（遗传学专业论文）溶酶体膜胆固醇丢失影响溶酶体的钾离子和质子通透性.pdf

摘要 胆固醇是溶酶体膜的基本组成成份。本论文重点在于研究溶酶体膜胆固醇的丢失是 否影响溶酶体膜溶酶体的钾离子和质子通透性，进而影响溶酶体的稳定性。 通过测定自由b 氨基己糖苷酶的活性，溶酶体膜电位变化，膜流动性，溶酶体膜内 部p h 值变化以及溶酶体质子漏，经过6 甲基环状糊精处理减少溶酶体膜胆固醇含量， 发现钾离子和质子通透性增强，同时膜流动性也增大。而进一步的研究发现钾离子进入 溶酶体是通过钾氢交换的方式。从而造成了溶酶体膜的渗透不稳定性，影响溶酶体的完 整性。此外研究还发现b 甲基环状糊精也造成了溶酶体的质子漏和其内部的p h 值升高。 上述的这些结论揭示了膜胆固醇在控制溶酶体的钾离子和质子通透稳定性上发挥 了重要的作用。溶酶体膜胆固醇的丢失会造成细胞内部酸化并影响细胞的稳定性。 关键词：溶酶体；胆固醇；离子通透性；膜流动性；p - 甲基环状糊精 a b s t r a c t c h o l e s t e r o li sa ne s s e n t i a lc o m p o n e n to fl y s o s o m a lm e m b 砌e s 1 1 1t h i ss t u d y ，w e i 1 1 v e s t i g a t e de 虢c t so fm e m b r a l l ec h o l e s t e r o lo nt h el y s o s o m a lp e m e a b i l i t ) ，t ok _ 锄d i + ，a n d m eo r g a n e l l es t a b i l i 够 t h r o u g h m e a s u r e m e m so fl y s o s o m a jp - h e x o s 锄i i l i d a s e 丘e ea c t i v i t y ，m e m b r a n ep o t e n t i a l ， m e m b r a n en u i d i 够，i 1 1 臼阻1 y s o s o m a lp h ，a i l dl y s o s o m a lp r o t o nl e a k a g e ，w ee s t a _ b l i s h e dt h a t m e t l l y l p c y c l o d e x t r i ne m p c d ) 一p r o d u c e d i o s so fm e m b r a l l ec h o l e s t e r o lc o u l di n c r e a s e l y s o s o m a lp e m e a b i l i 哆t 0 b o t hp 酏璐s i u mi o n sa n dp r o t o n s ， 锄dn u i d i z el y s o s o m a l m e m b r a n e s a sar e s u l t ，p o t a s s i 啪i o n se n t e r e d1 y s o s o m e st ：1 1 r o u 曲k + h + e x c h a l l g e ，w l l i c hp r o d u c e d o s m o t i ci m b a j a n c ea c r o s st l l em e m b m e sa i l do s m o t i c a l l yd e s 诎i l i z e dt h el y s o s o m e s i n a d d i t i o n ，仃e a n n e mo fl y s o s o m e s 谢也m p c dc a u s e dl y s o s o m a l lp r o t o nl e a k a g ea n dr a j s e d 协n a - 1 y s o s o m mp h t l l er e s u l t si n d i c a t et h a tm e m b r a i l ec h o l e s t e r o lp l a y si i i l p o r t a l l tr o l e si nt h em a i n t e n a j l c e o fl y s o s 0 m a l l i m i t e dp e n n e a b i l i 够t 0k + a i l d 旷l o s so ft h j sm e m b 瑚es t e r o l i sc r i t i c a lf o r 也eo r g a n e l l ea c i d i f i c a t i o na i l ds t a b i l i 妙 k e yw o r d s ：1 y s o s o m e ， c h o l e s t e r o l ， i o n p e 衄e a b i l i t ) ， m e m b r a n en u i d i 够， m e t h y l - p - c y c l o d e x t r i n ( m p c d ) 1 1 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中作了 明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：赵 l 日期：占盘垃l 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：驻 日 期：泌：丞至l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签 日 劢嘶 _)f， n 钎厶， 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 己l 言 丁ie j 溶酶体作为一个重要的细胞器，执行着更新细胞的生物大分子，消化细胞所吞噬的 异物以及加工营养物质等生理功能。此外，溶酶体在细胞的胞吞和胞吐过程发挥着重要 的作用。正常状态下溶酶体具有良好的完整性( 膜起到良好的屏障作用，确保该细胞器 囊泡的密闭性) 和稳定性( 溶酶体一般不易受其内外部环境正常变化的影响而破裂) 。 如果溶酶体遭到破坏( 表现为其膜的通透性增大甚至破裂，l ) 会导致传染性海绵状 脑病【l l ，老年痴呆【2 1 。同时会造成其水解酶的流失，细胞凋亡或者细胞坏死【3 ，4 1 。质子的 漏出会使其内部p h 升高，降低其各种酸性水解酶的活性。同时，溶酶体跨膜质子梯度 的丧失会影响许多生物大分子的跨膜转运而引起各种潴留病。当细胞发生某些病变时溶 酶体会发生破裂，例如某些类型的细胞凋亡和细胞坏死就是由于溶酶体发生l m p ，释 放水解酶所引起的，因而溶酶体被称为细胞的“自杀袋”。由此可见，溶酶体的完整性不 但是其执行各种生理功能的必要条件，而且是影响细胞的生存与死亡的重要因素。此外， 溶酶体的完整性还具有重要的临床意义。近年来，国际上许多学者都指出阐明破坏溶酶 体完整性的机制是一个有待解决的重要问题，对于细胞的代谢、凋亡、坏死以及临床医 药等方面的深入研究有着重要意义1 5 ，。 东北师范大学硕士学位论文 1 文献综述 溶酶体( 1 y s o s o m e ) ，源自希腊语“l y s ”和“s o m a ，为“消化小体”之意，其命名者 c s t i a nd ed u v e 于上世纪五十年代发现。他在对肝组织酸性磷酸酶的研究中偶然发现， 经差速离心获得的富含酸性磷酸酶区段经自然放置几天后酶活大大增强。经过不断摸 索，发现其存在于膜结构中，并排除了线粒体和微粒体的可能，至1 9 5 5 年又在该区段 中发现4 种酸性水解酶。随着离心技术和电镜技术的发展，溶酶体被分离纯化并被直接 观察，最终被学术界所认可。 1 1 溶酶体的结构与功能 溶酶体最外层为单层脂膜，该脂双层7 1 0 纳米厚，其磷脂成分与质膜接近，而与 其他细胞器膜组成不同，这可能是由于质膜与溶酶体膜融合的结果如下表所示。一般认 为溶酶体膜主要是从高尔基体出芽生成，然后与细胞内的吞噬泡融合。鞘磷脂通过胆固 醇与膜紧密结合可以稳定溶酶体，可能是其与胆固醇影响了膜流动性，形成了有利于膜 稳定的结构【7 ，8 1 。 各种细胞器膜及细胞膜脂类物质含量对比 溶酶体膜与细胞其他膜结构上的不同在于：膜上有v 型旷a t p a s e ，通过水解a t p 将质子转运到溶酶体内，以维持其酸性环境；膜上含有多种转运蛋白，可将有待降解的 生物大分子运进溶酶体并将水解的产物转运出去；膜内表面含有大量糖链( 可以防止被 其水解酶水解) ，膜外表面带负电荷( 主要为唾液酸，可能与膜融合的识别有关) 。 溶酶体内部p h 比胞液的p h 低大约2 个单位，该酸性环境不仅有利于维持其水解 酶活性，还有利于催化酶的水解过程。碱性物质可以升高溶酶体内的p h ，抑制其对蛋白 质的降解瞵】。低p h 也是多种生物大分子跨溶酶体膜转运的调控因素之一，人们发现溶 东北师范大学硕士学位论文 酶体的大多数转运体系都对跨膜p h 梯度敏感【9 】。溶酶体的质子漏出( 质子梯度改变) 会影响其他离子的通透平衡，进而影响溶酶体的渗透稳定性。n i l s s o n 等发现t n f 诱导 的u 9 3 7 细胞凋亡时，溶酶体内质子外流导致细胞内p h 下掣1 0 j 。此外，v 型矿a r p a s e 抑制剂( b 娟l o m v c i na 或c o n c a j l 锄y c i i la 1 ) 可引起凋亡1 1 】j ，而f 型矿a t p a s e 抑制剂 寡霉素( o l i g o m y c i l l ) 无此作用1 1 z j 。 溶酶体内f c a 2 + 】约为4 0 0 微摩尔，比胞液的浓度高很多，升高溶酶体内p h 可以使其 c a 2 + 】下降【1 3 】。因此溶酶体也被认为是细胞内的钙库。g p n 通过选择性渗透膨胀使溶酶 体通透，细胞内 c a 2 + 上升了近1 0 倍【1 4 】，该现象是否会对细胞的钙离子信号途径产生影 响还有待进一步研究。此外，溶酶体膜可保证其内部金属离子的富集，这些金属离子如 f e ”产生的自由基可加速溶酶体内物质的降解【”】。 溶酶体内含有约6 0 种水解酶，大多是糖蛋白。可溶性的酶多以阴离子复合形式存 在，结合性酶多以水溶性多聚阳离子复合形式结合于带负电的膜上( 在溶酶体内低于p h 5 的环境下) ，并不水解所结合的膜脂分子l l6 1 。但酸性鞘磷脂酶除外，它可以缓慢水解 膜上的鞘磷脂旧。溶酶体酶的产生和转运相当复杂：溶酶体蛋白质在附着于内质网的核 糖体上生成后被糖基化，通过内质网运到高尔基体再被磷酸化形成甘露糖6 磷酸，在高 尔基体的反面膜囊的甘露糖6 磷酸受体可特异性结合溶酶体酶，最后以出芽的方式转运 到溶酶体。蛋白水解酶以酶原的形式合成并进入溶酶体后，在酸性环境下自水解成活性 形式。很多癌细胞的溶酶体酶含量增高，可能与侵害组织有关。在老年有机体的细胞中， 溶酶体酶含量增高以去除有缺陷的蛋白质。 溶酶体内的蛋白水解酶( c a m e p s i l l ) 是其中研究最为深入的水解酶。根据其不同水 解位点可分为b 、c 、h 、f 、k 、l 、o 、s 、v 、w 、x ( 半胱氨酸) 和d 、e ( 天冬氨 酸) 及g ( 丝氨酸) 等。它们都为酸性水解酶，但在中性条件下也具有部分活性【l 引。 c 础e p s i n s 都以酶原形式合成，可被其他蛋白水解酶活化，或在酸性条件下自水解活化。 活化的c a t h e p s i nb 和l 在溶酶体中浓度高达1 i 州，占其蛋白含量的2 0 9 1 。这些水解 酶不仅参与了溶酶体内部的蛋白水解活动，其释放到胞液中或分泌到细胞外会引发各种 细胞病变，进而对机体产生广泛影响。 传统上认为溶酶体的功能就是消化各种生物大分子，包括各种病原微生物，如巨噬 细胞的溶酶体可将吞噬进来的病菌或异源物质隔离并消化。后来逐渐发现溶酶体的功能 大大超过人们的想象。精子的顶体就是一种特化的溶酶体，作用于卵细胞膜后，使精子 内部遗传物质进入卵细胞内【2 0 】。在动物发育、衰老及组织更新过程中，细胞通过溶酶体 发生的自吞噬作用，将蛋白及细胞器消化1 6 j 。在胞吞过程中，溶酶体参与了胆固醇的代 谢【2 1 】和受体的内化【2 2 1 等重要细胞活动。一些细胞中的溶酶体除了具备典型溶酶体的生物 学功能，还承担着存储、转运和分泌一些生物物质的功能，因而被称为分泌型溶酶体 ( s e c r e t o r vl v s o s o m e ) 。如黑色素细胞分泌黑色素，破骨细胞对骨组织的再吸收i 弱j ，自 然杀伤细胞向靶细胞分泌蛋白水解酶1 2 4 1 ，巨噬细胞和b 淋巴细胞的抗原呈递等【2 5 】。最 近还发现溶酶体参与了受钙离子调控的细胞膜修复1 2 6 。毫无疑问，随着对细胞生命活动 东北师范大学硕士学位论文 的不断研究，溶酶体的作用将引起人们更多的注意。 1 2 溶酶体膜的通透性 1 2 1 溶酶体膜的通透性与完整性的关系 溶酶体的通透性可以通过测定其标志酶的潜伏性( 1 a t e n c y ) 来反映：当溶酶体悬浮 于膜不通透的等渗溶液中，由于溶质分子无法进入溶酶体内，溶酶体保持了其内部分子 与外部环境的隔离，因而无法在外部检测到其酶活，即其酶具有潜伏性。作为这些观察 的必然结果，一种化合物在等渗浓度时提供渗透保护的能力，是其不能进入溶酶体的标 志。实验表明0 2 5m 蔗糖具有良好的渗透保护作用，因此常用于溶酶体的分离纯化。 而如果溶酶体悬浮于可通透溶质的溶液中会很快失稳。例如，0 2 5m 乙二醇虽然可提 供等渗渗透压，但由于乙二醇可迅速通透溶酶体膜，这种渗透平衡很快被打破而使溶酶 体破裂【2 7 】，此时可以测定到其自由酶活的升高( 其潜伏性下降) 。对溶酶体膜通透性较 低的分子则会缓慢使溶酶体失稳。因而溶酶体破裂的快慢程度就能反映对该溶质的通透 性。l l o v d 认为如果溶酶体内含物是同质的，它们将会同时裂解，表现出一个急剧的s 型曲线，但实验表明是一个持续上升的裂解，这进一步证明溶酶体的异质性1 2 引。 溶酶体的通透性与完整性有密切关系。维持溶酶体的完整性不仅必须使其内外渗透 压相等，还必须保证提供外部渗透压的物质不能通透溶酶体膜。一旦通透性增大，随着 外界物质的进入，由于水的流入而导致溶酶体膨胀，发生溶酶体破裂。生理条件下，溶 酶体具有一定调节膜两侧渗透压平衡的能力，这主要是经由排出其内部过多的钾离子来 实现。过量的钾离子进入并在溶酶体内的浓集会导致其对溶酶体的渗透性破坏，所以溶 酶体膜的钾离子通透性在其病生理学上具有十分重要的意义i2 9 1 。溶酶体膜的通透性在较 低温度下会有所变化，如钾离子通透性显著增加【3 0 】。膜流动性的改变例如膜脂质过氧化、 聚阴离子的浓集、胆红素等生物活性物质会改变膜的通透性【3 1 。3 3 】。在某些病理状态下溶 酶体膜的通透性也会发生改变，发生溶酶体膜通透化( 1 y s o s o m a lm e m b r a n e p e 锄e a b i l i z a t i o n ，l m p ) 。很多药物如维生素a 和某些类固醇是亲脂的，它们与膜结合会 改变膜的性质，稳定或破坏膜。稳定剂对对治疗溶酶体系统功能失调，如溶酶体酶的过 度分泌是很重要的，如用可的松、胆甾醇等治疗风湿性关节炎。膜活性剂是某些具有高 度氢结合能力的颗粒( 如硅酸与石棉) ，此类物质被细胞吞噬后竞争并分隔膜内氢结合 部位，从而破坏溶酶体。用甲基环式糊精减少溶酶体膜胆固醇含量也可导致溶酶体通 透性和渗透敏感性增大【3 4 】。 1 2 2 溶酶体膜对不同物质的通透性 通过测定溶酶体酶的潜伏性研究了溶酶体膜在3 7 0 c 下对离子的通透性大小顺序， 发现其对阴离子的通透性顺序为：s c n i c h 3 c o o 。 c l 。h c 0 3 。p i s 0 4 ；对阳 离子的通透性顺序为：c s + k + n a + h + 。现在普遍认为溶酶体膜对质子和一价阳离 子的通透性很小。膜对核苷通透性的顺序是：t 1 1 y m i d i n e u r d i n e c 蛳d i n e 。 4 东北9 币范大学硕士学位论文 另外温度对溶酶体膜的通透性具有一定的影响，溶酶体膜在0 0 c 时不仅对中性物质， 而且对阳离子也具有较大的通透性。利用渗透保护的方法研究溶酶体膜对氨基酸的通透 性，发现一般情况下溶酶体膜对于氨基酸不通透，但依赖于悬浮介质的p h 。例如，谷 氨酸和赖氨酸在p h 为7 的情况下对溶酶体的渗透保护性作用比p h 为5 和6 的情况下 大得多。一般而言，小于3 0 0d a 的分子能通透，大于此者不能通透。大分子的转运主 要通过转运子进行，如胱氨酸、半胱氨酸、维生素b 1 2 、酸性糖、和硫酸盐转运子等。 发生l m p 时，溶酶体不仅对离子通透，对大分子也具有一定的通透性，这也是l m p 中 c a t h e p s i n 释放的原因。通过观察溶酶体对不同分子量的f i t c d e x 仃a n s 的通透，发现凋 亡中l m p 对大分子的通透依赖于其分子量，低于7 0l ( d a 较易通过溶酶体膜。 1 3 溶酶体的完整性 1 3 1 影响溶酶体膜完整性的因素 很多蛋白可影响溶酶体膜的稳定性。虽然多数发生机制还不清楚，但大量实验说明 细胞内众多事件的发生可改变溶酶体的完整性。如b 1 1 j n k 实验室发现磷酸化的b c l 2 可 减轻氧应激对溶酶体的损伤【3 5 1 ，随后又发现p 5 3 活化后可引起l m p 【3 1 。人为降低肿瘤细 胞h s p 7 0 水平可以引起l 御和c a t l l e p s i n 介导的细胞凋亡，但其保护溶酶体的机制不清 【3 6 】。用星形孢菌素( s t a u r o s p o 血e ) 引发凋亡时，b a ) 【结合到溶酶体和线粒体膜上引起 l m p 和内含物的释放，体外实验证实重组b a x 可插入纯化的溶酶体膜并使其内含物释 放，但无法使血红蛋白从红血球释放，说明其与溶酶体膜的相互作用具有特异性，可能 的原因是b a x 的疏水c 端可插入溶酶体或线粒体膜内，缺失该片断其破坏溶酶体膜作用 大大降低【3 7 】。在趾水( a r y lh y d r o c a r b o nr e c e p t o r ) 作为受体活化的转录因子在无外源配 基的情况下可调节溶酶体对光敏损伤或n 吓的敏感性【3 8 1 。c a s p a s e 8 可能在n 旺引发凋 亡中作用于溶酶体【3 9 1 。神经细胞中载脂蛋白e 4 可加强淀粉样蛋白对溶酶体的损伤造成 凋亡【矧。载脂蛋白还可在锥体虫细胞溶酶体膜上形成阴离子通道，使其去极化和氯离子 内流，溶酶体发生渗透膨胀后使寄生虫死亡【2 4 1 。我国曹雪涛教授最近发现凋亡时一种 l a p f 蛋白转移到溶酶体膜上，发生l m p 并释放c a m e p s i nd 和l ，继而线粒体失稳， c a t l l e p s md 的抑制剂可抑制l 心f 引起的凋亡【4 1 1 。此外，磷脂酶也可直接对溶酶体产生 破坏作用，依赖钙离子的p l a 2 可能参与破坏溶酶体【4 2 1 。当完整的溶酶体在酸性环境中 ( p h5 o ) ，其磷脂被内源性磷脂酶水解，底物主要是p c 、p e 、s m ，同时溶酶体膜通 透性增大，在p h 大于6 o 则无此现象【4 引。 活性氧或氧自由基对溶酶体完整性的影响源于对溶酶体光敏损伤的研究，后来发现 细胞自身产生的活性氧或自由基也可使溶酶体失稳。瑞典的b m l l l ( 对此进行了大量研究， 他发现过氧化氢处理j u r 姗t 细胞1 5 分钟后引起l m p ，早期的溶酶体失稳和后期的凋 亡都与过氧化氢的剂量相关。该作用可被金属离子螯合剂所抑制。溶酶体内酸性环境不 仅使金属离子易于脱离蛋白，而且加强了金属离子引发的氧化破坏作用，如溶酶体内的 铁离子催化产生的氧自由基。 东北师范大学硕士学位论文 k a g e d 甜等发现氧应激4 小时后引起细胞内c a t l l e p s i l ld 活性上升、p 5 3 ( c a t h e p s i i ld 的转录因子) 出现，1 2 小时后c a s p a s e 3 活性上升，免疫标记发现凋亡早期c a t h e p s i n 释 放到胞液。抑制c a t h e p s md 可以阻止自由基引发的凋亡( 0 l l i n g e r ，2 0 0 0 ) 。其他实验室 也发现甲基汞和过氧化氢、光氧化或氧应激产生l m p ，释放c a t h e p s i nd ，引发线粒体 膜电位下降及细胞色素c 释放，导致细胞凋亡。 很多具有表面活性剂性质的药物可以直接与溶酶体膜作用并对细胞产生一系列影 响。m s d h ( 一种质子化表面活性剂) 特异性引起细胞发生l m p ，c a m e p s i l ld 释放并活 化c a s p a s e 引起凋亡，高浓度m s d h 可以引起细胞坏死。用毛地黄苷( d 诤t o m n ) 处理 的溶酶体，其上清可活化c 2 l s p a s e 3 ，该作用可被半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制，说明溶酶 体膜已经通透。苍树苷( a t i a c t y l o s i d e ) 可通透线粒体膜和溶酶体膜。二肽l e u 1 e u 甲基 酯可直接通过渗透性膨胀破坏h e l a 细胞溶酶体，水解b i d 引起凋亡。此外，阳离子脂 d o t a p 可影响鼠肝细胞溶酶体的完整性，可能是阳离子脂与溶酶体膜上的阴离子脂作 用导致其完整性丧失。神经酰氨和鞘氨醇可直接导致l m p 。过度运动产生的氨在溶酶 体内积累，使其p h 升高，导致l m p ，部分酶释放。还有一些分子对溶酶体产生破坏作 用的机制至今不清，可能是其间接作用的结果，如微管稳定剂e p o t h i l o n eb 和 d i s c o d e n n o l i d e 可破坏溶酶体，引起n s c l c 细胞不依赖c a s p a s e 的凋亡。a 生育酚琥珀 酸盐引起j u r k a tt 的细胞凋亡中溶酶体和线粒体失稳。由于溶酶体的敏感性，它还是各 种无机和有机毒物在亚细胞水平的主要作用靶点。因此生物体中溶酶体的病理变化可反 映环境变化，可能成为环境监测的指标。海洋软体动物如甲壳类底栖生物在含有污染物 的水体中生长，其溶酶体膜完整性会发生病变，蚯蚓细胞的溶酶体状态也可反映土壤环 境状况。 1 3 2 判断离体溶酶体的完整性 离体溶酶体的完整性可以通过渗透保护方法来测定。一般而言，完整的溶酶体膜对 提供渗透保护作用的溶质的通透性很低，一旦溶酶体完整性下降，由于其膜通透性增大， 其在等渗溶液中会很快失稳，在低渗溶液中则破裂的速度会更快。因此溶酶体对具备渗 透保护作用的溶质分子通透性的大小就能反映其完整程度。将溶酶体悬浮于等渗的膜不 通透的溶液中测定其标志酶潜伏性( 如p g a l a c t o s i d 2 l s e 或p h e x o s 锄i n d a s e ) 的丧失可反 映溶酶体的完整性：如果溶酶体膜保持完整，对该分子不通透，测不到该酶的自由酶活， 说明溶酶体酶的潜伏性保持良好，即其完整性很好；如果溶酶体完整性下降，通透性增 大导致渗透性失稳，则可测到其自由酶活的升高。利用这种方法，不但可以研究溶酶体 膜对很多物质的通透性，还可以研究在很多复杂情况下溶酶体的完整性。 1 3 3 判断细胞内溶酶体的完整性 通过观察巨噬细胞内空泡的形成可判断细胞中溶酶体对相应物质的通透性。当大分 子经胞吞作用进入溶酶体后，如果该物质对溶酶体膜不通透，就会在溶酶体内聚集，最 6 东北师范大学硕士学位论文 终导致溶酶体体积变大，表现为细胞内有大量空泡形成。使用该方法发现溶酶体膜对 2 0 0 2 2 0d a 以上的物质基本不通透，对不带电荷的氨通透，对其质子化形式不通透。通 过对中性红摄取实验也可对溶酶体的稳定性进行检测：将细胞悬浮于含有中性红的缓冲 溶液中，中性红进入正常溶酶体后可保持其潜伏性，而膜被损伤的溶酶体由于对中性红 有一定的通透性，染料会漏入胞液中将细胞染红，该过程所耗时间与溶酶体膜损伤程度 相关。该方法主要应用于细胞毒理学的研究。 随着共聚焦荧光显微镜( c o n f b c 甜) 的广泛应用，可利用溶酶体特异性亲和的荧光 探针如吖啶橙( a c r i d i l l eo r a i l g e ) 、l y s ot r a c k e r 等对其进行直接观察。基于免疫荧光( 溶 酶体膜蛋白l a m p 、溶酶体内蛋白c a t l l e p s i l l 的荧光抗体) 的荧光标记技术为我们提供 了更特异、更灵敏的工具。现在不仅能直接判断细胞内的溶酶体的完整性( 发生l m p 后荧光会弥散) ，还可对其在细胞内的分布、移动等活动进行原位、实时的观察。 1 3 4 溶酶体的完整性对生物体的影响 人们很早就发现坏死细胞中溶酶体破裂，故将其称为“自杀袋”。由于细胞凋亡研究 中c a s p a s e 的抑制剂也可抑制一些溶酶体蛋白水解酶，并且很多凋亡细胞中溶酶体的超 微结构并未发生变化，因此溶酶体在凋亡中的作用在很长一段时间被忽略。近年大量研 究发现很多造成溶酶体失稳的因素可导致细胞凋亡( 如下图所示) 。 i 瓤，： 蠡 嚣 燃一 麟 一誊薯 | _ ； 誊誊菱羞i 爹l |善。；爹一。；i | | ：。 豢 | n 畦：# ：姻i s b 阪话。p 2 秘_ _ 、i ；_ _ ； ：琢玲。嘲嵇鲑；i g 可由溶酶体介导引发细胞凋亡的多种因素 溶酶体损伤程度与细胞死亡的方式有一定的相关性：较低程度的损伤可引发凋亡或 凋亡样死亡，而严重的损伤可导致坏死。大量实验证实不仅直接作用于溶酶体的因素可 导致细胞死亡，一些典型的凋亡刺激，如死亡受体t n f 和p 5 3 介导的凋亡也通过溶酶 体发生。 饿|；j奢碧秭i_l獭j|霪笼端甄|s曩i：一曩雕警_豫嚣缆 东北师范大学硕士学位论文 溶酶体发生l m p 后是否选择性释放c a t h e p s i n 尚不清楚。可以肯定的是不同的刺激 因素在不同的细胞类型中通过不同的c a t h e p s i n 发挥作用。早期认为溶酶体酶漏出可通过 直接水解p r o c a s p a s e 引发凋亡。后来s t o l ( a 等发现纯化的ca _ t 1 1 e p s i l l ( b 、h 、k 、l 、s 、 x ) 并不能直接活化c a s p a s e ，而溶酶体的提取物可以水解b i d ，后者作用于线粒体导致 细胞色素c 释放并活化c a s p a s e ，而溶酶体的提取物可以水解b i d ，后者作用于线粒体导 致细胞色素c 释放并活化c a s p a s e ，敲除小鼠b i d 基因后，溶酶体无法使线粒体释放细 胞色素c 。b i g g s 等发现c a t h e p s i i lg 在凋亡时裂解b 册蛋白( h b 珊为一种调节染色体 构象的多肽复合物，只存在于细胞核内，凋亡时裂解) ，但c a s p a s e 无此作用。此外， c 砒e p s m 还参与了不依赖线粒体途径的凋亡及不依赖于c a s p a u s e 途径的凋亡。 溶酶体还参与了自吞噬型死亡( a u t o p h a g i cc e l ld e a m ) ：细胞质或细胞器碎片被膜包 绕形成自吞噬体( a u t o p h a g o s o m e ) ，它与溶酶体融合形成自吞噬溶酶体 ( a u t o p h a g o l y s o s o m e ) ，表现为细胞内形成空泡。溶酶体水解酶可将自吞噬体内的大分 子水解。自吞噬作用可以由饥饿触发，以产生细胞生存所必须的营养。在缺乏营养的情 况下，敲除自吞噬基因或抑制自吞噬体的形成或融合会导致细胞死亡，此时抑制溶酶体 质子泵也会产生类似结果。 作为细胞内重要的细胞器，溶酶体与很多种疾病息息相关。最早发现的是溶酶体潴 留病，其特征是内部积留了大量水解底物或产物，原因是溶酶体的一些酶突变或缺失， 如神经酰氨酶( f a r b e r sd i s e a s e ) 、酸性鞘磷脂酶( n i e m a m l p i c kd i s e a s e ) ，氨基己糖酯 酶( t a v s a c k sd i s e a s e ) 缺失的患者脑组织内潴留了超过正常1 0 0 一3 0 0 倍的神经节苷脂。 溶酶体膜转运蛋白异常也会因无法及时将水解产物运出导致潴留病，如唾液酸转运子和 半胱氨酸转运子突变导致s a l l a 疾病。近年来大量研究发现溶酶体非正常损伤可导致各 种疾病。很多因素使溶酶体失稳不仅使其丧失了正常生理功能，还会导致水解酶的释放。 神经系统中，神经细胞内吞作用的加强和溶酶体失稳是老年性痴呆( a l z i l e 硫e rd i s e a s e ， a d ) 的早期事件。a d 中可溶性a b 蛋白具有神经毒性，其两性结构可以结合在膜上， 在a d 的病理发生中起重要作用。a b 刺激细胞增加溶酶体的数量和体积，神经细胞退 变前溶酶体和酸性水解酶增多，存在大量结构异常的溶酶体。异常溶酶体可促进细胞内 产生非正常的或具有神经毒性的a p p 片断。虽然溶酶体降解a p 被认为可以清除其细胞 毒性，但体外实验表明a b 在溶酶体内积累会损伤膜，引起内含物的释放并导致细胞死 亡。它们被神经元摄取后在溶酶体内积累，引起溶酶体c 砒e p s i n 的释放并导致凋亡和坏 死。在朊病毒( p r p ) 感染的脑神经细胞中( 疯牛病或羊搔痒病) ，溶酶体结构异常，并 含有异常p r p 的形式p r p s c 。p r p s c 的加工过程可能在溶酶体内进行，其积累造成溶酶体 的破裂进而产生严重后果，其释放的水解酶可破坏细胞骨架，进而产生海绵状结构。 对肿瘤细胞的研究发现溶酶体在其中起到了“双刃剑”的作用。一方面癌基因的活化 可能改变溶酶体的功能，在癌细胞，尤其是具有转移性质的肿瘤中，溶酶体经常从核周 区域转移到外周区域，其内含物有时会释放到胞外参与细胞外基质的降解，以便于癌细 胞转移和侵染。此外，h s p 7 0 在很多种肿瘤发生时都有较高的表达，h s p 7 0 可以结合在 8 东北师范大学硕士学位论文 溶酶体膜上，抵抗各种引起溶酶体失稳的刺激，如抗肿瘤药物、辐射、光敏反应等，最 终产生抗凋亡的作用。另一方面，很多凋亡刺激可以引起肿瘤细胞的溶酶体膜通透并释 放c a t l l e d s i l l ，加速凋亡的进程。同时人们还发现多种致癌物质进入细胞在与染色质结合 前，先储存在溶酶体内。因此如何通过控制和利用溶酶体的稳定性来诊断和治疗癌症将 是一个重要的研究课题。 对于肿瘤细胞而言，可利用亲溶酶体光敏剂的光敏反应进行治疗：溶酶体内的水解 酶外泄可直接杀死肿瘤细胞；光敏反应中光敏剂从溶酶体中漏出，随后可定位到溶酶体 外的部位( 例如线粒体、细胞核等) ，从而对其他细胞器造成光敏损伤，产生细胞毒性。 亲溶酶体的光敏剂可在光照后的较短时间( 6 0 分钟) 内导致小鼠白细胞发生细胞凋亡。 利用该原理，我们还可通过光化学内化法将膜不通透的药物分子转运到细胞内：当药物 被细胞吞噬进溶酶体后，向提前载入亲溶酶体光敏剂的细胞进行光照，溶酶体破裂后药 物进入胞液中产生药效。其他调节溶酶体的功能或稳定性的药物也可影响t n f 引起的凋 亡，通过药物或分子抑制鞘磷脂酶或神经酰氨合成酶可抑制n 盯引起的溶酶体损伤和凋 亡。由于很多癌症的产生是因抑癌基因p 5 3 发生了突变，寻找并设计不依赖p 5 3 的促凋亡 药物可能成为治疗癌症的新途径。因此特异性引发l 的药物或以溶酶体为药物靶点的 研究成为新的热点。此外，由于溶酶体往往是药物进入细胞的必经之路和在细胞内的最 后富集位点，同时其水解酶与药物间存在复杂的反应，因此其在药物传递和药理中的作 用也越来越被人们所重视。 1 4 胆固醇的生物功能 1 4 1 胆固醇的分子结构和细胞功能 胆固醇的分子结构包括4 个环的骨架，在c 3 上有一个羟基，c 5 和c 6 之间为双键， c 1 7 上有一个异辛脂肪烷如下图。 胆固醇的分子结构 胆固醇最主要的功能是调节调节细胞膜的物理化学特性 4 4 。胆固醇以特定的方向 插入到磷脂双分子层中，其带极性的羟基朝向水相，而疏水的固醇环夹在磷脂之间( 如 下图所示) 。 9 东北师范大学硕士学位论文 质膜中的胆固醇 在细胞膜中，胆固醇与膜中的磷脂和鞘磷脂相互作用，并影响他们的行为1 45 l 。增加 胆固醇的含量，能够增大细胞膜的机械强度并且降低细胞膜的通透性【46 l 。而过量的胆固 醇会改变钙的转运，细胞质钙离子含量水平和细胞膜的流动性1 4 。 因为胆固醇影响膜的特性，所以它也会影响细胞膜蛋白的功能【48 1 。大量的膜内蛋白 包括离子通道，膜受体和酶都会受到膜物理性质变化的影响。一些蛋白直接结合胆固醇 变得有活性或者活性丧失【4 8 5 0 】，而一些膜受体的结合能力会因胆固醇含量的变化改变 【5 l 】 0 在细胞膜中，有一个重要的结构主要由脂类组成。胆固醇和鞘磷脂组成的这个特殊 的结构就是脂筏【5 2 】。脂筏在众多的细胞功能中发挥重要的作用，例如信号转导，膜转运， 细胞骨架的组成以及病原体的入侵【5 引。 1 4 2 溶酶体膜胆固醇的功能 在溶酶体膜中，胆固醇的含量也维持在很高的水平。但是在一个研究报告中，溶酶 体膜中的天然胆固醇转运是很缓慢的。而一些胆固醇结合蛋白( s c p 2 ) 能增大溶酶体 膜中胆固醇的转运速率，同时降低溶酶体膜中胆固醇的含量1 5 4 | 。 同时有报道简单的介绍了胆固醇的含量改变( 加v j v d ，砌v f 加) 课题调节溶酶体的 稳定性【55 | 。但这个研究报告中这是对胆固醇含量变化会影响稳定性做出了介绍并没有深 入研究。同时在最近的一篇报道中介绍溶酶体膜胆固醇的丢失会增大伴侣分子调节的自 吞噬活性，而膜胆固醇的增多会明显的降低自吞噬活性。文章分析胆固醇的丢失破坏了 溶酶体的膜微结构，进而影响了膜蛋白和这个微结构的相互作用。 总之胆固醇是细胞膜维持和其特性的一个关键调节因子。胆固醇是细胞膜及其他生 东北师范大学硕士学位论文 物膜的重要组成部分。它对于调节膜流动性，膜通透性，稳定性都十分重要。溶酶体膜 是典型的脂双层结构，同样含有大量溶酶体【5 6 1 ，存在于脂双层的胆固醇对于保持其膜的 流动性和其他物理性质也应该发挥着重要作用，但是目前为止还有很多解释不清楚的地 方。 如前面所述，溶酶体的离子通透性是这个细胞器一个重要的特性1 3 训。溶酶体对质子 的通透性会大大影响溶酶体内部的酸性环境。在动物细胞中，溶酶体处在高钾离子环境 ( 1 4 0 r i 州) 的细胞质中【57 1 ，如果溶酶体的钾离子通透性增大，溶酶体就会出现渗透混乱， 影响溶酶体的完整性。在过去几年中，关于溶酶体钾离子和质子通透性的要就很多，其 他大多数文章集中说明外部因子影响离子通透性的现象【3 0 ，5 铀o 】。胆固醇作为溶酶体膜的 组成成分，作为一个溶酶体膜内部的因素可能影响膜通透性还没有研究。 综上所述，溶酶体膜胆固醇的丢失可以会引起溶酶体失稳。溶酶体的完整性不但是 其执行各种生理功能的必要条件，而且是影响细胞的生存与死亡的重要因素。此外，溶 酶体的完整性还具有重要的临床意义。近年来，国际上许多学者都指出阐明破坏溶酶体 完整性的机制是一个有待解决的重要问题，对于细胞的代谢、凋亡、坏死以及临床医药 等方面的深入研究有着重要意义。 东北师范大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试剂 c a r b o n y lc y a l l i d em - c 1 1 l o r o p h e n y l h y ( 1 r a z o n e ( c c c p ) ， 1 ，6 一d i p h e n y l 1 ，3 ，5 - h e x a ：c r i e n e ( d p h ) ， n u o r e s c e i ni s o t h j o c y a j l a t e - d e x t m ( f i t c - d e x 衄l ，m = 7 0 ，0 0 0 ) ，4 - m e t h y l u m b e l l i f e 巧l n a c e 哆l - r - d g l u c o s 锄i 1 1 i d e ，m e t l l y l - p c y c l o d e x t r i n ( m p c d ) v a l i i l o m y c i n 购自s i g m a ( s t l o u i s ，m o ) b i s ( 3 - p r o p y l - 5 一o x o i s o x a z 0 1 4 一y 1 ) p e n t 锄e t h j n e - o x o n o l ( o x o n o lv i ) 购自m o l e c u l a r p r o b e s p e r c o l l 购自a m e r s h 锄p p s a l a ，s w e d e n ) b i c m h o i l i n i ca c i d 始( b c a ) p r o t e i na s s a y 飚t 购自p 正r c e 胆固醇含量测定试剂盒购自b i o s i n ob i o t e c h n o l o g y a n ds c i e n c ei n c 其他为国产分析纯试剂。 2 2 溶酶体制备 采用j o n a s 的方法通过密度梯度离心分离纯化溶酶体【5 9 ，鲫。成年雄性w i s t a r 大鼠禁 食2 4 小时后处死。取出肝脏并剪成1n 蚰3 的小块后在0 2 5m 蔗糖溶液中用d o u l l c e 匀 浆器匀浆1 0 1 2 次( 冰浴中进行) ，4 0 叫匀浆液分装于6 个4 0m 1 离心管中3 0 0 0g 离心 8r n j n 。收集上清并加入终浓度为1m m 的c a c l 2 ，3 7 0 c 水浴5m i n 以去除线粒体【6 1j 。上 清分装于3 个4 0m l 离心管中( 底部铺有3 5 0p lp e r c o l l ) 2 0 0 0 0g 离心2 0m i n 。取沉降 分别加入3 个含p e r c o l l 的蔗糖溶液的1 5m l 离心管中，总体积1 0m l ( p e r c o l l 约占3 5 ， v v ) ，混匀后4 0 0 0 0g 离心9 0m i n 。取离心管底部p e r c o u 层上面1 2 厘米区段( 颜色较 深区段) ，加入1 0 倍体积蔗糖中，1 0 0 0 0g 离心1 3m i n 以去除p e r c o l l 。沉降为分离纯化 的溶酶体，将其悬浮于o 2 5m 蔗糖溶液中自然分散。以上所有操作均在s i 肿a3 k 3 0 离 心机4 0 c 进行。纯化的溶酶体悬浮在等渗的蔗糖溶液中，膜蛋白质为1 3 5m g 柚。 2 3 溶酶体膜的制备及膜蛋白含量测定 正常及处理后的溶酶体4 0 0 0 0g 离心l oi l 血1 收集，将收集到的溶酶体悬浮3 0m i n 于低渗溶液( o 0 2 5m 蔗糖1i 洲啊s h c l ，p h 7 4 ) 1 6 2 1 ，然后4 0 0 0 0g 离心3 0m i n 收集 溶酶体膜碎片。收集的膜碎片加入适量1 0 s d s 磷酸缓冲液( 一般为2 0 ) ，超声振荡3 0 m i n 之后4 0 0 0 0 9 离心3 0m i n ，取上清l “l ，测定蛋白含量。膜蛋自含量利用p i e r c eb c a 1 2 东北币范大学硕士学位论文 p r o t e i na l s s a yb t 测定【6 3 1 。 使用标准蛋白样品制作标准曲线为：y = 0 0 0 0 5 x + o 0 7 0 4 r 2 = 0 9 9 3 4( x 蛋白 浓度，y 荧光值大小) 。 标准蛋白样品蛋白浓度1 2 52 5 0 5 0 0 7 5 01 0 0 02 0 0 0 ( 单位：肛g 枷) 2 4m p c d 处理溶酶体 纯化的溶酶体悬浮在含有不同浓度m d c d 的0 2 5m 蔗糖或者0 1 2 5mk 2 s 0 4 中， 3 7 水浴相应时间。溶酶体在处理时的终浓度是膜蛋白5 2 酌m 2 5 溶酶体完整性分析 溶酶体的完整性通过测定其标志酶d 半乳糖苷酶( b g a l a c t o s i d a s e ) 的自由酶活来检 测【6 4 ，6 5 】。具体操作如下：将2 0 “1 1 5m mu m b g 加入2 0 0 “l 测定液( 0 2 5m 蔗糖，0 1 6 m 柠檬酸柠檬酸钠，p h4 4 ) 中，预温3 0 秒后，立即加入一定体积的溶酶体样品( m p c d 处理样品和对照样品) ，避光反应1i i l i n 后立即用2m l0 2 5m 冰浴的n a 2 c 0 3 终止反应。 使用h i t a c l l if 4 5 0 0 荧光分光光度计( e x = 3 6 51