞膜缺陷，红细胞形状改变和血红蛋白物理化学性质的变化的因素，导致红细胞变形性或膜的机械稳定性降低，红细胞破坏( 溶血) 增加，最终引起贫血。3 ) 红细胞变形性是决定微循环灌注的重要因素。红细胞的轴向集中、血浆撇离现象和临界毛细血管半径，资料在学校是调节微循环中血细胞分布、影响微循环灌注的重要因素，而这些因素由于红细胞的变形性有密切关系。红细胞变形性降低时，临界毛细管半径将增大，导致微循环灌注量减少。二、红细胞变形性的测量方法正是由于红细胞变形性有重要的生理作用，特别是在微循环中的作用，人们便想方设法寻找既简便又准确的测量红细胞变形能力的方法，为临床诊断和实验研究提供有效的测量手段。目前已发展了许多种用于测量红细胞变形性的方法和仪器。有的是利用在大的几何系统中由于流动红细胞发生变形和定向，引起悬浮液的一些物理性质，如粘性、透光性、对声波传导性的变化，通过测量这些物理特性的变化间接估计和比较细胞群体的平均变形性的好坏。例如粘性测量法，离心沉降法、光测量法( 包括光反射和衍射测量法) 、电测量法( 电阻脉冲频谱分析法) 等都属于这一类有的方法是通过测量红细胞变形过程中应力应变之间的关系来研究单个细胞或细胞膜的力学性质。如微管吮吸法、表面附着和纤维拦截法。目前国际上在临床血液流变学的研究中采用最多的是微孔筛滤法、激光衍射法和粘性测量法。il 、粘性测量法粘性测量法是利用比较相同压积但变形性不同的红细胞悬浮液的表观粘度随切变率升高而降低程度上的差异来间接估计红细胞变形性。为避免血浆对结果的影响，将血样离心弃去血浆，用某一标准介质配成悬浮液，比较不同试样的粘性曲线，便可知红细胞变形性的好坏。在同样切变率下，表观粘度越高者，红细胞变形性越差。粘性测量法优点是一次测量可获得红细胞群体的平均变形性，且把变形性和血液流动性直接联系起来，方法简单，适于临床观察；缺点是不能分辨单个红细胞变形行为。2 、微滤筛法微滤筛法，即利用多孔的滤器、聚碳酯薄膜为基质的核孔滤膜的过滤作用来测定红细胞的变形能力。这种方法受红细胞悬浮液压积、血样放置时间、滤膜孔径与厚度、滤过压力、抗凝剂等多种因素的影响。由于国际上缺乏统一的规定，不同滤器、滤膜测得的结果之间无法进行横向比较。3 微吸管法微吸管法即在显微镜下利用微操纵器操纵微吸管，以一定负压吮吸红细胞的方法。这种方法除了可用于研究整个红细胞的变形，提供关于单个红细胞粘弹性行为的资料，还可用于研究红细胞膜的微观力学性质。运用这种方法的仪器名称如：4 激光衍射法激光衍射法是用h e n e 激光束垂直入射红细胞悬浮液层，产生衍射，得到反映红细胞形状变化的由红细胞群体衍射叠加而成的衍射图，可衡量在流场内剪切力引起的红细胞的伸长。这种方法优点是可通过调节外筒的转速或介质粘度来得到任意大小的切应方：还可用来观测红细胞的稳定性；并且方法简单，适于临床观察。在传统激光衍射法的基础上，文宗曜等人提出了在低粘切变流场中测量红细胞取向和小变形的新激光衍射法。“3 。新激光衍射法不仅具有传统激光衍射法的优点，还可以测量对红细胞变形能力和形状更为敏感的取向指数，并同时测得反映细胞膜变化的小变形指数，即可以获得更多的流变学信息。三、影响红细胞流变特性的因素在许多疾病中如镰状红细胞贫血症、遗传性球形红细胞病等，这些疾病中的红细胞变形性都表现为异常，其变形性介于正常红细胞和硬化红细胞之间。由于细胞膜变硬，血液粘度显著增加，从而导致高血粘滞性、缺氧、血栓等症状的形成。此外，象严重烧伤、出血、正肾上腺素注入、高脂肪食物的摄取，都会影响红细胞变形性，导致血液粘度增大。因此，研究红细胞流变特性的影响因素，可以为临床病理诊断提供定的依据。1 影响红细胞变形性的因素1 1 影响红细胞变形性的外因1 ) 血浆蛋白。血浆中存在的多种高分子量蛋白，血浆蛋白越多，血浆粘度越高。红细胞的流动性和刚性受到细胞内粘度和血浆粘度之比的影响，细胞内粘度和血浆粘度之比越低，表示红细胞的刚性越低，也就是流动性增高，变形性良好。2 ) 血浆渗透压。正常人血浆渗透压为3 1 3 m o s m k g ，血浆渗透压增高至t j 5 5 0 m o s m k g 以上，细胞内水分从细胞质转移到血浆，使红细胞内粘度增高，红细胞萎缩，红细胞刚性增加( 即弹性减小) 。在血浆渗透压低于2 0 0 m o s m k g 时；血浆内水分流入细胞内，虽然细胞内粘度下降，但细胞体积增大，细胞表面积与容积之比减小，红细胞变形性降低。3 ) 腺菅三磷酸( a t p ) 。a t p 是红细胞中有氧糖酵解的产物，是维持正常红细胞双凹圆盘形的基本物质。w e e d 等人用微吸管法发现t a t p 并n c a ”对红细胞的形态和可变形都起着重要作用。另外，体外培养试验证实代谢衰竭时，a t p 水平降低，变形性下降。a t p 在维持正常的分子之间相互作用中占重要地位：已证实a t p 对红细胞变老性的作用可以通过下列途径：1 ) 影响细胞内粘度，a t p 是a t p 酶的作用底物，a t p 酶调节细胞内离子浓度。2 ) 影响氧和血红蛋白的结合。3 ) 影响膜磷脂的翻向和交换。a t p 作为磷酰基供给者能影响磷酸化的作用，抑制转谷氨酰胺酶等。一般要求血液离体后4 小时完成变形测量，因为离体后随存放时间延长，细胞p q a t p 逐渐消耗，从而引起变形性降低。外部变形应力影响红细胞在流场中变形的大小，是外部流体切应力的函数。该外部变形应力是细胞外介质粘度和细胞表面切变率的乘积。在一定切应力范围内( o 0 2 n c m 2 以下) ，正常红细胞伸长随切应力增加而增大，当切应力大于此值，细胞伸长变慢。在外力作用下，红细胞伸长变形有一定的限度，过大的外部应力可引起膜破坏而溶血。4 ) 温度的影响。由于细胞膜脂双层结构具有流动性，而膜的流动性受温度影响。在相变温度以上，脂双层处于溶胶状态，膜易变形，在相变温度以下，脂双层处于凝胶状态，膜硬度增加，细胞变形性下降。3 7 0 c 时红细胞变形最大，温度低于或高于3 7 0 c 都可引起红细胞变形能力降低。以上是一些影响红细胞的变形性的外部因素。此外，影响红细胞变形性的外部因素还有p h 值、电解质、氧分压和二氧化碳分压以及氧化剂的损伤等。1 2 影响红细胞变形性内因1 ) 红细胞膜的机械特性决定于膜的粘弹特性，而粘弹特性又与细胞膜的成分及其在膜中的结构和排列有关。红细胞膜的面积弹性膜量主要决定于脂双层。红细胞的骨架蛋白主要有血影蛋白( s p e c t r i n ) ，肌动蛋白( a c t i n ) ，锚蛋白( a n k y r i n ) 及带4 1 蛋白和4 9蛋白为主体相互连接构成一层具有五边或六边形的纤维网状结构，通过膜蛋白带与脂双层联系在一起。红细胞变形性与膜骨架密切相关，而膜的剪切弹性膜量，表面粘性系数等均与膜骨架有密切关系。膜骨架蛋白的分子结构或其连接上的缺陷和变异都可以引起一系列疾病。2 ) 红细胞的几何形状主要是指细胞表面积与体积的比值，它是决定循环中红细胞变形性的主要因素。正常红细胞膜的表面积对于体积来说相对过剩，使红细胞能变成各种形态而不必增加表面积。红细胞的伸展弹性膜量比面积弹性膜量小4 个数量级。在表面积和体积不变的前提下，正常红细胞可拉伸至原长的2 3 0 。但表面积即使只增长3 ，便可破坏红细胞。因此，球形、椭圆形和圆形等形状的红细胞变形性比正常红细胞低。红细胞表面积与体积之间的关系可用球形指数s ；来表示：s ；= 4 8 4v 2 3 a( 1 )式中v 是红细胞的体积，a 为红细胞的表面积，正常红细胞的球形指数s ；值约为o 7 ，球形指数s i 越大，红细胞变形性越小。3 ) 红细胞的内粘度或细胞内血红蛋白的浓度。红细胞细胞质的粘度称为红细胞的内粘度，它是决定红细胞变形性的又一个重要因素。内粘度升高会导致红细胞膜“坦克履带运动”的阻力增加，降低细胞对流场的适应能力，使红细胞变形性下降。内粘度取决于细胞内血红蛋白的浓度和理化特性。当红细胞内血红蛋白异常，内粘度增高时，红细胞的变形性降低。以上三种因素“ 。7 3 是红细胞本身所固有的，三个因素之一发生异常，便可引起红细胞变形性降低。其中细胞膜的结构与功能尤其重要，因为红细胞膜脂双层和膜骨架蛋白不仅决定红细胞膜的力学特性，还控制和调节红细胞的形态。近年来微观血液流变学的研究多集中于红细胞膜对红细胞流变形的影响。1 3 红细胞膜对红细胞流变特性的影响图2 红细胞膜液态镶嵌模型红细胞膜粘度和流动性都是描述细胞膜液态特性的物理量。其中膜的流动性对红细胞的功能有重要影响，如膜的坦克履带运动、红细胞的变形性、通过膜的氧的扩散等都与红细胞膜有密切关系。所以，研究红细胞流变特性就必然涉及红细胞膜对细胞流变特性的影响，并且这种影响是以细胞膜组成与结构的变化为基础的。1 3 1 红细胞膜的化学组成与结构红细胞膜在总量上占整个红细胞的3 ，红细胞膜是由具有液态性质的脂质双层和内表面的膜骨架构成。膜的脂质双层是由磷脂，胆固醇和糖脂组成。它们都是两性分子，排列成双分子层，构成膜的网架。在水质环境中亲水端朝外，疏水端朝内，形成脂质双层环境。在脂双层内嵌有许多可移动的蛋白质，根据其在脂双层中位置的不同可分为内在蛋白和边周蛋白。通过这些嵌入的蛋白带，脂双层与膜骨架相连附1 1 “。图4 红细胞膜结构示意图红细胞膜中蛋白质约占膜中的一半，红细胞能保持其正常形态及变形性在很大程度上有赖于蛋白质的组成、结构及相互作用。在哺乳动物红细胞膜的内侧，紧贴着一层由肌动蛋白( a c i n ) 寡聚体、血影蛋白( s p e c t r i n ) 、原肌球蛋白( t r o p o m y o s i n ) 、连接蛋白、肌动蛋白( a c t i n ) ，锚蛋白( a n k y r i n ) 、带4 1 蛋白、带4 9 蛋白等至少八种蛋白所组成，具有五或六边形网格的的纤维网状结构一一膜骨骼( m e m b r a n es k e l e t a ln e t w o r k ) ，通过膜蛋白带与脂双层联系在一起，这样就构成了双层膜的蛋白质与粘合红细胞膜的骨架结构( 见图1 ) 。2 0若是膜骨架结构改变：红细胞的可变形性降低，则红细胞释放氧迟缓，从而导致氧扩散的障碍。血影蛋白是一种主要的膜骨架蛋白，约占膜骨骼的7 5 ，对红细胞的流变性质有重要的作用。无论是血影蛋白一肌动蛋白一4 1 蛋白的联结，还是血影蛋白的自联结，都与红细胞膜的稳定性有密切的关系。4 1 蛋白是另一种重要的膜骨架蛋白，它的重要性在于，它不仅在膜骨架中起着联系作用，而且还连接着一些跨膜糖蛋白( 如带3 蛋白、血型糖蛋白a 等) 。通过它与细胞质中带3 蛋白联结，可以调整锚蛋白和带3 蛋白的联结状况。红细胞膜骨架支持脂双层，膜骨架蛋白之间，蛋白与脂双层之间都有相互作用。膜骨架网络与脂双层之间的相互作用一方面是通过锚蛋 新f i b 一血影蛋白之间的相互作用，由带3 蛋白嵌入脂双层中固定的，另一方面是通过4 1 蛋白和血型糖蛋白联结实现的。无论是骨架蛋白之间联结状况的变化，还是膜蛋白与骨架联结状况的变化，对膜的变形性都有重要的影响。图3 红细胞的膜结构1 3 2 红细胞膜的流变性红细胞膜具有流动性“。“1 。在一定范围内随着温度的变化，构成膜的脂类可以从流动的液晶态变成晶态，晶态也可变成液晶态，这种引起相变的温度称为相变温度。晶态时磷脂的脂肪酸链排列整齐而致密，因而脂质双层流动性小；液晶态时，脂肪酸排列疏松，允许蛋白质跨膜作自由运动，所以红细胞膜有一定的流动性。红细胞膜是由血影蛋白、肌动蛋白和连接蛋白等形成的细胞膜网状骨架支撑着，这就使红细胞具有一定的弹性和粘度。1 3 3 膜脂对红细胞流变性的影响构成红细胞的脂类有磷脂( p h o s p h o l i p i d ，p l ) 、胆固醇( c h ol e s t e r 0 1 ) 和糖脂( g l y c o li p i d ) “。“1；磷脂主要有磷脂酰胆碱( p h os p h a t i d y l c h o l i n ep c ) 、磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n eps ) 、! 二毛谴刹蕊菥_ 竺型竺竺坚婴罢磷脂酰乙醇氨( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n ep e ) 、鞘磷脂( s p h i n g o m y e li ns m ) 等。质膜上的磷脂正常情况下是不对称分布的，卵磷脂( p s ) 和鞘磷脂( s m ) 主要分布于质膜外层，磷脂酰丝氨酸( ps ) 和磷脂酰乙醇胺( p e )分布在质膜内层。磷脂分子的一个显著特点是极性很强。它是由磷脂酰碱基和脂肪酸两部分通过甘油基团( 或鞘氨醇) 结合而成，磷脂酰碱基部分较短，一般称为头部，集中磷酸和碱基，因而极性很强，是亲水的；脂肪酸部分是两条较长的碳酸链，一般称为尾部，是非极性的疏水的。磷脂分子中的脂肪酸按其是否含双键分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸链呈直形，排列规则有序；而不饱和脂肪酸链，在双键处发生折曲，分子呈弯曲状，因而降低了膜脂分子之间排列的有序性，从而增加了膜的流动性。此外，链的长度也与流动性有关，短链能减低脂肪酸链尾部彼此相互作用的倾向，在相变温度以下，不易于凝集，链长的增加会使流动性降低。人成熟的红细胞膜中，磷脂呈不对称分布。约7 6 的磷脂酰胆碱( pc ) ，82 的鞘磷脂( s m ) 位于膜的外层，8o 的p e 和全部的p s 位于膜的内层。产生和维持膜磷脂不对称分布的详细机制仍不很清楚，但已知这种不对称性与红细胞变形性有关，如果这种不对称性消失，变形性即下降。另外改变红细胞膜上的磷脂对称性对红细胞的聚集也有一定的影响。红细胞中各种磷脂成份的含量或相对比例失常，对红细胞的流变特性也有影响。红细胞膜中的p c 含量增加将会引起红细胞变形性下降。胆固醇对调节膜的流动性有作用。在相变温度以上，它可使磷脂分子的脂酰链末端的甲基运动减小，即限制膜的流动性；在相变温度以下；可增加磷脂分子脂酰链的运动，从而提高了膜的流动性。实验表明红细胞膜中胆固醇与磷脂的比值( c p ) 增高会降低红细胞的变形性。1 3 4 膜蛋白对红细胞流变特性的影响在红细胞膜中，蛋白质约占膜重的一半2 “2 ”。蛋白质的组成、结构及相互作用在很大程度上决定红细胞能否保持其正常的形状及变形性。在一些遗传性血液疾病中，膜蛋白出现异常或缺失，引起红细胞流变特性的异常改变。由蛋白质组成的红细胞膜骨髂有多种功能：1 ) 它给予膜以强度和弹性，从而维持红细胞的特征性圆盘状结构；2 ) 通过和内在性蛋白质的结构联系，调节带3 蛋白在膜内的分布；3 ) 可能在维持脂质双分子层的不对称分布起着作用：4 ) 在决定膜的稳定性、细胞的形态及变形性方面起着重要作用。实验发现，当红细胞的a t p 含量低于正常值的5 15 时，正离子漏出，膜骨架发生变化红细胞变成球状且变形性下降。血影蛋白是一种主要的膜骨骼蛋白，对红细胞的流变性质着重要作用。血影蛋白含量下降会导致红细胞的渗透脆性增加；而血影蛋白二聚体含量的增加可能会引起红细胞膜的粘弹性增加：而在有遗传性椭圆形红细胞病的家族中发现，红细胞血影蛋白有不规则的联结，膜的变形性和最大变形性下降。加合蛋白可与血影蛋白及肌动蛋白的复合物结合，并促进血影蛋白与肌动蛋白的结合。加合蛋白在c a “存在的情况下可与钙调蛋白( c a l m o d u l i n ) 结合，他们结合后形成的c a 2 + _ 一钙调蛋白一加合蛋白复合物，又会使血影蛋白与肌动蛋白的结合减少。由此可见，加合蛋白通过与c a 2 及钙调蛋白作用来影响骨架蛋白的稳定性，从而影响红细胞的形态。用生化方法扰乱正常红细胞中骨架蛋白的相互作用发现，骨架蛋白之间联结的增加和膜蛋白与骨架联结的增加都对红细胞膜变形性有影响。无论是血影蛋白一肌动蛋白一4 1 蛋白，还是血影蛋白的自联结，都对红细胞的最大变形性有重要的影响。4 1 蛋白带是另一种重要的膜骨架蛋白，它的重要性在于，它不仅在膜骨架中起着联系作用，而且还连接着一些跨膜糖蛋白( 如带3蛋白、血型糖蛋白a 等) 。用激光衍射仪测量的结果表明，红细胞的机械稳定性随着膜上4 1 蛋白缺损程度的增大而降低。把从正常人的红细胞膜中提取出的纯蛋白4 1 添加重组到4 1 蛋白缺失的红细胞膜中时，随着蛋白4 1 浓度的增加，红细胞的机械稳定性逐渐恢复，这就直接证明了蛋白4 1 在维持红细胞膜的稳定性中的重要作用。伴随着红细胞变形性的下降，骨架蛋白中带3 蛋白、4 1 蛋白、锚蛋白等蛋白质发生降解。1 4 、低强度激光对红细胞流变特性的研究进展低强度激光血管内照射疗法( i n t r a v a s c u l a rl o wi n t e n s i t yl a s e ri r r a d i a t i o nt l l e r a p y 简称i u ，又称低能量激光血管内照射血液疗法i n t r a v a s c u l a rl a s e ri r r a d i a t o no fb l o o d i u b ) 。80 年代，前苏联科学院肿瘤研究中一心受紫外线照射自体血回输疗法的启发，进行低强度he ne 激光照射离体人淋巴细胞的作用研究，发现有提高免疫功能的作用。l9 84 年将he ne 激光从离体照射变为血管内照射治疗闭塞性血管病取得好的效果。以后原苏联相继报导用这种方法治疗心血管病，脑部疾患，支气管哮喘和眼科疾患等取得长足的进步。l990 年这种治疗方法引进到我国，广州第一军医大学的王铁、丹教授与桂林康兴激光仪器厂率先成功的生产出he ne 激光血管内照射仪并在全国应用，使我国成为世界上可应用此疗法治疗疾病的第二个国家( 在此之前只有独联体( 原苏联) 应用于临床) 。现已发展有血管外照射、穴位照射、粘膜照射等，已有数万名患者接受过治疗。特别是在缺血性心脏病，脑血管病的治疗中取得了一定的疗效。”。i l u 治疗的开展与研究在国际上仅走过仅几年的历程，而国内起步更晚，然而这项技术的发展速度确实是惊人的，其适用范围远远地超过了he ne 激光局部、穴位和反射血照射的范围。美国著名激光专家沃尔巴什特在激光在医学和生物学中的应用一书中这样谈到：“激光生物刺激可能是激光在医学上的一种新型应用的标志，这种应用比激光破坏和切开组织的应用更有价值”。但是激光治疗必竟还是一门新兴的边缘学科，而对于i l l l i 治疗的研究和使用也处于初级阶段，总体看其作用机制还是不十分清楚。不同的疾病，不同的病情治疗一律套用一种模式，说明还带有一定盲目性。仪器也需要不断发展和完善，应进一步寻找更有效的波长激光。对低强度激光的生物刺激作用和抑制作用的剂量如何掌握才严谨?我们相信i l l u 治疗随着基础理论与方法不断完善，对各种疾病的治疗不断深入，必将成为一种新型的造福人类的现代医学治疗手段，其前景是广阔的。红细胞变形能力对于微循环血流的灌注起着至关重要的作用。有研究表明”：冠心病不同程度冠状动脉狭窄时红细胞变形性下降，且红细胞变形性降低程度与冠状动脉狭窄程度有关。在各种病理情况下，红细胞变形性的改变更加受到重视，很多疾病。”1 如高血压、糖尿病、脑梗塞、冠心病、心肌梗塞、高脂血症都伴有红细胞变形性的下降，使血液与组织间气体交换受阻，从而影响微循环的灌流，引起组织缺血和缺氧。细胞和临床研究表明，低强度h e n e 激光可以调整红细胞的变形性。研究低强度激光对红细胞变形性的调整机制，对于相关疾病的治疗有重要的指导意义。刘承宜等人提出低强度激光的生物信息假说n 7 “来研究低强度激光对红细胞变形性的调整机制，并在总结低强度激光生物效应的基础上又提出了低强度激光的生物信息假说( b i m l ) 和激光生物信息转换假说( b i t m l ) 哆“1 。根据b i m l ，低强度激光通过与细胞膜化学配体受体的非共振作用，启动细胞内部的信号转导通路：绿、兰和紫等冷色兴奋信号途径1 ：c a m pf ：红、橙和黄等暧色兴奋信号途径2 ：c a m pi 。段锐等人哺”研究了低强度h e ne 激光对中性粒细胞呼吸爆发的促进作用，发现激光的作用是通过受体酪氨酸激酶( 属于信号途径2 ) 实现的，这直接证实了上述模型。根据b i t m l ，在不引起损伤的前提下，一种激光对信使浓度的改变超过相应的阈值，生物系统内部的平衡机制将使它所启动的信使系统转换成与现有信使系统相拈抗的信使系统。根据细胞第二信号系统的最新研究，bi m l 和bi t m l 解释了大量的细胞水平、临床水平和流行病学水平的研究结果。刘承宜等人的工作逐渐得到激光医学界的承认。8 “”。根据bi m l ，低剂量h e ne 激光将降低红细胞的变形性。肾上腺素兴奋红细胞的信号途径2 ，增加红细胞变形性。低剂量h e ne 激光与肾上腺素在调整红细胞的变形性方面相互拮抗，这与y o v a 等人的实验结果一致。根据b i m l 和b i t m l ，高剂量h e - ne 激光将增加红细胞的变形性。这与l i j i m a 等人“2 1 和王铁丹“如等人的实验一致。临床研究中发现h 3 1 “，高剂量的h e ne 激光血管内照射( h n i l l l i ) 可以改善红细胞的变形性。这与前面揭示的细胞机理是一致的。侯靖边等哺盯对2 5 例脑梗塞患者作h n i l l l i ( 1 5 m w ，6 0 m i n ) ，并对膜脂代谢，膜流动性和变形性进行研究。他们发现，经h e ne激光血管内照射治疗9 天后，脑梗塞病人的红细胞膜胆固醇膜磷脂之比明显降低，膜的流动性明显提高，红细胞变形性显著改善，i 临床治疗有效率达9 3 8 。王之光等”w 对3 8 只实验性糖尿病兔，分别采用1 2m w 、1 5m w 幂h 2 2 m w 的h e - n e 激光分两批一次性血管内照射各5 0 m i n ，测定其红细胞变形能力等8 项血液流变学指标，并观察指标随时间的变化。结果表明：( 1 ) 红细胞变形能力提高，以照射后第3天最明显。5 7 天后会回复到照射前水平：( 2 ) 可改善红细胞刚度，但时间上反映较迟。进一步的研究旧1 采用了较大的功率，即5m w 、1 0m w 、1 8m w 和2 5 m w 的h e ne 激光，对实验性糖尿病新西兰兔血管内照射各6 0 m i n ，观察了其红细胞变形功能( r c d ) 随剂量的时间的变化，结果发现：( 1 ) 在其实验所选用的功率和剂量范围内，大剂量照射对r c d 影响能较早地表现出来，且更持久。( 2 ) 在改善r c d 程度上，剂量越大，越表现出优越性，特别是在照射后第1 天和第3 天，剂量越大的组其r c d 改善程度越好。该实验在实验观测过程中末发现溶血现象。1 5 、本文工作的意义、特点和目的从上面的介绍可以看出，低能量激光血管内照射血液疗法在理论及临床上都有重要意义。虽然到目前为止，国内外做了许多研究工作想找出其作用机理并取得了一定的成果，但其机理仍然未得到一个大家都公认的结论，还需要进一步的研究。为此，我们设计了一些实验，希望对这些问题作深入研究，为进一步的工作积累资料。另外红细胞膜结构和红细胞性状的变化是对红细胞变形能力影响的主要因素之，而红细胞变形能力是影响血液流变学的重要因素之。红细胞的这些改变可以很灵敏的用激光衍射法进行测量。这就为研究低强度激光对红细胞流变特性的改变提供了一种新的便捷、灵敏的测量手段。激光衍射法是由b e s s i s 和m o h a n d a s 于1 9 7 5 年提出的，目前已经得到国际公认。但是这一方法测得的描写红细胞变形指数d i 的意义，仍然值得研究。1 9 9 1 年文宗曜、陶祖莱等b 2 1 把激光衍射法中使用的悬浮介质粘度扩大，并测量了红细胞在低粘的p b s 悬浮介质和高粘的p v p悬浮介质中的松弛过程，p b s 和p v p 中的动力学行为发现，两者的动力学行为有显著差异。并提出了低粘的p b s 中测得的d i 实际上包括红细胞的小变形指数( d i ) 。与取向( d i ) 。两成分。由此，文宗曜等提出了一种在低粘切变流场反映红细胞变形与取向的新型激光衍射法2 9 - - 3 1 。其中小变形指数( d i ) 。反映细胞膜的流动性，取向( d i ) 。反映细胞膜的各种微观变化。该法具有比传统激光衍射法更高的灵敏度，能在分子水平上反映红细胞膜微观流变特性的改变。通过核磁共振与荧光偏振技术实验证实了可用于描写红细胞膜脂的流动性溉3 ”3 。上述事实证明了新型激光衍射法可在接近正常生理条件下测量红细胞膜的流动性。文宗曜、严宗毅等对新型激光衍射法进一步研究，解决了传统激光衍射法不能实现的定量描写红细胞膜的弹性模量e 与膜粘度的问题。文宗曜等人利用新型激光衍射法作了大量研究工作，并得到国内外同行的认可与引用。为红细胞微观流变学的研究提供了一种新的方法。北医大血液流变中心主要从事红细胞微观流变性的研究，曾详细研究了红细胞受体对红细胞变形性的影响。文宗曜、高铁等人。埘从不同浓度的小麦胚凝集素( w g a ) 或伴刀豆球蛋白a ( c o n a ) 及唾液酸酶作用于红细胞膜蛋白或膜质受体的角度研究微观红细胞变形性的变化。他们通过对电子自旋共振法和荧光偏振法测量结果与新激光衍射法测量结果比较得出：红细胞的生理形态越好，取向指数( d i ) 。越高；低粘切变流场中的小变形指数( d i ) 。主要反映红细胞膜流动性的改变它与红细胞表面电荷的多少无明显关系；红细胞膜的流动性随w g a浓度增加而改变；随w g a 浓度增加红细胞的变形指数下降。+在文宗曜、高铁等人研究的基础上，为进一步了解低能量激光血管内照射后红细胞微观变形性的影响，本文使用文宗曜等提出的新激光衍射法，从分别从红细胞形状、内粘度、细胞膜结构等微观血液流变学的角度，用新激光衍射法验证了前人由其它方法得出的结论低能量激光照射离体后变形能力下降的红细胞，可以提高红细胞的变形能力。第二章低强度激光对离体人红细胞变形性的影响2 1 实验试剂及仪器：( 1 ) 磷酸缓冲液p b s氯化钠0 1 2 m o l l磷酸氢二钠0 0 2 m o l l磷酸二氢钾0 0 0 5 m o l l渗透压2 9 0 m o s m k gp h = 7 4( 2 ) 聚乙烯毗咯烷酮1 5 p v p ( m w = 3 0 k d )磷酸氢二钠0 0 2 m o l 1磷酸二氢钾0 0 0 5 m o l l氯化钠调整渗透压至l j 2 9 0 m o s m k gp h ：= 7 4( 1 ) m r 4 5 0 型低功率h e n e 激光器( 清华紫光生产) ，( 2 ) 3 f 一2 型多功能微量高速离心机( 北京市医用离心机厂) ，( 3 ) 电热恒温水浴箱( 北京长安科学仪器厂) ，( 4 ) l b y 一- b x 2 激光衍射仪( 北京普利生公司生产) ，( 5 ) 2 0 0 0 型u v - 2 0 0 0 型分光光度计( 上海尤尼柯仪器有限公司生产) ，( 6 ) 荧光分光光度计( 日本h i t a c h i 公司) 。以下实验均用这些试剂和仪器，不再另加说明2 2 实验方法：幽厂l、鬃图1 激光照射示意图f i g ! e x p e r i m e n t a ls e e po f l a a e r取正常健康成人血液8 例，用肝素抗凝放置4 8h 后。每例血样为1 2m l ，其中取两个2m 1 作为正常对照组( 为去除时间对观测结果的影响，分别在最初和最后测量) ，另外8m 1 摇匀后分装入四个试管，每管2m l 用m r 4 5 0 型低功率h e n e 激光器对样品进行照射，保证功率和光斑( 直径1c m ) 一定的情况下对四份血样进行照射。分别在2 0m i n 、4 0m i n 、6 0m i n 、8 0m i n 、1 0 0m i n 、1 2 0m i n 时取出标样进行各种参数的测定。改变照射功率，同时改变照射时间，但总能量保持不变的情况下重复上述操作测定八次，最后以这八次的缓誉平均值作为实验结果进行分析。2 2 1 红细胞变形性的测定红细胞膜变形的两个根本特点是：1 、红细胞形状可以改变很大，但膜表面积基本不变，若认为膜材料是不可压缩的，则膜厚度可不变。2 、平衡状态下红细胞总是双凹蝶形，应力和应变的历史过程对此无影响表明红细胞膜是炙样性的，其应力一应变关系是非线性的。红细胞变形能力决定于细胞膜和胞内血红蛋白，而血红蛋白的流变行为象不可压缩的流体，黏度6 c p ，因此红细胞变形能力取决于其膜。红细胞膜力学性质最大特点：即积分弹性模量( k ) 远大于剪切弹性模量( s ) ，s k = l o 一，只要红细胞不破裂，变形时表面积不变。红细胞膜的力学特点表明：1 、红细胞的形状、体积容易改变，但其膜表面积近乎不变，改变渗透压通过膨胀试验可提供胞膜变动刚度信息。2 、膜的多样性和可塑性决定膜的剪切弹性模量。3 、红细胞的