（细胞生物学专业论文）抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究.pdf

摘要 以香瓜枯萎病菌和玉米弯孢叶斑病菌等菌作为供试对象，对辽宁地区4 0 种有毒植物提取液进行了抑菌活性测定，并对其中活性较高的枫杨作了较为深入 地研究，得出如下结论： 1 4 0 种有毒植物样品9 5 乙醇浸提液对两种病原菌离体活性测定表明：当质 量浓度为0 0 5 9 m l 时，枫杨抑制率高于7 5 ，其它植物抑制效果明显低于枫杨； 枫杨多种有机溶剂浸提液测定结果表明，丙酮提取液0 0 5 9 m l 对两种抑菌率达 到8 0 以上，抑菌圈直径较大，达到3 9 2 m m 、3 5 5 m m 。 2 在单因素实验基础上，利用正交实验设计，得出枫杨最佳提取条件为：料 液比1 ：3 0 ，浸提时间2 4h ，浸提次数4 次，浸提温度6 0 时浸提率最高，单因 素实验结果与正交实验结果基本一致。 3 以香瓜枯萎菌和玉米弯孢菌为指示菌进行枫杨提取液抑菌试验，结果显 示：枫杨提取液最低抑菌浓度为2 5 m g m l ，最小杀菌浓度为5 m g m l ；分别采用平 板菌丝速率法、孢子萌发法、菌丝干重法、显微观察法测定枫杨提取液对病原菌 生长的影响，发现它对香瓜枯萎菌和玉米弯孢菌生长具有明显的抑制作用：对枫 杨提取液稳定性观察发现，枫杨丙酮提取物的抑菌活性在酸性条件下较好，受温 度影响较小。 4 枫杨丙酮提取物与吐温8 0 等量配置成乳油后，其2 0 0 倍液( 5 m g m 1 ) 抑菌效果与多菌灵可湿粉剂1 0 0 0 倍液、代森锰锌1 2 0 0 倍液作用相似。通过平板 菌丝生长速率法对三者活性进行比较，代森锰锌的抑菌活性高于枫杨提取物乳油 和多菌灵粉剂，但枫杨提取物季l 油的抑菌作用高于多菌灵粉剂。枫杨提取物乳油 浓度在2 5 m g m l - - l m g m 1 时，对香瓜种子萌发有促芽和壮苗作用。枫杨提取物乳 油对供试大豆的苯丙氨酸解氨酶活性和多酚氧化酶活性均有一定的促进作用 关键词：枫杨；提取物；生物活性 a b s t r a c t t h e r ea r e a l o t o f p l a n t 雎u r 溜i n l i a o n i n g , s o i t i s 加i d e a l p l a c e f o r u f l t o s e a r c h n c wf u n g i c i d e sb o r np l a n t s t h er e s e a r c hw a f tb a s e do ns c r e e n i n ga n t i f e n g a lp l a n t si n u a o n i n 孚mf i i n g i s 蛐o f4 0p l a n t s9 5 e t h a n o le x t r a c t sw e ms y s t e m a t i c a l l yt e s t e d w i t hf u s a r i u mo x y s p o r i u m f s p m e l o n i s 、c u r v u l a r i al u n a t ab o e d 、e r w i n i ac a t o t o v o r a , a n dw ef o u n dp t c r l o c a l y as t e o n o p t e t ah a dh i g h e ra n t i f u n 蛐a c t i v i t y s oi tw a ss t u d i e d f u r t h e r t h er e s u l t sw c i ea sf o n o w i n g ： 1 b y 咖t h ev i t r oa c t i v i t yo f 加p l a n ts 缸l p l 伪9 5 e t h a n o le x t r a c t s , t h c c o n c e n t r a t i o ni so 0 5 酣m l , a 细2p a i l l 啦r a l i c 哪，w ef o u n dt h a tt h ea m 翟魍 i n h i b i t i o no fn 盯缸y as t c o n o p t 曲aw a sm o 犯t h a n7 5 ，a n dw a sb e t t e rt h a n m h c b s e v e r a lm 蛐s o l v e n te x t r a c t so fn 鲫眦缸y as i 玳枷s h o w e dt h a tt h e a c e t o 配e x t r a c t si n h i b i t i o nw a sm o r et h a n8 0 1 9t h ci n h i b i t i o n 五m 嚣t h e yf o r m e dw c b i g g e r ，w h i c hi s3 5 5 m m 、3 9 2 m mr e s p e c t i v e l y 2 o nt h eb a s eo ft h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s t h er a t i oo ff 棚m a t e r i a lt oa c e t o n e 、 e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e 、e x t l a c t i o nt i m e 、e x t r a c t i o n 缸t c $ w f l cs e l e c t e da sf o u rf a c t o r st o d e s i g nt h eo l t h o g o n a lt e s ta n dt h eb e s ta 山翟6 c o n d i t i o nw a f to b t a i n e d t h cm a i n r e s u l t sf o l l o w e da sb e l l o w ：t h er a t i oo fr a wm a t e r i a lt oa c e t o n ei s1 ：3 0 、a 【n a d i o n t c m p c l m u r ci s6 0 、c x u a c t i o nl i m ei s2 4 h 、e x t r a c 6 mt i m e sj sf o r t h 3 f u s a r i u mo x y s i m f i u m l s p m e l o n i s 、c u r v u l a r i al u n a t ab o e dw 廿 e s e l e c t e da ss e n s i t i v e b a c t e r i at ot h es t u d y 。a n dt h em s t f l t ss h o w e dt h a tt h e ci s2 5 m g m l , w h i c hi s d i l u t e e d4 0 0t i m e s , t h em b ci s5m g m lu s i n gt h em e t h o d ss u c ha sg r o w t h 叩怫a d i n g m l q h o d $ 、r a t eo fg e r m i n a t i o n 、d r yw e i g h to fh y p ha a s s a yf o u n dt h a tt h ei n h i b i t i o n a c t i v i t yw a so b v i o u s t h ci n h i b i t i o nw a ss t a b l ei na c i dc o n d i t o n , a n dt e m p e r a t u r eh a s s m a l la f f e c to i li t 4 t h ce m u s l f l a b l es o l u t i o nw 鸹m a d eo ft w e e n - 8 0a n da n 瞄d so ff u s a r i u m o x y s p o r i u m f a p m d o n i s w h e ni tw a sd i l u t e d2 0 0t i m e s ( 5 m g m 1 ) ，i t si n l u b i t i o ne f f e c t w a ss i m i l a rw i t hc a r b e n d a z i mw pd i l u t e d1 0 0 0t i m e sa n dm a n c o z e bd 丑u t e d1 2 t i m e s u s i n gg r o w t hs p r e a d i n gm e t h o d s , w c ：f o u n dt h a tt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo f f u s a r i u mo x y s p o r i u m f s p m e l o n i se x t r a c t sw 越m o r ee f f e c t i v et h a n d a z i mw p p l e s st h a nm a n c o z e b t o m a t os e e d g e r m i n a t i o n t e s ti n d i c a t e dt h a tf u s a r i u m o x y s p o f i u m f s p j n e i o n i sa n 瑚虻娃伽e m u l s i o nc o u l dp r o m o t et o m a t os e e dg e r m i n a t i o n a n dg r o w t ha t2 5 m g m l l m g m lm g r n l ，a n di ta l s oh a ds o m ca c t i v i t yo np a la n d p p 0 k e yw o r d s ：f u s a r u ma r y s p o r i u m f s p m e l o n i s 、e x t r a c t 、b i o l o g i ca c t i v i t y 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文 中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的 研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均己在论文中做 了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 琚娑缈 f i ：= j 期：砷、舌； 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密 的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：移兴侈 指导教师签名：蓑缉 同期：柳b 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 第一章植物源杀菌剂的研究进展 前言 农业是全球化的主产业，随着科学技术的发展，化学农药已广泛应用于农业 生产，并有效的提高了土地单位面积的产量，从而提高经济效益，满足人们对粮 食、蔬菜、果品的需要。据统计，世界谷物生产每年因虫害损失1 4 、病害损失 l 傩、草害损失11 ，使用农药可挽回1 5 一3 0 农作物损失。但是，由于化学农药 的大量使用，导致许多负面作用的产生，出现了生态环境被破坏、人畜和有益生 物中毒等诸多问题。同时化学物质在粮食、蔬菜及饲料等中的残留，极大影响了 人类生存质量。 植物源农药是利用植物根、茎、叶、花、果实等部分分离到的成分加工成的 制剂，是生物农药的重要组成部分“1 ，具有低毒、低残留、对人畜安全、对环境 友好、不易产生抗药性等优点。植物体内的抗菌化合物是植物体内产生的具有抗 菌活性的次生代谢物质，因而，植物源农药包括植物体内次生代谢物质和转基因 植物农药，其中植物体内次生代谢物质又包括杀菌剂、杀虫剂、除草剂、抗病毒 剂等，由于杀虫剂的研究远远多于杀菌剂，因而我们更应该投入较大的力量进行 杀菌剂方面的研究。 研制植物源杀菌剂对我国具有重要的意义。首先，与发达国家相比，我国杀 菌剂品种偏少，大部分杀菌剂品种都是仿制的，在国际不断加强知识产权保护的 新形势下，我国农药的发展必须由仿制走向创制，加速农药的研究与开发脚。另 外，我国作为化学农药使用量居世界第一的国家，对化学农药的控制已经到了非 常紧迫的时候。 辽宁地区幅员广大，地处温带，兼有丘陵、平原和海洋等气候特点，植物资 源十分丰富尤其是。有毒植物”资源种类众多，它们是开发生物农药、生产 植物源杀菌剂的天然宝库。对有毒植物进行研究，不仅可以得到大量新的植物源 农药品种，同时也可以挖掘出新的农业生产增长点，扩大有效的植物资源，优化 农业生产结构、促进农业生产产业化进程，有力的推动农业生产向无公害、有机 化和农产品生态化方向发展 1 植物源杀菌剂研究概况 1 1 杀菌植物资源 植物是地球上抑菌活性物质的天然宝库，地球上可作为植物农药的资源十分 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 丰富。据估计，地球上有毒植物约占植物种类总数的4 ，而植物化合物的总数可 能超过4 0 万种，其中有1 0 0 0 0 多种植物次生代谢物质已通过化学鉴定，是农药先 导物的巨大资源。植物在与昆虫等有害生物的长期协同进化过程中所产生的绝大 多数次生代谢物质，如萜烯类、生物碱、类黄酮、酚类、独特氨基酸和多糖等均 具有杀虫和杀菌活性。据g r a n g e 和a h 腿d 报道，约有2 4 0 0 种植物具有控制有害 生物的活性，而我国近3 万种高等植物中已查明约有近千种植物含有杀虫、杀菌 活性物质，中国土农药志记载有8 6 科2 2 0 种植物性农药嘲，主要包括杀菌剂、 杀虫剂、除草剂和抗病毒剂。我省幅员辽阔，资源丰富植物种类众多，资源丰富， 开发植物源农药的潜力巨大删，主要集中在菊科、百合科、豆科、蓼科、十字花 科、卫矛科、大戟科等。 当前，很多植物已经成为农药的直接来源。试验表明f l e d e r ah e l i x 、s a l i x a l b a 和b r y o n i ad i o c a 三种植物提取物在温室和田间条件下对梨火疫病有活性 嗍；k a r a d e 等( 2 0 0 0 ) 发现m e n t h a a r v e n s i s 提取物对链格孢有抗菌活性删；桉树、 大蒜、金盏花、青黄菊、荨麻能有效控制葱白腐小菌核菌生长咖；d e t a r 等( 1 9 9 9 ) 研究发现番荔枝、银胶菊提取物对菜豆壳球孢有生物活性嘲；蒲公英中的一种倍 半萜具有抗菌活性，从e u p a t o r i c u mr i p a r i c u m 中分离出了具有抗菌活性的色烯 洲；k r i s t e n s e n 等( 2 0 0 0 ) 从甜菜叶中分离出蛋白i w f 5 ，l o p p 硼能有效抑制甜菜尾 孢嘲；玫瑰草油对丝核菌有活性咖；o j a l a 等( 2 0 0 0 ) 研究表明皱皮欧芹和芸香提 取物对立枯丝核菌有很高活性；t e l l e z 等( 2 0 0 1 ) 发现f l o u r e n s i ac e r n u a 叶提 取物对三种炭疽病有抑制作用嘲：l e t e s s i e r 等( 2 0 0 1 ) 研究表明牛膝草精油对稻 瘟病菌具有一定的抑菌作用咖；b h a t ( 2 0 0 1 ) 研究发现o x y s p o r ap a n i c u l a t a 对瓜 果腐霉有活性册；r a s t e g a r ( 2 0 0 1 ) 研究表明t r a c h y s p e r m u m c o p t i c u m 对瓜果腐霉、 立枯丝核菌具有活性呻1 ：e k e s t e e ne u c o m i s 发现a u t u m n a l i s 对立枯丝核菌、灰 葡萄孢等7 种病原菌具有活性；l u s i a l a n i c i 等从十字花科植物中分离到1 1 种芥子油苷及其酶解产物，在对8 种真菌活性研究中发现，芥子油苷本身不具有 抗菌活性，但其酶解产物具有抗立枯丝核菌的活性嘲；r a f i k a l i a m o m i n 首次报 道了早芹种子中能分离提取出具有抑菌活性的物质芹菜籽交酯1 ：k o u s h i k s e e t h a r a m n 等从禾本科植物高粱属中分离出抗真菌蛋白质( a f p ) 能抑制 f u s a r i u m m o n i l i f o r m e 等真菌孢子的萌发吲；e b e r h a r d 等( 1 9 8 7 ) 用小孽碱防治 马铃薯晚疫病成功并获得专利“；v i n c e n t 等( 1 9 8 6 ) 用硫酸小孽碱处理大麦种 子减轻了大麦网纹花叶病毒的危害嘲； o h t a n ik 等研究发现，很多树叶及木材 2 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 不完全燃烧产生的物质中含有大量抑菌和杀菌作用的脂肪酸、醛及酚类物质对多 种致病菌具有抑制作用呻一；r e i c h e l 研究发现海藻类对多种食品腐败菌具有抑 菌活性，尤其是对革兰氏阳性细菌具有较强的作用枷嘲；g r a y e rr j 等报道白花 羊蹄甲、落花生等有明显的抑菌活性删；b f o g l i a n i d e n g 对来自苏格兰的5 0 种 火筒树科的抗微生物活性进行了测试，发现4 9 种植物对尖廉孢有不同程度的抑制 作用咖；对4 8 科1 3 9 种植物的不同部位的抑菌活性进行了研究表明，8 3 的植物 具有不同程度的活性，在花的部分一般具有较高的抑菌作用 7 1 ) ，叶为6 2 ， 茎为4 6 ，根为4 6 。另外，研究表明，相思树、雾冰藜等提取物对番茄晚疫病有 防病作用：蛇床子中分离出甲氧基欧芹芬在1 2 铷2 5 u g m l 时抑制真菌生长；高 良姜中分离出醋酸基胡椒乙酸酯具有明显的抗菌活性；三叶草，芥末、楝油、肉 桂对尖孢镰孢霉具有较强的抑菌作用；木槿具有一定的抑菌作用；芦荟对曲霉菌、 链孢菌具有抑菌作用；e u g e n i a a r o m a t i c a 水提取物对a l t e r n a r i a 具有一定的作 用；印度3 6 种植物具有抑菌活性；巴勒斯l e _ j 也区小茴香等8 种植物有抑菌作用 披针叶野决明的醋酸提取物对苹果炭疽菌子囊孢子有活性，抑制孢子萌发比抑制 菌丝生长能力强：葱白、胡椒、芥末、万寿菊等对菌核病菌具有一定的抑制作用； 大蒜、洋葱和姜提取物对豌豆白粉病具有很强的抑菌活性；万寿菊、芥末油水浸 液对大麦条斑病菌的抑制作用。 植物源农药被国家发改委和科技部列为2 1 世纪优先发展产业，我国在植物源 杀菌剂的研究方面也取得了一定的进展。朱振东等从黄连中提取的生物碱1 0 0 0 倍粗提液对水稻白叶枯病的防治率与3 5 的叶青双1 0 0 0 倍液仿效相当哪；席玉芳 等报道了大蒜和洋葱提取物对柑桔青、绿霉具有较强的抑菌作用研；以银杏中生 物活性物质b 的化学结构为模板，莱阳农学院仿生中心成功的合成了拟银杏杀菌 剂绿帝，它对多种病原菌有显著的抑菌和杀菌作用嗍：莴苣、苍耳、苦豆子、 锦草、板蓝根、马齿蔸等多种植物也具有较强的抑菌活性嘲；俞大昭等发现1 7 科 3 2 种植物中有2 7 种植物粗提液具有明显抑菌活性“”；操海群o ”等发现毛金竹、 毛竹、青皮竹、短穗竹等竹提取物7 2 小时内对小麦赤霉病菌的菌丝抑制率在8 0 9 6 以上；杨胜远“o 等研究了4 0 种中草药提取物对芒果蒂腐病的抑菌作用，发现五倍 子对病原菌抑菌效果最好，并发现其主要的活性成分为3 ，4 ，5 - 三羟基苯甲酸： 白头翁提取液对小麦赤霉病有较高的抑制率，抑制菌丝扩展，使菌丝萎缩“：山 鸡椒挥发油中的柠檬醛是抑制尖孢镰刀菌、蠕孢菌、格孢腔菌生长的有效成分“”； 苦皮藤假种皮中分离到的阃苯二酚、麝香草酚等对玉米小斑病有较好的抑制作用 3 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 “”；大蒜的有效成分大蒜素，具有广谱抗菌活性，可抗细菌、真菌、线虫“”；厚 朴树的自然落叶中提取的总酚化合物，对禾赤色链孢霉、立枯丝核菌等l o 种真菌 有很强的抑制作用，盆栽和大田试验均显示出较好的防治效果o ”；兰香、桉树植 物叶片抽提物的l0 9 6 水谘液对黑胫病的抑制率达到8 4 4 _ _ 8 6 5 “”；库拉索芦荟 中分离出的酚性与非酚性成分的抗菌活性可与新霉素、四环素相匹敌；苏美灵研 究发现大多数红树植物叶的粗体液对柄锈菌具有较强的抑菌作用o ”；庄惠如等用 纸片扩散法测试福州2 5 种常见蕨类植物的抑菌活性，发现其中2 3 种蕨类植物醇 提物至少对1 种供试病原菌有活性，其中鳞毛蕨科4 个种显示出较强的抑菌能力 嘲；烟草、茶饼、鱼藤、雷公藤等植物的提取物能抑制某些病菌孢子的发芽和生 长，或阻止病菌侵入植株”：红藻产生的活性物质在化学组成上不仅多种多样而 且许多次生物质含有卤素，因而被认为是产生抗菌物质最丰富的藻类资源；辛 玉成等用8 种中草药配置了6 x - 0 8 复合剂，并经室内测定和田间药效试验表明对苹 果树腐烂病具有良好的作用侧：张国珍等发现麻黄油和细辛油有一定的抑菌作用 蹦；薄荷等粉碎物以土重0 5 - - 0 1 的用量处理严重感染棉花枯萎病的土壤，仿 效达4 3 9 * - 7 4 3 ；赵博光从苦豆草种分离出了7 种具有抑菌活性的生物碱。； 冯俊涛等从5 6 种中草药中发现芦苇、龙葵具有一定的抑菌活性汹1 ；李永刚等研究 表明由苦参、黄柏等1 0 余种中药所组成的混剂离体和活体活性均较好。当前国 内植物杀菌剂的研究主要集中在乌药、大蒜、甘松、麻黄、细辛、胡敏藤、连翘、 黄柏、板蓝根、烟草、茶籽、艾叶、鱼腥草、苍术、藿香、山奈、香茅、苦参、 鱼族、厚朴、银杏、苦皮羼等植物上，它们具有不同程度的抗菌、抑菌活性。 1 2 植物源杀菌剂的有效抑菌成分 植物杀菌剂是利用有些植物里含有的某些抗菌物质或诱导产生的植物防卫 素，有效抑制某些病原菌的生长发育。这些化合物是植物体内产生酌多种具有抗 菌活性的次生代谢产物，包含了生物碱类、类黄酮类、蛋白质类、有机酸类和酚 类化合物等许多不同的类型，如毛蒿素、皂角苷类。当前，从植物中提取的主要 杀菌成分包括萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮化合物“。在不 同植物中所含抗菌化合物的种类可能相同也可能不同，如苦参根中含有苦参酮和 槐属二氢黄酮，厚朴叶含有厚朴酚，大黄含葸醌类化合物( 大黄酸、大黄素) 。五 倍子含鞔酸，甘草含甘草甜素、甘草酸，桉叶含桉叶油等。不同有效成分对不同 微生物可能具有不同程度的抑制作用，即广谱抗菌能力；在同一种植物中可能存 4 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 在不同的抗菌成分，包括酚类、生物碱类、皂苷类、内脂类化合物、含硫化合物、 黄酮类、萜类、挥发油，每种类型又含有多种结构，具有不同的抗菌作用。 报告指出，从受伤的紫玫瑰中分离得到的倍半萜类物质能抑制扁豆枝孢霉的 生长；辐射松针叶中氧化双萜类化合物能够对针红斑病菌生长产生阻碍作用鲫； 异喹啉小孽碱可抑制导致根腐烂的乩s w a s e y i 真菌删；香蕉皮中的胺类化合物对 香蕉炭疽病有一定的抑制作用：芒果皮中的芳香族化合物间苯二酚混合物可抑 制交链孢霉的生长，茶多酚对常见的细菌具有一定的抑制作用：从北美干草中分 离得到的三种黄酮类化合物g l a b r a n i n 、g l e p i d o t i n a 、b 具有一定的抑菌作用嘲； 脂肪类化合物具有定的抑菌作用，从野芋中分离得到的9 ，1 2 ，1 3 - - - - 羟基一( e ) 一1 0 - 十八烷酸对甘薯长喙壳菌具有一定的抑制作用删；同样，科学家也发现植物 中的有毒蛋白也有很强的抑菌活性哪3 ，苦参根中的蛋白质苦参凝集素对棉花枯萎 病菌等真菌具有抑制作用嘲。 具有抗菌、杀菌活性的植物，其活性成分分布在植物的根、茎、叶、花、果、 种子等不同部位上。同种植物不同部位成分的含量亦存在差异口订。研究发现，厚 朴、银杏的叶片抑菌活性较高：植物的花具有较强的抑菌活性，其余的顺序是叶、 茎、根例。随着分析化学、结构化学、分析仪器的快速发展以及研究手段的日益 完善，天然产物中的有效抑菌、抗菌活性物质得到了分离纯化和结构鉴定，这些 成分在离体和活体中表现出了一定的抗菌作用嘲。 1 3 植物源农药有效成分的提取及结构鉴定 天然产物的提取方法很多。常用的提取方法包括浸溃法、渗漉法、水蒸气蒸法、 煎煮法、回流法、连续回流法。随着科学技术的发展，近年来又出现了超l 临界流 体萃取法、微波辅助提取法、超声技术提取法、真空液相层析等新方法口1 。这些 方法的使用提高了提取和分离的效率。在提取过程中，一般采用系统溶剂进行提取， 包括溶剂连续提取和溶剂平行提取，前者可以使植物中活性成分不造成漏筛，后者 能确定最佳的提取溶剂。如用水、9 5 乙醇、丙酮提取连翘中的抗菌有效物质，发 现9 5 乙醇提取物的抑菌效果最强嘲；从k u m a z a 中提取活性物质时加入一定量的纤 维素酶可使抗菌物质活性增强”。提取中可加入提取辅助剂如酸、碱、表面活性剂、 纤维素酶等提高提取效能，增大有效成分的溶解度，增大有效成分在提取过程中的 稳定性及减少某些杂质。 另外，对单体的官能团、结构片断、基本骨架或平面结构尤其是立体结构认 5 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 定方面发展了高分辨质谱、二维核磁共振谱、单品x 射线衍射法陶。应用这些技 术从黑胡椒果实中分离出了胡椒素、墙草碱嘲，从尼亚那的茎中分离出了尼鱼丁 和脱氢尼鱼丁”，从蕃荔枝果食中分离出了a n n o n i n 和n e o a n n o n i n 四氢呋喃脂肪 酸内酯化合物侧，这些化合物对果蝇都有很强的毒杀作用：吴文君等通过活性追 踪的方法，从苦皮藤根中分离出的苦皮藤素一i 、i i 、经鉴定为二氢沉香呋 喃类化合物1 ；从瑞香狼毒中分离出的伞形花内酯、瑞祥亭和狼毒色原酮3 种杀 虫活性成分对菜粉蝶5 龄幼虫有较强的拒食活性。 1 4 植物源农药的研发现状 目前，植物源农药的研究和开发主要分为四个层次：1 ) 从天然产物中寻找农 药活性化合物，单体和混合物直接用于加工农药，如烟草、除虫菊、印楝、鱼藤、 马钱予等；2 ) 不同植物的活性成分有机的、合理的配伍，如苦参碱烟碱乳油、雷 公藤银杏乳油等；3 ) 人工模拟合成植物源化合物，如云台素内酯、吲哚乙酸等： 4 ) 以植物源农药活性成分为先导结构筛选农药，例如以除虫菊素为先导物创制的 新烟碱类似物；以烟碱为先导物刨制的新烟碱类似物；以发酵苜蓿中的双向豆素 为先导结构合成的抗凝血杀鼠剂洲。以植物源活性成分为先导研究开发的农药其 效果明显大于自身，如多种除虫菊酯杀虫剂的活性超过了除虫菊素，而且克服了 先导物对光的不稳定性。因此近年来在新农药仓制中成功引进了组合化学、人工 自动合成、定向合成技术、生物等排理论、亚结构连接法以及化合物活性与结构 的定量关系等高新技术，极大地促进了新型生物农药的研发嗍。 目前国内开展的研究主要处于前两个层次，所涉及的植物包括除虫菊、烟草、 鱼藤、苦参、印楝、川楝、银杏、苦皮藤、藜芦、异羊角扭，苦豆子，第三、第 四层次还处于初级阶段。虽然植物农药业在我国已有5 0 多年的历史，但始终未能 形成规模产业，而国外的研究和投入已经集中在第三、四层次上了吲 从最近国内外研究杀菌植物的发展动态来看，植物药荆的研究也正在发生一 些变化，对我们今后的植物研究具有重要的启示，主要有以下几点：一是从植物 中易得到的或含量大的物质的研究发展到对难以得到的或含量微小的物质的研 究；二是在研究深度上，由植物化学活性物质分析发展到对植物中活性物质的生 物合成途径的探索；三是在研究对象的范围上应该由传统的杀虫植物筛选研究突 破到常规植物种类和特有植物种类进行大胆创新研究 6 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 2 枫杨的抗菌杀虫作用研究 2 1 枫杨的分类地位及分布 枫杨( p t e r o c a r y as t e n o p t e r ac 西d 为胡桃科枫杨属落叶乔木，高可达3 0 m 。 该属由k u n t h 于1 9 8 4 年建立，中国植物志所描述的现代枫杨属包括8 种即 枫杨、高加索枫杨( 只f r a x i n 打w i a ( l a m ) s p a c h ) 、水胡桃只r h o l f o l i a 贷出g t z u c c 越南枫杨只t o n k i n e n m s ( f r a n c h ) d o l e 以及湖北枫杨( 只h u p e h e n s i s s k a n ) 、华西枫杨( 只i n s i g n i s r e h de tw i l s ) 、甘肃枫杨( 户m a c r o p t e r a b a t a l ) 和云南枫扬( 尸d e l a v a y lf r a n c h ) m 。枫杨原产于我国，现主要分布在中国大 陆和台湾地区以及邻近的韩国，在欧美一些国家和地区也大量引种此树；高加索 枫杨主要分布在外高加索、伊朗以及土耳其；水胡桃分布在我国山东省胶州湾及 日本；越南枫杨主要分布在云南省东南部以及邻近的越南。 2 2 枫杨的化学成分 杨光忠等啕运用c - c - m s 联用仪分离提取了枫扬叶片挥发浊，分析其化学成参影 研究表明：枫杨叶片含有2 一戊醇、b 蛇床烯、b - 红没药烯、十六烷酸、b _ 谷茁醇 以及2 b ，3 b - - - 羧基齐墩果一1 2 烯一2 3 ，2 8 - - - 羧酸等1 1 种化合物。其中2 一戊醇的 含量最多，约l o 7 5 。而b 一谷茁醇及2 b ，3 b - z 羧基齐墩果一1 纠卜2 3 ，2 8 - - - 羧 酸这两种化合物首次在枫杨中分离得到。彭旦明等咖分析认为，枫杨叶中含有如 没食子酸、槲皮素等毒性成分z h o u 等m 报道了枫杨叶中含有一种去甲基倍半萜! 内脂化合物枫杨内脂p t e r o a c t o n e o 2 3 枫杨研发概况 枫杨种植面积广泛，取材方便，国外对枫杨的研究仅局限于作为绿化树种的 探讨。由于其特殊的药理成分，已引起国内一些科研人员的关注，对枫杨叶片提 取液的杀菌作用、杀螺作用，医学作用有些研究报道。但对枫杨在农业生产中的 抑菌作用的研究报道甚少，对枫杨中有效抑菌活性的进一步探索和研究不够。 2 3 1 枫杨的杀虫、抑菌活性 枫杨的杀虫作用已被许多研究证明：江丽萍嘲报道枫杨树叶可以用来治疗鱼 塘中的车轮虫病、草鱼赤皮病和出血病；石鸿文侧用新鲜枫杨树叶捣碎榨出汁液 舫治卷时蛾、茶毛虫和刺蛾等：王宏等1 通过对夹竹桃、枫杨、羊蹄水提物的灭 7 抑菌植物筛选与枫杨杀苗活性研究 螺活性研究表明，3 种植物的水提物都表现了较强的灭螺活性；秦昌华嘲用枫杨 的新鲜叶和凋落物的水浸液处理钉螺，结果表明：两者的水浸液对钉螺均有毒杀 作用，死螺率可达8 0 铲1 0 0 ；彭旦明”1 分析认为，枫杨叶中含有某些毒性成分如 没食子酸、槲皮素等，当积累到一定程度后，钉螺对营养成分的摄取产生障碍， 导致其死亡率升高：肖春等驯在田间进行枫杨枝把、邻羟基本甲醇和性诱剂对棉 铃虫成虫的引诱作用比较，发现应用枫杨枝把诱蛾的效果比邻羟基本甲酵和性诱 效果好。但有关枫杨的抑菌研究少有报道 2 3 2 枫杨的医用研究 枫杨枝叶和花有独特的气味并且具有很强的生物活性，枫杨含水杨酸、内脂、 酚性成分及大量的抗坏血酸等，性苦、温，有小毒，可作为传统中药，具有较高 的药用价值，可杀虫止痒，利尿消肿，治疗火伤，同时对治疗慢性气管炎，蜂窝 炎、稻田皮炎、神经性皮炎、麻风溃疡等有很好的疗效。在我国部分地区民间作 为草药用于治疗癌症。另外在驱风剂、驱虫剂、催吐剂等方面也有应用蛳。刘红 兵等”1 通过采用t s g r 2 1 0 细胞的流式细胞术筛选模型，从枫杨中分离出具有抗肿 瘤活性两种化合物：齐墩果酸、2a ，3b ，2 p 三羟基齐墩果酸 ( 1 ) 齐墩果酸 l ( z ) 2 q ，3 b ，2 3 - 三羟基齐墩果酸 8 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 3 本论文研究目的及意义 植物是抑菌活性物质的天然宝库，很多植物已经成为生物农药的直接来源。 我省“有毒植物”资源丰富，植物体中必将含有大量的杀虫抑菌活性物质。从 国内外研究现状来看，植物源生物农药的研发多数集中在杀虫方面，而抑菌、杀 菌剂的研究相对不足。因此，有必要对这些植物进行抑菌筛选及活性测定，从植 物中寻找可用于生产植物源农药的植物种类和具有农药活性的化合物，直接用于 加工农药，为人工模拟合成植物源化合物、以植物源农药活性成分为先导结构筛 选农药，为今后植物源杀菌剂的仿生合成提供理论依据和应用基础，这对可持续 农业和绿色食品的发展具有重要的现实意义 本研究以我省4 0 种“有毒植物”为试材，以农业生产危害较严重的香瓜枯 萎病菌和玉米弯孢叶斑病菌作为指示菌，筛选出了对两种病原真菌具有较高抑菌 活性的枫杨。依文献检索得知，目前对枫杨的研究在杀虫剂和医药方面有些研究， 但作为抑菌剂及相关抑菌活性研究少有报道。本研究初步探讨了枫扬的抑菌活 性，试图开辟枫杨资源利用新途径。 9 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 第二章抑菌植物的筛选 在植物中寻找新的具有杀菌活性的物质，特别是具有新型分子结构和特殊作 用机理的化合物，正越来越受到各方面研究的重视，也是当今开发、研制新型农 药的有效途径之一。我国有丰富的植物资源，种类众多，可作为植物源农药的 约有2 0 0 多种。我省幅员辽阔。植物种类多样。依据资料记载，其中“有毒植物” 1 2 9 种。本文以我省“有毒植物”为切入点，进行抑菌植物的筛查，试图找到抑 菌活性较高的植物种类，为植物源农药开发奠定基础。 1 实验材料与方法 1 1 供试植物种类 自2 0 0 4 年9 月份始，陆续采集2 5 科，共4 0 种植物，洗净后自然阴干或烘干 处理，分装纸袋、注明标签备用。供试抑菌植物种类如表2 1 。 表2 1 供试抑菌植物种类 t a b l e 2 一lv a r i e t i e so fa n t i f u n g a lp l a n t s 1 0 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 酸浆用眦曲醚全草础a k 础叫大连 苦木科痂饯帕啦i a 勰 臭椿砸b i 蚺叫础妞面l 犯叶z 呵。大连 伞形科j j i 曲础，打粥 走马芹a n g e ! i m叶l 吲? 大连 菊科q 啤曲配蒲公英4 h 肼吧妒勋m全草融脚删大连 艾蒿知仞岫妇叶珂大连 野菊花a 哆础硎m 讥彘花加大连 茵陈力妇岫出 m d 茎叶础m ，z 日盯大连 银杏科a 喇留饵嘲银杏g 蝴脯6 咖 叶埘大连 忍冬科。矿和正f a 双花厶n 妇朔问，铆t v花胁大连 堇菜科h 础i c紫花地丁砌妇粥面m 出全草咖缸脚删大连 杜鹃花科d b m p 杜鹃肋砌越咖幽w 妞m l叶埘大连 大戟科印呻砷- 瞄蓖麻刷咖惜m 脯全草 幻如础埘 朝阳 叶底珠叫r 0 圮弘甩! c j l d f全草眦坤瞳大连 毛蓖科盈暇“越睇 白头翁a 吐s 蕊洳全草确嘲f 咖f 大连 豆科“剁棚删m 合欢月舾4 如地 t 嘲n 口叶z 呵大连 皂角g f b 面* 出面i m 出厶叶埘大连 国槐帅庙帅工叶埘大连 剌槐舶蚰妇班口出础叶埘大连 紫藤瑚纰砌面目硫瓣叶l 啄大连 草木犀j l | 锄h 岫鲥“伽z 积曲叶t e a l 大连 夹饷蝌肋蛔触m夹竹桃饿觚硼啪叶埘大连 萝摩科a d 叩衄自萝摩m 瞳叫b 熵细n 妇m 眦全草h a k 曲皤 。大连 旋花科c 砷椭1 妇打嘲自花0 6 嘲咖舷翻全草h 触曲耐大连 牵牛礴4 出r 豳，l i f 姗根茎嘲期，l 大连 芸香科r u t a c 蝴, 花椒压叫b 咖6 l | 昭，h果加妇大连 槭树科 a r 五角槭a c 盯m o n o叶蛔r 大连 1 2 供试病原菌 香瓜桔萎病菌( f u s a r i u 辨o x y s p o r i u m f s p 薅e l o n i s ) 由大连民族学院植物病 理实验室提供；玉米弯孢叶斑病菌( c u r v m a r i a u n a t a b o e d ) 和白菜软腐病菌 ( f 撙i m ac 丑m 功啪) 为本学院省植物重点实验室提供。 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 1 3 仪器和试剂 仪器：真空泵( 上海亚荣生化仪器厂) ，旋转蒸发器( r e 5 2 a a ，上海亚荣生化 仪器厂) ，植物试样粉碎机( 上海标本模型厂制造) ，压力蒸汽消毒器( y x q _ l s 一5 0 s 1 ， 上海伯逊实业有限公司医疗设备厂) ，全温振荡器( t i z q - - q 型) ，恒温培养箱( 帅 1 1 5 0 0 ) ，超净工作台( s z x 型) ； 有机溶剂：乙醇、四氯化碳、氯仿、丙酮、正己烷等均为化学纯。 1 4 抑菌实验方法 1 4 1 管碟法： 取活化好的菌种若干，在无菌条件下分别挑取一环放入9 m i 无菌水中，振荡 摇匀，制成一系列菌悬液。麦氏比浊管制成1 0 7 个m 1 的菌液。加入到约5 0 的 1 0 0 m l 灭菌p d a 培养基中，混匀，制备带菌平板，然后将灭菌的牛津杯置于培养 基中。每个牛津小杯中加入药液量为2 0 0 u i ，阴性对照为等量的提取溶剂。平皿 先在4 冰箱中放置3 h ，使药液充分扩散到琼脂层中，然后将真菌平皿置于2 8 c 恒温箱中培养，培养7 2 小时后取出观察；细菌平皿置于3 6 恒温箱中培养鸽小 时后取出观察。 1 4 2 生长速率法： 采用琼脂平板法澳i 定供试植物的抑菌活性。 指示菌菌饼的制备：固体真菌p d a 培养基接种指示菌( 香瓜枯萎病菌和玉米 弯孢叶斑病菌) 后，在2 8 下恒温培养7 d ，待菌丝长满平皿后用无菌打孔器在菌 丝平展处获取菌饼，直径大约4 o m m 。 取供试植物提取液( 对照组加入等量的提取溶剂) ，与培养基混合制各平板培 养基。待琼脂凝固后放入生长一致的指示菌菌饼。以不加药剂为空白对照，每处 理重复三次，培养皿直径为9 c m , 每皿培养基1 2 m l 。放置2 8 恒温箱中培养6 d 后，用十字交叉法测量供试真菌菌落直径，用下述公式计算抑菌率。 菌落直径( r a m ) = 测量菌落平均值一4 0 ( 菌饼直径) 抑菌率( ) = 对照菌落直径一含药平板菌落直径对照菌落直径 1 0 嘴 1 5 植物活性物质的提取 i 5 i9 5 乙醇提取实验 1 2 抑菌植物筛选与枫杨杀菌活性研究 将供试植物粉碎后过2 0 0 目筛，每次称取干粉样品l o o g ，用5 倍量9 5 7 , 醇常 温浸泡3 次，每次2 4 h 。合并提取液于真空旋转蒸发仪上减压浓缩，制成l g m l 浸 提液，保存备用。 1 5 2 无菌水提取实验 新鲜叶片l o o g 组织匀浆机粉碎常温下用无菌水提取2 4 小时，提取三次， 合并三次提取液于真空旋转蒸发仪上减压浓缩成l g m l 浸提液，4 放置，备用。 1 5 3 其它溶剂提取液的抑菌试验 将供试植物粉碎后过2 0 0 目筛，称取干粉样品l o o g ，用5 倍量不同有机溶剂 浸泡3 次，每次2 4 h ，合并提取液于真空旋转蒸发仪上减压浓缩，制成l g m l 浸提 液，保存备用 2 结果与分析 2 19 5 乙醇提取液抑菌试验 中等极性溶剂9 5 乙醇可较全面地浸出有毒植物中亲脂性和亲水性成分。4 0 种植物9 5 的乙醇浸提液在工作浓度为0 0 5 9 m l 的情况下，抑菌试验表明，这些 。有毒植物”对供试的指示菌种都有抑菌活性，只是抑菌率大小不同( 参见表 2 2 ) 。其中枫杨的抑菌圈最大，抑菌活性表现突出，对香瓜枯萎病菌和玉米弯孢 叶斑病菌的抑菌圈直径分别为3 2 2 r a m 和3 1 5 r a m ，抑菌率分别为7 8 1 和7 6 3 ，、 另外，侧柏对香瓜枯萎病菌和玉米弯孢叶斑病菌的抑菌率分别为6 2 既和6 1 拍， 洋金花为6 2 眺和6 2 4 ，臭椿为6 3 5 和6 0 1 ，洋金花为6 1 5 和6 2 4 ，花 椒为6 1 9 和6 0 6 ，其余植物抑菌率均低于6 0 ，因而，枫杨在备选植物中具有 较高的抑菌活性( 初期与多菌灵作用相似，参见第五章) ，可作为本研究的研究 对象。 嚷2 - 2 供试植物9 5 7 , 醇提取液对病原真菌的抑菌效果 t a b l e 2 - 2i n h i b i t o r yr a t e so f4 0p l a n t st o2t e s t e df u n g i ( ) 塑堕垫塑堕垄兰塑丝墨堕适丝堑塞 1 4 抑苗植物筛选与枫杨杀菌活性研究 2 2 水提液抑菌试验 将上述各种植物的水提液( o 0 5 9 m 1 ) 进行抑菌活性测定。结果表明( 表2 - 3 和图2 1 ) ，枫杨对2 种病原真菌的抑制率分别为2 7 既和2 8 3 ，其它大部分植 物的水提液对供试菌的抑制率低于2 5 。 就表2 - 2 和2 - 3 比较来看，从植物不同提取液对病原真菌抑菌效果分析，植 物水提液的抑菌效果都比较低。由此可见，大多数植物中的活性物质易溶于有机 溶剂，而在水中的溶解性很差，导致抑菌活性降低。因此，选择合适的有机溶剂 浸提植物活性成分为佳 表2 - 3 不同植物水提液的抑菌结果 t a b