（细胞生物学专业论文）转zmpis基因及聚合betatsvp基因提高棉花耐旱性的研究.pdf

一 瘴 ，； - ：， 1 、 ： 、 鼋 一 j 原创性声明 f i l l l li1 1 1 ii ii i i i l li il 17 912 3 9 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：圣盘氢 日 期：边：堑：2 f 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：至盥导师签名：兰豳盛 日 期：坐：堑：2 1 山东大学硕士学位论文 目录 中文摘要l a b s t r a c t 5 符号说明1 0 第一章前言l l 1 1 干旱对植物的影响1 2 1 1 1 对植物生长发育的影响1 2 1 1 2 干旱胁迫对光合作用的影响。1 2 1 1 3 干旱胁迫对膜系统的影响1 3 1 2 作物耐旱机理1 3 1 2 1 渗透调节物质的积累1 3 1 2 2 抗氧化防御系统1 4 1 2 3 逆境诱导蛋白1 4 1 2 4 膜转运载体1 5 1 2 5 激素与信号转导系统1 5 1 3 磷酸肌醇信号系统及其相关的植物基因工程1 6 1 3 1 肌醇磷酸信号系统简介1 6 1 3 2 磷脂酰肌醇合成酶的研究进展。1 9 1 4 甘氨酸甜菜碱及其相关的植物基因工程2 0 1 4 1 甜菜碱的生物合成途径2 0 1 4 2 甜菜碱的作用机制研究2 2 i a 3 甜菜碱合成的基因工程的研究。2 5 1 5h + - p p a s e 及其相关的植物基因工程2 6 1 5 1 液泡膜h + - p p a s e 的分子结构与功能2 7 1 5 2h + - p p a s e 的主要功能2 8 1 5 3 液泡膜旷p p a s e 与植物抗逆性3 0 1 6 转基因聚合的植物基因工程研究3 2 1 6 1 实现基因聚合的策略和方法。3 2 1 6 2 耐逆相关基因聚合的研究进展3 4 1 7 棉花基因工程研究现状3 5 1 8 本工作的目的和意义3 6 第二章转磷脂酰肌醇合成酶基因z m p i s 棉花的抗旱性分析3 7 2 1 材料与方法3 7 2 1 1 实验材料3 7 山东大学硕士学位论文 2 1 2 转基因棉花t 3 代植株p c r 检测。3 7 2 1 3 转基因棉花的抗旱性分析。3 8 2 1 4 磷脂酰肌醇合成酶活性测定3 9 2 1 5 棉花叶片相对含水量测定4 0 2 1 6 棉花叶片细胞溶质势测定4 0 2 1 7 棉花叶片光合作用及叶绿素荧光参数的测定4 0 2 1 8 棉花叶片叶绿素含量测定。4 0 2 1 9 棉花叶片离子渗漏率、丙二醛含量测定。4 0 2 1 1 0 棉花叶片可溶性总糖及脯氨酸含量的测定4 l 2 2 结果与分析4 1 2 2 1 转基因棉花t 3 代植株的p c r 检测。4l 2 2 2 渗透胁迫对棉花根系磷脂酰肌醇合成酶活性的影响一4 2 2 2 3 转基因棉花苗期抗渗透胁迫能力4 2 2 2 4 转基因棉花蕾期的抗旱性。4 5 2 2 5 开花期长期干旱胁迫对棉花生长发育的影响。5 0 2 3 讨论5 2 第三章聚合b e t a i t s v p 基因提高棉花耐旱性的研究5 4 3 1 材料与方法5 4 3 1 1 实验材料。5 4 3 1 2 聚合6 p 耐乃阡。基因植株的分子生物学检测5 4 3 1 3 聚合b e t a t s v p 基因棉花的抗旱性分析5 7 3 1 4 棉花叶片甜菜碱含量测定5 8 3 1 5 棉花液泡膜的分离及液泡膜a t p a s e 和h + - p p a s e 活性测定一5 8 3 1 6 棉花叶片相对含水量的测定。5 9 3 1 7 棉花叶片叶绿素含量的测定。5 9 3 1 8 棉花叶片光合作用和叶绿素荧光参数的测定。5 9 3 1 9 棉花叶片可溶性糖、脯氨酸含量和渗透势的测定一5 9 3 1 1 0 棉花叶片离子渗漏率和丙二醛含量的测定5 9 3 1 1 l 棉花叶片超氧化物歧化酶活性测定5 9 3 2 结果与分析6 0 3 2 1 抛纠和t s v p 转基因聚合棉花的获得6 0 3 2 2 干旱胁迫对棉花叶片甜菜碱含量的影响。6 l 3 2 3 液泡膜旷p p a s e 和h + - a t p a s e 酶活性变化6 2 3 2 4 转基因棉花苗期抗渗透胁迫能力6 3 3 2 5 转基因棉花蕾期的抗旱性。6 5 山东大学硕。f ：学位论文 3 2 6 开花期长期干旱胁迫对植株生物量的影响7 3 3 3 讨论。7 3 第四章总结与展望7 7 附录7 8 植物表达载体p c a m b i a l 3 0 2 t s v p - p i s 的构建7 8 参考文献8 7 j 变谢10 4 攻读学位期间发表的学术论文目录1 0 5 山东大学硕t = 学位论文 山东大学硕士学位论文 转z m p i s 基因及聚合b e t a t s v p 基因提高棉花耐旱性的研究 中文摘要 干旱已成为限制全球农业生产的重要因素。随着人口增长和对生物能源的迫 切需求，增加粮食和经济作物产量已成为当务之急，利用生物技术培育抗旱作物 品种具有重要的战略意义。棉花是一种抗旱性较强的作物，适合在适度干旱条件 下种植。不同棉花品种的抗旱性差异较大，在缺水灌溉条件下无法获得较高产量， 进一步提高棉花的抗旱性对于提高棉花产量和加强干旱、半干旱地区的开发利用 具有重要意义。 转z m p i s 基因棉花的耐旱性分析 植物在进化过程中形成了对干旱应答的复杂机制，通过多种信号途径来做出 相应的抗逆反应。研究表明，磷脂酰肌醇信号途径在植物生长、发育和对环境胁 迫应答过程中发挥重要的作用。磷脂酰肌醇合成酶以c d p d g 和m y o - i n o s i t o l 为 底物生成磷脂酰肌醇。磷脂酰肌醇是真核细胞中主要磷脂成份之一，也是细胞中 主要磷脂信号分子的前体。 本工作对来自鲁棉研1 9 的转z m p i s 基因t 3 棉花植株在苗期、蕾期和开花 期进行了水分胁迫下的相关生理指标和耐旱性测定，结果表明转基因棉花一些株 系的抗旱显著提高。5 叶期棉花幼苗在含有1 2 p e g 6 0 0 0 的h o g l a n d 营养液中 处理2 4 小时后，野生型植株的叶片失水严重，植株严重萎蔫，而转基因株系叶 片比较伸展，植株未发生萎蔫或萎蔫程度较轻。1 2 p e g 6 0 0 0 渗透胁迫后，转 基因株系的净光合速率和气孔导度显著高于野生型对照。渗透胁迫降低了棉花幼 苗细胞的溶质势，转基因植株细胞溶质势下降幅度较野生型对照显著，即转基因 棉花细胞中积累了更多的溶质，增强了细胞吸取水分和持水能力，从而有利于植 株保持正常形态和细胞膨压。 棉花在花盆中生长至蕾期时，一次性浇足水后停止浇水，进行干旱胁迫处理。 野生型植株在干旱胁迫第4 天时，叶片已经开始萎蔫，含水量急剧下降。干旱胁 迫至第8 天，转基因植株叶片细胞膜离子渗漏率和丙二醛含量显著低于野生型植 株，说明转基因植株叶片细胞的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度都较轻。转基因植 山东大学硕士学位论文 株叶片的叶绿素含量和净光合速率在干旱胁迫下也高于野生型对照。叶片可溶性 糖含量、脯氨酸含量和细胞溶质势的测定结果表明，干旱胁迫前后，各株系可溶 性糖与脯氨酸含量没有显著差异。干旱胁迫下转基因棉花的始下降程度显著高 于野生型对照，转基因棉花植株具有较强的渗透调节能力。 开花期干旱试验结果表明干旱胁迫不同程度地影响了各株系棉花植株的单 株分支数、开花数和结铃数。开花期干旱胁迫后，转基因株系在单株分支数、开 花数和结铃数上与野生型相比没有显著差异。但干旱胁迫导致野生型单株籽棉产 量和皮棉产量分别下降了1 6 5 1 和2 3 5 3 ，而其它三个转基因株系仅下降了 1 0 3 3 - - 11 5 9 和1 5 8 9 1 9 6 9 。值得注意的是，干旱胁迫后，转基因株系s 3 的单株籽棉产量和皮棉产量显著高于野生型( 3 4 0 7 和3 0 7 7 ) ，而转基因株系 s l 和s 2 的籽棉产量和皮棉产量也比野生型高4 9 5 9 扣1 0 4 4 和1 4 1 0 , - 1 5 3 8 。 苗期、蕾期和花期耐旱性测定结果表明，外源z m p i s 基因的导入提高了转 基因棉花在各个发育时期的耐早性，且经过开花期的长期干旱胁迫后，转基因株 系s 3 的单株籽棉产量显著高于野生型对照，这为培育抗旱棉花新品种提供了优 良材料，对于棉花耐旱育种具有重要意义。此外，该工作为探讨渗透胁迫和磷脂 酰肌醇信号传导途径的关系提供了有价值的参考资料。 转基因聚合棉花b t ( b e t a x t s v p ) 的耐旱性分析 利用基因工程技术提高作物耐旱性是解决作物耐旱育种的有效途径之一。目 前，通过向植物中转入耐逆相关基因可在一定程度上改善植物的耐逆性。然而， 由于植物的耐逆性是受多基因控制的复杂遗传性状，依赖于多个基因之间的相互 作用，是多种耐逆生理性状的综合体现，因此，转入单个耐旱相关基因只能部分 。：一提高植物的耐旱性。一般认为，将多个耐旱相关基因聚合到同一植物中有可能会 _ 大大提高转基因植物抵抗干旱胁迫的能力。来源于大肠杆菌的b e t a 基因，编码 胆碱脱氢酶，转入植物后可提高细胞甘氨酸甜菜碱含量；来自于盐芥的t s v p 基 因编码v - h + - p p a s e ，该基因过表达可提高液泡膜逆浓度梯度转运离子的能力；已 有的基因工程研究表明，分别过量表达这两个单基因都可以明显改善植物的耐旱 性。 本工作以分别转抛蹦基因( b l ) 和转黏阡基因棉花( t l ) 植株为材料， 2 山东大学硕士学位论文 皇| 量| | 置量鲁皇曼置量置| 暑皇皇鲁量鼍量鼍曼曼鼍, l i i | 置| 罾量| 罾置葛量量量曼量鼍 通过有性杂交方法获得聚合有两个基因的棉花植株，即b e t a x 聊( b t ) 。p c r 检测和甘氨酸甜菜碱含量及v h + p p 硒e 水解活性的测定结果表明，b e t a 和黏p ? 两个基因稳定存在于转基因聚合棉花植株中，并进行了活跃表达。在干旱胁迫下 对转单基因植株和转基因聚合植株进行了生理生化测定，结果表明转基因聚合植 株与转单基因植株相比具有较高的耐早性。 5 叶期棉花幼苗在含有1 2 p e g 6 0 0 0 的h o g l 船d 营养液中处理2 4 小时后， 野生型棉花植株叶片的失水严重，植株严重萎蔫。与野生型对照相比较，转单基 因及基因聚合植株叶片比较伸展，植株萎蔫程度较轻。经渗透胁迫处理2 4 小时 后，植株叶片相对含水量明显下降，转基因棉花与野生型对照相比叶片相对含水 量降低幅度较小，聚合株系b t i 棉花的叶片含水量( 7 3 0 0 ) 比转单基因棉花 ( 6 8 6 l “9 3 l ) 的高。在渗透胁迫条件下，植物叶片溶质势的降低有利于水分 的吸收和保持。比较在相同胁迫条件下转基因聚合株系棉花与转单基因棉花的溶 质势，发现基因聚合株系b t l 与转单基因株系棉花相比具有更低的溶质势，并 且差异显著，这表明转基因聚合棉花在苗期渗透胁迫条件下积累了更多的溶质， 有利于细胞吸取更多的水分以保持细胞膨压。 在干旱胁迫下蕾期棉花植株叶片的相对含水量逐渐下降，转基因棉花植株与 野生型对照植株相比失水速度较慢。在胁迫处理第8 天时，转基因聚合株系b t l 的叶片相对含水量比转单基因株系的高，但差异不显著。干旱胁迫处理导致棉花 叶片的光合活性下降，转基因棉花植株的净光合速率和f v f m 显著高于未转基 因棉花植株，转基因棉花的光合效率较高，光系统受到干旱胁迫的影响较小， 转基因聚合植株受到干旱胁迫的影响低于转单基因植株。干旱胁迫使膜系统受到 伤害，不同株系植株的叶片m d a 含量和离子渗漏率大幅度升高。野生型对照植 株叶片的m d a 含量和细胞离子渗漏率值最大，转基因聚合植株b t i 叶片的最小， 这表明野生型对照植株叶片受到的伤害最严重，转基因聚合细胞受害程度最小。 此外，转基因聚合棉花叶片细胞维持了更高的s o d 活性而具有更强的自由基清 除能力，从而更好地保护了棉花细胞免受干旱胁迫的损伤。 棉花开花期进行干旱胁迫后，转基因棉花在株高、分支数和植株总干重上高 于野生型植株。转基因聚合植株b t l 在株高、分枝数和总干重上均高于转单基 因植株，但差异不显著。 3 l ij 东大学硕士学位论文 尽管转基因聚合植株中各外源基因分别通过各自的方式对提高植株的耐旱 性做出相应的贡献，但与单基因分别提高植株耐旱程度之和相差很大，这有可能 是由于植物耐旱性是多个代谢活动综合反应的结果，而某些关键环节或多基因互 作决定了植株对干旱胁迫的敏感性。因此，进一步深入了解不同耐早性相关基因 互作及其调控机制十分必要，从而为拟订出针对性强易于操作的植物抗逆基因工 程提供策略。 关键词：转基因聚合；棉花；耐旱性；删；b e t a ：西即 4 i l j 东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h ef a c eo fao o h a ls c a r c i t yo fw a t e rr e s o u r c e s ，d r o u g h th a sa l r e a d yb e c o m ea p r i m a r yf a c t o ri nl i m i t i n gc r o pp r o d u c t i o nw o r l d w i d e w i t ht h ei n c r e a s eo fw o r l d p o p u l a t i o na n dt h ed e m a n df o rb i o m a s sr e s o u r c e s ，i n c r e a s i n gf 0 0 da n dc a s hc r o p s p r o d u c t i o nh a sb e c o m eat o pp r i o r i t ya n di ti so fi m p o r t a n ts t r a t e g i cs i g n i f i c a n c et o b r e e dd r o u g h tt o l e r a n tc r o pv a r i e t i e sb yb i o t e c h n o l o g y c o t t o n , c l a s s i f i e da sad r o u g h t t o l e r a n tc r o p ，i ss u i t a b l ef o rm o d e r a t ed r o u g h tc o n d i t i o n s h o w e v e r , i t ss e n s i t i v i 哆t 0 d r o u g h tv a r i e sg r e a t l ya m o n gg e n o t y p e s ，a n dt h ec o t t o ny i e l dc a n tb es a t i s f y i n gu n d e r s c 、，e 咒d r o u g h tc o n d i t i o n s t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a ti m p o r t a n c ef o re n h a n c i n gc o t t o n y i e l da n du t i l i z i n gt h e a r i da n ds e m i a r i ds o i l st o f u r t h e ri m p r o v et h ed r o u g h t t o l c r a n c eo fc o t t o n s t u d i e so nd r o u g h tt o l e r a n c eo f t r a n s g e n i cz m p i sg e n e p l a n t sh a v ee v o l v e dm a n yc o m p l i c a t e dm e c h a n i s m si nr e s p o n s et od r o u g h t t h r o u g h av a r i e t yo fs i g n a l i n gp a t h w a y s p r e v i o u ss t u d i e sh a v ei n d i c a t e dt h a t p h o s p h o i n o s i t i d e s i g n a l i n gp a t h w a yp l a y sk e yr o l e si np l a n tg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n d r e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( p t d i n s ) i ss y n t h e s i z e df i o m c d p d ga n dm y o - i n o s i t o l ，c a t a l y z e db yp h o s p h a t i d y l i n o s i t o ls y n t h a s e ( p i s ) ，a n di s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tp h o s p h o l i p i d sa n dam a j o rp r e c u r s o ro fm o l e c u l e si n v o l v e d i np h o s p h o i n o s i t i d e s i g n a l i n gp a t h w a y s i nt h i ss t u d y , t o l e r a n c et od r o u g h ts t r e s so ft 3g e n e r a t i o n so ft r a n s g e n i cz m p i s l i n e sf r o ml u m i a n y a n l 9w a si n v e s t i g a t e da tt h r e ed e v e l o p m e n t a ls t a g e s ，i n c l u d i n g s e e d l i n g s ，s q u a r i n gs t a g ea n da n t h e s i ss t a g e c o t t o ns e e d l i n g sa tf i v e l e a fs t a g ew e r e s u b j e c tt oo s m o t i cs t r e s s i n h o a g l a n ds o l u t i o ns u p p l e m e n t e dw i t h1 2 ( w v ) p e g - 6 0 0 0f o r2 4h - a r e rt r e a t m e n t , w i l d t y p eo v t ) p l a n t sw i l t e ds e r i o u s l yb e c a u s e o fl a r g el o s eo fw a t e r , w h i l em o s to ft h e t r a n s g e n i cp l a n t sg r e ww e l l 谢t 1 1 c o m p a r a t i v e l ys l i g h ts y m p t o m s o fw a t e rs t r e s s a f t e ro s m o t i c s t r e s s ，n e t p h o t o s y n t h e s i s a n ds t o m a t a lc o n d u c t a n c eo ft h ef o u r t r a n s g e n i c l i n e sw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ff 住t h es o l u t ep o t e n t i a lo fc o t t o ns e e d l i n g s 5 山东大学硕士学位论文 d e c r e a s e dg r e a t l ya f t e ro s m o t i cs t r e s s ，w i t ht r a n s g e n i cl i n e sd e c r e a s i n gm o r et h a nt h a t o fw t t h el o w e rs o l u t ep o t e n t i a l ，w h i c hi m p l i e dt h a tm o r es o l u t e sw e r ea c c u m u l a t e d i nt r a n s g e n i cp l a n t st h a ni nw tp l a n t s ，c o u l dh e l pp l a n tc e l l sa b s o r bm o r ew a t e ra n d m a i n t a i nc e l lt u r g o ru n d e ro s m o t i cs t r e s s c o t t o np l a n t sc u l t u r e di n f l o w e r p o t s w e r ee x p o s e dt o d r o u g h ts t r e s sb y w i t h h o l d i n gw a t e ra tt h es q u a r i n gs t a g ef o r8d a y s a tt h ef o u r t hd a yo fd r o u g h ts t r e s s ， t h ep l a n t so fw ts t a r t e dt o w i l ta n dt h el e a fr w cd e c r e a s e dd r a m a t i c a l l y a f t e r8d a y s o fd r o u g h ts t r e s s ，t h ec e l lm e m b r a n ei o nl e a k a g ea n dm d al e v e li nt r a n s g e n i el i n e s w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to f 谬zw h i c hs u g g e s t e dl e s sm e m b r a n ed a m a g e a n di i p i dp e r o x i d a t i o no c c u r r e di nt h e s et r a n s g e n i cl i n e s i na d d i t i o n , t h ec h l o r o p h y l l c o n t e n ta n dp h o t o s y n t h e s i sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nt r a n s g e n i cc o t t o np l a n t st h a n i n 丽l dt y p e r e s u l t so fm e a s u r e m e n to fs o l u t es u g a r s ，p r o l i n ec o n t e n ta n ds o l u t e p o t e n t i a li n d i c a t e dt h a t ，s o l u t es u g a r sa n dp r o l i n ec o n t e n to fa l lc o t t o nl i n e sh a dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ；t r a n s g e n i ep l a n t se x h i b i t e dal a r g e rd e c r e a s ei n贿，a n d t h e r e f o r eh a ds t r o n g e ro s m o t i ca d j u s t m e n ta b i u t y e x p e r i m e n tr e s u l t sf r o mc o t t o np l a n t ss u b j e c tt oal o n g - 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旷p p a s eh y d r o l y t i ca c t i v i t yi n d i c a t e dt h a tt h et w og e n e sw e r ei n t e g r a t e di n t ot h e g e n o m ea n de x p r e s s e df u n c t i o n a l l yi nt r a n s g e n ep y r a m i d i n gc o t t o np l a n t s t h e a n a l y s i so fd r o u g h tt o l e r a n c ea tt h ep h y s i o l o g i c a ll e v e la n db i o c h e m i c a ll e v e lw e r e p e r f o r m e d t h et r a n s g e n ep y r a m i d i n gp l a n t ss h o w e dh i g h e rd r o u g h tt o l e r a n c et h a n s i n g l eg e n et r a n s g e n i ep l a n t s 。7 山东大学硕士学位论文 c o t t o ns e e d l i n g sa tf i v e - l e a fs t a g ew e r es u b j e c tt oo s m o t i cs t r e s si nh o a g l a n d s o l u t i o ns u p p l e m e n t e dw i t h12 ( w v ) p e g 一6 0 0 0f o r2 4h a f t e rt r e a t m e n t , w i l d - t y p e t w t ) p l a n t sw i l t e ds e r i o u s l yb e c a u s eo f 爱e 、，e rl o s eo fw a t e r , w h