（细胞生物学专业论文）cenpe马达蛋白作用网络在细胞有丝分裂中的功能研究.pdf

中国科学技术大学学位论文相关声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究 工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权， 即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和电子版，允许论文被查阅或借阅，可以将学位论文编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名： 坷年d 6 月o l 日 中国科学技术大学博士学位论文 a c a a p c 娶c l c b u b c d c c d e c e n p c l a s p s c l i p c t f d a d d a m d a p i g f p h e c i f i p i p l k t m a d m c m m i f m i s m c a k m a p s m p s m s p s 【t 英文缩写词表 a n t i - c e n t f o m e r ea n t i s e r a e d e n o m a t o u sp o l y p o s i sc o l i a n a p h a s ep r o m o t i n gc o m p l e x c y c i o s o m e b u d d i n gu n i n h i b i t e db yb e n z i r n i d a z o l e c e l ld i v i s i o nc y c l e c o n s e r v e dd n ae l e m e n t c e n t r o m e r e a s s o c i a t e dp r o t e i n c l i p a s s o c i a t e dp m w m s c y t o p l a s m i cl i n k e rp r o t e i n c h r o m o s o m et r a n s m i s s i o nf i 曲l 蚵 d e f e n d e ra g a i n s tc e l ld e a t h d u o l pa n dm p s l pi n t e r a c t o r 4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n h i g he x p r e s s i o ni nc a l l e 盯 i m m u n o f l u o r e s c e n c e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n i n c r e a s e - i n - p l o i d y k i n e t o c h o r e m i t o t i ca r r e s td e f e c t m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e m i t o t i cf i d e l i t yo f c h r o m o s o m et r a n s m i s s i o n m i n i c h r o m o s o m ei n s t a b i l i t y m i t o t i cc e n t r o m e r e - a a s o e i a t e di 【i n e s i i l m i e r o t u b u l e sa s s o d a t ep r o t e i n s m o n o - p o l a rs p i n d l e m i n i s p i n d l e sp r o t e i n m i e r o t u b u l e s 4 苎苎兰垫查苎量堡主兰竺! 坚 n d c n u f p b s p m s f s d s s p c t a c c t b s t t k w b n u c l e a rd n ac o n t e n t n u c l e a rf i l a m e n t p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h c n y l m e t h y l s u i p h o n yf l u o r i d e p a g es d sp o l y a e r y l a m i d eg e ld e c t r o p h o r e s i s s p i n d l ep o l ec o m p o n e n t t r a n s f o r m i n ga c i d i cc o i l e dc o i l sb u f f e r e ds a l i n e tc e l lt y r o s i n ek i n a s e w e s t e r nb l o t 中国科学技术太擘博士学位论文 中文摘要 细胞周期是细胞复制的过程，在此过程中子细胞生长并且发育为一个完整的生 命体。细胞周期中最为重要的事件是那些涉及遗传物质的复制和分配的过程，即染 色质d n a 的复制与有丝分裂期姐妹染色体的分离。每个事件的开始都受到精确的 调控，并且事件执行过程中的错误可以被修正。有丝分裂过程中染色体的运动和分 离是由定位于染色体着丝粒部位的动点复合物与动态的微管的相互作用来调节的。 c e n p e 是维持稳定的动点微管连接和纺锤体检查点功能的至关重要的一个 大分子马达蛋白。我的研究目的即寻找其相互作用蛋白质，并进一步揭示它在动点 上的功能行使机制。最初，我们选用了位于c e n p - e 中间的c o i l e d - c o i l 区域( h p x 9 5 5 1 5 7 1 氨基酸) 作为诱饵。进行了酵母双杂交筛选，在大概二十个阳性克隆中，我 们挑选t s k p l 进行进一步的功能研究。s k p l 是u b q u i t i n 介导的蛋白降解途径中一个 至关重要的e 2 连接酶一s c f ( s k p l - c u u i n fb o x ) 的固定组分。此二者的相互作用很可能 与c e n p - e 的降解相关联。在此基础上，我们进行了进一步的生化和细胞学的分析， 发现此二者的相互作用很可能发生在细胞分裂末期的中体( m i d b o d y ) l 显域。在作用过 程中，c e n p e 先集中在中体上，并且随着s k p l 在中体上的积聚，c e n p e 的量越来 越少，最终消失，母细胞完全分裂为两个均等的子细胞。接下来，我们用r n a 干扰 技术系统评估了s k p i 在有丝分裂末期的具体功能，发现缺少t s k p l 的h e l a 细胞无法 完成正常的有丝分裂过程，而更多的以四连细胞的形式存在，从而证明了s 蝻l 对于 正常细胞周期行进所不可缺少的功能。为了证明该功能是否与c e n p e 的相互作用有 关，我们将缺失了c e n p - e 相互作用区域的s k p l 转入h e l 瑚胞，发现了与s k p l 敲除相 似的表型，因此，我们推断c e n p - e 与s k p i 的相互作用对于有丝分裂末期的中体调控 有着非常重要的意义。 接下来我们的工作发现原始的c e n p e 序列缺失t 2 1 3 1 2 1 6 7 这段的3 6 个氨基 酸，为了寻找这一段序列的功能，同时寻找c e n p e 在动点上可能的相互作用蛋白以 及功能行使机制，我们再次选用了它c 末端的两段序列( 2 1 6 7 - 2 7 0 1 氨基酸以及 2 1 3 1 - 2 7 0 1 氨基酸) 进行酵母双杂交的筛选，在这两个筛选的结果里面，我们都发现 了一个已知的动点蛋f j - n u t 2 。n u f 2 可以与h e e l 形成个稳定的复合物，并且凭借 6 中国科学技术太学博士学位论文 其在稳定动点微管连接中不可或缺的作用而为人们所熟知。而c e n p - e 也一直被认 为在该方面有不可替代的功能。鉴于二者在功能上的相似性，我们怀疑他们协同作 用从而稳定动点微管的连接，但二者是不是一个并列的关系呢? 为了回答这个问 题，我们利用s i r n a 技术，分别抑制n u f 2 ，c e n p - e 以及h e c l 的表达，然后看其他两 个蛋白在动点上的定位情况，结果发现，n u f 2 和h e e l 的敲除均可以在一定程度上影 响c e n p e 的定位，而c e n p e 表达与否对n u f 2 和h l 则没有任何影响，同时，三者 的单独敲除和两两的共敲除会不同程度地破坏动点微管的稳定连接，当c e n p - e 和 n u f 2 同时敲除时对动点微管连接的影响最大。因此，我们认为c e n p - e 和n u f 2 - h e c i 复合物是协同作用来稳定动点微管的连接的，二者相辅相成，缺一不可，最有可能 的方式是通过c e n p e 来加固n u f 2 h e e l 复合物与微管的连接作用，同时，该复合物 也稳定了c e n p e 在动点外层的定位。 综上所述，c e n p - e 是一个在有丝分裂过程中功能很丰富的蛋白，在有丝分裂中 期的时候，n u f 2 h e c | 复合物在c e n p e 的帮助下完成微管捕捉和稳定的作用，从而 令染色体整齐的排列在赤道板上，等待后期的分裂，而在其任务完成后，c e n p - e 会集中于两个子细胞中间的中体位置，并且被s c f 介导的u b q u i t i n 化进程降解。 7 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t c e l lc y c l ei st h eu n i v e r s a lp r o c e s sb yw h i c hc e i l sr e p r o d u c e i tu n d e r l i e st h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fa l ll i v i n go r g a n i s m s t h em o s ti m p o r t a n te v e n t so f t h ec e l lc y c l ea r et h o s ec o n c e r n e dw i t ht h ed u p h c a f i n ga n dp a r t i t i o n i n go ft h e h e r e d i t a r ym a t e r i a l s i no t h e rw o r d s ，t h a ti sr e p l i c a t i n g t h eg e n o m i cd n a d u r i n g sp h a s ea n ds e p a r a t i n gt h er e p l i c a t e dg e n o m e si n t ot w od a u g h t e rc e l l sd u r i n g m i t o s i s t h eo n s e to ft h e s ee v e n t sw a sr e g u l a t e df a i t h f u l l ya n dd e l i c a t e l y , a n d e r r o r si nt h e i re x e c u t i o nc a na n dm u s tb er e p a i r e dt op r e v e n tc a t a s t r o p h i c o u t c o m e s t h ec h r o m o s o m em o v e m e n t sa n ds e p a r a t i o nd u r i n gm i t o s i sa r e m a i n l y o r c h e s t r a t e d b y t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ed y n a m i cs p i n d l e m i e r o t u b u l e sa n dk i n e t o c h o r e - as p e c i a l i z e dc h r o m o s o m ed o m a i nl o c a t e dw i t h i n t h ec e n t r o m e r e c e n t r o m e r e a s s o c i a t e d p r o t e i ne ( c e n p e ) i s ak i n e s i n - r e l a t e d m i e r o t u b u l em o t o rp r o t e i nt h a ti se s s e n t i a lf o rc h r o m o s o m ee o n g r e s s i o nd u r i n g m i t o s i s o u rp r e v i o u ss t u d i e ss h o wt h a tm i c r o t u b u l em o t o rc e n p - er e p r e s e n t s al i n kb e t w e e na t t a c h m e n to fs p i n d l em i c r o t u b u l e sa n dt h em i t o t i cc h e c k p o i n t s i g n a l i n gc a s c a d e h o w e v e r ，t h em o l e c u l a rf u n c t i o no fc e n p - e a tt h em i d b o d y h a dr e m a i n e de l u s i v e h e r ew es h o wt h a tc e n p ei n t e r a c t sw i t hs k p la tt h e m i d b o d ya n dp a r t i d p a t e si nc y t o k i n e s i s c e n p - ei n t e r a c t sw i 也s k p l nv t r o a n di nv i v ov i ai t sc o i l e d - c o i ld o m a i n o u ry e a s tt w o - h y b r i da s s a y sm a p p e dt h e b i n d i n gi n t e r f a c e st ot h ec e n t r a ls t a l kr e g i o no fc e n p e ( 9 5 5 1 5 7 1a a ) a n dt h e c - t e r m i n a l3 3a n l i n oa c i d so fs k m ，r e s p e c t i v e l y o u ri m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e sr e v l e dt h a tc e n p et a r g e t st ot h em i d b o d yp r i o rt os k i na n dt h e m i d b o d yl o c a l i z a t i o no fc e n p eb e c o m e sd i m i n i s h e da ss k ma r r i v e sa t 也e m i d b o d y s u p p r e s s i o no fs k mi n m i t o t i ch e l ac e l l sb ys i r n ar e s u l t e di n a c c u m u l a t i o no ft e l o p h a s ec e l l sw i t he l o n g a t e di n t e r 电e l lb r i d g e sa n dw i t h m i d b o d i e ss t r e t c h e d2 - 3t i m e sl o n g e rt h a n 也a to fn o r m a lc e l l s t h e s e s k p l e l i m i n a t e d o rs u p p r e s s e dc e l l sa c c u m u l a t eh i g h e rl e v e lo fc e n p e s u g g e s t i n gt h a ts p a t i o t e m p o r a lr e g u l a t i o no fc e n p - ed e g r a d a t i o n a tt h em i d b o d y i se s s e n t i a lf o r c y t o k i n e s i s o v e r - e x p r e s s i o n o f s k ml a c k i n g t h e c e n p e - b i n d i n gd o m a i nc o n f i r m e d t h a ts k m - c e n p - - ei n t e r a c t i o ni se s s e n t i a lf o r 8 中国科学技术夫学博士学位论吏 f a i t h f u lc y t o k i n e s i s w eh y p o t h e s i z et h a tc e n p - ed e g r a d a t i o ni se s s e n t i a lf o r f a i t h f u l m i t o t i c e x i t a n d t h e p r o t e o l y s i s o f c e n p - e i s m e d i a t e d b y s c f v i a a d i r e c t s k p ll i n k c e n p ee x t e n d si t sm o t o rd o m a i no nt h es p i n d l em i c r o t u b u l ea n da n c h o r st o k i n e t o c h o r ep l a t eu s i n gi t sc a r b o 剐t e r m i n u s t od i s s e c tt h em e c h i n e a r y r e s p o n s i b l ef o rt h ec e n p - el o c a l i z a t i o nt ot h ek i n e t o c h o r e , w ec o n d u c t e da s e a r c hf o rp r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t hc e n p - ec t e r m i n u su s i n gay e a s tt w o - h y b r i d a s s a y , i nw h i c hn u f 2 ，ac o r ec o m p o n e n to fn d c 8 0c o m p l e ，w a si d e n t i f i e db y 妇 a b i l i t yt ob i n dc e n p e f u r t h e re x p e r i m e n t ss u c ha sf a r - w e s t e r na n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o nc o n f i r m e dt h i si n t e r a c t i o n nu i t r oa n di nv i v o w ea l s o m a p p e dt h eb i n d i n gr e g i o nt o3 4 1 - 4 2 4 a ao fn u f 2b yu s i n gg s tp u l ld o w nm e t h o d t oe x p l a i nt h ef u n c t i o no ft h i sn o v e li n t e r a c t i o n , w et r a n s f e c t e ds i r n ao fn u f 2 。 h e e li n t oh e l ac e l l sa n df o u n dn l a tc e n p el e v e lw a sg r e a t l yr e d u c e di nn u f 2 d e p l e t e dc e l l s w h i l ed e p l e t i o no fh e e l 咖r e t a i nl o w e rl e v e lc e n p ec o m p a r i n g w i t ht h ec o n t r o ls i r n a t oc h e c kt h es p e e i f i c i t yo fs i r n a , w et r a n s f e e t e d g f p - t a g g e dn u f 2 ( 2 8 1 - 4 6 2 a a ) i n t on u f 2s i r n at r e a t e dc e l l sa n df o u n dt h a t c e n p e sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo nk i n e t o c h o r ew a sr e s c u e di na b o u t7 0 c e l l s t og a i n i n s i g h ti n t ot h ep o s s i b l ef u n c t i o n o ft h i si n t e r a c t i o ni ns t a b i l i z i n g k i n e t o c h o r e m i c r o t u b u l ea t t a c h m e n t , w ep e r f o r m e dm o r ee x p e r i m e n t sa n df o u n d t h a ta c ad i s t a n c ew h i c hi sam a r k e ro fk i n e t o c h o r et e n s i o nw a ss h o r t e n e dm o s t i nc e n p - ea n dn u f 2d o u b l ed e p l e t e dc e l l s t h i sp h e n o t y p ei n d i c a t e st h a tt h e i n t e r a c t i o nm a yh e l p sc e n p - ea n dn u f 2c o l l a b o r a t et o k e e p as t a b l e k i n e t o c h o r e - m i c r o t u b u l ea t t a c h m e n ta n da l s oat e n s i o nb e t w e e ns i s t e r k i n e t o c h o r ew h i c hc o n t r o l st h es p i n d l ec h e e k p o i n l i ns u m m a r y , c e n p ef u n c t i o n sw i t hi t sa c c e s s o r yp r o t e i n st oc o n s t i t u t et h e k i n e t o c h o r e r n i c r o t u b u l ei n t e r f a c ef o ro r c h e s t r a t i n gc h r o m o s o m ed y n a m i c si n m i t o s i s c e n p ei s d e g r a d e db yat w o - s t e pc a s c a d ed u r i n ga n a p h a s et o c y t o k i n e s i s 9 中固科学技术大学博士学位论文 第一章文献综述 动点复合物与纺锤体检查点 细胞周期是细胞复制的过程，在此过程中细胞生长并且发育为一个完整的生命 体。细胞周期中最为重要的事件是那些涉及遗传物质的复制和分配的事件，也就是 在间期复制染色质d n a 并且在有丝分裂期分离复制的染色体。每个事件的开始都 受到精确的调控，并且事件执行过程中的错误可以被修正。在从最简单的单细胞真 核生物酵母直到复杂的后生生物例如我们人类自己，这些调控的分子事件都是高度 保守的。细胞周期事件的精确调控可以保证生命的存活，而这些精确调控的丢失则 会增加染色体不稳定性并且增加罹患癌症的风险。在合予形成过程中，有丝分裂细 胞周期被改变为减数分裂细胞周期，产生对有性生殖至关重要的染色体数目减倍。 减数分裂同时增加了遗传变异，而变异是进化的驱动力。因此，细胞周期在所有生 命的调控和发育过程中发挥一个中心的作用，而且保证生命在亲代和子代的连续性。 除了d n a 复制之外最重要的细胞周期事件当然是有丝分裂了。十九世纪六十 年代的早期工作主要集中在描述和结构的研究，研究方法逐渐由光学显微镜转交为 电子显微镜和生化分析。有丝分裂纺锤体最初被描述为一个在两个中心体之问延伸 的星状放射线系统。固定方法和电镜技术的改良阐明了纺锤体由微管组成，并且鉴 定了秋水仙碱结合蛋白质，最终发现了微管由管蛋白多聚体组成。荧光图象和体外 分析表明微管处于生长和收缩状态之间摆动，这个过程叫做动态不稳定性 d y n a m i c i n s t a b i l i t y l 。微管组织中心被发现定位在中心体和动点，前者是新微管的生长点， 后者俘获和稳定已经存在的微管以阻止其收缩。微管蛋白亚基的聚合和解聚 t u r n o v e r 和微管马达蛋白可以移动染色体，马达蛋白也通过固定微管来参与组装 中固科学技术太擘博士学位论文 有丝分裂纺锤体 n u r s e , 2 0 0 0 。 有丝分裂纺锤体的性质提供了一个对有丝分裂事件满意的但并不完全的解释。 最初，中心体复制和分离，然后在它们之间产生微管纺锤体。这样建立的一个双极 的细胞状态，对于有丝分裂的早期步骤是必需的。在前期 p r o p h a s e ，当核膜破裂 后由两个姐妹染色质构成的染色体开始凝聚，在每一个染色单体的着丝点位置都有 一个可以俘获纺锤体微管的动点。纺锤体微管以随机的方式俘获染色体动点，只有 当姐妹染色单体上的两个动点分别被来自两极的微管俘获后，纺锤体上的染色体才 能形成一个稳定的构象。这是有丝分裂最为关键的一步，因为只有实现了这样的状 态，复制的d n a 分子才可以被分配到朝向相反的两个子细胞中。这个纺锤体微管 俘获动点并且双极定向【b i - o r i e n t a t i o n l 染色体向赤道板汇集 c o n g r e s s i o n 的时期被 叫做前中期 p r o m e t a p h a s e 。在前中期动点组装完成并且纺锤体检查点 s p i n d l e c h e c k p o i n t 处于激活状态。正常的细胞仅仅在中期 m e t a p h a s e 停留短暂的时问， 这时染色体完成在赤道板的排列 a l i g n m e n t 并且检查点失活。当染色体在中期实 现稳定构象后，连接两个姐妹染色单体之间的复合物被降解，继而染色单体被拉向 两极，这时细胞进入后期 a n a p h a s e 。当胞质分裂 c y t o k i n e s i s 完成后，形成两个新 核，子细胞进入新的一轮周期。 纺锤体微管以随机的“搜寻与俘获”模式俘获染色体动点。有丝分裂初始时，染 色体的动点随机与来自某一极中心体的微管相结合，这称为单极定向 m o n o - o r i e n t a t i o n l 。单极定向的染色体常常向它所附着的那一极中心体运动，称为 pm o v e m e n t 。随后姐妹动点与另一极的微管相互作用，形成双极定向 h i - o r i e n t a t i o n l ，并且向另一极中心体运动，称为a pm o v e m e n t 。随着两个姐妹动 点与两极微管正极末端稳固结合的建立，染色体开始在趋向两极的两个方向间摇摆 【o s c i l l a t i o n 】。最终，染色体移动并聚集到赤道板上，该过程称为汇集 c o n g r e s s i o n 。 汇集后的染色体在赤道板附近摇摆，姐妹染色体逐渐获得相等的微管连接。当细胞 进入后期，姐妹染色单体分离。 动点 k i n e t o c h o r e 是一个相当庞大的由多个蛋白质装配成的复合物，它介导纺 锤体微管和染色单体的相互作用，保证纺锤体微管俘获染色单体并最终牵引其分配 到两个子代细胞。本文将从芽殖酵母的动点、哺乳动物的动点和纺锤体检查点三个 中国科荦技术大擘博士擘住论文 方面对动点的结构和功能做一个尽可能全面的总体描述和展望。 第一节芽殖酵母的动点结构 在真核生物中保证有丝分裂过程中精确的染色体分离的分子机制对于保证染 色体的整倍性是极其重要的。精确的染色体分离不仅需要染色体d n a 上的功能结 构域，也需要细胞周期过程中众多分子的协调。定位于着丝粒d n a 上的动点复合 物和其调节系统对于染色体分离的保真性是必需的。动点提供了纺锤体微管的黏附 位点，也提供细胞周期调节机制传感的位点。芽殖酵母的动点是最简单也是了解的 最为清晰的动点，作为一个模式系统，它有助于我们了解高等真核生物的动点结构、 组装和功能。 着丝粒d n a 与内层动点 芽殖酵母是第一个着丝粒d n a 被克隆和测序的生物。每一条染色体上存在一 个单拷贝的1 2 5 - b p 的c e n 【c e n t r o m e r e 序列，对于染色体在有丝分裂和减数分裂 中的分离是必需的也是足够的。将不同染色体的着丝粒序列进行比较表明存在三个 保守的元件：c d ei 、c d ei i 和c d ei i i _ q o n s e r v e 如l d n a e l e m e n t 】 k i t a g a w aa n d h i e t e r ，2 0 0 1 】。 s - b p 的c d ei 序列被c b f l 结合匹e n t r o m e r eb i n d i n g _ f a c t o rl 】。c b f l 含有 h e l i x 1 0 0 p - h e l i x 的d n a 结合结构域，介导转录调节和染色体分离。7 8 8 6b p 的 c d ei i 区域由富含a t 的d n a 序列组成，可能是为了分隔保守的c d ei 和c d e i i i 元件。c s e 4i c h r o m o s o m es e _ e _ e _ e _ e _ e _ e _ e _ e _ 曼g r e g a t i o n 是人类c e n p - a 的同源物，是组蛋白h 3 的变异体，结合着丝粒d n a ，它可能与c d ei i 序列存在物理的相互作用。另一个 c d ei i 的结合蛋白质是m i f 2 丛i t o t i c _ f i d e l i t yo fc h r o m o s o m et r a n s m i s s i o np r o t e i n 2 1 一哺乳动物c e n p c 的同源物。 2 5 b d 的c d ei i i 序列是必需的，c d ei i i 的点突变将导致着丝粒功能的废除。 中国科学技术大擘博士学住论文 c b f 3 c e n u o m e r eb i n d i n gf a c t o r 复合物与c d ei i i 相互作用，它i i n d c l 0 噬u e l e a r d n ac o n t e n t 、c t f l 3 _ c _ h r o m o s o m et r a n s m i 豁i o n _ f i d e l i t y 、c e p 3 和s k p l 曼曲a i d n a s e a s s o c i a t e d1 2 r o t e i n1 】四个蛋白质组成。这四个蛋白质对于酵母的存活都是必 需的，任何一个的温度敏感突变都会使c b f 3 的c d eh i 结合活力丧失另外， g f p - n d c i o 被发现不仅定位在动点，也定位在纺锤体上，提示n d c l o 可能在纺锤体 上也发挥功能。s k p l 和它的结合伴侣s g t l 【s u p p r e s s o ro f g 2a l l e l eo f s k p l 可以激活 c t f l 3 ，对于c b f 3 复合物的装配是必需的。s k p l 、s g t l 也是s c f 【s k p l - c u l l i n - f - b o x c o m p l e x 泛素连接酶复合物的组分 m c a i n s h e ta 1 ，2 0 0 3 。 中间层动点结构 从宏观的角度，可以将动点看作内中外三层。内层直接结合着丝粒d n a ，外 层则直接结合微管，那么必然有一些中间层蛋白质联系d n a 结合与微管结合。我 们已经认识到动点复合物是由一些亚单位复合物组成，c t f l 9l c h r o m o s o m e t r a n s m i s s i o n _ f i d e l i t y 复合物和n d c 8 0 复合物是中间层动点的组分。 n d e s 0 复合物w n d c 8 0i n u c l e a r d n ac o n t e n t 、n u l 2 隧_ u c l e a rf i l a m e n t 、s p c 2 4 隆p i n d i c1 2 0 l ec o m p o n e n t 和s p c 2 5 四个亚基组成，每一个都是必需的。n d c s o 和 n u f 2 在进化中非常保守，在人类、酵母和爪蟾等多种生物中对于染色体的分离都 是必需的。n d c 8 0 复合物组分的突变导致染色体与微管的完全脱离。s p c 2 4 和 s p c 2 5 功能的丧失也会失活纺锤体检查点功能，提示n d c 8 0 复合物对于b u b 和 m a d 检查点蛋白质的定位中发挥功能。n d e 8 0 复合物对于d a m l 复合物、c i n 8 和 k i p l 驱动蛋白以及微管关联蛋白s t u 2 的动点结合都是必需的，提示n d c 8 0 复合物 在动点的d n a 结合组分与微管结合组分之间发挥一个桥梁作用 m c c l e l a n de ta ， 2 0 0 3 。 利用串联亲和层析 t a n d e ma f f i n i t yp u r i f i c a t i o n , t a p 】，c h e e s e m a n 和同事从 芽殖酵母中分离纯化了四个亚复合物，分别是4 亚基的n d c s 0 复合物、9 亚基的 d a m l 复合物、1 2 亚基的c t f l 9 复合物和3 亚基i 拘l p l l 复合物。过去，酵母双杂 交和免疫共沉淀分析鉴定了3 个不同相互作用动点蛋白质组：c t f l 9 、m e r e 2 1 中国科擘技术大学博士学位论文 m i n i e h r o m o s o m em a i n t e n a n c e 】和o k p i 险u 储_ k i n e t o c h o r el ! r o t e i n ；m c m 2 2 、 m c m l 6 和c t f 3 ：c h l 4 和m c m l 9 。t a p 分析纯化的c t f l 9 复合物不仅包含以上8 种蛋白质，3 个新蛋白质n k p l 、n k p 2 和a m e i ，另外还有一个重要的动点蛋白质 m t w l 【c h e e s e m a ne ta 1 ，2 0 0 2 b 。 随着研究的深入，d ew u l f 和同事的研究认为芽殖酵母的动点至少由1 7 个亚 复合物组装而成。精细的分离纯化打破了过去对c t f l 9 复合物的认识。c t f l 9 、 o k p l 、m _ _ c m 2 1 和a m e i 共同存在于一个亚复合物中，被作者称为c o m a 复合物。 m t w l 【m i st w e l v el i k el 】、n n f l 哩如c e s s a r yf o rn _ u c l e a r _ f u n c t i o n 、n s l l 、d s n l 被发 现存在于另一个复合物中【可能还有一个未知蛋白质】，被作者称为m i n d 复合物 唑咐li n c l u d i n gn u f l n s l ia n d 旦s n l 】。因此，c o m a 、m i n d 和n d c 8 0 这三个复 合物是相互独立的外层动点蛋白质的装配平台 d ew u l f e t a l ，2 0 0 3 。 外层动点蛋白质 动点最关键的功能是连接染色体与微管。酵母的动点是如何连接纺锤体微管， 细节仍不很清楚。在哺乳动物中，包括c e n p e 、d y n e i n 和x k c m i 等微管关联 的马达蛋白在介导动点微管的黏附和随后的染色体运动中发挥作用。 在酵母中有6 个驱动蛋白相关的马达蛋白 k i n e s i n r e l a t e dp r o t e i nm o t o r , k r p 】，它们中的一部分在动点微管的黏附中发挥功能。通过染色质免疫沉淀和 免疫荧光技术，k i p l 、k i p 3 和c i n 8 被证明与着丝粒d n a 相关联。这3 个k r p 都 不是必需的，但它们在遗传上呈现复杂的相互作用。c i n 8 c h r o m o s o m ei n s t a b i l i t y 与k i p lk 堑n e s i nl i k er r o t e i n 】属于b i m c 1 3 l o c k 伽- m i t o s i sc 】家族马达蛋白，在高等 细胞中形成四聚体以交连微管。在芽殖酵母中，c i n 8 与k i p l 在纺锤体稳定性中发 挥功能，也提高染色体分离的保真性。l ( i p 3 属于m c a k k i n l x k c m l 家族驱动 蛋白成员，具有解聚微管的活力 m c a i n s h e t a l ，2 0 0 3 。 b i k l 是一个正端微管结合蛋白质，与人类的c l i p l 7 0 同源，定位于动点和皮 层黏附位点。它可以和k a r 9 共同发挥作用俘获微管的正端。在单倍体和二倍体细 胞中缺失b i k l 没有明显的表型；但对于四倍体细胞b i k l 是必需的，它有助于姐妹 1 4 中国科擘技术大学博士学位论文 动点之间产牛张力。b i m lb 墅n d i n gt om i c r o m b u l e s 艇) - - 个在芽殖酵母动点发挥功 能的微管正端结合蛋白质。b i m i 在哺乳动物中的同源物e b l 在中期和动点相关 联。b i m l 在调节正端微管的动态性中发挥作用【l 订c a i n s he t 讲，2 0 0 3 。 s t u 2l s u p p r e s s o ro ft u b u l i n 是一个与爪蟾的x m a p 2 1 5 x e n o p u sm i c r o t u b u l e a s s e m b l yp r o t e i n l 和人的t o g l 同源的微管关联蛋白质，定位在动点和皮层末端。 通过s t u 2 缺失菌株的表型分析，证明s t u 2 在体内促进微管正端的动态性，同时这 种动态性对于动点与微管以及皮层位点的相互作用是十分重要的。 t o g ! x m a p 2 1 5 家族蛋白质起到稳定微管的作用，令人惊讶的是，s t u 2 在体外 起到去稳定微管的作用。定量的微管动态分析表明s m 2 通过干扰微管末端的管蛋 白质加入诱导微管的解聚。因此，s t u 2 一这个新的d i s l ) 函协p 2 1 5 家族成员是一 个新的微管去稳定机制 v a nb r e u g e le t a l ，2 0 0 3 1 。 非马达的