（分析化学专业论文）基于纳米功能材料的电化学生物传感器研究.pdf

复旦大学硕士学位论文 摘要 生物传感器是一门涉及化学，生物学，物理学，电子技术等诸多领域的交叉 学科，在临床医学、工农业生产、环境保护等许多领域有着广阔的应用前景。在 生物传感器发展进程中，电化学生物传感器是十分重要的一类。而对于研制电化 学生物传感器，生物分子的固定化是一个关键因素。如何在电极表面有效地固定 生物分子无论对于研究蛋白的性质，还是研制新型电化学生物传感器都具有非常 重要的意义，这种生物分子的固定方法要求既能保持被固定生物分子活性，又能 促进有效的电子转移。本论文通过设计一系列功髓纳米材料固定氧化还原蛋白分 子，制备成生物传感器，并研究了其电化学性质。论文包括以下四部分内容： 1 概述纳米材料及其在生物传感器中的应用 从以下几个方面对该领域研究概况进行评述 ( 1 ) 生物传感器的发展概况 ( 2 ) 纳米材料的发展概况 ( 3 ) 纳米材料在生物传感器中的应用 ( 4 ) 本论文工作的目的与意义 2 氧化钛溶胶凝胶介体过氧化氢传感器 本文研究了一种新型的过氧化氢传感器，用t i 0 2 溶胶一凝胶将辣根过氧化物 酶和介体固定到玻碳电极上。循环伏安及相关的电化学测量表明，与酶共同固定 在酶和电极之间起到了很好的电子传递作用。该传感器在p h 7 0 ，2 5 c ，外加电 压为一0 2 5 v 时响应较好，在过氧化氢浓度为4 0 x 10 m 1 0 1 0 。3m 的范围内呈 线形，电极使用两个月后，仍能保持其响应活性的8 0 。 3 介孔氧化铌纳米材料在生物传感器的应用 本实验描述了一种新方法，即应用有序介孔氧化铌纳米材料修饰电极研究负 载在该无机基质上的功能蛋白的直接电化学行为。介孔氧化铌材料具有高的比表 面积、有序的孔道结构、均一的孔径分布，以及良好的生物相容性，这使得人们 复旦大学硕士学位话支 可以通过调变其结构来改变其对蛋白质吸附的选择性。在这儿，我们成功地将细 胞色素c 固定到介孔氧化铌薄膜上，并研究了材料形貌对生物分子吸附的影响。 实验结果表明，介孔氧化铌纳米材料能够有效吸附蛋白分子。且固定的细胞色素 c 具有直接电化学行为。说明该材料还能够促进电极表面和氧化还原蛋白之间的 直接电子转移。此外，制作的生物电极响应迅速，对过氧化氢有较好的催化响应， 其晌应线形范围为0 0 7m m 5 o m m ，说明氧化铌纳米材料对生物分子的固定 能够保持其活性。 4 - 基于有序介孔碳纳米材料的生物传感器研究 在实验中，我们采用有序介孔碳纳米材料固定葡萄糖氧化酶分子，首次将介 孔碳纳米材料应用于生物电分析及生物传感器研究。有序介孔碳材料具有极大的 比表面积，良好的生物兼容性和电化学活性等，既能很好地圃定蛋白分子，又能 有效地促进固定化的酶分子与电极之间的直接电子转移。固定化的酶分子仍然保 持其生物活性，制作的生物传感器具有较好的稳定性，对葡萄糖响应迅速，其线 形范围为l i or a m 。此外，通过将纳米铂颗粒掺杂到介孔碳，得到的复合材 料表现出更好的电催化性和生物亲和性，制备得到的传感器对葡萄糖的响应具有 更低的检测下限，其响应电流与葡萄糖浓度的线形范围为5 x l o 七m o l l 6 5 x 1 0 4m o t l 。 关键词：溶胶凝胶，有序介孔材料，介孔氧化铌，c r a g 碳，电化学生物传感器 i i ，墨兰垄苎! 主兰堡垒查 一 一苎墨 a b s t r a c t b i o s e n s o r sh a v ed e v e l o p e dt ob eaf r o n t i e ra n dn e w l y i n t e r d i s c i p l i n a r yi n c l u d i n g c h e m i s t r y , b i o l o g y , p h y s i c s ，m e d i c a l s c i e n c ea n d e l e c t r o n i c s e l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o ri s e x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e da n db e c o m e so n eo ft h em o s tp r a c t i c a la n d p r o s p e c t i v e d e v i c e s a m o n ga l l k i n d so fb i o s e n s o r s av e r y i m p o r t a n t f a c t o ri n b i o s e n s o rd e v e l o p m e n ti st h ei m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s 。i m m o b i l i z a t i o no f b i o m o l e c u l e so n t oe l e c t r o d es u r f a c e si s i m p o r t a n ti nt h eu n d e r s t a n d i n go fp r o t e i n p r o p e r t i e sa n da l s oi nt h ed e v e l o p m e n to f n o v e lb i o s e n s o r s t h e r e f o r e ，i ti se x p e c t e d t of i n da s i m p l e ，r e l i a b l ea n d e f f e c t i v ei m m o b i l i z a t i o ns t r a t e g yt or e t a i nh i g ha c t i v i t y o ft h ei m m o b i l i z e db i o m o l e c u l e sa n da l l o we 硒c i e n te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h e e l e c t r o d ea n dar e d o x p r o t e i n i nt h i s t h e s i s ，w eh a v ed e v e l o p e da s e r i e so f f u n c t i o n a ln a n o m a t e r i a l st oi m m o b i l i z er e d o xp r o t e i nm o l e c u l e sa n d s t u d y t h e p r o p e r t i e so f d e f i v e db i o s e n s o r s 1 i n t r o d u c t i o no fn a n o m a t e r i a l sa n di t sa p p l i c a t i o nf o rb i o s e n s o r s ar e v i e wo nn a n o m a t e r i a l sa n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o s e n s o r si sp r e s e n t e d a s p e c t s d e t a i lr e v i e w e di n c l u d e ( 1 ) b r i e f i n t r o d u c t i o no f b i o s e n s o r s a n di m m o b i l i z a t i o n ， ( 2 ) i n t r o d u c t i o n o fn a n o t e c h n o l o g ya n dn a n o m a t e r i a l s ， ( 3 ) d e v e l o p m e n t o fn a n o m a t e r i a l sd e r i v e db i o s e n s o r s ， ( 4 ) c o n c l u s i o no f t h i st h e s i s 2 t i 0 2s o l g e ld e r i v e da m p e r o m e r t i cb i o s e n s o r an o v e lb i o s e n s o rf o rt h e a m p e r o m e t r i c d e t e c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e w a s d e v e l o p e db a s e d o nt h ec o i m m o b i l i z a t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n d p h e n a z i n em e t h o s u l f a t e ( p m s ) o n t i 0 2s o l g e lf a b r i c a t e dg l a s s yc a r b o n e l e c t r o d e t h e p p m s p r o v i d e da s u i t a b l ee l e c t r o ns h u t t l eb e t w e e nt h eh r p i m m o b i l i z e di nt h et i 0 2 s 0 1 g e lm a t r i xa n dt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e t h eb i o s e n s o rp r o v i d e d aw i d el i n e a r i i i 型垫塑型型堕一一 塑 c a l i b r a t i o nr a n g ef r o m4 0 x 1 0 6m t o1 0 1 0 。3m t h es e n s o rr e m a i n e d8 0 o f i t s o r i g i n a la c t i v i t ya f t e rt w o m o n t ho p e r a t i o n 3 -o r d e r e d m e s o p o r o u s n i o b i u mo x i d ef i l m ： an o v e lm a t r i x t oa s s e m b l e f u n c t i o n a lp r o t e i n sf o rb i o s e n s o r a p p l i c a t i o n s t h eh i g h l yo r d e r e dm e s o p o r o u zn i o b i u mo x i d e sf a b r i c a t e db y s e l f - a d j u s t e ds y n t h e s i s h a v eb e e nu s e da si m m o b i l i z a t i o nm a t r i c e so f h e m e p r o t e i n si n c l u d i n gc y t o c h r o m ec ( c y tc ) f o rt h e i rl a r g e s u r f a c e a r e a s n a r r o wp o r es i z ed i s t r i b u t i o n sa n d g o o d b i o c o m p a t i b i l i t y t h ea s s e m b l i n gp r o c e s sw a si n v e s i t i g a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y , a m p e r o m e t r y a n d p o t e n t i a ls t e p c h r o n o a m p e r o m e t r yi n d e t a i l s n i o b i u mo x i d e m a t r i c e sw i t l ld i f f e r e n ts t r u c t u r a lf e a t u r e sw e r e t e m p l a t e dw i t ht h es u r f a c t a n t sa n dt h e s e l e c t i v i t yo ft h e s eh o s t st os p e c i f i cp r o t e i nc h a r a c t e r i s t i c sw a sd e t e r m i n e d i tw a s o b s e r v e dt h a tp r o t e i n sc o u l db er e a d i l ya s s e m b l e do n t ot h em e s o p o r o u sf i l m sw i t h d e t e c t a b l er e t e n t i o no f b i o a c t i v i t y t h en b 2 0 5m a t r i xw i t hat a i l o r e dp o r es i z ea n d c o u n t e r p o i s e ds u r f a c ec h a r g et o t h a to fh e m ep r o t e i na l l o w e df o ram a x i m u m a d s o r p t i o nc a p a c i t yo fb i o m o l e c u l e s t h ea d s o r b e dr e d o xm o l e c u l e se x h i b i t e dd i r e c t e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ra n dg a v eap a i ro fw e l l - d e f i n e d q u a s i r e v e r s i b l ec y c l i c v o l t a m m e t r i c p e a k s ，i n d i c a t i n gt h a tt h em e s o p o r o u sn i o b i u mo x i d em a t r i xc o u l d e f f e c t i v e l yp r o m o t e t h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h e p r o t e i n r e d o xs i t e a d s o r b e da n dt h ee l e c t r o d es u r f a c e f u r t h e r m o r e ，t h ei m m o b i l i z e dc y t co n t on b 2 0 5 d e r i v e de l e c t r o d e p r e s e n t e dg o o db i o a c t i v i t y a n dt h u sw a sf a b r i c a t e da sa n a m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r f o rt h er e s p o n s eo f h y d r o g e np e r o x i d ei nt h er a n g ef r o mo 0 7 m m t o5 。0 m m 4 p r o t e i ne n t r a p m e n tw i t h i nc a r b o nm e s o p o r o u sm a t e r i a l s ：a na p p r o a c hf o r p r o b i n gp r o t e i ne l e c t r o c h e m i s t r ya n da s s e m b l i n gb i o s e n s o r s i nt h i s e x p e r i m e n t ，w e d e m o n s t r a t ea s t r a t e g y , f o r t h ef i r s t t i m e ，o ft h e p r e p a r a t i o no fp r o t e i n e n t r a p p e dm e s o p o r o u sc a r b o nn a n o c o m p o s i t ef i l m s ，i nw h i c h t h ed i r e c tr e v e r s i b l ee l e c t r o nt r a n s f e rf o rr e d o xe n z y m e ( s u c ha sg l u c o s eo x i d a s e ) i s p r o b e da n d t h ea s s o c i a t e db i o c a t a l y t i ca c t i v i t yi sr e v e a l e d s u c hm a t e r i a l sp o s s e s st w o a d v a n t a g e s ，l a r g es u r f a c ea r e aa n d r e m a r k a b l ee l e c t r o c a t a l y t i cp r o p e r t i e s ，w h i c hm a k e t h e ms u i t a b l ec a n d i d a t e sf o rh i g hl o a d i n go f p r o t e i n sm o l e c u l e sa n dt h ep r o m o t i o no f 复旦尢学硕士学位论文 h e t e r o g e n e o u s e l e c t r o nt r a n s f e r t h ei m m o b i l i z e dg o xo n t o m e s o p o r o u sc a r b o n d e r i v e de l e c t r o d e p r e s e n t e dg o o db i o a c t i v i t y a n dt h u sw a sf a b r i c a t e da sa n a m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rf o rt h er e s p o n s eo fg l u c o s ei n t h er a n g ef r o m1t o1 0m m f u r t h e r m o r e ，c a r b o nm e s o p o r o u sm a t e r i a l sw a sa l s ou s e dt os u p p o r tad i s p e r s i o no f p l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s t h e r e s u l t e dm a t e r i a l se x h i b i t e dh i g h e rc o n d u c t i v i t ya n d e l e c t r o c a t a l y t i cp r o p e r t i e s ，t h ef a b r i c a t e db i o s e n s o rh a v eal o w e r d e t e c t i o nl i m i tw i t h al i n e a rr a n g ef r o m5 1 0 。6 m o l l t o6 5 x 1 0 4 m o l l k e yw o r d s ：s o l - g e l ，o r d e r e dm e s o p o r o u sm a t e r i a l s ，m e s o p o r o u sn i o b i u m o x i d e ( m n o ) ，c a r b o nm e s o p o r o u sm a t e r i a l s ( c m m ) ，e l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r v 复旦大学硕士学位论文 第一章纳米材料及其在生物传感嚣串的应用 第一章纳米材料及其在生物传感器中的应用 一、生物传感器概述 1 生物传感器 生物传感器是一种以酶、抗体抗原、细菌、酵母、脂质体、类脂质体等生物 分子为分子识别元件构造出来的分析装置，具有方便携带，成本低，易操作等优 点，是由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的新 兴学科，这种交叉学科在理论上和技术上有许多问题有待深入探索，在应用上则 有宽广的领域可以进行开拓。 基于电化学、光学、热学或压电晶体等不同类型的生物传感器，其探头均由 两个主要部分组成：感应器，由对被测定的物质( 底物) 具有高选择性分子识别 功能的膜构成；转换器，它能把膜上进行生化反应中消耗或生成的化学物质，或 产生的光、热等转化为电信号，最后把所得的电信号经电子技术的处理后，在仪 器上显示或记录下来。 在生物传感器中，电化学生物传感器是非常重要的一类。其中研究和应用最 多的是酶传感器，这种将酶作为电极结合试剂的概念是1 9 6 2 年由c l a r k 和l y o n s 【1 建立，他们提出可以通过检测其酶催化反应所消耗的氧来测定葡萄糖的含量。 继这些开创性的工作之后，在酶电极和生物传感器方面每年均有大量的工作发 表，涉及到设计和几何学、固定化方法、膜的组成、电极的构象等。根据酶与电 极间电子转移的机理，大致可将生物传感器分为三代：采用酶的天然介体t 氧的 催化原理设计制作的酶传感器为第一代生物传感器：第二代生物传感器将人工合 成的媒介体掺入酶层中，改进了分析参数并简化了处理步骤，能进行无试剂测量； 第三代生物传感器是指在无媒介体存在下，利用酶与电极间的直接电子转移制作 的酶传感器，也有人认为第三代传感器包括传感体中的电子信号处理、微型化与 多功能传感。近年来，生物传感器引起人们的巨大关注，相当多的公司与研究单 位开展了生物传感器的研究与开发，相关的文章和专利也急剧增加。【2 。5 】 2 生物组分的固定方法 早期的生物活性物质测量法，如酶分析法，是在水溶液状态下进行的。由于 复里大学硬士学位论文 第一章蚋米材料压其在生物传感器中的应用 酶在水溶液中一般不太稳定，且酶只能和底物作用一次，因此，使用起来很不方 便。要使酶作为生物敏感膜使用，必须将酶固定在各种载体上。将具有分子识别 能力的生物功能物质，如酶、抗原、抗体等，包藏或吸附于某些高分子材料，生 物高分子材料或无机材料制备成感应器，这称为生物组分的固定化。这是生物传 感器的研究和开发中最为重要的工作。选择理想的固定方法应该满足以下几个条 件： a 固定后的生物识别分子仍能保持良好的活性。 b 生物膜与转换器须紧密接触，且能适应多种测试环境。 c 固化层要有良好的稳定性与耐用性。 d 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。 为了研制价格低，灵敏度高，选择性好和寿命长的生物传感器，生物识别分 子固定化技术显得非常重要。经过近2 0 年来的不断工作，已经建立了对各种不 同的分子功能物质的固定化方法，主要包括夹心法，吸附法，包埋法，共价键合 法，交联法等，如图1 所示。现己报道的较为成熟的固定方法可归纳如下。 坫1 1 ) 吸附法 吸附法相对比较简便，操作条件温和，对生物活性影响小，但生物识别分子 与固体爱面结合力比较弱，容易导致生物分子的泄露或脱附。而且生物分子暴露 在外，容易受温度、p h 、离子强度等环境因素的影响。 2 1 共价键法 共价键法是通过共价键将生物分子固化在固体表面，相对比较稳定，不易发 生脱附。但是与固体本身键合导致灵敏度降低或生物分子失活，操作复杂，耗时， 成本高。 3 1 交联法 使用戊二醛等双功能团试剂，使生物分子以共价键交联在固体表面，其缺点 是难以控制，形成的生物分子层比较膨松，导致扩散阻力大，且需要的试剂量比 较大，容易引起生物分子活性降低。 4 、包埋法 包埋法是将生物分子包埋在聚合物膜等三维空间网状结构中，包埋物质不易 渗漏，最早是采用n a t i o n 、聚氯乙烯等高分子膜中，但发现有生物活性降低的问 2 复旦大学项士学位论文 第一幸纳来材料厦其在生物传感器中的应用 题。 5 1 夹心法 夹心法是将酶封闭在双层滤膜或电极滤膜之间，这种方法用于酶反应器和早 期的传感器中。 器辫 f i g ，1i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so f b i o m o l e c u l e s ( a ) 夹心法，( b ) 吸附法，( c ) 包埋法，( d ) 共价键，( e ) 交联法 二、纳米材料概述 1 ，纳米材料发展概况 在2 0 世纪6 0 年代，诺贝尔奖获得者物理学家费曼曾经预言：如果我们对物体 微小规模上的排列加以某种控制的话，我们就能使物体得到大量的异乎寻常的特 性，就会著到材料的性能产生丰富的变化。他所说的材料就是现在的纳米材料。 t 9 8 1 年德国科学家格莱特首次提出了纳米材料的概念。1 9 8 2 年i b m 公司苏黎 世研究所的两位科学家宾尼格和洛勒发明了扫描隧道显微镜( s t m ) 。这是一种 基于量子隧道效应原理的新型高分辨率显微镜，它能以原子级的空间尺度来观察 宏观块体物质表面上的原子和分子的几何分布和状态分布，确定物体局部区域 的光、电、磁、热和机械特性。1 9 9 0 年人们首次用s t m 进行了原子、分子水平 的操作。1 9 9 0 年7 月在美国召开的第一届国际纳米科学技术会议，正式宣布纳 米材料科学为材料科学的一个新分支，而采用纳米材料制作新产品的工艺技术则 被称为纳米技术。现在，纳米技术已经形成为高度交叉的综合性科学技术，是一 个融科学前沿和高技术于一体的完整的科学技术体系。【l 7 1 纳米技术是指在0 1 1 0 0 n m 尺度空间内，研究电子、原予、分子的运动规律 耙颡 爿爿舞身习 复旦大学硕士学位论文 第一章纳采材料及其在生物传感嚣中的庄甩 和特性，从而研究在纳米尺度范围内物质所具有的物化性质、功能及其应用的高 新技术，其含义包括纳米材料设计、制造、测量、控制和产品。在纳米材料的发 展初期，纳米材料是指纳米颗粒和由它们够成的纳米薄膜和固体，现在广义的纳 米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围，或由它们作为基本单元 构成的材料。 纵观纳米材料发展的历史，大致可划分为三个阶段。第一阶段( 1 9 9 0 年 以前) ，主要是在实验室探索中合成、制备各种材料的纳米颗粒粉体并形成块体 的方法和手段( 包括薄膜) ，研究评估表征的方法，探索纳米材料不同于常规材 料的特殊性能对纳米颗粒和纳米块体材料结构的研究在2 0 世纪8 0 年代末期 一度形成热潮研究的对象一般局限在单一材料和单相材料，国际上通常把这 类纳米材料称为纳米晶或纳米相材料第二阶段( 1 9 9 4 年以前) ，人们关注的热 点是如何利用纳米材料所具有的奇特的物理、化学和力学性能，设计纳米复合 材料，通常采用纳米微粒和纳米微粒复合，纳米微粒和常规块体复合及发展复 合纳米薄膜，国际上通常把这类材料称为纳米复合材料，这一阶段的纳米复合 材料的合成及物性的探索一度成为纳米材料研究的主导方向第三阶段( 从 1 9 9 4 年到现在1 ，纳米组装体系、人工组装合成的纳米结构的材料体系或者被 称为纳米尺寸的图案材料越来越受到人们的关注它的基本内涵是以纳米颗粒 以及纳米丝、纳米管为基本单元在一维、二维和三维空间组装排列成具有纳米 结构的体系，其中包括纳米陈列体系，孔组装体系，薄膜嵌镶体系，纳米颗 粒、丝、管可以有序地排列如果说第一阶段和第二阶段的研究在某种程度上 带有一定的随机性，那么这一阶段的研究特点更强调按人们的意愿设计、组装、 创造新的体系，使该体系具有人们所希望的特性。 2 纳米材料的分类| j 卅 广义上，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们 作为基本单元构成的材料，即纳米材料是物质以纳米结构按一定方式组装成的 体系，或纳米结构排列于一定基体中分散形成的体系，包括纳米超微粒子、纳米 块体材料和纳米复合材料等。组成纳米材料的基本单元在维数上可分为三类： 零维。指在空i 自l - - 维尺寸均在纳米尺度内。如纳米尺度颗粒、原子簇等；一维。 蔓旦大学硕士学位论文 第一章纳米材料及其在生物倍感b 4 的应用 指在空间有两维处于纳米尺度，如纳米丝、纳米棒、纳米管等；二维。是指在 三维空间中有一维处于纳米尺度，如超薄膜、多层膜、超晶格等。构成纳米材料 的物质的类别可以有多种，分为金属纳米材料、半导体纳米材料、纳米陶瓷材料、 有机一无机纳米复合材料及纳米介孔固体与介孔复合体材料等。 3 纳米材料的特性 2 0 】 1 ，j 、尺寸效应当纳米微粒尺寸与光波的波长、传导电子的德布罗意波长以 及超导态的相干长度或穿透深度等物理特征尺寸相当时，晶体周期性的边界条件 将被破坏，声、光、力、热、电、磁、内压、化学活性等与普通粒子相比均有很 大变化，这就是纳米粒子的小尺寸效应( 也称体积效应) 。 2 表面与界面效应纳米微粒由于尺寸小，表面积大，表面能高，位于表面 的原子占相当大的比例。这些表面原子处于严重的缺位状态，因此其活性极高， 极不稳定，遇见其它原子时很快结合，使其稳定化。这种活性就是表面效应。 3 量子尺寸效应当粒子尺寸下降到最低值时，费密能级附近的电子能级会 由准连续态变为分立能级，吸收光谱阈值向短波方向移动，纳米微粒的声、光、 电、磁、热以及超导性与宏观特性有着显著的不同，称为量子尺寸效应。 4 介电限域效应当半导体超微粒表面被修饰以某种介电常数较小的材料 时，由于比表面积随微粒尺寸的减小不断增大，显著影响了其性质。 5 宏观量子隧道效应隧道效应是指微观粒子具有贯穿势垒的能力，后来人 们发现一些宏观量，如磁化强度、量子相干器件中的磁通量等也具有隧道效应， 称之为宏观量子隧道效应。 4 纳米材料的制备方法1 2 1 。”1 纳米材料的合成与制备一直是纳米科学领域的一个重要的研究课题。目前纳 米材料的制备方法，以物料状态来分可归纳为固相法、液相法和气相法三大类。 1 气相法是直接利用气体或者通过各种手段将物质变成气体，使在气体状态 下发生物理变化或化学反应，最后在冷却过程中凝聚长大形成纳米微粒。气相法 可制备出纯度高、颗粒分散性好、粒径分布窄而细的纳米微粒。 2 液相法是以均相溶液为出发点，通过各种方法使溶质和溶剂分离，并使溶 复旦大学硕士学位论文 第一章纳米材料及其在生物传感器中的应用 质形成一定形状和大小的颗粒，得到所需粉末的前躯体，热解后得到纳米微粒。 液相法主要有沉淀法，水解法，喷雾法，溶剂热法，氧化还原法，乳液法，溶胶 凝胶法等。 3 固相法是通过从固相到固相的变化来制备粉体。固相法的原料是固体，所 得固相粉体产品和最初固相原料可以是统一物质，也可以不是统一物质。 按照途径的不同，纳米材料的制备可分为物理方法和化学方法。其中物理方 法又包括蒸汽冷凝法、物理破碎法、机械球磨法、非晶晶化法、等离子体沉积法 和溅射法；化学方法包括溶胶一凝胶法、微乳液法、喷雾热解法、金属醇盐水解 法、化学沉淀法等。 三、纳米材料在生物传感器中的应用 纳米技术是用单个原子、分子制造物质的科学技术，纳米材料从根本上改变 了材料的结构，被公认为是2 1 世纪最具有前途的科研领域。近年来，纳米技术 逐步进入生物传感器领域，并取得了很大的进展。 1 纳米颗粒在生物传感器中的应用【2 7 】 纳米颗粒，如金和银纳米颗粒，现在被用于生物分子的标记或生物组织的着 色，从而被作为成像和观察生物学过程的有效方法。纳米颗粒可以用来定位肿 瘤，荧光素标记的识别因子，与肿瘤受体结合，可以在体外用仪器显影确定肿 瘤的大小和位置。另一个重要的方法是用纳米磁性颗粒标记识别因子，与肿瘤表 面的靶标识别器结合后，在体外测定磁性颗粒在体内的分布和位置，从而给肿瘤 定位。许多文献也报道了金属纳米颗粒在电化学生物传感器中的应用，一些生物 催化电极通过将氧化还原酶分子和金纳米颗粒共沉积到电极上，从而被应用于生 物传感器。通过将a p o 葡萄糖氧化酶与1 4n ma u 5 5 纳米颗粒重组，可以实现葡 萄糖氧化酶与电极的高效电接触。 2 8 1 图2 是与金纳米颗粒重组的葡萄糖氧化酶和 f a d 修饰的金纳米颗粒被组装在电极表面的巯基单层上。与金纳米颗粒重组的葡 萄糖氧化酶在没有介体的条件下与电极表面能够直接发生电子转移，且对葡萄糖 具有催化作用。 6 复旦大学硕士学位论文 第一章纳米材料及其在生物传感嚣中的应用 i b _ l ，t 晴 f i g 2e l e c t r i c a l w i r i n g o fg l u c o s eo x i d a s e ( g o x ) b y t h ea p o e n z y m e r c c o n s t i t u t i o nw i t haa un a n o p a r t i c l e - f u n c t i o n a l i z e dw i t has i n g l ef a dc o f a c t o ru n i t 2 生物掺杂纳米复合物【2 9 1 生物掺杂纳米复合物研究主要集中在生物包埋的溶胶凝胶上。溶胶凝胶的纳 米孔结构和高孔容允许小分子自由扩散，并与包埋的生物分子发生反应。同时其 纳米孔结构和框架刚性防止了包埋的生物分子的泄漏，保持了生物分子的结构。 在溶胶一凝胶应用于生物传感器时，通常在形成溶胶一凝胶时加入生物元素，并混 合均匀。随着硅烷聚合物链的形成，生物分子就被无机氧化物构成的网状结构包 埋起来。多孔的溶胶凝胶网状结构能够支持生物试剂，并与待分析物在同相中 相互作用。溶胶凝胶材料的这些优势，如合成简便、孔径可调、低温包埋、化 学惰性、透光性好、非溶胀性、机械稳定性，保证了这种材料在发展化学传感器 和生物传感器中可占有一席之地。由于硅的良好的透光性，基于其溶胶- 凝胶过 m 瑚 舯 钟 m 辨 m 噶i，鼍一 固 复旦大学硕士学位论文 第一章蚋米材料厦其在生物待感器中的应用 程的传感器已经被制作成光敏性设备。溶胶凝胶过程和材料本身的多变性使得 它在电化学传感器的制作方面也提供了非常有用的工具。1 9 9 3 年，s a n c h e z 3 0 l 等 将葡萄糖氧化酶涂布在以t m o s 为前体分子的溶胶凝胶上，固定到电极表面， 制备出葡萄糖氧化酶传感器。o l e v 和g l e z e r 3 1 1 将掺有葡萄糖氧化酶的五氧化 二钒溶胶- 凝胶涂布在铂电极上制备葡萄糖氧化酶传感器，得到了很好的响应。 y a n g 3 2 1 等设计了将涂布有葡萄糖氧化酶的溶胶凝胶膜覆盖在微硅干胶片上的 葡萄糖微型传感器。 硅y d r 0 l 浮s 珞 m 0 r h + x 哪+ h i + x r 州 - s i n l 8 珏 c o hd _ 鄹n s h o llil iil i ill i i f 一洲+ 盼一f 一一一m j - - o - - i f 一+ 啪li ji p 0 1 y c 0 硝啪娜s t 加峨 扣卜 一，一t 斗斗山 f i g 3s t e p so fs o l g e lp r o c e s s 3 纳米孔金属氧化物材料 最近，几种纳米孔金属氧化物材料，如纳米氧化钛和氧化锌材料等，被用于 固定氧化还原蛋白如细胞色素c 和血红蛋白，同时被制成固定这些蛋白的电极。 3 3 - 3 5 1 此外，将细胞色素c 富集在t i 0 2p h y t a t e s 纳米膜并测定其活性也被报道。1 3 6 j 这些纳米孔材料具有许多优点，这些金属氧化物一般是半导体，具有电活性；具 有良好的生物兼容性，如氧化钛被广泛应用于牙膏和白色涂料：同时其孔径是纳 米尺寸，能够充分允许蛋白分子固定。这些材料的表面积也很大，保证了足够多 的生物分子固定。这些特点表明纳米孔金属氧化物材料在生物传感器领域具有很 大的应用潜力。图4 是制备的纳米孔氧化钛膜的s e m 图，该纳米孔氧化钛膜材 复旦大学硕士擘住论文 第一章蚋米材料及其在生物传感器中的应用 料可以很好地固定细胞色素c 和血红蛋白分子，固定的血红蛋白分予被用来检测 水溶液中溶解的一氧化碳浓度。d u r r a n t 等【3 7 1 还应用纳米孔氧化锌膜材料吸附绿 色荧光蛋白，研究了其光谱和电化学性质。 f i g 4s e mp i c t u r eo fn a n o c r y s t a l l i n et i 0 2f i l mp r e p a r e d 4 碳纳米管在生物传感器中的应用 碳纳米管于1 9 9 1 年被首次发现，由于其独特的结构和物理、化学特性以及 潜在的应用前景而成为当今研究热点之一。它是由碳原子形成的石墨片卷曲而成 的无缝、中空的管体，是一种纳米尺度的具有完整分子结构的新型碳材料，分为 多壁碳纳米管和单壁碳纳米管，已在原子力显微镜、新型电极材料和新型贮氢材 料等方面得到了应用。碳纳米管的比表面积大，孔径大小在一定范围内可控，是 一韵较理想的电极材料，将经过羧基化的碳纳米管作为电极使用时，其优良的 导电性能将会很好地促进生物电活性分子的电子传递，是一种良好的生物传感 器的材料。d a v i s 等 3 8 1 将不同的金属蛋白和酶分子吸附在氧化与净化过的单壁 碳纳米管上，并测定了其生物活性。d e k k e r 等【3 9 使用单根单壁碳纳米管制备生 物传感器( 图5 ) ，通过键合分子将葡萄糖氧化酶分子固定到碳纳米管管壁上， 可以有效的检测葡萄糖和监测p h 变化。j o s e p hw a n g 等1 4 0 j 碳纳米管与t e f l o n 混合，制各了碳纳米管复合电化学传感器，分别测定了葡萄糖和n a d h 。 9 复旦大学硕士学位论文 第一章纳米材料厦其在生物侍感嚣中的应用 l i q u i d - g a l e 稍i 鼬呻狮 f i g 5 ( a ) s c h e m a t i cp i c t u r eo ft w oe l e c t r o d e sc o n n e c t i n gas e m i c o n d u c t i n g s w n t 、v i t lg o xe n z y m e si m m o b i l i z e do ni t ss u r f a c e ( b ) c o n d u c t a n c eo fa s e m i c o n d u c t i n gs w n t a saf u n c t i o no f t h el i q u i d g a t ev o l t a g ei nm i l l i qw a t e r 四、本论文的目的与意义 在电化学生物传感器的研制中，生物分子的固定化是一个关键因素。而纳米 材料能够有效固定生物组分，在生物传感器中具有极大的应用潜力，日益引起人 们的关注。但到目前为止，与报道的大量纳米功能材料相比，只有很有限的几种 功能材料被应用于生物电分析和生物传感器的研究中。本论文正是基于以上考 虑，设计了系列新型纳米功能材料。将其用于固定生物分子，并结合各种电 化学方法，研究了其生物电化学性质并制备了相应的电化学生物传感器。 ( 1 ) 通过将辣根过氧化物酶固定在t i 0 2 溶胶一凝胶中，制作介体过氧化氢生 物传感器，并对其相关性能进行了研究。 ( 2 ) 首次将有序介孔氧化铌( m n o ) 纳米材料应用于生物电分析研究，成 1 0 复旦大荦硕士学位论文 第一章蚋米材料厦其在生物传感嚣中的应用 功地将细胞色素c 固定到介孔氧化铌薄膜上，研究了该蛋白的直接电化学行为和 电催化性质，制备了基于氧化铌材料的生物传感器。 ( 3 ) 首次将有序介孔碳( c m m ) 纳米材料应用于生物传感器，通过采用吸 附法将葡萄糖氧化酶分子固定到有序介孔碳纳米材料中，制备了葡萄糖电化学传 感器，探测了蛋白质可逆的直接电子转移以及揭示其相关的高效生物催化活性。 随后，我们还分别采用溶胶凝胶法固定酶分子和应用纳米颗粒掺杂的介孔碳材料 进一步拓展了介孔碳及其掺杂复合材料在生物传感器中的应用。 复旦大学硕士学位论文 第一章蚋米材料厦其在生物待感嚣中的应用 参考文献 ( 1 ) l c c l a r k ，c l y o i l s ，a n n _ ya c a d s c i 1 9 6 2 1 0 2 5 8 2 ( 2 ) vl i n ，k m o t e s h a r e i ，k d a n e i l ，m s a i l o r , m g h a d i r i ， s c i e n c e19 9 7 ，2 7 8 ，8 4 0 ( 3 )