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文档简介
血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析,【目的要求】1.掌握琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白的原理,掌握正常人血浆脂蛋白的分类。2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。3.了解电泳带中脂蛋白显色特点,1,【实验原理】,琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物,为一种含硫酸根、带负电荷的多糖类物质。琼脂是直链多糖,它由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖主要通过氢键形成凝胶。电泳时,因为凝胶中含水量大(9899%),近似自由电泳,固体支持物的影响较少,故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团,电渗影响很小,是一种良好的电泳材料,分离效果较好。血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同,因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此,以琼脂糖凝胶为支持物,在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑(或油红等)进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离。通电后,可以看到脂蛋白被分成三条区带,从负极到正极依次为脂蛋白(最深)、前脂蛋白(最浅)及脂蛋白(比前脂蛋白略深),在原点处应无乳糜微粒。,2,【实验器材】,1.电泳仪、电泳槽2.载玻片3.台式离心机,3,【实验操作】,1.预染血清血清0.2ml中加苏丹黑色液0.02ml,混合置37水浴中染色30分钟,离心(2,000转/分)5分钟。2.制备琼脂糖凝胶板将已配制好的0.50%琼脂糖凝胶于水浴中加热融化,用吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上,立即放上“桥”,静置待其凝固后,小心取下“桥”。3.电泳将凝胶板平行放入电泳槽中,加样孔端置负极。用四层滤纸于巴比妥缓冲液浸湿,然后轻轻盖贴在凝胶板两端,滤纸的另一端则浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中。接通电源后低压加样,加样完后电压调为120130V。经电泳3550分钟,即可见到分离的区带。4.如果需要保留电泳图谱,可将电泳后的凝胶板放入干胶机中制成干胶片。若无干胶机,可用玻璃纸包好凝胶板(连同载玻片),其上平铺多层吸水滤纸,滤纸上再压上书等重物,吸干凝胶中的水分。也可将凝胶板先放入清水中浸泡脱盐2小时,然后放烘箱(80左右)中烘干,但应陋随时注意温度的变化以及凝胶的脱水程度,以避免凝胶在脱水过程中龟裂。,4,【注意事项】,1.预染血清与温度有关,低温着色慢,高温着色快,37较为适宜。2.浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一,否则会影响脂蛋白的分离效果。3.将凝胶板放入电泳槽中,应切记与电力线平行、样品端置负极、搭桥滤纸不能搭在样品上。4.制备干胶时,要严控制脱水的温度和速度,避免脱水时温度过高、速度太快引起凝胶收缩龟裂。,5,【思考题】,1.琼脂糖凝胶电泳有哪些操作要点?2.在不同的实验方法(超速离心、琼脂糖凝胶电泳、PAGE)中,正常人血清脂蛋白如何分类,电泳后的相对位置及其与超速离心法的对应关系?3.各种脂蛋白的功能?为什么正常人血清脂蛋白电泳时见不到乳糜微粒区带?,6,【正常参考值】,乳糜微粒
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