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坛紫菜的细胞发育研究中文摘要 中文摘要 本文报道了坛紫菜单离体细胞的培养结果，坛紫菜作为大量在南方栽培的一 种重要经济型海藻已成为实验室加以研究的重要材料。由于植物细胞的全能性， 解离的单细胞或原生质体经培养能够正常发育成叶状体。本实验表明单离细胞能 在琼脂糖固体培养基上良好地存活，分裂和再生。从某种程度上看固体培养下的 再生产物和液体培养下相似，正常的体细胞能再生为正常苗，畸形苗，壳孢子以 及较多的细胞团等。固体培养下有些细胞团能长成类愈伤组织。作者观察到一些 单离细胞经生长能直接成为壳孢子囊枝，成熟的叶状体和细胞团还能释放果孢子 以及一些象单孢子类型的未知孢子。实验还发现从不同年龄大小的叶状体坛紫菜 酶解下来的单离细胞的再生产物在某种角度上看存在较大的差异。在培养过程中， 我们定点观察了某些果孢子和膨大孢子的生长发育以确定他们之间的关系和最终 的发育结果。 关键词：坛紫菜，固体培养，再生，体细胞，生长发育，叶状体，果孢子， 壳孢子，单孢子 作者：顾勤英： 指导教师：沈颂东博士 j ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 竺坐! ! ! ! ! ! ! 垫竺! ! 翌生竺! ! ! ! ! 竺：竺!垒! ! ! 璺! ! s t u d i e so nt h es o l i dc u l t u r eo fs o m a t i c c e l l sf r o mp o r p h y r ah a i t a n e n s i s a b s t r a c t t h i s p a p e rr e p o r t st h er e s u l to fc u l t i v a t i o no fs o m a t i cc e l l sf r o mp o r p h y r a h a i t a n e n s 括， o n eo ft h em o s ti m p o r t a n te c o n o m i c a ls e a w e e d sc u l t i v a t e di ns o u t h c o a s t a lo f c h i n a ，w a ss e l e c t e da st h ei m p o r t a n tm a t e r i a li nr e s e a r c h t h ei s o l a t e dn o r i c e l l so rp r o t o p l a s t sc a r lb ec u l t i v a t e di n t ot h a l l if o rt h et o t i p o t e n c yo f p l a n t t h er e s u l to f e x p e r i m e n t ss h o w st h a tt h ei s o l a t e dn o r ic e l l sc a ns u r v i v e ，d i v i d ea n dr e g e n e r a t ew e l l o ns o l i da g a r o s es e a w a t e rm e d i u m t h ed i v i s i o na n dr e g e n e r a t i o no fn o dc e l l so ns o l i d m e d i u mi sm u c ht h es a m ea st h a ti nl i q u i dm e d i u mi nc e r t a i ne x t e n t t h ei s o l a t e dn o d c e l l sc a l ld i v i d ea n dr e g e n e r a t et of o r mi n t on o r m a lt h a l l i ，a b n o r m a lt h a l l i ( w i t ho r w i t h o u th o l d f a s t ) ，e o n c h o c e l i sa n dm o r ec e l l g r o u p s o ns o l i dm e d i u m ，r e g e n e r a t e d t h a l l ic a l ls l o w l ya n dc o n t i n u o u s l yg r o w ，a n dc o n c e l i sc a nn o r m a l l yg r o wa n dm a t u r a t e t h r o u g hc u l t u r e a l s o ，p a r t so fc e l l g r o u p sc a nd e v e l o pi n t oc a l l u s l i k ec l u m p s t h e n t h ec l u m p sc o u l dd i f f e r e n t i a t ei n t oy o u n gp l a n t l e t si nt h eo p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r e t h ea u t h o ro b s e r v e dt h a tf e wc e l l sc a nd i r e c t l ys p r o u ti n t oc o m c h o s p o r a n g i a lb r a n c h a n dc a r p o g o n i ao nt h em a t u r el e a f yt h a l l u sc o u l dd i s c h a r g ea n dg e r m i n a t ei n t o c a r p o s p o r e si nt h es a m ew a y a sm o n o s p o r ed i d i th a da l s ob e e nd e m o n s t r a t e dt h a tt h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fi s o l a t e dn o r is o m a t i cc e l l si nd i f f e r e n ta g e di n d i v i d u a lt h a l l i w e r eq u i t ed i f f e r e n ti nc e r t a i nr e s p e c t s k e yw o r d s ：p o r p h y r ah a i t a n e n s i s ， c e l l s ，g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t ，t h a l l i ， s o l i dc u l t u r e ， r e g e n e r a t i o n ， s o m a t i c c a r p o s p o r e ，c o n c c h o s p o r c ，m o n o s p o r e p o s t g r a d u a t e g uq i n y i n g d i r e c t e db yd r s h e ns o n g d o n g 。i ， 3 a 7 1 7 8 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：塑塾董日期：! ! ：! 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 1th* 研究生签名：垡塾塞日期：2 ：! ! ：! 导师签名：i 晚i 蹲日 坛紫菜的细胞发育研究 前言( p r e f a c e ) ：坛紫菜培养概况 前言( p r e f a c e ) ：坛紫菜培养概况 早在一千多年前的隋唐时期，我国就有了关于食用紫菜的记载。我国人民利 用和养殖紫菜已经有相当长的历史，积累了丰富的经验。最原始的是采用简单工 具清除或火把烧除的方式，清除岩礁上的杂藻、野贝来增殖紫菜。到了2 0 0 多年 前，在福建的平潭发展为用石灰水处理岩礁的杂藻，创造了“菜坛式养殖法”，并 传到了福建莆田、山东和浙江等地，取得了良好的增产效果。解放后，我国紫菜 的栽培取得了显著的进步，产量迅速提高，成为紫菜出口国。8 0 年代中期，张佑 基等曾用选择育种法培育出长叶品种，在生产上发挥了重要作用。但由于一些关 键性的理论问题没有解决，目前我国紫菜养殖的品种，除从日本引进了几个品种 试养外，基本上仍属于未经遗传改良的自然群体，个体之间表现出明显的遗传差 异，限制了我国紫菜养殖的发展。 在德国著名科学家h a b e r l a n d t ( 1 9 0 2 ) 提出的细胞器官和组织可以不断分割直至 单个细胞的基础上，1 9 4 9 年美国科学家w h i t e 又正式提出植物细胞具有全能性 ( t o t i p o t e n c e ) 学说，使植物细胞培养日益成为一门新兴的科研产业体系。 自从卢澄清( 1 9 7 9 ，1 9 8 3 ) 报道了紫菜叶状体营养细胞的分离、培养并长成小紫 菜的实验工作以来川，国内外已有不少工作者致力于紫菜单离细胞的培养。 s a g a ( 1 9 8 4 ) 用酶法分离条斑紫菜细胞并再生成植株【2 j ；王素娟等( 1 9 8 6 ) 用酶法分离 到坛紫菜细胞再生成株1 3 】：戴继勋等( 1 9 8 9 ) 用坛紫菜进行过体细胞直接附网育苗等。 自酶法用于紫菜叶状体细胞或原生质体分离获得成功后【6 1 ，已有一些研究者利 用液体培养法，对坛紫菜叶状体营养细胞或原生质体的培养和细胞发育、体细胞 直接采苗法工艺、细胞融合、e m s 及秋水仙碱等对体细胞生长发育的作用等进行 了研究1 7 1 。而固体培养仅见于极少的报道【8 i 。固体培养在植物细胞变异体的筛选上 具有许多优点【9 】，因此我们用海螺消化腺提取的粗制酶液分解获得坛紫菜单离细胞 或原生质体，以含营养盐天然海水的琼脂糖凝胶为培养基进行固体培养实验。以 期待了解各种单离细胞的发育方向和不同的再生产物及再生产物的分化规律等， 对跟踪筛选遗传品质优良的紫菜，指导人工酶法育苗具有极为重要的理论意义和 现实意义。 、 坛紫菜的细胞发育研究前言( p r e f a c e ) ：坛紫菜培养概况 文献参考( r e f e r e n c e ) ： i 卢澄清等，紫菜叶状体营养细胞的研究。1 9 7 9 年第一届中国藻类学会讨论会论 文集，北京，科学出版社，1 9 8 3 ，5 5 5 2 s a g an ， a n dys a k a i ， i s o l a t i o no fp r o t o p l a s tf r o ml a m i n a r i aa n dp o r p h y r a 1 9 8 4 ，b u l l j a p s o c s u f i s h ，4 4 8 7 3 王素娟等，坛紫菜营养细胞和原生质体的研究( i ) 。海洋与湖沼，1 9 8 6 ， 1 7 ( 3 ) ：2 1 7 2 2 1 4 戴继勋等，坛紫菜原生质体的发育研究遗传学报，1 9 8 8 ，1 5 ( 4 ) ：2 9 9 3 0 2 5 王素娟f e d ) ，海藻生物技术。1 9 9 4 ，第一版，上海科学技术出版社，上海 6 唐延林，紫菜营养细胞和原生质体的分离和培养。山东海洋学院学报，1 9 8 2 ， 1 2 ( 4 ) ：3 7 5 0 7 戴继勋等，紫菜原生质体的纯系培育、诱变处理和种问细胞融合的研究。海洋 与湖沼，1 9 9 0 ，2 1 ( 3 ) ：2 9 3 2 9 7 8 王志勇、黄世玉、陈为、张冬防，坛紫菜叶状体营养细胞的固体培养。厦门水 产学院院报，1 9 9 6 ，1 8 ( 1 ) ：1 5 9 奚元龄、颜昌敬( 编译) ，植物细胞培养手册。1 9 9 2 ，农业出版社，北京 堡整墨塑塑丝垄堕型壅 笙二堡坌苎堕! ! 塑生 第一部分文献综述 第一章坛紫菜的系统分类学及其形态与分布 1 1 紫菜的名称 紫菜属红藻门( r d 却缸恤) 红毛菜科( 肋”口c p a p ) 紫菜属( j p d 伊 胛) 植物，欧美 称l a v e r ，日本叫n o r f 。全世界约有7 0 余种，广泛生长在全球海岸的潮间带。我 国紫菜分布在辽宁、河北、山东、江苏、浙江、福建、广东和海南岛沿海，大约 有1 5 种。作为栽培的种有2 个，南方为坛紫菜h a i t a n e n s i sc h a n g e tz h e n g ) ，北 方为条斑紫菜y e z o e n s i su e d a ) 。 1 2 坛紫菜的分类地位 坛紫菜在自然界分类系统中属： 红藻门( r h o d o p h y t a ) 原红藻纲( p r o t o f l o r i d e o p h y e a e ) 红毛菜目( b a n g i a l e s ) 红毛菜科( b r l t g i a c e r e ) 紫菜属( p o r p h y r a ) 真紫菜亚属+ ( e u p o r p h y r a ) 全缘紫菜组( s e c t i o ne d e n t a t a ) 刺缘紫菜组( s e c t i o nd e n t a t e ) 坛紫菜( p h a i t a n e n s i sc h a n g e tz h e n g ) 边缘紫菜组( s e c t i o nm a r g i n a t a ) 双皮层亚属+ ( d i p l o d e r m a ) 双色素亚属+ ( d i p l a s t i d a ) 我国藻类学家曾呈奎与张德瑞根据叶状体边缘有无缘状突起将真紫菜亚属分为三类。 1 3 坛紫菜的形态与分布 坛紫菜藻体披针形、亚卵形或长亚卵形，色暗绿紫而带褐。自然生长一般高 1 2 1 8 c m ，有时达2 8c i l l 以上。边缘无皱褶或稍有皱褶边缘细胞具有稀疏的锯齿。 、l卜 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 营养部分的细胞为单层，局部为两层。多数细胞具单一星状体，少数具有双色素 体，藻体厚6 5 - i1 0 1 a m ，生长假根丝的细胞呈圆头形。 我国紫菜分布北自辽宁、山东、江苏、浙江、福建、南到海南岛沿海，大约 1 0 余种。坛紫菜盛产于福建平潭县，在我国主要分布于浙江、福建两地属暖温性 海藻，广东北部汕头地区亦有自然生长。本种多密生于高潮带的岩礁上，耐干性强。 第二章坛紫菜的药用及食用价值 2 1 坛紫菜的药用价值 中医认为紫菜性味属甘、咸、寒、有化痰软坚，清热利尿，补肾养心之功效。 现代医学证明紫菜具有降血脂作用，并可用胃酸或为蛋白酶作用引起的消化性胃 溃疡病，经常食用紫菜可防止衰老、贫血、头皮屑、瘙瘁、龋齿，还可治疗水肿、 甲状腺肿、夜盲症、妇女更年期综合症及男子阳痿等症【ij 。 坛紫菜在防治高血压、甲状腺肿大，慢性咽喉炎方面都有一定的疗效u j 。日本 学者曾在白鼠上作过对照试验，喂养2 紫菜饵料的白鼠有2 0 的可抑制肠癌，而 且能使白鼠的双歧杆菌和乳酸杆菌数明显增加呈现良好的肠内平衡现象u j 。 2 2 坛紫菜的食用价值： 坛紫菜是一种味美而营养丰富的食用海藻。据测定每克干品含蛋白质 3 5 4 8 2 m g ，脂肪酸1 6 4m g ，碳水化合物3 1 4 m g ，无机盐3 0 3 m g ( 钙3 6 3 m g ，磷7 2 6 m g ) ，其中经测的1 7 种氨基酸和人体必需的9 种氨基酸( 未测色氨酸，t a b l e l ) ，与 理想蛋白质中必需氨基酸含量的模式谱( f a o w h ol9 7 3 年修正模式谱) 相一致 ( t a b l e 2 ) 。钙磷含量是鸡肉、猪肉松的3 4 0 倍，而且钙磷比为l ：2 极有利与人体 的吸收。铁含量是香菇的5 倍：碘含量是牛奶、鸡蛋的1 0 0 0 倍以上，坛紫菜所含 的维生素也十分丰富，胡萝h 素的含量( 视黄醇当量) 相当于牛奶中维生素a 的2 5 倍，维生素b l 、b 2 及维生素e 均比牛肉、鸡蛋和蔬菜高。这些数字都说明坛紫菜 有极高的营养价值，其铅含量低于卫生指标，是名副其实的绿色食品。 我国坛紫菜的加工利用技术相对滞后，丰富的坛紫菜资源得不到有效利用， 造成严重的资源浪费。日本在大学和研究所中设立专门从事紫菜研究工作的就有 2 0 多所，在紫菜的养殖技术、加工保存技术及保健功能、药用成分的研究均处于 领先地位，其紫菜深自n - r - 产品也大量出e l 欧美各国。他山之石可以攻玉，我国应 lp 坛紫菜的细胞发育研究 第一部分文献综述 加大科技力量，充分提高坛紫菜的附加值，使我国的坛紫菜养殖业、加工业更上 一台阶。 t a b l e 2 坛紫菜九种人体必须氨基酸与f a o 模式标准比较 注：为联合国粮农组织 第三章坛紫菜的生殖及生活史相关研究 3 1 紫菜的生殖及生活史 3 1 1 紫菜的有性生殖 首先由紫菜叶状体上形成果孢( 卵) 与精子囊器，两者成熟后精子囊脱离藻体， 随海水流动被带到果孢的受精丝上，精子被释放进入果孢后两核融合完成受精过 程。受精的果孢( 合子) ，经过多次分裂成为果孢子，果孢子直接萌发成丝状体：然 后成为生活史上的另一阶段即丝状体阶段。以尸g e n e r ak j i l l m ( 甘紫菜) 为例，其为 雌雄同株，在水温1 5 c 以上，产生性器官。藻体的任何一个营养细胞，都可转变 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 为精子囊，其原生质体分裂为6 4 个精子。果孢有1 个普通细胞稍加变态形成的， 一端隆起，伸出藻体胶质的表面既为受精丝，果孢内有1 个卵。 根据雌雄生殖细胞在藻体上的分布情况可将紫菜藻体的性别可分为4 种类型： 雌雄异体，如户d e n t a t ek j e l l m ( 长紫菜) 和pp s e u d o l i n e a r i su e d a ( 拟线形紫菜) ；雌雄 同体，如py e z o e n s i su e d a ( 条斑紫菜) 、p s u b o r b i c l a t ak j e l h n ( 圆紫菜) ：雌雄异体为 主兼有雌雄同体，如尸h a i t a n e n s i sc h a n ge tz h e n g ( i 云紫菜) ；雌雄同体兼有雄体，如 pk a t a d a im i u r av a t h e m i p h y l l at s e n ge tt j c h a n g ( 坛紫菜) 。 3 1 2 紫菜的无性繁殖 紫菜叶状体除了进行有性生殖产生果孢子外有的种类还进行无性繁殖产生单 孢子( 中性孢子) ，单孢子由营养细胞转变而来，一般由叶状体的边缘细胞经过质的 变化形成，一个营养细胞形成一个单孢子。 3 1 3 紫菜生活史的相关研究 最早的科学家对紫菜生活史的研究归纳起来有几种意见： ( a ) 果孢子休眠度夏，到秋季再从海底漂浮起来附着于竹枝、竹帘、岩石上萌 发成紫菜叶状体，持这种看法的有b e g h o r d ( 1 8 8 1 ，1 8 8 2 ) 、k u n i e d a 、国枝溥( 1 9 3 9 ) 、 须藤( 1 9 4 8 ，1 9 5 0 ) 等。 ( b ) 果孢子直接萌发成小紫菜，用小紫菜度夏，果孢子萌发成丝状体是一种不 正常的现象，提这种意见有殖田( 1 9 2 9 ，1 9 3 7 ) 、日下部( 1 9 2 9 ) 、和田( 1 9 4 1 ) 、木下、 中谷( 1 9 4 1 ) 、木下( 1 8 4 3 ，1 9 4 9 ) 等。 ( c ) 果孢子萌发成丝状体，由丝状体再形成孢子，为k y l i n ( 瑞典 希林1 9 2 2 ) 、 r e e s ( 1 9 4 0 ，1 9 4 0 ) 等的意见。 ( d ) d a n g e a r d ( 丹则亚1 9 3 1 ) ，认为果孢子萌发成丝状体，在上面再形成紫菜幼 芽。日本藻类学家以pt e n e r ak i i l l m 为对象，k y l i n 以pl a n c i n i a t a 、r e e s 以p u m b i l i e a l i s ，d a n g e a r d 以pl e u c o s t i c t a h e 和户m i n i a t a 、p u m b i l i c a l i s ( 脐形紫菜) 为对象。 直到1 9 4 9 年，d r e w ( 英国 德鲁) 举出充分的证据证明紫菜果孢子的萌发结果 是丝状体构造，而且钻进软体动物的贝壳之后就成长为藻类学家一直认为是另一 种海藻的c o n c h o c e l i sr o s e ab a t t ( 壳斑藻b a t t e r s 1 8 9 2 ) 。我国藻类学家曾呈 奎与张德瑞以p t e n e r a 为对象证明紫菜生活史是由叶状体和丝状体两个阶段组成， 由丝状体产生壳孢子并由其生成叶状体。 以后经过其他国家的学者对其他种类紫菜的生活史研究得出同样的结果即紫 坛紫菜的细胞发育研究 第一部分文献综述 菜的一生由宏观的叶状体阶段和微观的丝状体阶段组成的根据现有的资料可分为 以下几个阶段： ( a ) 叶状体阶段( 紫菜阶段) 紫菜在1 5 1 7 。c 以上的温度环境，能够产生 单孢子，在1 5 以下，产生性细胞，精子和卵子交配成合子，通过减数分裂成为 果孢子。 ( b ) 丝状体阶段( 壳斑藻阶段) 果孢子萌发成丝状体，到了1 5 1 t c 或以 上，产生壳孢子。 ( c ) 小紫菜阶段壳孢子在夏季长成小紫菜，以单孢子繁殖个体。小紫菜在 青岛地区可分为三类型：初夏型，夏型和秋型。在水温持续下降时，夏型可转为 秋型，秋型可转为大型。 ( d ) 紫菜阶段水温在1 7 2 0 。c 以下时，壳孢子和小紫菜的单孢子均能萌发 成为大型紫菜。 在紫菜生活史上共有三种孢子：果孢子( 2 n ) ，壳孢子( n ) ，和单孢子( 2 n ) 。其中 以果孢子和壳孢子为主，单孢子为副。同种紫菜中果孢子和壳孢子的大小相近似， 但比单孢子小，大型紫菜和小型紫菜的单孢子基本是同样的，但大小有别，且抗 温性亦不同【4 】。 3 2 坛紫菜的生殖及生活史型 3 2 1 坛紫菜的繁殖 坛紫菜多为雌雄异体，少数为雌雄同体。当为雌雄同体时，果孢子囊群和精 子囊器常以直线或曲线分别集中区分于藻体的一定区域上，有的分布在藻体的对 半等分。精子囊器具有1 2 8 或2 5 6 个精子囊表面观1 6 个共8 层或1 6 层，分裂式 为6a 4 8 4 c 8 或6a 4 8 4 c 1 6 ，果孢子囊具有1 6 或少数为3 2 个果孢子表面观4 个或 8 个，分裂式为g a 2 8 4 c 4 或早a 4 8 2 c 4 。 3 2 2 坛紫菜的生活史型及其核相 以叶状体产生果孢子，果孢子长成丝状体，从丝状体上产生壳孢子，壳孢子 附着后长成小叶状体进而长大成商品紫菜。在坛紫菜生活史上共有两种孢子：果 孢子( 2 n ) ，壳孢子( n ) ，没有单孢子。 多数人( m i g i t a ，1 9 6 7 ；g i r a u d & m a g n e ，1 9 6 8 和k i t o ，1 9 7 4 ) 认为染色体减数 分裂是在壳孢子母细胞第一次减数分裂时进行的。因而可以确定叶状体是单倍体， 丝状体是双倍体。果孢成熟后要经过受精过程，受精的果孢核不进行减数分裂。 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 因而染色体是两倍的。受精的果孢分裂成果孢子，它的染色体也是双倍的。直到 壳孢子母细胞第一次二分为两个壳孢子时，染色体才经过减数分裂，成为单相。 第四章坛紫菜体细胞分化发育和形态进程等方面的研究 1 9 4 9 年美国科学家w h i t e 正式提出植物细胞具有全能。l 生( t o t i p o t e n c e ) 学说，即 每个植物细胞具有该植物细胞的的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。般 植物细胞和组织再生过程分为两个不同生长时期。首先使培养的细胞或组织脱分 化，形成愈伤组织，然后由新形成的愈伤组织中形成一些分生细胞团，随后由之 分化成不同的器官原基。由于海藻细胞的愈伤组织与高等植物的愈伤组织在结构 及色素方面有差异，所以海藻的愈伤组织又称类愈伤组织( c a l l u s ) 或细胞团。紫菜 细胞团多为深红色，且壁较厚。海藻细胞以及愈伤组织中的细胞大多数情况下是 以胚状体的形式直接形成小苗，有的单细胞经培养后直接分裂形成小苗，称之为 单细胞苗；而有的细胞先形成细胞团，其细胞团释放出类似的单或壳孢子的细胞 后也能形成小苗称之为孢子苗lz j 现将坛紫菜单离细胞在液体培养基和固体培养基 上的再生产物简单描述如下。 4 1 液体培养 坛紫菜和条斑紫菜虽属同一属，但事实证明两种紫菜的分化发育是各有其特 点的。坛紫菜叶状体用海螺酶酶解后一般以单细胞为数最多。单细胞分裂趋势有 三种：一种是单细胞的一端伸出突起，逐渐发展成假根，而另一端分裂成2 个细 胞，成为典型的两极分裂，这种分裂与孢子萌发相同，次种幼苗外形细长似等腰 三角形；第二种情况是由单细胞不断分裂成2 ，4 细胞，最后成为多细胞团。每个 细胞直径大，色素体呈星状，逐渐成为不规则的叶状体，次叶状体由边缘细胞伸 出较粗壮的凸起，可以是1 条、2 条或3 条，细胞单列，内有色素体。这类假根不 能附着，在培养中多漂浮在水中，称之为畸形苗：第三种发育类型是有些受精的 卵或未成熟的精子囊，解离后，经过一段时间的培养，仍能不断分裂成果孢子囊 或精子囊。但又分两种情况： ( a ) 无论是果孢子囊或精子囊先分裂成2 细胞如两极分裂，以后成网球拍状， 在各部分的细胞均分裂成生殖细胞( 果孢子或精子) 。 ( b ) 解离的果孢子囊或精子囊细胞经培养后分裂成团状，其中每一个细胞分化 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 成精子囊或果孢子囊，成熟后果孢子或精囊囊可以从细胞团中放散出来。果孢子 萌发成丝状体【6 1 。 4 2 固体培养 坛紫菜的固体培养目前报道很少仅见于王志勇、黄世w , ( 1 9 9 6 ) 进行的的试验， 他们将坛紫菜叶状体细胞在半固体、固体琼脂糖培养基上培养并对两培养基上的 产物进行了比较分析，简单讨论了固体培养的优点和有关坛紫菜愈伤组织的诱导 培养 7 1 。 第五章坛紫菜的细胞生物学研究 5 1 坛紫菜染色体数目、形态、d n a 含量的变化 自1 9 2 1 年l s h i k a w a 首次报道了甘紫菜( p o r p h y r a t e n e r a ) 的核分裂研究工作以 来，相当多的藻类学家对紫菜的细胞学进行了研究，全世界7 0 多种紫菜已有5 4 种做了染色体计数。紫菜属染色体的一个显著特征是不同种紫菜的染色体数目不 同且数目较少。分析这些报道过的染色体资料，可见具3 条染色体的种有2 5 个， 占绝大多数。具4 条的有1 2 个，2 条的有8 个，5 条的有9 个，具6 条和7 条染 色体的种各有1 个。根据m u m f o r d ( 1 9 7 3 ) 研究得出坛紫菜的营养细胞的染色体为3 个，精子为3 个，果孢子为6 个，丝状体是6 个p 1 。 紫菜的染色体在几乎所有文献中都报道为短棒状或点状，未见明显的着丝点， 因而无法进行核型分析。m u m f o r d & c o l e1 9 7 7 年报道了北美西海岸1 5 种紫菜属 植物的染色体数目紫菜染色体一般比较小，染色体绝对长度变化于0 5 3 5 9 m 之间”1 。 由于紫菜种间或种内染色体数目存在变异，k r i s h n a m u r t h y1 9 8 4 年推测紫菜 的原始种染色体数是3 ( 共2 5 种) ，k a p r a u n 等1 9 9 1 年利用细胞光度计测定了4 种 紫菜的染色体组中核d n a 含量，发现这4 种植物的染色体有3 条和4 条两种类 型，但2 倍染色体组( 以下略写为2 c ) 的d n a 含量却均在o 9 3 1 1 8 p g 之间。其中 采自北卡州w r i g h t s u i l l e 海滩的pl e u c o s t i c t a 具4 条染色体，2 c d n a 含量为 1 0 1 p g ，同种采自德州的2 个居群均具3 条染色体，2 c d n a 含量分别为1 0 8 p g 和0 9 3 p g 。在pl e u c o s t i c t a 这同一个种内具不同染色体数目，却具有基本相同的 2 c d n a 含量，证实染色体数目变异是由于融合断裂而来，而不是通过整条染色 体丢失获得产生的。 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 5 2 坛紫菜的原生质体培养、融合及杂交技术的研究 根据藻类细胞脱壁程度的不同，a d a m i c h 将脱壁后的细胞分为原生质体 ( p r o t o p l a s t ) 和原生质球( s p h e r o p l a s t ) 。原生质体指质膜外的胞壁和包被层全部除去 而保持其余细胞组分的任何基因型的藻细胞：原生质球是指胞壁全部除去或部分 除去，仍保持质膜外包被层的含全部细胞组分的部分。原生质体有以下特征： ( a ) 无细胞壁障碍，可对膜、细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作。 ( b ) 具有全能性，能在人工条件下，进行大量快速繁殖。 ( c ) 可诱导融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供材料。 原生质体融合是指2 个或2 个以上的完全去壁的原生质体相互靠近、粘连， 最后融合成1 个融合体。海藻原生质体的方法有机械法、微生物酶法和酶法。 早在1 8 9 2 年k l e r k e r 就用机械法从藻类中分离到原生质体，但分离率非常小费时 费力。1 9 0 9 年k u s e r 用硝酸盐诱导洋葱的表皮细胞从而揭开了原生质体融合的序 幕。1 9 6 0 年c o c k i n g 等人首次用纤维素酶制备出番茄的原生质体，摆脱了机械法 的束缚，开辟了新的原生质体的制备方法使植物原生质体的制备、培养和融合进 入了新的发展时期。1 9 7 1 年t a k e b e 用酶法获得烟草叶肉细胞原生质体，并培养再 生植株。植物细胞全能性彻底被证实，这是植物细胞杂交的重要基础之一。1 9 7 4 年k a o 等人用聚乙二醇( p e g ) 和高p h 值，高c a 2 + 并用的方法，提高了融合频率， 是许多植物的原生质体融合成功。 细胞融合和细胞杂交使存在很大差异的细胞质和染色体的重组成为可能戴继 勋等( 1 9 9 0 ) 用p e g 融合法对刚分离的坛紫菜和条斑紫菜原生质体进行融合，单个 异质融合体被挑出来培养，l 周后开始第一次分裂，4 周后发育成多细胞团，但不 能分化出完整的植株。严兴洪等( 1 9 9 1 ) 用p e g 融合法对坛紫菜野生型原生质体和 红色型变异体的原生质体诱导融合，两者比例i ：1 。获得1 0 1 2 的融合率。异 质融合体发育成有野生色彩的细胞和红色色彩的细胞组成的色彩嵌合体，并对两 个红色原生质体融合成的同质融合体进行培养最终证明融合体只是发生了细胞质 融合，核融合可能没有发生。坛紫菜野生型叶状体的原生质体与条斑紫菜的原生 质体之间的种间杂交细胞，也只发育成细胞团，严兴洪利用酶法分离出野生型叶 状体和红色突变体的坛紫菜原生质体以及条斑紫菜野生型叶状体的原生质体，再 用p e g 法进行种内原生质体的融合，种内原生质体融合率坛紫菜为9 7 1 2 4 ， 条斑紫菜为l o 1 1 5 。p e g 分子量在1 5 4 0 6 0 0 0 之间，随着分子量的提高， o 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 原生质体融合率增高f 1 1 1 。 第六章坛紫菜的生理、生化等基性础研究 紫菜叶状体生长的好坏与生产有密切的关系，而它的生长有直接受海洋环境 的影响，为了收获更多的叶状体，就必须对叶状体的生态与生理有较全面的了解， 作为紫菜栽培的依据，一般影响紫菜生长发育快慢的主要因子有温度、光线、营 养盐、水流等。现结合国内外有关的研究资料介绍如下： 6 1 光、温度等对紫菜发育的影响 从生态条件上看紫菜属于好光性藻，但对弱光有较强的适应力，这是因为他 的补偿点较低。光照时间过长，容易促进生殖细胞的提早形成，相对的是生长较 早停止。在光质方面，富士) l l ( 1 9 3 6 ) i i e 明红光与黄光对紫菜叶面积与增长率和氮的 固定率三方面都不比日光差，用红光照射的紫菜，缺少红色几乎成青色。中谷( 1 9 6 1 ) 证明叶状体的生长以短波长( 4 6 0 n t o ) 为好，长波长( 7 0 0 h m ) 下生长不良且偏于红色。 岩崎、松平( i 9 5 8 ) ，须藤( 1 9 6 1 ) ，岩崎( 1 9 6 5 ) 对光周期的研究认为紫菜的生长需要 一定时期的暗条件。紫菜叶状体对温度的要求，不但因种类而不同而且也随着生 长发育而变化。 坛紫菜从孢苗期到幼苗期生长所要求的温度相对比条斑紫菜要高。林增善 ( 1 9 8 2 ) 根据坛紫菜生长速率与鲜干比的研究认为浙江北部坛紫菜叶状体长度和宽 度日平均增长率以1 1 月份为最高，以后随水温的降低而逐月递减，藻体的生长速 度在浙江成马鞍形。温度还影响到雌雄生殖细胞的形成，坛紫菜果孢子形成的水 温比条斑高，果孢子萌发温度范围为7 2 6 c ，在福建1 0 月中、下殉即出现精子 囊和果孢子，在温度低于l o 以下时，形成果孢子较少，如果天静温暖时形成数 量较多。坛紫菜的营养藻丝，生长温度范围为7 2 8 c ，以1 5 2 8 较适宜，其 中尤以2 0 2 5 为生长最适温度，如果超过3 0 以上，藻丝部分死亡，但忍耐高 温的程度比条斑紫菜高。据刘恬敬等( 1 9 8 1 ) 试验证明坛紫菜丝状体形成孢子囊枝的 温度为2 3 3 0 c 左右，以2 8 c 为最适温度。坛紫菜壳孢子形成的温度比条斑紫菜 需要的温度高，形成壳孢子的温度范围为2 0 3 0 c ，适宜温度为2 5 2 8 c ，而以 2 7 2 8 下形成的量为最多。坛紫菜的壳孢子形成以后，在1 7 1 8 。c 范围内可以 放散，但放散的适宜温度为2 3 2 5 c ，比它们的壳孢子形成的适宜温度要低。因 坛紫菜的细胞发育研究 第一部分文献综述 此经过夏季转向秋季壳刨子放散时，温度下降是必不可少的条件。光照的强度和 光周期不但对紫菜丝状体的颜色有着明显的影响而且影响生长发育的各个阶段。 光照强度对果孢子萌发的影响比光照时间的影响大。坛紫菜的果孢子萌发以1 0 0 0 米烛1 5 0 0 米烛为适宜光照，壳孢子形成的最适光强是5 0 0 1 0 0 0 米烛此外短日 照也是壳孢子形成的必要条件，在光时8 1 0 h d ，形成的较多，1 4 2 4 小时日的 长日照不形成壳孢子。汤晓荣、费修绠( 1 9 9 3 、1 9 9 4 、1 9 9 7 ) 在前人的基础上 郑宝 福( 1 9 7 9 ) ，陈国宜( 1 9 8 0 、1 9 8 4 ) 试验证明较高光强对坛紫菜丝状体的生长和壳孢子 囊的形成都有促进作用，丝状体在1 7 2 1 时生长快速健康而在高于2 9 是开始 死亡，藻丝的色泽随光强的增加由红色趋于黄色，不同温度下形态和色泽与生长 速度和发育程度有关。他们认为利用光温调控丝状体的生长发育进程可以获得理 想的发育阶段的材料“。 总之，光温对紫菜的生长发育的作用是共同的，而相关的生理过程与温度也 是密切相关的。因此它们的作用往往是同时的，不可分割的。近年来丝状体的研 究正有宏观阶段向细胞与分子水平发展，但丝状体品系的选育还处于较低水平， 需要对品系的纯度和稳定性做进一步的研究，对光温调控丝状体发育的具体条件 的研究还需要扩展“。 6 2 营养盐等对紫菜发育的影晌 c 、h 、o 、n 、p 、m g 、c u 、m n 、z n 和m o 是所有藻类生长所必须的，n 、p 、 f e 可能是限制海藻生长的主要元素。在自然海水中氮主要以无机氮州2 、n 0 3 、 n 0 2 、n h 4 + ) ，可溶性有机氮( 尿素、游离氨基酸、酰胺和维生素) 和颗粒性有机氮( 有 机氮碎屑、细菌和浮游植物成分) 的形式存在，且在海洋中n 往往成为初级生产力 的限制因子，在海水中总氮的浓度平均为3 5 7 i t m o l l ( w h i t f i e l de ta 1 ，1 9 8 1 ) 。根 据岩崎和松平( 1 9 5 6 ) 的试验认为对紫菜的生长以硝酸氮为最好，氨态氮的吸收速度 虽然快，但不如硝酸氮。 在天然海水的p h 条件下( p h = 8 2 ) ，p 主要以三种游离形式存在于一个平衡体 系中 2 0 。c 下，h p 0 4 2 - 占9 5 ；p 0 4 n 占1 ；h 2 p 0 4 占2 5 ( t u r n e re ta 1 1 9 8 1 ) 。全 球海洋中p 的平均含量是1 9 4 1 _ i m o l l ( w h i t e f i e l de ta 1 ，1 9 8 1 ) ，约为0 0 6 m 【g l 。紫 菜利用p 的主要形式是无机正磷酸盐，有机磷有时可经磷酸酯酶或磷酸化酶水解 后被利用，p 一般不被认为是海洋中的限制营养盐。紫菜叶状体除需氮肥外，对磷 肥的要求估计为o 0 7 o 0 8 之间岩崎和松平认为单细胞具有贮蓄磷肥的能力。 坛紫菜的细胞发育研究 第一部分文献综述 沈颂东( 2 0 0 0 ) 对条斑紫菜细胞培养时发现p 对细胞的生长速度未见明显影响，不加 n 元素的消毒海水虽可以短时期内维持紫菜细胞和原生质体的活性，但对其发育 不利，培养8 天后就表现出缺素症状，只要氮素不缺乏，即使完全不添加p ，紫菜 细胞一样可以正常发育。 6 _ 3 维生素、金属离子、激素及抗生素等对紫菜发育的影响 一般藻类培养基介质中加入三种维生素( v b l 、v h 、v b l 2 ) ，v b l 2 是广泛存在的。 岩崎和松平( 1 9 5 7 ) 研究了在e d t a 溶液中加f e 、m n 、c o 、c u 等微量元素，对紫 菜叶状体的生长有明显的促进作用，维生素b 。2 ，谷氨酸钠、硫化钠均能促进紫菜 的光合作用。h o p k i n ( 1 9 7 8 ) 研究了h g 对极北海带的生理影响。侯和胜( 1 9 9 7 ) 研究 了c u 2 + 、c d 2 + 、z n 2 + 对裙带菜配子体的毒性c u 2 + 的毒性最大；c d 2 + 低浓度时有促进 生长的作用，一般而言其毒性大小的顺序是h g c u c d a g p b z n f e r i c e ( 1 9 7 3 ) ，r a i ( 1 9 8 1 ) ，沈颂东( 2 0 0 0 ) 试验认为f e 2 + 作为紫菜生长的必须营养盐， 在海水中是缺乏的，c d ”对紫菜细胞的色素体恢复和细胞的早期生长有一定的促进 作用，金属离子对细胞的毒性大小是z n 2 + c d 2 + f e 2 + m n 2 + 。 木下、寺本( 1 9 5 8 、1 9 5 8 ) 的试验证明赤霉素( 1 肛p l ) 对紫菜藻体有促进作用，下 茂、中谷( 1 9 6 4 ) 用o 1 p p m 的激动素对紫菜幼苗进行实验结果也有促长作用。寺本、 木下( 1 9 6 0 ) 报告了赖氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、鸟嘌呤、尿酸等对生长都有促进 作用。沈怀舜、王素娟( 1 9 9 6 ) 进行了条斑紫菜细胞对氯霉素及四环素的敏感性实验 及半致死量的测定并证明它对氯霉素很敏感，对四环素也有一定的敏感性。低浓 度的对紫菜细胞不敏感的抗生素对紫菜细胞培养能提高成活率u “。 6 4 坛紫菜主要成分的分析与测定 英国人s t a n f o r d ( 1 8 8 1 ) 从狭叶海带中发现了褐藻酸，此后人们对海藻的化学成 分、含量、化学组成结构及提取方法等进行了多方面的研究，近来，人们又对海 藻营养生理、氨基酸、蛋白质、酶、色素及糖代谢等方面进行了深入的研究。 r e n n ( 1 9 8 9 ) 在第十三届国际海藻会议上题为“海藻与生物技术：不可分割的伙伴” 的报告中指出，海藻多糖独特的生物化学性质在现代生物技术中发挥越来越重要 的作用。曾繁杰、蒋丽金等( 1 9 9 1 ) 结合采集地点、时间、加工等方面在原有氨基酸 组分测定的方面对坛紫菜的氨基酸营养成分进行了分析和讨论u “。谢土恩、林增 善等( 1 9 9 4 ) 对浙江坛紫菜的1 7 种氨基酸组成含量进行了两年的重复分析。陈人弼 坛紫菜的细胞发育研究第一部分文献综述 ( 1 9 9 9 ) 用g b 5 0 0 9 标准方法对不同时期坛紫菜的蛋白质、脂肪、纤维素等进行了测 定，同时对氨基酸、维生素进行了分析。曾繁杰等( 1 9 9 1 ) 对红藻坛紫菜中r 一藻蓝 ， 蛋白的分离和特性进行了研究分析发现，坛紫菜的r 一藻蓝蛋白刺激人b 淋巴细 胞增殖，当细胞促丝分裂剂s a c ，f h a 或抗人l