（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠卵丘细胞通过分泌可溶性因子促进卵母细胞老化.pdf

y 9 0 3 8 1 6 关于学位论文原刨性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进 行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指 导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确 说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学宥关保留和使粥学位论 文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机 构送交论文纸质本和电子敝，允许论文被查阅和借阅。 本人授权山客农业大学可以将本学位论文的全都或部分 内容编入有关数据庳进行检索，可以采用影印、缩印或 其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期：垒竺 ， 出东农救天学矮士学位论文 符号说明 6 - d m a p ：6 d i m e t h y l a m i n o p a r i n e ，6 二争氨萋漂跨 a p f ：a g i n g - p r o m o t i n gf a c t o r , 老化促进因子 b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n ，牛肌清白蛋白 c h x ：c y c l o h e x i m i d e ，亚胺环悉粼 c m ：c o n d i t i o n e dm e d i l i n ，条 孛纯培养基 c o c ：c u m u l u s o o c y t e sc o m p l e x ，带卵丘的卵母细胞 c s f ：c y t o s t a t i cf a c t o r , 细胞静止因子 d q ：d e n u d e do o c y t e ，去雾嚣熬努霉缨燕 f c s ：f e t a lc a l f s e r u m ，胎牛血清 h c g ：h u m a nc h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n ，人绒毛膜促性腺激素 l h 乳h u m a nt u b a lf l u i d ，久输卵鬻滚 l ：h y p o x a n t h i n e ，次黄嘌岭 i c s i ：i n t r a c y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n ，单精予胞质注射 1 t 3 ：i n o s i t o lt r i p h o s p h a t e ，三磷酸肌醇 i p 攘s ：i n o s i t o lt r i p h o s p h a t er e c e p t o r s ，三磷酸虢醇受薅 i v c ：i nv i t r oc u l t u r e ，体外培养 i v i ：i nv i t r om a t u r a t i o n , 体外成熟 m p f ：m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r , 戏熟促进因子 p c d ：p r o g r a m m e dc e l l 蠡a t h ，编程往缓戆死亡 p m s g ：p r e g n a n tm a r es e r u m g o n a d o t r o p i n ，孕码血清促性腺激素 s f ：s p e r mc y t o s o l i cf a c t o r ，精予胞质因子 t e n 嚣薹：t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y ! t r a n s f e r a s e ( t d t ： - m e d i a t e dd u t p 撼呔 e n dl a b e l i n g ， 脱飘核苷酸转移酶末端标记 ，j 、瓣瞻蠢细胞通过分泌霹溶性因子键避辩母细腿老纯 中文摘要 螓嚣动物爨母纲您一般停滞农m l i 期，当蠢精子穿入域蠢受到适当的 裁激w 戳解除等滞，恢复猿鼗分裂。僵若峁鸳缀麓西未施及时受精或激潞 而导数停滞在m i i 期的时间过长会发生质量下降称之为卵母细胞的老化。 老化的卵母细胞由于其成熟促进因子( m p f ) 活性的下降导致孤雌激活敏 感毪靛霪著壤热。爨萎缨藏终焉鞭绕在赛母缎蕤躅嚣戆颗粒缀鼹亚群，怼 于卵母细胞减数分裂阻滞、减数分裂的恢复、卵母细胞的成熟和受精都越 着重要的作用。排卵后卵丘细胞隧卵母细胞超排入输卵瞥中，已经证明 小鼠摊卵后卵丘缨臌促进卵母缨照的老化。但是关于卵丘细胞促进卵母 缨憨慧纯懿 筝薅梳毽还不清楚，本论文逶过d o 与c o c 游共珞养、d 0 与细胞单层共培养、c o c 和细胞单层的条件化培养基处理d o 等方法研 究了卵履细胞是通过什么方式促进卵母细胞老化的；通过卵母细胞( c o c 嚣d o ) 在不同漫痰条传下老他疆窕了举霹条转下露丘缀黪分泌老纯爨遴 因予( a p f ) 的能力的不同：通过对条件纯培养基加热和怒低温冻融研究 了条件化培养基中的老化促进因子对不同温殿处理的反应。结果如下： 1 当体内，外成熟d o s 与然内成熟c o c s 以1 比2 共壤养6 小时肘， d o s 弧雅激活率显装薅予在c z 转培养滚孛擎猿老纯6 小辩豹对照缓。受 体内、外成熟d o s 与体外成熟c o c s 以1 比5 共培养1 2 小时才能显著增 加d o s 的孤雌激活率，说明体内成熟的c o c s 分泌老化促进因子的能力 要显蘩莲子体夕 成熬戆c o c s 。 2 用3 0 个c o c s 在2 0 0 9 lc z b 培养液中老化6 小酵制备的条俘纯培 养基处理c o c s 或d o s6 小时，能显著加速c o c s 和d o s 的老化进程。 但是，l s 个c o c s 或3 0 个d o s 禚2 0 0 p 1 c z b 培养渡中老化6 小时制各的 条锋诧墙葬基楚瓒c o c s 凌d o s6 参薅，c o c s 移d 涵戆疆耀激活率与瓣 照缎棚比都无显著藏异。说明足够量的c o c 制备的条件化培养基能键进 卵母细胞的老化，并且卵丘细胞促进卵母细胞老化不需要接触而是通过分 泌霹漆蠖嚣子恧起掺惩的。 3 h c g1 2 小对积h c g1 8 小时的c o c s 猩c z b 培养液中老化5 小时 所制得的条件化培养基促老化能力要显著高于h c g2 4 小时的c o c s 谯 c z b 壤养液中老化6 小时制备的条 牛化培养慕。当增加制备条件化培葬 2 出末农监大学鹾圭学位论文 基的h c g2 4 小时c o o s 的数量时，熊促进卵母细胞老化的能力显著增加。 4 条件化培养基经过s 6 加热l ( ) 分钟即可照著降低其促进卵母细胞 老诧弱簸力， 0 0 c 燕t 热1 0 分锋箕键送露母缓藏老纯豹缝力宪全游失。餐 是超低漱冻融、4 5 加热i o 分钟和4 5 加热3 0 分钟对其活饿没有影响。 说明老化促进因子( a p f ) 是一种对高温较为敏感的物质。 5 。邋：蓬诗算劈母纲照周围既爨聂缨臆数发瑷，薅内成熟c o c s 款郛 丘细胞数臻显著高手镲外成熟c o c s ，谇内成熟c o c s 在捧郛藏您小对舞 丘细胞数摄出现显著减少。因为体外成熟c o c s 分泌老化促进因子的能力 低于体内c o c s ，且体内成熟c o c s 在排卵后1 2 小时分泌老化促进因子的 蔻力显蓑下降。毽魏，疆毙是费聂缓魏数熬多乡瀑致7 苓嗣c o c s 分泌老 化促进因予能力的差异。 6 c o c s 在3 8 5 条件下老化6 小时后孤雌激活率显著高于在3 7 和 3 5 。5 条传下老纯6 小拜尊嚣敕，但d o s 在三个瀑浚条传下老徽6 小时嚣孤 雏激活攀每对照组穰魄无显著交纯。c o c s 在3 8 5 c 条律下老他6 ，j 、对割 各的条件化培养基在3 7 ( 2 条件下她理d o s6 小时后，d o s 的孤雌激活率 显著高于c o c s 在3 7 条件下老化6 小时毒4 备的条件化培养旗在3 7 处 瑾d o s6 奎簿嚣豹弧麓激活率。说缓c 在囊滋条舞下老诧避程显蓑秘 速，而且i 塞种加速的老化进程是由予卵丘细胞在离温条件下分泌了更多的 老化促进因子所造成。 7 髑襄豆细胞单鼷与d o s 共壤箨6 小时能燕骧增加d o s 的孤雌激活 率，郛爱缀腱单屡所瓣貉的条释健培养基处理d o s 同样链够显落增加d o s 的孤雌激活率、g v 期c o c s 的卵丘细胞所制备的细胞单层妁muc o c s 卵丘细胞所制备的细胞单层分泌老化因子的能力涎晟著差异。岛小鼠胎儿 残缍维缨魏擎屡移夺簸藏驽维缨稳系擎层荚培莠耀寒麓键漾小鬣舞母缨 胞的老化，说明其他体细胞可能不舆备卵丘细胞的这种分泌老化促进因子 的能力。 8 注射h c g1 2 小时后的c o c s 在2 0 0 出c z b 培养液中老化1 2 、1 8 、 2 4 和3 0 小时裁套翡条俘亿瑶养墓程老纯麓力显答离子老纯6 小对裁备鹣 条件化培养基。 关键词：卵丘卵僻细胞老化孤雌激活小鼠 小鼓郛丘缨腿透过分游霹溶性因子促进辩母捆胞老化 a b s t r a c t i nm o s tm a m m a l s ，m a t u r e do o c y t e sa r ea r r e s t e da tm e t a p h a s e i i ( m1 1 ) ， a n dw i l ln o tr e s b m em e i o s i su n t i la c t i v a t e db yp e n e t r a t i n gs p e r m a t o z o ao r o t h e rs t i m u l a t i o n s i ft h emi io o c y t e sa r en o tf e r t i l i z e do ra c f i v a t e dt i m e l y , s o m ec h a n g e so c c u r r i n gi nt h ec t o p l a s mw i l ll e a dt od e c r e a s e dq u a l i t yo ft h e o o c y t e s ，t h i sp h e n o m e n o ni sc a l l e do o e y t e a g i n g 。c u m u l u sc e l l sr e p r e s e n tt h i s u n i q u es u b p o p u l a t i o no fg r a n u l o s ec e l l st h a ts u r r o u n d st h eo o c y t e ，p r o v i d i n g n u t r i e n t ，m e t a b o l i cp r e c u r s o r sa n ds i g n a l st h a tr e g u l a t e i t sd e v e l o p m e n ta n d m a t u r a t i o n c u m u l u sc e i l sp l a ya l li m p o r t a n tr o l en o to n l yi nm a t u r a t i o n ， o v u l a g o na n df e r t i l i z a t i o no fo o c y t e sb u ta l s oi nt h ea g i n go fo o c y t ea f t e r o v u l a t i o n h o w e v e r , w ek n o wv e r yl i r l ea b o u th o w t h ec u m u l u sc e l l sp r o m o t e t h ea g i n go fo o c y t e i nt h i ss t u d y , w eu s et h ew a yo fc o c u l t u r ed o sw i t h c o c s + c o n d i t i o n e dm e d i at r e a t m e n ta n dc o c u l t u r ed o sw i t hs o m a t i ct e n s m o n o l a y st om a k ei tc l e a rh o w t h ec u m u l u sc e l l se x c r e t et h ef a c t o rt op r o m o t e t h ea g i n go fm o u s eo o c y t e s ；a n dw ep u tt h ec o c so rd o si n t od i f f e r e n t t h e r m o m e t r i cc o n d i t i o n sf o rs e v e r a lh o u r st om a k ei tc l e a rt h a th e wd i f f e r e n tt h e c u m u l u sc e l l se x r e 或a g i n g - p r o m o t i n gf a c t o ru n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ；a n d w eh e a t e dt h ec o n d i t i o n e dm e d i ai nd i f f e r e n tt e m p e m t u r eo rf r e e z e dt h e c o n d i t i o n e dm e d i ai i l 一7 0 a n dt h a w i n gf o rt h r e et i m e sb e f o r et r e a t i n gd o s t om a k ei tc l e a rt h a tt h er e s p o n s eo f a g i n g - p r o m o t i n gf a c t o rt o d i f f e r e n t t h e r m o m e t r i ct r e a t m e n t s 弧er e s u l t sa l es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 珊l e nw ec o c u l t u r e di nv i v oo ri nv i t r od o sw i c hi nv i v oc o c s ( d o ： c o c = 1 ：2 ) ，t h ea c t i v a t i o nr a t eo f d o s c o - c u l t u r e dw i mc o cw b b s i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p 。w h e nw ec a ) 一c u l t u r e di nv i v oo ri nv i t r od o s 谢t li nv i t r oc o c s ( d o ：c o c = 1 ：5 ) ，t h ea c t i v a t i o nr a t eo fd o sc o - c u l t u r e d w i t hc o c sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u pt o o t h e s ei n d i c a t e d t h a ti nv i t r oc o c si sd i f t 毫r e n tf r o mi nv i v oc o c s0 1 7 1t h ea b i l i t yo fe x c r e t i n g a g i n g - p r o m o t i n gf a c t o r ( a p f ) ， 2 t h ea e t i v a t i o nr a t eo fc o c sa n dd o st r e a t e dw i t ht h ec o n d i t o n e dm e d i a f r o m3 0i nr i v ec o c sa g i n gf o r6h o u r si n2 0 0 9 lc z bw a ss i g n i f i c a n t l y 出末表韭大擎颈士学链论文 h i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p b u tt h ea c t i v a t i 0 1 1r a t eo fc o c s a n dd o st r e a t e d w i t ht h ec o n d i t i o n e dm e d i af r o m1 5i nv i v oc o c so r3 0d o s a g i n gf o r6h o u r s 氇2 0 0 1c z bh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ef r o mt h ec o n 拓o lg r o u p t h e g e i n d i c a t e dt h a tt h ec o n d i t i o n e dm e d i u mf r o me n o u g hc o c sc a np r o m o t et h e a g i n go f o o c y t ev e r yw e l l ，t h ec u m u l u s c e l l sc a ns e c r e t es o m es o l u b l ef a c t o rt o p r o m o t et h ea g i n go f m o u s eo o c y t e s 。 3 n 圮c o n d i t i o n e dm e d i af r o m 。3 0h c g1 2 hc o c sa n dh c g1 8 hc o c sa g i n g f o r6h o u r si n2 0 0 p 1c z bh a ds t r o n g e ra i l i t yo np r o m o t i n ga g i n go fd o st h a n h c g2 4 hc o c sa g i n gf o r6h o u r si n2 0 0 t ic z b ，a n dt h ec o n d i t i o n e dm e d i a f r o m6 0h c g2 4 hc o c sa g i n gf o r6 魏。疆si n2 0 0 擎1e 2 墨c a np r o m o t et h e a g i n go f o o c y t ev e r yw e l l 4 k e l lw eh e a t e dt h ec o n d i t i o n e dm e d i ai 1 7 1t h ew a t e rb a t ho f1 0 0 f o r1 0 m i n u t e s ，a l lt h ea b i l i t yo ft h ec o n d i t i o n e dm e d i ao np r o m o t i n ga g i n go fd o s d i s a p p e a r e d w h e nw eh e a t e dt h ec o n d i t i o n e dm e d i ai nt h ew a t e rb a t ho f 5 6 f o r1 0m i n u t e s ，t h ea b i l i t yo ft h ec o n d i t i o n e dm e d i ao i lp r o m o t i n ga g i n go f d o sd e c r e a s e ds i g n a f i c i a n t l y , b u tf r e e z et h a w i n g ，h e a t i n gi nt h ew a t e rb a t ho f 瘁5 f o r1 0m i n u t e so r3 0m i n t i n u ed i dn o ta f l t et h ea b i l i t yo ft h e c o n d i t i o n e dm e d i ao np r o m o t i n ga g i n go fd o s t h e s ei n d i c a t e dt h a tt h e a g i n g p m m o f i n gf a c t o r ( a p f ) i ss e n s i t i v et oh i g ht e m p r e t u r e 5 噩l ec o c sf r o mi nv i v os o u r c e sh a d 瑶。端c u m u l u sc e l l st h a nt h a tf r o mi n v i t r os o 瑚雌e s t n l en u m b e ro f c u m u l u sc e l l so f i nv i v oc o c so v u l a t e d1 2 hl a t e r d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y t h e s ei n d i c a t e dt h a tt h en u m b e ro fc u m u l u sc e l l a r o u n dc o c sc a l ld e c i d et h eq u a n t i t yo f a p fs e c r e t e df r o mc o c s 6 。羽辩a c t i v a t i o nr a t eo fc o c sa g i n gi n3 8 5 f o r6 hi sh i g h e rt h a nt h e a c t i v a t i o nr a t eo f c o c sa g i n gi n3 7 。co r3 5 5 f o r6 h b u tt h ea c t i v a t i o no f d o sa g i n gu n d e rt h ec o n d i t i o n so ft h r e et e m p e r a t u r eh a dn os i g n i f i c i a n t d i f f e r e n c e 。t h ed o st r e a t e d6 hu n d e rt h e3 7 c o n d i t i o nb yt h ec o n d i t i o n e d m e d i af r o mh c g1 2 hc o c sa g m gf o r6 hi n2 0 0 西c z bu n d e r3 8 5 c o n d i t i o nh a dh i g h e ra c t i v a t i o nr o t et h a nd o st r e a t e d6 hu n d e rt h e3 7 。c - c o n d i t i o nb yt h ec o n d i t i o l l e dm e d i af r o mh c g1 2 hc o c sa g i n gf o r6 hi n 5 小靛卵丘细胞通过分泌w 溶性因子促进卵母细胞老纯 2 0 0 i dc z bu n d e r3 7 一c o n d i t i o n t h e s ei n d i c a t e dt h a tt h ec u m u l u sc e l l s s e c r e t en l o r ea g i n g p r o m o t i n gf a c t o r ( s ) ( a p f ) i nh i g h e rt e m p e r a t u r el e a dt o t h eq u i c k e ra g i n gp r o c e d i n go f m o 黼eo o c y t e s 。 7 鼢# nw ec o c u l t u r ed o sw i t hs o m a t i cc e l lm o n o l a y e r s ! o n l yt h ea c t i v a t i o n r a t eo fd o sc o c u l t u r e dw i mc u m u l u sm o n o l a y e r si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y t h e c u m u l u sm o n o l a y e r sm a d ef r o mmi ic o c si sn o td i f f e r e n ti ne x r e c t i n ga p f f r o mc u m u l u sm o n o l a y e r sm a d ef r o mg vc c c s 。t h ea c t i v a t i o nr a t eo fd o s c o c u l t u r e dw i t l lf e t u sf i b r o b l a s te e l lm o n o l a y e ra n ds t oh a dn od i f f e r e n c e f r o mc o n t r o lg r o u p t h e s ei n d i c a t e dt h a to t h e rt y p e so fc e l l sc a nn o ts e c r e t e t h i ss o l u b l ef a c t o r 协p r o m o t et h ea g i n go f m o u s eo o c y t e sl i k ec u m u l u sc e l l s 。 8 1 1 辅c o n d i t i o n e dm e d i am a d ef r o m3 0h e g1 2 hc o c sa g i n gf o r1 2 t l , 1 8 h a n d2 4 hi n2 0 0 1 1 1c z bh a ss t r o n g e ra b i l i t yo np r o m o t i n ga g i n go f d o st h a n3 0 h c g1 2 hc o c sa g i n gf o r6 hi n2 0 0 9 lc z b t h e s ei n d i c a t e dt h a tt h eq u a n t i t y o f t h e 烘i nt h ec o n d i t i o n e dm e d i ai n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ei n c r e a s e d c u l t u r i n gt i m e k e y w o r d s ：c u m u 轴sc e l l s ，o o c y t e ，a g i n g , p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ，m i c e 6 出东农渡大学疆士学健论文 1 前言 蠛乳动物排卵厩努母缨胞大多停滞在第二次减数分裂的中疑( m i i ) ， 受稽残者霰罐激漭使努母缝稳宠戒减数分裂莠窟魂链虢发窘。魏渠雾鸯缎 胞未按时受精，随着卵母细胞在输卵管或体外培养液中停滞时间的延长卵 母细胞的胞质会发嫩某些变化。例如，延长堵游的猪卵母细胞其活化率和 碎囊警鄂秀裹( k i k u c h ie t a l ，1 9 9 5 ) ，在薅蠹老像较长眩鬻豹枣簸努母缨 胞出现不同程度的碎裂和死亡( l a n m a n e t a l ，1 9 8 8 ) 。这种m i i 期卵母细 胞由于在体内或者体外停滞的时间过长而导数质量下降的现象称为卵母 细胞的老化。卵母鳃腿老化的基謦特征就是毅雌激活敏感性的增加、卵母 鲴稳促成熬因子( m p f ) 活毪下降帮疫震鬏糠鹩部分藏戆，最终导致爨繇 细胞受精率下降及辩常的胚胎发育和胚胎死亡。而包括显微操作和体外受 精在内很多研究实黢都需要对体内外成熟卵母细胞进行体外培养，可能公 发生辩母细照弱老健两降低隧瑟戆发弯戆力。尽管我髑已经知遴搂郛器努 丘缁施能够促迸卵母细胞豹老纯，但还不清憩卵丘细胞是邋遥什么方式来 起作用的。为了能够找到抑制卵母细胞老化的最佳方法，商必要对卵丘细 胞倪遴卵母细胞老化的枫理进行翌进一步的研究。 1 1 舞褥缍箍老纯霉l 起熬危害 卵母细胞老化会导致包括人在内的哺乳动物异常的胚胎发育，这些辨 常往被表现为染色体异常，如出现三倍体、嘏倍体、三体贼单体。在人， 卵母缨瞧匏老镬二衾壤热蠡发挂溅产懿发病率( g u e r r e r oe ta 1 ，1 9 7 5 ) 。在猪， 拖延1 2 h 交配就w 大大降低静母细麓的受精率以及由于多精受精面导致 的发商异常和胚胎死亡率的增加( h u n t e r ，1 9 6 7 ) 。仓鼠、小鼠和兔的老化 卵母细胞不论在体内还是体外其受糠率和发育率都大大下降( y a n a g i m a c h i e | a 1 ， 9 6 1 ；a d a m se | a l 一1 9 6 2 ；s m i t h e t 嚣1 ，1 9 8 7 ) 。 t a r i n 等( 1 9 9 9 ) 报道，当对摊卵后1 小时和l o 小时的自然发情小飘 进行人工授精，结果发现排卵聪1 0 小时受精的实验组与排卵后l 小时受 精靛瓣照组耱鞋：妊娠率显著降低、妊娠时阉交矮、殛仔的掇生重降低、绥 仔穗瞧比率增加，并且排郛后l o 小时受精所获得豹f l 谯小鼠出现生长遮 缓和情绪不稳等现稼。 1 。2 激化卵母细胞耀微结构的异常变化 小鼠卵丘细胞通过分泌可溶性因子倨进卵母细胞老化 卵母细胞的老化会导致卵母细胞超微结构的变化，纺锤体旋转和内移 会造成第二极体的滞留( 形成两个雌核，d i g y n y ) ，纺锤体崩解造成细胞 质碎裂。在猪和牛中减数分裂纺锤体是桶状的，并且大约1 0 1 x m 长，然而 在实验用的啮齿类动物中纺锤体较长并且呈梭状，在小鼠中长2 6 3 4 士o 3 i x m ，在大鼠中长1 6 _ ：4 + 0 7g m 。研究证明，猪卵母细胞在老化过程中纺 锤体的极对极( p o l e - t o - p o l e ) 长度显著增加f e i c h e n l a n be ta 1 ，1 9 8 6 ， z e m i c k ae ta 1 ，1 9 9 3 ，n a v a r ac ta i ，1 9 9 4 ，k i me ta 1 ；1 9 9 6 ，s u z u k ie ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，这与之前报道的老化的牛卵母细胞相似( l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。与此相 反，在老化的小鼠卵母细胞中纺锤体的长度缩短。这些细胞骨架行为和特 征的不同可能反映了纺锤体特征的种属差异。 研究表明，在卵母细胞老化过程中，边缘微丝( 负责将纺锤体锚定于 卵母细胞的皮质区) 的密度显著降低( w e b be ta 1 ，1 9 8 6 ) 。k i m 等( 1 9 9 6 1 报道，在老化的猪卵母细胞中减数分裂赤道板通常位于微丝富集区域之 外。在小鼠卵母细胞中也发现这种现象。这些微丝结构的变化可能导致老 化卵母细胞第二极体排出的比例降低，因为极体的排出依赖于细胞骨架的 组装( m a r oe ta 1 ，1 9 8 6 ) 。微管纺锤体极丧失锚定能力和，或纺锤体中微管 组装的不稳定性可能是造成纺锤体伸长的原因，从而导致老化卵母细胞中 染色体的异常分离。 一 与透明带反应和卵质膜反应有关的皮质颗粒的内移和碎裂( s z o l l o s id 1 9 7 1 ；l o n g o1 9 7 4 ) 可能引起多精受精。卵母细胞老化还会导致线粒体的 破坏，导致受精或者孤雌激活后的卵母细胞发生碎裂，线粒体中含有很多 与细胞凋亡有关的组分，而且能够生产a ：r p 作为细胞的能量工厂，因此 线粒体的膜和生产a t p 能力的破坏会对细胞的增殖和存活产生影响。c h i 等( 1 9 8 8 ) 认为小鼠卵母细胞随着培养时间的延长胞质内的a t p 的量持 续下降。在人，卵母细胞的发育能力与胞质中的线粒体浓度有密切的关系 ( v a n b l e r k o m c ta 1 ，1 9 9 5 ) ，而延长培养时间能够降低人卵母细胞内线粒 体膜的通透性( w i l d i n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，线粒体膜的破坏会导致细胞色素c 和其他凋亡组分被释放出来( w a n g ，2 0 0 1 ) 。线粒体功能紊乱的后期阶段 往往伴随着活性氧自由基( r o s ) 的积累，进一步影响了细胞的存活。p e r e z 等( 2 0 0 0 ) 向小鼠卵母细胞内注射经纯化的体细胞线粒体能够抑制老化导 血象农监麦攀骚 上掌覆谂文 致的卵撵缁脆自发碎裂。 1 3 老张翱姆细胞孤雌激溉攀的交他 受黯怒癸母绥魏澈滔熬天然裁激，然嚣转是鹣人王麓激氇鬻激溪爨鸯 缭您势嫠萁笈髯。甄舔激滔蘑子辑究髓黢发育道程中骄发生翡垒纯农形态 学事件。 襄莺镪魏懿强耀激浠方法包瑟糖壤羧裁激帮化学毪刺激。躲避瞧裁激 售摇税截麓激、遴爱绷激殴及龟裁激簿，纯学程裁激霞鏊鹜麓激、渗透嚣 瓣激、离予裁激、麻辩粼处理、敝缀随黧楚理襁爨岛激酶搀杂裁缝理等。 嚣翦主鬻粥化学物质寐激活舜母缀腿。鞭用的化学试剂主要有蒜簿、氯化 德、锈鬻予载薛a 2 3 1 8 7 、离孑霉繁( i o n o m y c i n ) 、臻波嚣 p 醚a ) 、虽鑫 会藤箨馘裁( 壁获琴嚣聚( c h x ) 、瞟岭霉豢( p r o m 萝c i n ) ) 骥投鬣自磷酸 化抑制粼( 6 ，二甲氨熬嘿呤( 6 ，d m a p ) ) 等。他们擞要是通过碍l 怒腿质汽 c a 2 + 浓艘麴魏藏积m p f 滔瞧貔失溪获褥激嚣了粥蹲纲戆，毽爨棒豹途径 窘掰不瓣。己醣鼹爨耀缀蘧黪激灌花懿阕褥舅鼹，大多鼗嚷襞劫妨戆嚣 麓郛母绷臌在禽有7 8 琏的乙醇培养液中培莽5 一? 努钟就可激被激滔，荨l 发琢核形戏，有些激潦蚋郛母细胞绷腿蕊至可以发鸯剥囊胚；6 - d m a p 是 一耪蛋鑫壤辏羧诬掺铡魏，戆疆正蛋海臻酶臻羧豫避嚣蛰截溅p f 襄c s f 戆滔往，霹霹掺裁统键髂影残畦激餐蛋鑫瓣磷酸稳避焉箨每l 辍傣静鼗窭。 兰国成等( 2 0 0 2 ) 使用乙醇结台6 - d m a p 处理小鬣卵母细胞获得较好激 潺效果，黼慧避免了离浓度的乙簿娥疆对郛母鲻魏撩成的损镪。 嚣予侮努藏熬熬獠舞母臻庭，琴捷是在强逡熬；孛嬲激条释下，蒋多 潼 养3 6 1 t 辩舔缩脆静激活攀瞧不越过1 0 ，嚣体岁 培莽 l 重闻超避7 2 小时酶 猪卵母缎臌孤雌激活攀w 达到5 0 戳上( k i k u e h ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。使用s 己醇楚鹫辩蹲缨您5 努镑络念2 r a m6 - d m a p 懿臻6 枣瓣熬激满方寨，楚 理枣鬣h c g 蜃1 2 孛簿鹩掰簿髂蠹羚褥缨琏鼗嚣攀麓2 0 。5 ，瑟簿榉鹣激 活方案处磺h c o 后2 4 小时的体海赣化卵母细胞激灞率为9 8 ；粥此方案 处理体多 戚熬1 4 小时的辩母细黪激溪率为2 5 ，体终残熟1 霹小聪囊熊 c o c 袭c z b 书老豫i 8 夺瓣嚣激摅率为5 9 ，8 ，溺鼗不管髂蠹成熟述整露 步 藏熟麓小鼠卵母爨施，疆雅激疆率豁随簧露龄熬爝加霞增搬( m i a oe t a l ，2 0 0 5 ) 。这些结祭淡暇卵母细胞程老化过程中，激活率会髓蛰老化时 小鼠卵丘细胞通过分泌可溶性因子促进卵母细胞老化 间的延长而逐渐升高，高激活率可作为卵母细胞老化的一个衡量标准。 1 4 老化卵母细胞受精后发生异常c a + 波动 受精能够导致卵母细胞的减数分裂恢复和皮质颗粒的外排，这些重要 事件的发生与受精后卵母细胞内游离的c a 2 + 浓度的急剧变化有关，包括 一个单一的相对长时间c a 2 + 浓度升高和随后短暂的重复的c a 2 + 浓度的升 高，这段时间大约持续几个小时，这种受精时发生的c a 2 + 的暂时变化称 之为ca ：2 + 波动( c u t h b e r t s o n 和c o b b o l d ，1 9 8 5 1m i y a z k ie ta 1 ，1 9 8 6 ) ， 有报道认为，小鼠卵母细胞中第一次c a z + 浓度的升高与卵母细胞皮质颗 粒的胞吐有关，而接下来的c a 2 + 波动则与减数分裂的恢复有关( k l m cc t a 1 ，1 9 9 2 ) 。o z i l 等( 1 9 9 0 ) 报道，兔和小鼠卵母细胞受精后ca _ ”波动 的频率和幅度能够影响原核形成和胚胎的早期发育。d u c i b e l l a 等( 2 0 0 2 ) 认为c a 2 + 波动能够影响小鼠卵母细胞受精后m p f 活性的下降和母源 m r n a 的活化。因此c a 2 + 波动不仅能引起皮质颗粒的外排和姐妹染色单 体分离及排出第二极体，而且对于卵母细胞受精后正常的胚胎发育是非常 关键的。 t a k a h a s h i 等( 2 0 0 3 ) 通过比较h c g 后1 2 5 小时的新鲜卵母细胞和h c g 后1 8 5 - 2 2 5 小时的老化卵母细胞受精后的c a 2 十波动，发现老化卵母细胞 受精后ca j 2 + 波动的频率增加，同时c a 2 + 波动的幅度显著下降。老化卵母 细胞受精后异常c a 2 + 波动的变化可能是由于老化卵母细胞内质网再吸收 c a 扑的速度下降造成的。而内质网再吸收c a 2 + 的速度与a t p 的量有关， 所以可能是由于老化导致了线粒体的损伤从而使线粒体产生a t p 的能力 降低，以至造成内质网对c a 2 + 再吸收的速度降低。 1 5 老化导致卵母细胞凋亡 细胞凋亡，即a p o p t o s i s ( a p o - p t o s i s ) ，源自古希腊语，意指花瓣或树叶 的脱落、凋零。细胞凋亡是一个主动由基因决定的自动结束生命的过程。 由于细胞凋亡受到严格的遗传机制决定的程序性调控，所以也常常被称之 为细胞的编成性死亡( p r o g r a n u n e dc e l ld e a t h ，p c d ) 。p c d 最初是发育生 物学上提出的概念，其含义是发育过程中( 例如幼虫发育成成虫) 发生某 类细胞( 例如肌肉细胞) 的大量死亡。而这类死亡需要一定的基因表达。 m a r s t o n 和c h a n g ( 1 9 6 4 ) 发现，老化1 2 小时的小鼠卵母细胞后受精2 4 1 0 山东农业大学硕= 匕学位论文 小时后出现大量的畸形和碎裂的合子。t a k a s e ( 1 9 9 5 ) 报道，体内成熟的 卵母细胞在体外培养一段时问后发生胞质碎裂，通过脱氧核苷酸转移酶末 端标记( 1 1 腿l ) 分析表明，胞质碎裂的同时也发生了d n a 的碎裂。 k i k u c h i 等( 2 0 0 2 ) 报道，体外成熟培养7 2 小时后的猪卵母细胞有一部分 发生自发激活，在这部分自发激活的卵母细胞中有7 s _ 3 发生碎裂。g o r d o 等( 2 0 0 2 ) 将小鼠卵母细胞在体外老化到h c g 后3 2 小时后，注入精子胞 质因子( s p e r mc y t o s o l i cf a c t o r ，s f ) 、a d e n o p h o s t i na 或精子，所引起的 c a 2 + 波动的幅度和持续时间都发生降低，而且卵激活引起的弱的钙离子波 动不是启动胚胎发育，而是引起卵母细胞的凋亡。老化卵母细胞的胞质变 化可能与其对凋亡的敏感性有关，当将刚排出魄卵母细胞与老化并注射 s f 的卵母细胞相融合时，可抑制老化卵的碎裂。在测定凋亡调节蛋白b c l 2 和b a xm r n a 和蛋白水平时发现，老化卵母细胞的b c l 2m r n a 和蛋白水 平明显下降，而b a xm r n a 和蛋白水平没有明显变化。这些结果表明， 调节钙离子与抗或促凋亡蛋白平衡的一种或几种重要的胞质分子，在卵母 细胞老化过程中会发生丢失或失活，从而将受精时钙离子信号转化成凋亡 诱导信号。 受精在老化卵母细胞中引发的c a 2 + 波动能够导致卵母细胞的凋亡： 首先，ca _ “波动的启动可能导致了内质网内c a ，的消耗，内质网中较低 的c a ”浓度在体细胞中能够抑制蛋白质的合成并能够有效启动细胞的死 亡( s o b o l o f f 和b e r g e r ，2 0 0 2 ) ，这些作用能够影响胚胎发育。其次，线 粒体能够储存c a 2 + 并且参与细胞中c a 2 + 波动的产生。正常条件下，三磷 酸肌醇( 口3 ) 通过结合三磷酸肌醇受体( i p 3 r s ) 调节c a 2 + 浓度的增加， 同时刺激了线粒体的功能和a t p 的生产。老化的卵母细胞三磷酸肌醇受 体可能导致细胞色素c 从线粒体中释放，线粒体膜的通透性降低。因此， 老化卵母细胞中较低的a t p 和b c l 2 的量可能作为一