（微生物与生化药学专业论文）面包酵母转化大茴香醛合成手性医药中间体初探.pdf

摘要 摘要 大茴香醛( c h 3 0 c 6 h 4 c h o ，分子量1 3 6 1 5 ，c a sn o 1 2 3 1 1 5 ) 是一种天然来源的苯 甲醛的结构类似物。以大茴香醛为底物，运用生物转化技术，在酵母体内醇脱氢酶 ( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，a d h ) 和丙酮酸脱羧酶( p y r u v a t ed e c a r b o x y l a s e ，p d c ) 的催化 下，可以生成非手性产物对甲氧基苯甲醇0 m e o b a ) 和手性产物( 1 r ) 1 羟基1 ( 4 甲氧苯基) 丙酮2 ( l - p m e o p a c ) 。l - p m e o p a c 经a d h 的进一步转化，便可生成合成 良性前列腺增生症治疗用药物但) 坦舒洛辛( t a m s u l o s i n ) 的关键手性中间体原料 ( - ) 一( 1 r ，2 s ) 1 对甲氧苯基- 1 ，2 - 丙二醇一m e o p p d a ) 。 为了调节酵母转化大茴香醛的体系中a d h 和p d c 对底物大茴香醛的竞 争，以便获得更多的手性产物p m e o p p d a ，本文借助于t l c 法、比色法和g c m s 法，对酵母转化大茴香醛体系进行了初步探索研究，并从转化菌种、转化温度、转化时 间、蔗糖浓度、大茴香醛浓度、菌种活化时间、起始p h 、转速、乙醛、助溶剂、固定 化等方面对酵母转化大茴香醛合成p m e o p p d a 的条件进行了优化，得出了较为理想的 p m e o p p d a 的合成条件。最后对所得的产物p m e o p p d a 进行了分离纯化研究，并 对其进行了纯度检验和结构鉴定。 结果表明：相对于酿酒酵母和啤酒酵母，面包酵母( b a k e r sy e a s t ，s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 对温度的要求低( 2 9 ) ，蔗糖需求量少( 8 0g l ) ，所需的活化时间短( 1h ) ，对底 物大茴香醛的转化速率快，转化生成的手性产物多，是理想的转化用酵母菌种。并且还 发现面包酵母在2 9 ，添加蔗糖8 0g l ，起始p h 为4 o ，转速8 0r m i n ，活化4 0m i n 后，加入乙醇3 ( v v ) 和大茴香醛0 0 8m o l l ，转化1 4h 时生成的p m e o p p d a 较多， 在该体系的产物组分中，副产物p m e o b a 的含量为6 3 7 0 ，目标手性产物 p - m e o - p p d a 的含量达2 7 7 6 ，两者的比例可降至2 2 9 5 。 合成得到的产物p m e o p p d a 为无色针状结晶，得率1 0 1 2 ，经质谱、红外光谱、 紫外光谱、核磁共振( 1 hn m r ) 等检验，确定该结晶产物为p m e o p p d a ，纯度近于9 5 ， 旋光性【c 】d z 4 = 5 2 o 0o 0 0 5 ，c h c l 3 ) ，熔点为9 8 ，该物质不溶于水，不溶于正己烷和 甲醇，能溶于乙酸乙酯和氯仿。 关键词：酵母，面包酵母，大茴香醛，( ) - ( 1 r ，2 s ) 一1 对甲氧苯基一1 ，2 一丙二醇 a b s t r a c t a b s t r a c t p - a n i s a l d e h y d e ( p c h 3 0 c 6 h 4 c h o ，m w ：1 3 6 ，15 ，c a sn o 12 3 - 1l 一5 ) ，i sak i 蕊o f a n a l o go fb e n z a l d e h y d ef o u n df r o mn a t u r a lr e s o u r c e s i tc a l lb eb i o t r a n s f o r m e dt oa c h i m l p r o d u c tp - m e o b e n z y la l c o h o l ( p - m e o - b a ) a n dc h i r a lp r o d u c t ( 1 震) 一1 - h y d r o x y - 1 - ( 4 一m e t h o x y p h e n y l ) p r o p a n - 2 一o n e ( l - p m e o p h e n y la c e t y lc a r b i n o l ，l - p - m e o - p a c ) b yt h e a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( h d h ) a n dt h e 哪a t ed e c a r b o x y l a s e ( p d c ) e x i s t e di nt h ey e a s t , r e s p e c t i v e l y a n d t h el - p m e o - p a cc a r lb ef u r t h e rt r a n s f o r m e d t o ( 一) 一( 1r ，2 s ) - l 一( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) p r o p a n e l ，2 一d i o l 一m e o p p d a ) ，t h ek e yc h i r a li n t e r m e d i a t e f o rt h e s y n t h e s i so f 冰) 一t a m s u l o s i n ，ad r u gu s e df o rt h es y m p t o m a t i ct r e a t m e n to fb e n i g np r o s t a t i c h y p e r p l a s i a i no r d e rt or e g u l a t et h er e l a t i v ea c t i v i t yo fa d 嚣a n dp d cc o e x i s t e di nt h ew h o l ec e l l o fy e a s t - m e d i a t e db i o t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mt o w a r d st h es u b s t r a t eo fp a n i s a l d e h y d e a n d i m p r o v et h ec h i r a lp h a r m a c e u t i c a li n t e r m e d i a t ep r o d u c t i o n , e s p e c i a l l yt h ep r o d u c to f p - m e o p p d a ，t h eb i t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a so p t i m i z e d ，f r o mt h ea s p e c t so fy e a s ts p e c i e s ， t e m p e r a t u r e ，b i o t r a n s f o r m a t i o nt i m e ，c o n c e n t r a t i o n o f s u c r o s e ，c o n c e n t r a t i o n o f p - a n i s a l d e h y d e ，c e l la c t i v a t i o nt i m e ，i n i t i a lp h ，r o t a r ys p e e d ，a c e t a l d e h y d e ，a u x i l i a r ys o l v e n t s ， c e l li m m o b i l i z a t i o n ，w i t ht h eh e l po ft l c ，c o l o r i m e t r ya n dg c m sa n a l y s i s a n df i n a l l y ，t h e c h i r a lp r o d u c to fp m e o p p d aw a ss e p a r a t e d ，p u r i f i e da n dc r y s t a l l i z e d 翻锵p u r i t yo ft h e c r y s t a l sw a s c h e c k e da n dt h es t r u c t u r ei d e n t i f i c a t i o nw a sc a r r i e do u tc o n s e q u e n t l y 曩瓣o p t i m i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：b a k e r sy e a s tw a st h ei d e a ly e a s tt o t r a n s f o r mp - a n i s a l d e h y d ei n t oc h i r a lp r o d u c t s ，f o ri t sl o w e rt e m p e r a t u r er e q u i r e m e n t s ( 2 9 4 c ) ， s h o r t e ra c t i v a t i o nt i m e ( 1 蟛，h i g h e rc o n v e r s i o nr a t e ，l o w e rd e m a n do fs u c r o s e ( s 0 班) a n d h i g h e rc h i r a lp r o d u c t i o n ，c o m p a r e dw i 也s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n db r e w e r sy e a s t f u r t h e rm o r e ，t h ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o nf o rt h ec h i r a li n t e r m e d i a t ep r e p a r a t i o nb yb a k e r s y e a s tw a sa tt h et e m p e r a t u r eo f2 9 ，s u c r o s e8 0 班，i n i t i a lp ho f4 0 ，a g i t a t i o no f8 0r r a i n ， a f t e r4 0r a i nf o rc e l la c t i v a t i o n 。a d d i n ge t h a n o l3 ( v v ) a n dp - a n i s a l d e h y d eo 0 8m o l l f e r m e m i n gf o r14h r s ，t h ec o m p o s i t i o no fp r o d u c t sw a sg o o d ，b y - p r o d u c to fp - m e o b aw i t h t h ec o n t e n to f6 3 7 0p e r c e n t ，w h i l ep m e o p p d ar e a c h i n gt h ec o n t e n to f2 7 ，7 6p e r c e n t ，a n d t h er a t i ob e t w e e nt h et w o & s c e n d e dt o2 2 9 5 。 t h ec h i r a lp r o d u c t , p - m e o p p d a ，i sc o l o r l e s sn e e d l ec r y s t a l s ，y i e l d10 12 ，w h i c hw e r e c o n f i r m e dt ob ep - m e o - p p d ab ym s ，i r , 巩n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( 1 hn m r ) a n d o t h e rt e s t s h i g hp u r i t yu pt o9 5 ，【仅 d 2 4 = 一5 2o ( co 0 0 5 ，c h c l 3 ) ，m e l t i n gp o i n to f9 8 ，i t 幽e sn o td i s s o l v ei nw a t e r , n e i t h e ri nh e x a n ea n dm e t h a n 0 1 b u ti tc a nb ed i s s o l v e di n a c e t o a c e t a t ea n dc h l o r o f o r n l k e y w o r d s ：y e a s t , s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，p - a n i s a l d e h y d e ，( 一) - ( 1 r ，z s ) 1 一( 4 一m e t h o x y p h e n y 1 ) p r o p a n e 一1 ，2 一d i o l 专用术语注释 专用术语注释 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：i 虱趣趣 日 期：趣2 ：幺主! 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且拳人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：z 习趣盔导师签名：2 圣趁 日 期：翮铲孑口 第一章绪论 第一章绪论 1 1 本课题的研究背景 1 1 1 手性医药中间体p m e o p p d a 的应用前景 手性是自然界最重要的属性之一，也是生命物质区别于非生命物质的重要标志。自 然界中构成生命体的基础物质核苷酸、氨基酸和单糖以及由它们构成的生物大分子核 酸、蛋白质和糖类都具有独特的手性特征。许多物理、化学、生物功能的产生都起源于 分子手征性的精确识别和严格匹配，例如酶催化的高度化学、区域和立体选择性作用， 手性药物的手性对其生物应答关系等，所以分子手性识别在生命活动中起着极为重要的 作用。手性直接关系到药物的药理作用、临床效果、毒副作用、药效发挥及药效时间 等。正是由于药物和其受体之间的这种立体选择性作用，使得药物的一对对映体不论是 在作用性质还是作用强度上都会有差别。在2 0 世纪6 0 年代，欧洲曾以消旋体的反应停 ( t h a l i d o m i d e ) 作为抗妊娠反应的镇静剂，一些妊娠妇女服用此药后出现多例畸变胎儿。 后经研究证实饵) 构型才真正起镇静作用，而( 固构型则有强致畸作用。其它一些手性药 物的另一异构体表现不良作用的例子也很多【2 】。 随着人们对手性药物认识的不断深入，手性药物的市场逐年扩大，手性药物的研究 目前已成为国际新药研究的新方向之一，各国政府和各大医药公司、实验室纷纷投入巨 资，在手性药物制剂、手性原材料和手性中间体等领域进行研究开发，抢占世界手性药 物市场，形成手性技术的开发热潮。据不完全统计，截至2 0 0 2 年，欧洲已有1 3 6 个生 物催化的过程应用于产业，而且按指数规律急剧增长，其中9 0 以上为手性化合物的生 物催化反应1 3 。7 】。面对发达国家和地区生物催化合成手性化合物技术迅速发展的国际形 势，本课题将致力于生物催化法合成手性化合物( ) ( 1 r ，2 s ) 1 对甲氧苯基1 ，2 丙二醇 一m e o p p d a ) 的研究，p m e o p p d a 是合成良性前列腺增生症治疗用药物根) 坦舒洛辛 ( t a m s u l o s i n ) 的关键原料，俾) - 坦舒洛辛首先由y a m a n o u c h ip h a r m a c e u t i c a l s 研发，并很快 作为一种单一对映体流通于市场，2 0 0 7 年，d a n i e l a a c e t t i 等基于生物催化的对映选择性， 设计了种合成具有药效活性的饵) 坦舒洛辛的新途径，此合成途径涉及关键手性中间 体p m e o p p d a ，见图1 1 ，不涉及胺的反应，亦不涉及迷幻剂【8 , 9 1 ，是值得推广的合成 方法。 圆- 塑舒格辛 图1 1 僻) 一坦舒洛辛的合成路径 f i g 1 1t h es y n t h e t i cp a t h w a yo f ( r ) 一t a m s u l o s i n 江南大学硕士学位论文 1 1 2 酵母在生物催化手性合成中的应用 生物催化( b i o c a t a l y s i s ) ，也称生物转化( b i o t r a n s f o r r n a t i o n ) ，是指应用生物反应器( 酶 及多酶系统，包括微生物、动植物细胞等) 对前体化合物进行结构修饰和改造，合成新 型的有机化合物。其实质是利用生物体本身产生的酶对外源化合物进行酶催化反应，其 优点是反应条件温和( 常温、常压) ，反应速率快，高度的立体对映选择性，反应步骤少， 设备简单，生产安全，收率高，环境友好，还可用于合成化学法难以合成的物质，特别 是复杂的天然活性物质。生物催化，在天然次生代谢产物的修饰、有机化合物的不对称 合成、对映异构体的拆分以及以天然活性成分为基础的创新药物研究与开发等方面显示 出巨大的应用潜力，它符合2 1 世纪“绿色化学 的要求，被认为是手性化合物生产取得 突破的关健技术 1 0 - 1 5 j 。 酶法获得手性化合物的研究和开发已取得长足的进步，但目前能真正用这种方法 制各并用于工业化生产的手性化合物类型不够多，主要原因有：( 1 ) 可以利用的酶制剂品 种有限。自然界中已经发展的酶制剂约有2 5 0 0 0 多种，其中只有1 5 0 种得到应用开发，但 工业上有用的酶有5 0 6 0 种，而大量制造与应用开发的还只限于淀粉酶、蛋白酶、葡萄 糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等1 0 多种，且大部分是水解酶类。( 2 ) 酶比较 娇嫩，容易失活。( 3 ) 酶制剂相对较贵。特别是对氧化还原酶来说，由于其要完全发挥作 用需要价格昂贵的辅酶因子参加，在工业上很不经济【l j 。近年来直接以微生物细胞为催 化剂获得手性化合物的研究取得了很大进展。 与酶法相比，微生物法有以下优点：( 1 ) 有利于提高酶的稳定性，延长催化剂的使用 寿命。许多酶特别是胞内酶对外界环境相当敏感，对p h 、温度、底物、产物、离子强度 及流体剪切等有较高要求，容易失活。菌体细胞是酶的天然载体，胞内环境可以增强酶 对反应诸因素的适应性从而增加使用的稳定性。( 2 ) 降低生产成本。微生物是取之不尽的 酶源，依靠其增殖培养可以保证酶的充分供给，反应中甚至可以使用死亡的细胞，只要 酶未失活。( 3 ) 菌体细胞的使用可以避免酶的分离、提取和纯化等繁琐程序从而简化工艺。 ( 4 ) 对于较复杂的反应，微生物可利用其体内精巧的酶系进行催化，避免副产物的形成。 ( 5 ) 相对于需要辅酶方能起作用的酶而言( e g ：氧化还原酶) ，由于微生物细胞内含有辅助因 子，其优点更为明显。此外菌体细胞可以减少一些过渡金属元素对酶的失活作用l l 加挎j 。 生物催化，尤其是直接以微生物细胞为催化剂获得手性化合物，在手性合成中占有 很重要的地位，日益引起了人们的广泛关注和兴趣，逐渐发展成为生物学家和化学家们 共同关注的合成方法，我国国家自然科学基金委在“十五”期间将这方面的研究作为重 点资助和优先资助领域 2 0 2 h 。 酵母作为世界上研究最多的微生物之一，是当今生物技术产品研究开发的热点和现 代生物技术发展、基因组研究的模式系统，同时也是生物催化中常用的一种微生物。工 业上最常用的酵母属菌种是面包酵母( b a k e r sy e a s t ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，其安全 不产生有毒产物，生长快、价廉易得，无需特殊设备，可在普通实验室中进行生物催化 反应。体内含有脱氢酶、酯酶、丙酮酸脱酶及烯醇酸( 酯) 还原酶等多种能催化不对称合 成反应的酶类，催化底物的范围非常广。此外使用全细胞面包酵母催化可省去昂贵的单 2 第一苹绪论 一酶分离纯化费用，更重要的是细胞内含有氧化还原反应所需的辅助因子n a d ( p ) h 及其 再生系统，只需加入廉价的碳源就可以进行辅酶再生，因而在不对称合成领域具有广泛 的应用前景，受到广泛关注【1 9 ，2 2 。此外，2 0 世纪8 0 年代以来，我国酵母工业取得了跨越 式发展，拥有了畅销全球的自主创新品牌，酵母产品的研究、生产和应用达到了国际先 进水平，其中规模最大的安琪酵母股份有限公司。我国已成为全球重要的酵母生产国和 供应国，2 0 0 5 年度中国酵母产品出口2 万多吨，实现出口创汇5 0 0 0 多万美元。目前，酵 母转化培养体系及酵母酶系研究已成为国内外有机合成化学和生物技术研究的新的研 究热点和生长点，并广泛应用于医药、食品、化工工业【2 3 1 。 1 1 3 酵母转化大茴香醛的研究进展 近年来有关生物转化苯甲醛合成左旋麻黄素的手性前体l 苯基乙酰基甲醇( l p a c ) 的研究报道颇多，转化机理及代谢途径的研究已相当成熟 2 2 , 2 4 , 2 5 1 。酵母催化苯甲醛与乙 醛的联姻反应得到合成麻黄素的前体，是第一个实现工业化的酵母催化不对称合成反 应，丙酮酸酸脱羧酶( 帅a t ed e c a r b o x y l a s e ，p d c ) 是催化这类反应的重要酶类，它可 以使醛与丙酮酸先缩合再脱二氧化碳制备l 苯基乙酰基甲醇( l p a c ) 2 5 - 2 7 】，图1 2 。 p t r u v a t e 。d e c a 由o x y l a s e + h 弋 c 0 2 月) p h e n y l a c e t y l c a r b i n o l 【( 1 睁p a c l 月 - p 心 ? 鬻瓣害怕 1 如口h g i 又、c h 3 _ | l ，i i 2 ) h p n h c h 3 f ，s 2 s e p h e d r i n e = + - p s e 刊。 糖扣e d d 图1 2c r ) 一p a c ，麻黄素和伪麻黄素的合成 f i g 1 2p r o d u c t i o no f ( r ) - p a c ，e p h e d r i n ea n dp s e u d o e p h e d r i n e 早在1 9 2 1 年，n e u b e r g 和h i r s c h 就利用酵母发酵，由苯甲醛和丙酮酸制得了l p a c ， 但其中的机理一直没有得到诠释。直至u 1 9 9 1 年，d a v i d 等人通过实验证明了是丙酮酸 脱羧酶，在t p p 和镁离子的辅助作用下，将丙酮酸脱羧，尔后与苯甲醛缩合而成。随着 丙酮酸脱羧酶x 射线衍射图的诞生，及其三维空间构象的确定，丙酮酸脱羧酶中的氨基 酸残基、t p p 与反应底物之间的相互作用，得到了进一步的阐明，反应机理如图1 3 所示。 丙酮酸脱羧酶的谷氨酸残基上的羧基与t p p 相互作用，使t p p 噻唑环上的2 位碳原子成为 碳负离子，碳负离子向丙酮酸的羰基发起亲核进攻，丙酮酸进而脱羧，生成的中间产 物碳负离子烯胺，或进一步与苯甲醛发生聚合反应生成l p a c ，或分解成t p p 和乙醛， 洲o9 x 一鼍 _ ( ( f 阳 乜 h + 灿 必h扩。凡蝴儆洲 9 一删 9 江南大学硕士学位论文 最后的分解反应是可逆的，由于反应体系中含有乙醛、苯甲醛，故会有少量的副产物乙 偶姻、2 羟基苯基乙基酮( 2 h p p ) 、苯偶姻的产生【2 8 】。 矿l r j 丫o 。 鬻? 欢 耗。 e 早r ， 托_ ，c m 蚓3 嚣归砰 矿凡 嘲 一l 一础 e 酶p 龄小哆一础 轷= 孤e 晦 图1 - 3 丙酮酸脱羧酶催化酮酸脱羧生成a 一羟基酮的反应途径 f i g 1 - 3 t h er e a c t i o np a t h w a yo fe n z y m a t i c 仅k e t oa c i dd e c a r b o x y l a t i o na n df o r m a t i o no fc t - h y d r o x y k e t o n e sb yp d c 酵母体内的醇脱氢酶( y e a s ta l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，y a d h ) ，也是重要的生物催化剂 之一，它以n a d 十n a d h 为辅酶，可逆催化醇和醛酮之间的氧化还原反应，其中醇氧化 过程属于序列随机机理，辅酶和底物醇随机与酶结合，而醛或酮的还原过程是序列有序 的印。3 2 j 。y a d h 本身为四聚体，单个亚基肽链含3 4 7 个氨基酸残基，亚基分子量3 5 0 0 0 ， 每个亚基又都由两个结构域组成，辅酶结合结构域( 又称生物有机催化结构域) 和催化活 性结构域( 又称生物无机催化结构域) ，辅酶结合结构域具有r o s s n m a n 折叠，能通过氨 基酸残基上的官能团与辅酶相互作用而使辅酶( n a d + n a d h ) 结合在醇脱氢酶上，催化 活性结构域结合的催化活性z n z + 能与许多底物相结合，这两个结构域大小不等，催化活 性结构域的氨基酸数占整个肽链的6 0 ，辅酶结合结构域占4 0 。y a d h 对底物专一性 强，对乙醇及其他直链伯醇活性较高，只对少数仲醇和侧链烷醇具有活性【3 孓3 6 1 。 以大茴香醛为底物，经生物转化得到相应手性纯产物的研究目前国内尚未见报道， 国外也仅零星报道【8 , 3 7 , 3 8 】。参照苯甲醛的生物转化机理和近年国外对生物转化大茴香醛 的研究】，得出大茴香醛的生物转化情形，见图1 _ 4 ，其中大茴香醛会在p d c 作用下生 成( 1 r ) - 1 一羟基一1 一( 4 一甲氧苯基) 丙酮2 ( l - p m e o p a c ) ，而l - p m e o p a c 会在醇脱氢酶 ( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，a d r 0 作用下进一步转化生成p m e o p p d a 。 1 9 8 9 年，l o n ga 等u 驯曾对面包酵母转化大茴香醛合成l 节。m e o 。p a c 进行过研究，之 后鲜有报道。2 0 0 7 年，d a n i e l aa c e t t i 等【8 】采用面包酵母，在葡萄糖的条件下，转化大茴 香醛合成p m e o p p d a ，用作合成良性前列腺增生症治疗用药物( 尺) 坦舒洛辛 ( t a m s u l o s i n ) 的原料。在以上的转化体系中，手性产物的产率皆不高，面包酵母使用量偏 多，大茴香醛与面包酵母比例为1 ：1 0 ( ，转化时间长( 7 21 1 ) ，生成副产物对甲氧基苯 4 必 悯吼嚣 第一章绪论 甲醇与目标手性产物p m e o p p d a 的比例为7 ：3 【8 】，有必要对酵母转化大茴香醛生成手性 产物p - m e o p p d a 的体系进行优化，提高手性产物p m e o - p p d a 的产量。 b c o 件m e t l l o x 3 f ，h e n y o m e t h a l m p - m t 0 b a 峙洲 g 写詈哪们i 8 c i d 刚嗍 量喜j r c d 夏e c ；r b o x y l a s e ，。 q h 删弋n 旆删3 h ：| cl |1 4 r l - 2 0 n - 0 瓢c 1 ；i r z - o r i ：牛m 出o x y p i m n y p a o r o p a n , p 1 叠do i p m t o - p i 叠a 图l - 4 大茴香醛的生物转化途径 f i g 1 - 4t h eb i o t r a n s f o r m a t i o np a t h w a y so f p a n i s a l d e h y d e 1 2 立题意义 大茴香醛，学名对甲氧基苯甲醛p a n i s a l d e h y d e ，c h 3 0 c 6 i - h c h o ，分子量1 3 6 1 5 ， c a sn o 1 2 3 1 1 5 ) ，是天然来源的苯甲醛的结构类似物，目前在我国己实现工业化生产。 有关酵母转化苯甲醛合成l p a c 的研究已相当成熟 6 2 6 1 。但是以大茴香醛为底物，经酵 母转化得到相应手性产物的研究目前国内尚未见报道，国外也仅零星报道【3 7 j 引。在所见 报道的转化体系中，手性产物的产率皆不高，文献报道的酵母量偏多，转化时间又长【引。 为了参与国际水平的竞争，弥补国内生物法合成p m e o p p d a 的研究空缺。本课题借助 于t l c 法、比色法和g c m s 法，对酵母转化大茴香醛的手性合成体系进行了优化，得 出了p - m e o - p p d a 的理想合成条件，并且对所得的产物p m e o p p d a 进行了分离纯化 和结构鉴定方面的研究，为今后实现工业化做了必要准备；从学术上讲，本课题是国内 首次以大茴香醛为生物催化的底物合成手性化合物，也是国内首次合成p m e o p p d a ， 有一定的创新性；生物催化法合成具有光学活性化合物顺应了当今手性合成的发展方 向，有助于推动我国国民经济的发展，促进我国医药与生物技术、资源节约和环境友好 等可持续发展特征的生物制造产业尽微薄之力。 帅伽p 盯 a 1 弓t ) - de眚dro4墨毪吣 江南大学硕士学位论文 1 3 本课题研究的主要内容 1 酵母转化大茴香醛的初步探索 2 面包酵母转化大茴香醛合成p - m e o - p p d a 的条件优化 3 产物p m e o p p d a 的分离纯化及结构鉴定 6 第= 章酵4 转化太自香醛的初步探索 第二章酵母转化大茴香醛的初步探索 2 1 前言 大茴香醛是天然来源的苯甲醛的结构类似物，有关酵母转化苯甲醛合成产物l - p a c 的研究已相当成熟，但以大茴香醛为生物转化底物的研究极少。据苯甲醛的生物转化机 理推测p “，大茴香醛经酵母转化后会生成对甲氧基苯甲醇( p m e t h o x y b e n z y a l c o h 0 1 p m e o - b a ) 和l - p m e o p a c ，而l - p - m e o - p a c 又可继续被转化生成p - m e o p p d a ， 三种产物的结构式见图2 1 ，这里大茴香醛转化生成l - p - m e o p a c ，而l - p - m e o - p a c 进而转化为p - m e o p p d a 的路径可称之为手性合成途径，该手性合成途径是本课题的研 究重点。为切实了解酵母转化大茴香醛的代谢途径，把握其转化机理，为优化手性合成 条件的研究做好铺垫，本章建立了酵母转化大茴香醛体系，井采用薄层层析法( t l c 法) 、 碱性a 一萘酚显色法和气质联用法( g c m s 法) ，对该转化体系生成的产物进行了测定。 此外，不同菌种的体内代谢酶系会有差异，相同菌种在不同的外界条件下，酶系活 性亦会有差异，酶系活性的差异必然会导致转化性能的不同_ 4 ”。本章对目前所能获得 的酵母菌种，从转化温度、转化时间、蔗糖浓度、大茴香醛浓度、菌种活化时间等方面， 对其转化大茴香醛合成手性产物的性能进行了考察和评价，得出了理想的转化用酵母菌 种，完成了对酵母转化大茴香醛的初步探索。 ( a 】c o )( o ) 图2 - 1 p m e o b a ，l - p - m e o - f a c 和p m e o p p d a 的立体化学结构 f i g2 - 1 n 砒e d i m e n s i o n a lc h e m i c a ls r x t l c l u t _ eo f p m e o b a ，l - p - m e o - p a ca n d p - m e o p p d a ( 曲p m e o b a ；( b ) l - p - m e o - p a c ；( c ) p - m e o - f p d a 2 2 材料与方法 2 2 1 仪器和试剂 试剂：大茴香醛( 纯度9 5 ，国药集团化学试剂有限公司) ；硅胶g f 2 5 4 ( 青岛海洋化 工有限公司) ：肌酸( 国药集团化学试剂有限公司) ：“一萘酚( 上海亭新化工厂) 。 仪器：恒温振荡器( 金坛市新航仪器厂) w f h 一2 0 3 8 三用紫外分析仪( 上海精科实业 有限公司) ；紫外可见分光光度计u v - 2 4 型( 日本岛津公司) ：u n i c 2 0 0 0 可见分光光度计 ( 上海尤尼科仪器有限公司) ；申科r - 2 0 1 旋转蒸发器( 上海申顺生物科技有限公司) ： t r a c em s - g c 联用仪( f i n n i g a n 仪器公司) 。 江南大学硕士学位论文 2 2 2 菌种和培养液 菌种：安琪高活性干酵母( 面包酵母，b a k e r sy e a s t ，m ) ；安琪酿酒高活性干酵母( 酿 酒酵母，n ) ；安琪啤酒用高活性干酵母( 啤酒酵母，b r e w e r sy e a s t ，p ) ，皆购于安琪酵母 股份有限公司。 培养液：1 0 0g l 蔗糖，1 0g l ( n i - - 1 4 ) 2 s 0 4 ，1 5g l n a 2 h p 0 4 ，自然p h5 8 。 2 2 3 酵母转化大茴香醛生成产物的初探 向盛有1 0 0m l 培养液的锥形瓶( 规格2 5 0m l ) 中添加5g 面包酵母，置3 5 水浴摇 床中活化1 5h ，转速1 0 0r m i n ，活化完成后加入大茴香醛1m l ，分别转化2h 和4h ， 之后将转化液进行抽滤，得澄清的转化滤液，然后分别用等体积的乙酸乙酯萃取三次， 合并乙酸乙酯有机相，减压蒸除乙酸乙酯得粗产物，并用g c m s 法检测粗产物组成。 g c m s 法测定条件：进样2 5 0 ；柱温6 0 停留o 5m i n ，以每分钟1 5 的速度升 至2 5 0 ，停留8m i n ；载气h e ；流速1 2m l m i m 传输线2 5 0 ；离子源2 0 0 ；e r 十一7 0 e v ，质量扫描范围3 3a l n u _ 4 5 0a m u 。 2 2 4m 、n 、p 转化条件的考察 以大茴香醛的转化速率和手性产物的生成量为评价标准，对现有的面包酵 母( m ) ，酿酒酵母( n ) ，啤酒酵母( p ) ，依次从转化温度、转化时间、蔗糖浓度、大 茴香醛浓度、酵母活化时间等方面，进行综合考察和比较，选出对大茴香醛的转 化速率快，同时转化生成手性产物量较多的理想转化菌种，即p d c 酶活相对 较高的菌种。 其中大茴香醛的转化速率可通过t l c 法追踪检测大茴香醛的耗光时间表示， 但是产物p m e o p p d a 因在转化体系中的干扰较多( e g - 多羟基的糖类物质及其它醇类 物质p m e o b a 等) ，不好用一般的评价方法直接测定，而长期采用g c m s 法测 定代价较高，我们最终选择手性合成途径中，p m e o - p p d a 的合成前体l - p - m e o p a c 为间接评价标准，即通过碱性0 【萘酚显色法追踪测定l 哆m e o p a c 的生成情况【2 6 ，4 2 4 5 1 ， 间接反映p m e o p p d a 潜在的生成状况。 ( 1 ) t l c 法：取0 2m l 转化液，加入0 4m l 乙酸乙酯，轻轻混匀，静置分层，然后毛 细管吸取乙酸乙酯层，在5 1 8 5c m 硅胶g f 2 5 4 薄层板上点样，在展开剂环己烷：无水乙 醚= 4 ：6 ) 中展开，展开后将溶剂挥干，于紫外荧光灯( 波长2 5 4n m ) 下观测暗斑。 ( 2 ) 碱性0 【萘酚显色法：取1m l 澄清过的转化液，分别加入lm lo 5 肌酸溶液和1 m l 5 0 【萘酚溶液( 5g 仅萘酚溶于1 0 0m l 的2 5m o l l 的氢氧化钠溶液，4 。c 暗处存放) ， 充分混匀，2 8 暗处显色2h ，稀释2 0 倍，测定特征吸收波长下的吸光度。 2 2 4 1l - p m e o p a c 的特征吸收波长扫描 处理样品：( a ) 加酵母不加大茴香醛的澄清的发酵滤液；( b ) 大茴香醛的乙醇溶液；( c ) 对甲氧基苯甲醇的乙醇溶液；( d ) 对甲氧基苯甲酸的乙醇溶液；( e ) p - m e o - p p d a 的乙醇 溶液；( f ) 2 n 大茴香醛和酵母的澄清的转化滤液。采用碱性0 c 萘酚法对各样品显色处理l n 6 乃0 6 】：分别取1m l 检测样品，加入1m lo 5 的肌酸溶液和1m l 5 的a 萘酚溶液，充 8 墨三兰壁主要些茎堕重壁望塑生堡雯 分混匀，统一暗处显色，之后，以空白碱性n 萘酚显色溶液为参比，依次扫描各显色样 品，确定l - p m e o p a c 的特征吸收波长。 2 2 4 2l - p m e o - p a c 标准曲残的绘制 用无水乙醇将含量为1 08 5 的l - p m e o p a c 样品( 含对甲氧基苯甲醇杂质，对测 定无干扰) 稀释成一系列浓度梯度，碱性n 一萘酚显色法测定特征吸收波长下的吸光度， 然后以l - p m e o p a c 的量为横坐标，吸光度a 为纵坐标，绘制标准曲线。 2 3 结果与讨论 2 3 1g c m s 法测定产物组成 大茴香醛经面包酵母转化2h ，所得粗产物中尚含有底物大茴香醛( r t99 2 5m i n ) ， 有产物p - m e o b a ( r t1 02 9 0m i n ) 和l - p - m e o p a c ( r t1 22 2 8m l n ) ，见图2 - 2 所示，但 此时尚未有p - m e o p p d a 生成。转化4 h ，已有产物p m e o - p p d a ( r t l l3 3 7 m i n ，94 3 ) 生成，见图2 3 所示，l - p m e o p a c ( r t81 9 3r a i n ，1 93 7 ) ，大茴香醛( r t4 7 7 1r a i n ， 3 78 ) ，p - m e o b a r t63 7 9m i n ，3 34 0 ) ，此时p - m e o b a 和p m e o - p p d a 的比例 为35 4 2 。 ( a ) ( b )( c )( 由 图2 - 2 转化2h 粗产物组分的气质联用检测图谱 f 培2 - 2 g c m sd e t e c t i o no f c r u d e p r o d u c tc o m p o n e n t sb i o t r a n s f o r m i n g f o r 2h ( 曲：粗产物组分的气相谱鸥；( b ) ：r t 为9 9 2 5 m i n 产物组分的质谱图；( c ) ：r t 为1 02 9 0r a i n 产物 组分的质谱圈；q ) ：r t 为1 22 2 8 r a i n 产物组分的质谱圈 蕊霞 江南大学硕士学位论i 0 )( c )( d ) 囤2 - 3 转化4h 粗产物组分的气质联用检测图谱 f i g2 3 g c m sd e t e c t i o n o f c r u d ep r o d u c tc o m p o n e n t sb i o t r a n s f o r m i n g f o r4h n ( 砷：转化4h 生成产物组分的气相谱图，( b ) ：r t 为6 3 7 9 m i n 产物组分的质谱图；( c ) ：r t 为8 1 9 3 m i n 产物组分的质谱图，( d