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疟原虫检测技术,阜宁县疾控中心检验科吴琼,一、疟疾诊断方法,实验室诊断：直接检测原虫（显微镜镜检）检测抗原(快速诊断RDT，分子诊断RPR）检测抗体（免疫荧光抗体试验IFA，酶联免疫吸附试验ELISA）分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准”仍然是血液显微镜检查,二、血片制作与染色,1）器材载玻片：新旧开玻片均应进行清洗擦干后方可使用。采血针：一次性采血针75%酒精棉球：采血前后的皮肤消毒用。玻片盒：存放制备好的玻片。记号笔：用于标记样本号等,用一次性采血针在耳垂或指端（一般是无名指）采血，婴儿可从拇趾或足跟采血。75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干。左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持采血针刺入皮肤约1-2mm。左手拇、食指与右手中指配合轻轻挤压出血滴。,2）采血,3）血片制作,厚血膜用推的一片角刮取4L-5L血（小米粒大小），置于第3格中央。手持推片，以一角由里向外一个方向旋转涂抹，制成直径0.8-1.0cm圆形厚血膜。血膜厚度：应厚薄均匀，厚度以1个油镜视野可见5-10个白细胞为宜。薄血膜左手持载玻片，右手持推片，蘸取血液1.0L-1.5L,使血滴接触载玻第4格右侧，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以25-35夹角均匀而迅速向左推成舌状薄血膜（长2-2.5cm）。厚度以红细胞之间互相接触而不重叠为宜,标签,薄血膜制作区,载玻片,厚血膜制作区,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片,门诊发热病人血片1人,居民普查血片2人,4）血片染色,试剂吉氏染液或瑞氏染液甲醇PBS自来水,两种染色方法吉氏染色法瑞氏染色法吉氏染色法常用，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。,固定薄血膜固定：待薄血膜干后，以玻棒或吸管取少量甲醇轻轻抹过薄血膜,3）血片制作,吉氏染色法染液稀释：吉氏原液：pH6.8-7.2PBS,1：20染色：将稀释的吉氏染液铺满厚、薄（固定）血膜上，室温染30分钟冲洗：用蒸馏水冲洗（注：勿用水直接对准厚血膜，以免血膜脱落）。镜检：血片晾干油镜检查。快速吉氏染色法：原液1ml加稀释液5ml，染色5分钟冲洗，晾干镜检。原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。吸取母液果.时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效,瑞氏染色法血片准备：先将厚血膜溶血。待厚血膜干后，用吸管取水置后膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去。固定染色：将瑞氏原液铺满厚（已溶血）、薄血膜上约30-60sec后加与染液等量的蒸馏水，摇动混匀，染制5分钟，冲洗（勿先倒去染液）。镜检：晾干油镜检查,瑞氏染液配制试剂：瑞氏染粉0.1-0.5g，甲醇97ml，甘油3ml。配制：将瑞氏染粉加入甘油中充分研磨，加少量甲醇研磨后倒入瓶内甲醇冲洗：用甲醇分数次冲洗研钵，倒入瓶中，直至用完。过滤：将染液摇匀，24小时后过滤待用。一般1-2周后再过滤。,血片制作注意事项,载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果干燥血片时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高检镜质量,厚薄血片制作质量标准,不合格血片,厚薄血膜的标准,厚血膜血量适宜，不宜过多或过少薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列,三、疟原虫密度计数法三种,白细胞虫原密度计数法(厚血膜WHO)半定量计数法(厚血膜)红细胞感染率计算法(薄血膜),白细胞疟原虫密度计数法,白细胞原虫密度计数法（厚血膜）厚血膜按顺序观察时，从看到第一个疟原虫开始计数，记录观察200个白细胞所看到的疟原虫数，若原虫密度较低，可增加白细胞计数500-1000个。虫密度计算公式疟原虫数/计数的WBC数患者每微升WBC数=疟原虫数/微升血。如果不知患者白细胞数，则每微升血以8000个白细胞为准（国际标准）,假设计数200WBC中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：35（疟原虫数）200（计数的白细胞）x8000（每微升血白细胞数）=1400/l,答：该患者的疟原虫密度为1400/l,半定量计数法,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野15个虫，记录“”4.平均每个视野610个虫，记录“+”5.平均每个视野11100个虫，记录“+”6.平均每个视野100个虫以上，记录“+”。,红细胞感染率计算法（薄血膜）,红细胞感染率计算（薄血膜）镜下（1000）选择红细胞排列整齐密集，无生重迭的视野（每视野约300红细胞）计算公式红细胞感染率（%）=疟原虫数/计数的RBC数100原虫密度=原虫RBC感染率RBC数/l若疟原虫数非常少，虽可查见，但观察10000个RBC时却未发现虫体，则设定感染率为1%,薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf,感染人类4种疟原虫形态特征对比,感染人类4种疟原虫形态特征对比,感染人类4种疟原虫形态特征对比,红细胞通常涨大薛氏点明显成熟环状体粗大滋养体胞浆有阿米巴样伪足可见各发育期滋养体成熟裂殖体约含12-24个裂殖子,间日疟（P.vivax）鉴定要点,间日疟原虫PV,血细胞中的形态：环状体（小滋养体）大滋养体裂殖体配子体,环状体钎细,红细胞不涨大一个红细胞内可有几个环状体,环状体内可有2个核环状体可贴在红细胞边缘血片中没有其他发育期滋养体配子体呈新月形或腊肠形成熟裂殖体约含8-26个裂殖子可出现茂氏点,恶性疟（P.falciparum）鉴定要点,红细胞不涨大或略小环状体可呈方形胞浆不活跃呈