（细胞生物学专业论文）汽油降解菌的分离鉴定及特性研究.pdf

山东师范大学硕士论文 汽油降解菌的分离鉴定及特性研究 摘要 汽油，作为被人们普遍使用的交通能源，在给人们带来巨大便利的同时，由 于提炼、贮存、运输和使用的过程中存在的种种不当，汽油的泄漏事故也在危害 着人类的生产生活。汽油可通过饮食、皮肤接触和蒸汽吸入等途径进入人和动物 的体内，能够引用神经系统的损伤、导致皮肤水肿、造成肝、肾功能异常、影响 免疫系统，严重情况下甚至会引起癌变。汽油污染土壤后，也危害着作物的生长， 影响作物的产量。所以，对汽油污染的治理刻不容缓。 本文论述了汽油降解菌的降解原理、研究进展。作者从美国康涅狄格州 s o u t h e n t o n 的一个加油站附近的土壤中分离到一株能以汽油和辛烷为唯一碳源的 汽油降解菌，并命名为m m 3 。对该菌株进行的一系列生理生化鉴定和l 酊r d n a 测序的分子鉴定，初步确定该菌株是一株铜绿假单胞菌。 分别测算了该菌株在不同的温度、汽油浓度和p h 条件下的生长情况。结果 发现m m 3 的最适生长温度为2 5 、最适p h 值为8 ( 弱碱性) 、汽油的最适浓 度为1 0 0 0m g l 。 通过重量分析法测算该菌株在不同的温度汽油浓度p h 条件下的汽油降 解率。结果发现m m 3 降解汽油的最佳温度为2 5 摄氏度、最佳p h 值为8 ( 弱碱 性) 、汽油的最佳浓度为1 0 0 0m g l 。以上指标与该菌株的最适生长条件相同。 由于表面活性剂具有促使非极性分子乳化、增大油与微生物活动的表面积的 功能。在实验中加入各种表面活性剂，同时测算m m 3 对汽油的降解率。发现 t w 8 0 对提高降解率的效果最好，但是过高的表面活性剂浓度会对细菌的生长 有毒害作用。 由于使用适当的诱变剂诱导有提高降解率的作用，因此选用紫外线和氯化锂 对菌株进行诱变。结果发现，氯化锂和紫外线组合使用的诱变其提高降解率的效 果好于单独使用，3 0 w 紫外线的诱变后降解率高于1 5 w 的紫外线诱变。 考虑到汽油的主要成分是辛烷，用辛烷代替汽油加入无机盐培养基中，在不 同的温度、辛烷浓度和p h 条件下进行培养。发现在以辛烷为碳源的情况下，细 山东师范大学硕士论文 菌生长和降解辛烷的最佳温度、辛烷浓度和p h 值与以汽油作为碳源的情况完全 相同，但是细菌的生长情况和降解情况均不如在以汽油作为碳源的情况的生长和 降解情况。说明，汽油中其他成分对m m 3 的生长和活性存在促进作用。 由于微生物修复汽油污染环境有着无可比拟的优越性，汽油降解菌必定有着 广泛的应用前景。 关键词：汽油降解菌筛选纯化降解特性 分类号：q 2 8 u 山东师范大学硕士论文 a b s t r a c t g a s o l i n e ，w h i c hi sw i d e l yu s e da st h em o s tc o m m o nf u e l ，c a l lb eh a r m f u lt o h u m a nl i f ea sw e l lb e c a u s eo fm i s u s ei nr e s t o r i n gt r a n s p o r t a t i o na n dr e f i n i n g ，t h o u g h i ti so fg r e a tu s et oh u m a n g a s o l i n ec a nb ea b s o r b e di nh u m a nb o d yb yt h ea l i m e n t a r y c a n a l ，t h er e s p i r a t o r yt r a c ta n ds k i n i tc a l lc a u s et h ee d e m ao ft h em u c o u sm e m b r a n e ， t h ei n j u r yo fl i v e ra n dk i d n e y t om a k et h i n g sw o r t h ，t h eg a s o l i n ec a l lc a u s ec r i i c e l t h es o i lc o n t a m i n a t e db yg a s o l i n eh a sb a da f f e c t s0 1 1t h eg r o w t ho fc r o p sa n d v e g e t a b l e s t h u s ，e f f e c t i v em e a s u r e sm u s tb et a k e nt oc l e a nt h es o i ls a m p l e sp o l l u t e d b yg a s o l i n e t h i sa r t i c l e g e n e r a l l y d e s c r i b e da n dd i s c u s s e dt h em e c h a n i s mo ft h e b i o d e g r a d a t i o nb a c t e r i a t h es o i ls a m p l ei so b t a i n e df r o mag a ss t a t i o nw h i c hi si n s o u t h e n t o n ，c t , u n i t e ds t a t e s t h eb a c t e r i an a m e dm m 3w h i c hc a nd e g r a d eg a s o l i n e o ro c t a n ea n du s ei ta st h eo n l yc a r b o ns o u r c ew h e ni ti sn e c e s s a r y t h eb a c t e r i ai s s t u d i e db yu s i n gb i o c h e m i c a lm e a s u r e s a n dt h e16 sr d n ao ft h eb a c t e r i ai s s e q u e n c e d f i n a l l yi ti si d e n t i f i e da sat y p eo f p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a r e s p e c t i v e l yt h eo p t i m a lp h ，t e m p e r a t u r ea n dg a s o l i n em a s sc o n c e n t r a t i o na r e 8 ，2 5 * c a n d1 0 0 0m e d l s i n c es u r f a c t a n t sc a ni n c r e a s et h eb i o a v a i l a b i l i t yo fg a s o l i n ea n de n h a n c et h e d e g r a d a b i l i t yo fg a s o l i n eb yb a c t e r i a c e r t a i nk i n d so fs u r f a c t a n t sa r ea d d e dt ot e s t w h i c ht y p ec a nb e s th e l pt h eb a c t e r i ad e g r a d et h eg a s o l i n e t h ee f f e c to ft h et w 一8 0i s b e a e rt h a nt h ee f f e c to ft h eo t h e ro n e h o w e v e r ，t h ed e n s i t yo fs u r f a c t a n t sw h i c hi f h i g h e rt h a nn o r m a li sh a r mt ot h eg r o w t ho ft h eb a c t e r i a t h em u t a n t sb yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o nt r e a t m e n th a dg r e a t e rd e g r a d i n ge f f i c i e n c y t h a nt h eo r i g i n a lo n e s ，w i t h3 0wu l t r a v i o l e tl i g h th a v i n gb e r e rm u t a t i o ne f f e c to nt h e s t r a i n st h a n15wu l t r a v i o l e tl i g h t t h eb a c t e r i ar e p r e s e n ta d e g r a d i n ge f f i c i e n c yw h e n b o t hu l t r a v i o l e tl i g h ta n dl i t h i u mc h l o r i d ea r eu s e d f o ro c t a n ei so n eo fm a i ni n g r e d i e n t so fg a s o l i n e ，g a s o l i n ei ss u b s t i t u t e db y o c t a n ei na n o t h e rr e s e a r c ht ot e s tt h eo p t i m a lp h ，t e m p e r a t u r ea n d g a s o l i n em a s s t h e r e s u l ti st h a tw h e no c t a n ei su s e da st h eo n l yc a r b o ns o u r c e ，t h eo p t i m a l p h ， 山东师范大学硕士论文 t e m p e r a t u r ea n dg a s o l i n em a s sa r et h es a m ea sb e f o r e b u tb o t ht h eg r o w t ha n d d e g r a d i n gr a t eh a v ed e c r e a s e dc o m p a r e dt ow h e ng a s o l i n ei s u s e da st h ec a r b o n s o u r c e k e yw o r d s ：g a s o l i n e ；d e g r a d a t i o ns t r a i n ；i s o l a t i o n ；d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r ：q 2 8 i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 导师签字： 学位论文版权使用授权书 轫啁 本学位论文作者完全了解堂拉有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权i 盐可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位做作者签名：王砀 刷磁字 i _ _ - o o 。o _ 一，i 签字日期：2 0 0i 年6 月1e l 劳阁 黼眦o o 尹锣日 山东师范大学硕士论文 1 汽油对环境污染的来源 1 1 加油站的污染 综述 贮油罐的泄露是日益严重的环境污染问题之一。造成水体和土壤的污染。美 国环境保护局对2 0 0 1 年以前地下贮油罐的泄露污染情况进行的统计。全美国有 大约4 2 x 1 0 5 个地下贮油罐存在着渗漏的问趔1 1 。到2 0 0 3 年，仍有1 4 x 1 0 5 个因 贮油罐的泄露造成的污染点需要清理【2 】。但是，中国国内的加油站汽油泄露情况 比美国更严重，但是此类工作还没有得以开展。 由于加油站操作人员操作不当，在加油和油料转移的过程中汽油发生溢溅和 泄露，会直接污染加油站附近的空气、土壤和水体。 1 2 汽车的污染 在经济发展的同时，汽车的使用也日益频繁。由于汽油在发动机中燃烧不充 分，汽油中的碳氢化合物，尤其是大分子化合物，例如芳香烃、环烷烃物质，随 着汽车尾气排入汽车周围的环境中，造成空气的污染和公路两侧的土壤甚至水体 的污染【3 】。 1 3 生产中的排放 在石油的开采和提炼过程中，存在着许多不当的生产方式。在进行油井清洁 和维护时，会有许多碳氢化合物流入油井附近的环境中，其中包括汽油的主要成 分辛烷等短链烃类。此类物质也存在于井喷污染过的土壤中。对生态环境造 成严重的影响。 1 4 带有汽油的垃圾 这类废弃物包括报废的汽车、机械设备和报废的汽油发动机，其中残留的汽 山东师范大学硕士论文 油流入土壤和水体，或者经过挥发进入空气中。一些含有汽油的固体垃圾在填埋 后直接与土壤接触，碳氢化合物渗入土壤，会对土壤造成污染。 1 5 含有汽油的废水的利用 利用含有汽油的废水进行污水灌溉也是造成土壤和水体污染的重要原因之 一。有实验数据显示，土壤中汽油成分的含量与使用含汽油的废水灌溉的时间成 正比。 1 6 汽油的泄露 汽油在生产、运输、使用和贮存过程中由于种种原因会发生泄露、溢出等现 象。大量的汽油因此进入土壤或者海水中。此类突发性泄露危害最大，引起的污 染往往具有小区域的局部性，但是污染区的碳氢化合物浓度高、破坏性大 4 1 ，有 时可彻底改变局部的生态环境。 2 汽油污染的危害 2 1 汽油对人体的危害 汽油对人体的主要危害通过使神经细胞内类脂物质平衡失调，而麻痹和刺激 中枢神经。急性汽油中毒可以引起脑充血水肿严重者可导致死亡【5 】。 汽油与皮肤接触可直接引起皮肤水肿，经常接触汽油会引起皮肤的干燥和龟 裂和皮肤湿疹。汽油可以蒸汽的形式由呼吸道进入人体，在呼吸道中可以引起咽 粘膜充血、扁桃体充血肿大、鼻粘膜改变旧，还可以引起肺充血坏死。汽油进入 人体后，可以引起白细胞数量和血红蛋白的下降，血清e o i g g 水平升高。并且可 引起头疼、眩晕、失眠、记忆力减退、乏力等症状。消化道反应多为食欲不振、 恶心、腹痛或者腹泻等。汽油的慢性中毒还可以引起人的肝肾功能的损伤【_ 7 1 。汽 油中苯和其化合物，是一种引起人体严重病变的有害物质，由于其充分燃烧需要 较高的温度，所以苯和其化合物存在于由于燃烧不充分而产生的汽车尾气中，对 空气造成严重污染。还有研究结果表明，汽油汽车尾气可诱导大鼠睾丸组织生物 2 山东师范大学硕士论文 大分子的氧化损伤和d n a 单链断裂，说明汽油尾气具有遗传毒性和生殖毒性网。 2 2 汽油污染对环境的破坏 汽油污染土壤后，对土壤的活性破坏很大。由于汽油中很多成分如烃类物 质属于非极性化合物，当它们污染土壤后，引起土地的板结，使土壤的通透性发 生变化，降低土壤颗粒与水的亲和力【9 1 。汽油会降低土壤中的活性成分的含量， 从而影响土地的肥力【l o 】。由于汽油流动性强，一旦流入江河湖泊，会造成水体的 污染，危害水中生长的动植物，甚至影响人类的饮用水安全。经过富集吸收，汽 油污染水域中的鱼体内汽油经过富集，浓度明显增高，一旦被人食用，会对人类 健康造成影响【1 1 j 。 2 3 汽油对作物的影响 汽油中的非极性物质接触植物的根部后，会影响植物的根部对土壤中水和无 机物的吸收，从而影响作物的生产情况，降低土地的亩产量。汽油中的某些有毒 物质被植物吸收后，并不能被分解，反而进入下一个营养级，从而造成有毒物质 的富集作用【1 2 】。 3 汽油和短链石油烃类污染的处理 汽油和短链石油烃类的处理方法有三种：化学处理法、物理处理法和生物 处理法。化学处理法包括氧化剂氧化法、光化学氧化法、热分解法、萃取法和化 学栅法。物理处理法包括挖掘填埋法、电解法、洗涤法等。这两类处理方法虽然 定程度上可以减轻汽油和短链石油烃类污染，但成本高，处理的土壤环境的破 坏也比较大，甚至能够导致二次污染【l 3 1 。 生物处理法也被称作生物修复主要包括植物法、微生物法和堆肥法。植物 法包括植物降解、根系降解、植物的蒸发作用【14 1 。相比植物法，微生物法有着无 可替代的优越性，其原因可以归纳为：微生物生长周期短，代谢速度快，在适当 的环境条件下生长曲线呈对数曲线，有利于污染区域的快速处理；一般情况下， 烃类物质在微生物体内被降解成小分子物质例如二氧化碳，有效地避免了对环境 3 山东师范大学硕士论文 的二次污染；微生物的遗传物质是d n a ，具有一定的变异性，因此可以利用此 特性筛选出在具体污染区域最适合生长、降解率最高的微生物，做到“因地制宜”； 微生物产生降解酶类，其催化活性比一般的化学催化剂好高的多，因而具有高效 性【1 5 1 1 6 1 。 4 生物修复微生物的分类学特征 能够修复短链石油烃和汽油污染的环境的微生物主要有：细菌、霉菌和酵 母菌。在土壤中发现的能够修复短链石油烃和汽油污染土壤的细菌主要有假单胞 菌属( p s e u d o m o n a s ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、棒状杆菌属( c o r y n e f o r m s ) 、无 色杆菌属似c h r a m o b a c t e r ) 、不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、诺 卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 等；真菌主要有：曲霉属 ( a s p e r g i l l u s ) 、毛霉属( m u c o r ) 、镰刀霉属( f u s a r i u m ) 和青霉属( p e n i c i l i u m ) ；酵母茵 有：球拟酵母属( t o r u l o p s i s ) 、假丝酵母属( c a n d i d a ) 、红酵母属( r h o d o t o r u l a ) 和 酵母属( 勋c 如口，d 叼，7 邸) 1 7 1 。酵母属( 5 缸c 办口阳，缈协) 是己发现的最普遍能够降解烃 类的酵母菌。 路佳等经过研究发现一株假单胞茵属的菌可以降解汽油中的芳香烃成分甲 苯【1 8 】。无铅汽油添加剂，甲基叔丁基醚( m t b e ) ，可以被铜绿假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s 口e 懈加d s 口) 所降解【1 9 】。某些蓝细菌和藻类也可以利用烃类，如颤 藻属( o s i l l a t o r i a ) 鞘藻属( m i c r o c o l e u s ) 、小球藻( n o s t o c ) 、杜氏藻( d u m a l i e l l a ) 、 衣藻( c h l a m y c l o m o n a s ) 、石莼藻( u l t v a ) 、细柱藻( c y l i n d r o t h e e a ) 、双眉藻 ( a m p h o r a ) 、紫球藻( p o r p h y r i d i u m ) 和翅线藻( p e t a l o n e m a ) 1 2 0 。 5 烃类生物修复菌的分布以及环境对其影响 5 1 烃类降解菌的分布 能够降解烃类的微生物在土壤和水体中广泛存在。 在海洋表面，烃类降解菌群体密度比1 0 厘米深度的海水中高1 0 1 0 0 剧2 1 1 。 在大西洋西北和波斯湾海底的淤泥中存在的碳氢化合物降解菌比其他地区的要 多【捌。笔者认为和海洋中的泄露石油的诱导有关。几乎所有的异养菌都可以分解 4 山东师范大学硕士论文 和利用碳氢化合物，但是降解能力迥异，分解能力较强的占总数的不到1 0 ，在 南极洲和北冰洋的海底也有能够利用碳氢化合物的微生物【2 3 1 。 烃类降解菌的数量，随着季节的变化，也有明显的差异，在温带地区，烃 类降解菌的数量在夏天比在春天明显增多1 2 3 1 。 汽油降解菌的数量与土壤和水体中受到汽油污染的时间成正比，往往污染 时间长的地方，汽油降解菌的数量也多 2 4 1 。加油站和公路附近，能够利用汽油作 为碳源的微生物数量明显增多。 土壤收到外来烃类物质污染后，生物修复微生物的种群密度急剧升高，有 人发现在石油溢出数日后，被污染的环境中烃类降解菌的数量会增加数个数量 级，而且增加的生物修复微生物的密度会持续较长一段时间，在一年内没有显著 的变化【2 5 1 。 当含有氮和磷元素的物质被添加进被汽油污染的环境后，汽油降解菌的数 量明显升高【2 6 1 。 5 2 环境对烃类降解菌的影响 由于汽油降解菌主要作用于油水混合界面的碳氢化合物，所以在水分比较 多的土壤中，汽油容易被乳化，被乳化的汽油容易被汽油降解菌降解。因为表面 活性剂可以使汽油等碳氢化合物乳化，所以表面活性剂的存在可以提高汽油的降 解掣2 7 1 。值得一提的是，某些生物修复微生物也可以产生乳化剂，如某些假单胞 菌和棒杆菌【2 8 】。 温度也是影响降解菌降解碳氢化合物的重要因素之一，例如在2 5 摄氏度时， 碳氢化合物的降解率比在5 摄氏度时高出一个多数量级。汽油在2 0 摄氏度下， 可以被快速的氧化，但是在5 摄氏度的条件下，汽油就几乎不能被微生物氧化分 解2 9 1 。 由于汽油中的混合成分物理性质不同，它们受到温度的影响也不尽相同。 由于某些小分子碳氢化合物对微生物细胞有毒害作用，而在低温的条件下，这些 小分子碳氢化合物的挥发率低，所以较低的温度势必会影响某些汽油降解菌的降 解率。偏好降解小分子的微生物的最适温度往往比较低，而偏好降解大分子的微 生物的最适温度相对较高【3 0 1 。 山东师范大学硕士论文 环境中的氮和磷对限制微生物对碳氢化合物的降解，起着重要作用。在对 汽油进行降解的时候，如果适当增加一些氮肥和磷肥，对大大提高微生物对汽油 的降解率【3 l 】。 因为碳氢化合物的降解需要加入氧分子，所以在自然界中，降解碳氢化合 物的微生物几乎都是好氧菌，厌氧菌对碳氢化合物的降解率很低【3 2 】。所以，氧气 的含量就成为微生物对汽油降解重要限制因子之一。在土壤中，一些土壤动物的 活动可以为生物修复微生物提供氧气。 一般情况下，环境中盐浓度升高，会降低微生物对碳氢化合物的降解率， 但是在某些情况下，比如某些高盐的土壤和海水中，存在着耐盐的降解菌，对盐 浓度的变化不是十分敏感f 3 3 1 。 6 汽油进入微生物的途径和方式 汽油进入微生物细胞可以有两个阶段p 4 1 ，第一个阶段是从非极性相转移到细 菌细胞膜表面，第二个阶段是从细胞膜进入微生物细胞，这一阶段对只合成胞内 酶的微生物来说尤为重要。 汽油等石油烃类物质与微生物细胞表面相接触，是微生物进行生物修复必要 条件。在被汽油污染的水体中，个别种类能与水互溶的碳氢化合物可以直接与微 生物的细胞膜接触。但是大多数烃类是非极性物质，不能或者基本不能与水互溶， 必须以某种方式转移进细胞膜表面从而与细胞接触。 不同于在被污染的水体中，在被污染的土壤中，微生物、烃类、土壤颗粒、 空气和水分，构成了一个复杂的系统【3 5 1 。在这个系统中，汽油中的烃类可以由多 种途径进入微生物。 首先，和在水体中一样，微生物可以与土壤中的水分溶解的烃类直接接触， 但是这种方式存在的比例比较少。 其次，微生物可以与挥发性强的烃类的气体分子直接接触。由于汽油中的主 要成分挥发性强，这种方式在降解汽油的过程中意义重大。 再次，微生物细胞与土壤中存在的液态的烃类分子接触。这一过程，主要取 决于微生物细胞表面的疏水程度。 微生物也可以在表面活性剂存在情况下，吸收被表面活性剂乳化烃类。这种 6 山东师范大学硕士论文 情况下乳化的烃类是通过自由扩散的方式进入微生物细胞的。 实际上，微生物吸收汽油的时，往往使用以上的多种模式，而不是单纯使用 一类方式。 7 微生物对汽油的降解 由于汽油的是多种烃类的混合物，各种成分被微生物境界的途径也不尽相 同。在汽油烃类的代谢过程中存在共氧化作用3 6 1 。某些微生物在利用汽油中的某 类烃类物质时，可以合成一些分解汽油中另一类烃类的酶。这种作用在分解汽油 这样的混合物时，是十分重要的。 7 1 直链烷烃的降解 直链烷烃在微生物修复的过程中，直链烷烃分子首先被氧化成醇，继而在 醇脱氢酶的催化作用下，被氧化成相应的醛，生成的醛又在醛脱氢酶的作用下， 被催化生成相应的脂肪酬3 7 1 。直链烷烃具体的化学结构式变化可以用下面的化学 式表示： 单末端氧化： r - c h 2 - c h 3 + 0 2 r - c h 2 - c h 2 - o h r - c h 2 一c h o r - c h 2 - c o o h 双末端氧化： h 3 c 一( c h 2 ) n - c h 3 + 0 2 - - - h 3 c - ( c h 2 ) n - c h 2 0 h h 3 c - ( c h 2 ) n - c h o 斗h 3 c ( c h 2 ) n c o o h = - + h o h 2 c 一( c h 2 ) n c o o h o h c ( c h 2 ) n c 0 0 h ，h o o c 一( c h 2 ) n c o o h 次末端氧化： h 3 c 一( c h 2 ) n - c h 3 + 0 2 h 3 c 一( c h 2 ) n 1 - c h ( o h ) - c h 3 斗0 2 一 h 3 c ( c h 2 ) n 1 一c o c h 3 + 0 2 - - h 3 c - ( c h 2 ) n 2 - c h 2 - o c o c h y - * h 3 c - ( c h 2 ) n - 2 一c h 2 0 h + c h 3 c o o h 7 2 支链烷烃的降解 相比直链烷烃，支链烷烃被微生物降解的难度较大。原因是，由于支链的 存在烷烃的稳定性和抗分解能力增加。支链烷烃的被降解难度与支链的数量成正 7 山东师范大学硕士论文 比。在一般情况下，支链烷烃可被氧化成脂肪酸。但是，在某些情况下，支链烷 烃可能被氧化烯烃、仲醇和酬3 8 1 。 7 3 环烷烃的降解 环烷烃类在被生物降解的第一步，会被氧化成一元醇也就是环烷醇，环烷醇 可以继续被氧化生成环烷酮，环烷酮可以继续被氧化生成内脂中间体，内脂中间 体继而断裂形成二元脂肪酸。一般情况下，能够利用环己醇的微生物，也可以利 用环烷酮【3 9 1 。 7 4 芳香烃类的降解 芳香烃由于水溶性差，架构复杂，微生物的修复难度更大。在芳香烃降解 的过程中，双加氧酶和单加氧酶是降解过程中的关键酶。双加氧酶可以在苯环上 直接加2 个氧形成儿茶酚；单加氧酶可以直接作用于苯环或者氧化侧链，进而形成 儿茶酚，再经过儿茶酚双加氧酶作用使苯环裂解，进一步被降解后进入三羧酸循 环。 在苯双加氧酶的催化作用下，加氧变成顺苯二氢二醇，然后经过加氧酶的作 用形成邻苯二酚。邻苯二酚发生邻位切割和间位切割，降解成直链化合物，进入 三羧酸循环【4 l 】。结构式如图l ： f k 留二留 图1 苯的降解过程【4 1 j 甲苯是芳香烃中很重要的一类，也是汽油的成分之一。甲苯的代谢途径和苯 是有所区别的。但是，由于细菌的种类不同，在不同微生物中的代谢途径也不尽 相同。在某些菌中，甲苯先是在单加氧酶的氧化作用下，形成苯甲醇，然后进一 步被氧化变成苯甲醛，进一步被氧化生成苯甲酸，从而形成邻苯二酚这种中间产 物，和苯的代谢一样，邻苯二酚发生邻位切割与间位切割，降解成直链化合物， 进入三羧酸循环1 4 2 1 。甲苯在某些微生物中也可以在甲苯加双氧酶的作用下生成顺 8 r 一 跳上 一一占 磊 州叫 。拉 山东师范大学硕士论文 甲苯二氢二醇，继而形成直链分子，从而进入三羧酸循环【4 3 1 。如图2 车 i 0 蛾 蚌f 鼍 j 烤， t ，。“ 仑= 黑 k 、( o 2 - 怒i 旁- 2 加吐一：爝t 争“愎 i 一州 ? ，w 蛾 k 洲， 2 ，嘲肇k c 。埘i 如 。睡 子一秽。一。叫 肇叩髓t 善4 噔聱抟。妊 一l 苎馈魄 扩1 ，i 班 2 一囊哆蕊，黼霸 均哇j 上 4 - 鲣照2 喇 成埔爱 鞠艄帕 l 菇 a t ，磊基 o 图2 甲苯的降解过程【4 3 】 萘、菲和葸也少量的存在于汽油中，但是，由于其结构复杂不容易被分解， 常常残留在土壤中，对土壤的破坏力比较大【删。 假单胞菌、芽孢杆菌、诺卡氏菌等可以把萘分解，并且完全降解成二氧化氮 和水f 4 5 1 。某些假单胞菌能够利用萘作为唯一的碳源。另外，某些真菌和蓝细菌也 可以降解剽蛔。萘被降解的过程中，先是一个苯环发生二羟基化、开环，然后生 成二氧化碳和丙酮酸【4 7 】，具体方式如下图3 ： 9 戏 5 一 般 渊 6 一 莹己r 卜 山东师范大学硕士论文 孓一 o 冀 凄 霉 令o 丧。 u 渊 j 在高温裂解的石油生产裂解汽油的过程中可产生菲和葸。菲具有明显的致 癌作用。菲和蒽的微生物降解途径很大程度上与萘的降解途径类似。能够降解菲 和葸的微生物有假单胞菌、黄杆菌、气单胞菌等。许多土壤中的假单胞菌能够将 菲降解成二氧化碳和水【4 8 】。具体代谢途径如下图4 、5 ： 7 锋 l o 留歹n镕f 山东师范大学硕士论文 僦一测h o h ： 9 b 矍 愿 j ( ：( ) o m 憔等舡鲂 8 降解酶类和相关基因 弼 图5 葸的降解过程【铝】 k n i e m e y e r 和h e i d e r 从一株反硝化菌中分离出一种成分为钼铁正铁血红蛋 白的乙苯脱氢酶【4 9 1 。这种蛋白有1 5 5 k d ，有a 、b 、7 三种亚基组成。其中a 亚基的n 末端氨基酸序列和其他钼蛋白相类似。m a e n g 等从一株 a c i n e t o b a c t e rs p 菌中得到在一种正烷烃氧化酶，这是一种双加氧酶，直链 烷烃可以被这种酶催化成为氢过氧化物，在此催化作用中有氧气参与，但 是没有n a d p h 2 。这种酶分子量为1 3 4 k d 的同二聚体，含有等摩尔的黄素 嘌呤二核苷酸，在有铜离子的条件下表现酶活性，它可以催化某些烯烃， 但不能作用于支链烷烃【5 0 】。 l w a b u c h i 和h a r a y a n a 从非降解菌n o c a r d i o i d e ss p k p 7 中分离到的2 羟基 苯醛脱氢酶，是由四个相同的亚基组成的，每个亚基5 3 k d t 5 n 。这个酶的编码基 因为1 4 5 5 k p ，和这个基因相邻的7 个开放阅读框中，有编码1 羟基2 萘酸双加 氧酶的基因p h d i 编码反2 羟基苯唑丙酮酸醛缩酶的基因p h d j 编码2 羧基苯醛 脱氢酶的基因p h 北另外，有一个开放阅读框的编码产物类似于 p s e u d o m o n a s p u t d ar s 2 0 0 0 中的芳香烃转移基因p c 擞的编码产物，另一个开放 阅读框的编码产物则与细胞色素p 4 5 0 相似【5 2 1 。 随着研究的继续，f o n g 等发现p s e u d o m o n a s p u t i d am l 2 中与苯降解相关的 山东师范大学硕士论文 双加氧酶基因b e d c l c 2 b a 和依赖于n a d 的脱氢酶b e d d 5 3 】。k i m 和z y l s t r a 发 现了b e o e r i n c k i as p 联苯降解中两个关键基因b p h c 和x y l e ，其中b p h c 编码产 物为催化2 ，3 二羟基联苯间位裂解得双加氧酶，x y l e 编码的蛋白是可以催化儿 茶酚的间位裂解的双加氧酶，这两个基因相距5 5 k b ，以相反方向转录m 】。 某些微生物中，编码降解酶类的相关基因存在于质粒上【5 5 1 ，这为菌株的改 良筛选提供了重要分子生物学依据。 9 本论文的意义 随着化学工业和交通运输的发展，汽油极大的方便了人们的生活，但是汽 油也是一把双刃剑，如果使用不当，反而会危害人类的生产生活。鉴于汽油污染 严重性，因此分离纯化并且优化一株能够较好降解汽油的生物修复微生物势在必 行。 文章分析了汽油污染土壤的微生物种群，并且分离出汽油降解菌，对其进 行了生理生化和分子生物学的鉴定，分析了影响其降解率的各种因素，并且对其 进行了优化，提高了降解率。 1 2 山东师范大学硕士论文 正文 由于汽油在生产生活中的广泛应用，汽油的泄漏事故也在危害着人类的生产 生活。汽油可进入人体后，能够引用神经系统的损伤、导致皮肤水肿、造成肝、 肾功能异常、影响免疫系统，严重情况下甚至会引起癌变。汽油污染土壤后，也 危害着作物的生长，影响作物的产量。 微生物修复，相比其他物理和化学处理汽油污染的方法具有：对污染的环 境修复速度快、处理效率高、生成小分子物质因而二次污染小、遗传物质为d n a 所以改造潜力大、相对费用低等特点。因此，微生物修复具有光明的前途和广泛 的应用前景。 本实验从加油站和汽车修理厂分离出3 株可以利用汽油作为唯一碳源的菌 株，其中1 株降解活性较强，命名为m m 3 ，进行生理生化和分子生物学1 6 sr r n a 鉴定，初步确定为l 株铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 。研究最适合其 生长的温度、p h 和汽油浓度。研究不同p h 、温度汽油浓度和不同浓度的表面活 性剂对其降解率的影响。利用紫外线和氯化锂诱变，提高其降解率。并且并用辛 烷代替汽油作为唯一碳源，研究其生长和降解特性。 1 3 山东师范大学硕士论文 第一章汽油降解菌的分离纯化 l 实验材料与实验仪器 1 1 土壤的采集 234 号样品分别取于美国康涅狄格州s o u t h e n t o n 附近的c v s 停车场、加 油站和汽车修理厂，采样时间2 0 0 8 年3 月。 用铁锹除去地面浮土之后，得到地表及地下1 0 2 0 c m 的土壤样品。采集后 混合均匀。 1 2 实验仪器 电热恒温培养箱 微型旋蜗混合仪 微量移液器 光学显微镜 电热磁力搅拌器 高速冷冻离心机 全温水域振荡器 电子天平 立式冷藏柜 一次性培养皿 1 3 实验试剂 l a bl i n e 公司 f i s h e r 公司 e p p e n d o r f 公司 o 姗p u s 公司 f i s h e r 公司 f i s h e r 公司 g y r o t o r y 公司 f i s h e r 公司 通用电气 f i s h e r 公司 n a c l 、k h 2 p 0 4 、n h 4 h 2 p 0 4 、m g s 0 4 7 h 2 0 、k n o s 、牛肉膏蛋白胨、汽油、 马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、琼脂。 1 4 山东师范大学硕士论文 1 4 培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基( l ) ：牛肉膏蛋白胨1 5 昏琼脂1 5 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 、 p h7 - 7 2 、1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 高氏一号培养基( l ) ：可溶性淀粉2 0 9 、k n 0 3l g 、n a c l0 5 9 、k 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 5 9 、m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 9 、琼脂1 5 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 7 4 、 1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 马铃薯蔗糖培养基( g l ) - 马铃薯2 0 0 9 、蔗糖2 0 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l 、琼脂 1 5 2 0 9 、p h7 ，马铃薯去皮，粉碎煮2 0 m i n ，用筛网过滤，再加入蔗糖和琼脂， 溶化后补加水至1 0 0 0 m l ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 无机盐液体培养基( l ) ：n a c i5 9 、k h 2 p 0 4l g 、n h 4 h 2 p 0 4l g 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 、k n 0 33p h7 - 7 2 9 、1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 无机盐固体培养基( g l ) - n a c l5 9 、k h 2 p 0 4l g 、n h 4 h 2 p 0 4l 、m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 9 、k n 0 33 琼脂1 5 9 、p h7 7 2 、1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 无机盐汽油液体培养基( l ) ：无机盐液体培养基1 2 1 灭菌后加入汽油 1m 1 。 2 实验方法 2 1 接种与涂布 分别将2 、3 、4 号土壤用生理盐水稀释至1 ：1 0 、l ：1 0 2 、l ：1 0 3 、l ： 1 0 4 、l ：1 0 6 在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基进行 涂布。 牛肉膏蛋白胨培养基用来筛选细菌，高氏一号培养基用来筛选放线菌，马 铃薯蔗糖培养基用来筛选真菌。 2 2 细菌的培养与菌落的计算 将涂布好的浓度为l ：1 0 、1 ：1 0 2 、l ：1 0 3 、1 ：l o 、1 ：1 0 6 的培养基在2 0 c 的条件下，培养2 d 。 山东师范大学硕士论文 进行平板计数，通过对平板上微生物菌落的计数，计算出单位重量的土壤 中所含的微生物数量。 2 3 汽油降解菌的筛选与富集 分别称取1 92 、3 、4 号土壤样品，接种于l o o m l 无机盐汽油液体培养基中， 2 0 摇床培养5 d ，取0 5 m l 培养液，转移到相同的无机盐汽油液体培养基中，2 0 摇床培养5 d ，在这样的条件下连续富集培养2 0 d ，共4 个周期。 取l m l 培养液体，稀释至l ：1 0 、l ：1 0 2 、l ：1 0 3 并且取0 1 m l 涂布于无 机盐固体培养基上【5 6 - 1 。将涂布的平板放入塑料容器中，同时在容器中放入一个装 有汽油的5 m l 的三角瓶，这样高浓度的汽油蒸汽存在于容器中，就可以将汽油蒸 汽作为唯一碳源，筛选可以利用汽油的微生物。然后将容器放入通风橱中( 2 0 ) ， 培养1 5 d 。挑取菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。 纯化后，再将菌株在无机盐固体培养基上划线，继续放在含有汽油蒸汽的 容器中，置于通风橱中培养1 5 d 。 挑取生长状况好的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化【5 7 1 。纯化后将菌 接种于牛肉膏蛋白胨平板上，4 c 保存。 3 结果与讨论 3 1 微生物种群 表1 土壤的微生物群落分析 3 2 微生物富集分离结果 在本实验中共分离出3 株可以以汽油为唯一碳源的菌株，其中2 株来自3 号 土壤样品，l 株来自4 号土壤样品，但是从3 号样品中筛选的其中一株在汽油无 1 6 m 东师范大学| 甄十电文 机盐固体培养基上的生长情况要明显好于另外两株。于是，选出这一菌株。这株 菌被命名为m m 3 。 3 3 讨论 圈1 - 1m m 3 在牛内膏蛋白胨培养基上 阁l 一2m m 3 在汽油无机盐培养基 就三份卜壤样品的微牛物总量来看，2 弓 壤样品中的微牛物数量咧显的 山东师范大学硕上论文 低于3 号和4 号，其原因可能是因为c v s 是一家药店，对环境的卫生要求比较 高，可能应用了消毒剂，或者存放有抗生素，消毒剂或者抗生素排到周围环境中， 会导致细菌数量的减少。 2 号土壤样品中，真菌含量明显高于其他土壤样品，其原因可能是周围落 叶较多，某些真菌可以产生能够分解纤维素的的数量就相应增多。 4 号土壤样品中，放线菌的比例明显高于2 号、3 号土壤样品。其原因可能 是4 号土壤样品来自汽油修理厂，环境较其他两处干燥，而干燥的环境适合放线 菌的生长。这可能是4 号土壤样品中放线菌数量高的原因。而某些放线菌会分泌 抑制细菌生长的抗生素，所以4 号土壤样品中细菌的比例较其他样品中要低。 而且3 号、4 号土壤中微生物数量比较多，说明3 号、4 号这两种土壤中营 养成分丰富，适合微生物的生长。微生物在这两种土壤中种类比较多。从中筛选 出可以降解汽油的微生物的可能性比较大。 由于加油站存在一定的汽油泄露，所以在加油站附近筛选到了理想的汽油 降解菌，这也是和预期目标相吻合的。可能是由于长期的汽油污染，汽油在土壤 中的浓度比较高，由于长期生长在高浓度汽油的土壤环境中，细菌的营养方式受 到驯化，从而可以利用汽油作为唯一碳源。但是这两株菌对汽油的利用情况不同。 所以从中选取了对汽油利用较好的一株。 而在4 号土壤环境中，虽然有汽油污染，但是汽油的浓度不如3 号土壤中 高，而且汽油污染的连续性也不如3 号土壤中长，所以在4 号土壤中虽然能够筛 选出的可以利用汽油作为唯一碳源的细菌，但是种类比较少，而且其生长情况明 显不如m m 3 。 1 8 山东师范大学硕士论文 第二章汽油降解菌的鉴定 1 实验材料与实验仪器 1 1 实验菌株 m m 3 ，分离于美国康涅狄格州s o u t h e n t o n 的加油站。 1 2 实验仪器 电热恒温培养箱 微型旋蜗混合仪 微量