（分析化学专业论文）蛋白在弱阳离子交换柱上的双保留机理研究及应用.pdf

西北大学硕士学位论文 摘要 古比物技术纯化蛋白质的多个步骤中，二维( 2 d - l c ) 及多维液相色谱法( m d - l c ) i j , 成为分析化学中复杂体系组分分离和分析的有力工具。本研究从二维色谱的核心色 谱柱入手，选取了几种具有弱阳离子交换( w c x ) 和疏水相互作用( h i c ) 混合机理的色谱 柱，研究蛋白在其上的色谱行为，通过选择合适的流动相，从而在这两种模式下仅用一 种流动相，就有可能完成通常用两根色谱柱和两种流动相才能实现的在线蛋白“二维色 谱”分离。 全文研究内容包括四部分： 文献综述本章概括的介绍了液相色谱技术分离生物大分子的方法以及研究现状，重 点介绍了2 d - l c 中混合模式色谱柱的研究进展以及重要意义，同时对液相色谱的基本 理论计量置换保留模型、短柱理论和在线缓冲溶液交换的研究方法做了简要阐述。 实验方法对实验中所用仪器试剂、实验原理、方法步骤作了详细说明。 蛋白在二维色谱柱t s k g e ic m - 5 p w 上的保留行为优化研究选取t s k g e lc m 5 p w 柱发现该柱在离子交换和疏水两种模式下对蛋白都有很好的保留作用，并且有很高的分 辨率。从动力学和热力学两个方面研究了蛋白在色谱柱上迁移过程中的保留规律，拟合 出计量置换理论( s d t ) 中三个线性关系方程。通过对这种双功能色谱柱的分离特点的研 究，以及色谱分离条件的优化为2 d l c 及m d - l c 中色谱柱的选择提供了可能。 弱阳离子交换色谱中疏水作用对蛋白保留的影响及应用选取了四种常用的w c x 商品柱，发现在h i c 模式下蛋白在这四种w c x 商品柱上也有不同程度的保留特征，且 洗脱曲线呈现出保留值随盐浓度变化的盯型。从分子力学角度定性解释了因疏水相互 作用力的存在影响了蛋白在w c x 色谱柱上洗脱顺序的改变。又运用s d t 中的两组线性 方程进一步证实了w c x 和h i c 中蛋白与固定相间相互作用力的性质。选择其中的一种 色谱柱p o l y c a t a 。对牛胰腺中的胰岛素进行二维快速分离纯化。 关键词：离子交换色谱，疏水色谱，二维液相色谱，计量置换，混合保留机理， 蛋白分离 西北大学硕士学位论文 _ _ _ _ - - _ _ _ 一- a b s t r a c t h lt h em u l t i s t e p p u r i f i c a t i o no fp r o t e i n si nb i o t c c h n o l o g y ，t w o d i m e n s i o n a la n d m u l t i d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yi na n a l y t i c a lc h e m i s t r yh a sb e c o m ep o w e r f u lt o o l f o rs e p a r a t i o na n da n a l y s i so f c o m p l e xs 弘缸啊纽稚sr e s e a r c h ，s e v e r a lc o l u m n sw i t hm i x e d w e a kc a t i o n - e x c h a n g c ( w c x ) a n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n 饵i c ) m e c h a n i s mw e r es e l e c t e d t os t u d yc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ro f p r o t e i n so nt h e m b ys e l e c t i n gas u i t a b l em o b i l ep h a s e ， s o m ep r o t e i n su s u a l l yr e q u i r e dt os e p a r a t ew i t ht w od i m e n s i o n a lc h r o m a t o g r a p h yc a nn o wb e a c c o m p l i s h e db yo n l yu s i n gt h es i n g l ec o l u m n t h ef u l lt e x to fs t u d yi n c l u d e sf o l l o w i n gf o u rp a r t s ： l i t e r a t u r er e v i e w t h i sc h a p t e rs u m m a r i z e sl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o da n d r e s e a r c hs t a t u so fs e p a r a t i o no fb i o l o g i c a lm a c r o m o l c c u l e s i tf o c u s e so nt h er e s e a r c hp r o g r e s s a n ds i g n i f i c a n c eo fm i x e d - m o d ec o l u m ni nt w o - d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( 2 d - l c ) a tt h es a m et i m e ，t h eb a s i ct h e o r yo fl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 咄i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n t m o d e lf o rr e t e n t i o n ( s d t ) ，s h o r tc o l u m nt h e o r ya n do n l i n eb u f f e re x c h a n g eh a sb e e nb r i e f l y d e s c r i b e d e x p e r i m e n t a lm e t h o d s t h ee x p e r i m e n t a li n s t u m e n t s ，r e a g e n t s ，e x p e r i m e n t a lm e t h o d s a r ee x p l a i n e di nd e t a i l s o p t i m i z a t i o no ft h er e t e n t i o nb e h a v i o ro fp r o t e i n so nt w o - d i m e n s i o n a lt s k g e l c m - 5 p wc o l u m n i tw a sf o u n dt h a ta l lp r o t e i n sh a v et h ec h a r a c t e ro fb o t hi o ne x c h a n g ea n d h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h i cm o d e so nt h i sc o l u m nw i t hh i 曲r e s o l u t i o n w e s t u d i e dt h er e t e n t i o nr o l eo ft h et r a n s f e rp r o c e s so fp r o t e i n si nt h ec o l u m nu s i n gb o t hk i n e t i c a n dt h e r m o d y n a m i ct h e o r y t h r e el i n e a re q u a t i o n sf r o ms d tw e r et e s t e da n df o u n dt of i tw e l l a l lt h e s es t u d i e so fs e p e r a t i o nc h a r a c t e r sa n do p t i m i z a t i o no fc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n c o n d i t i o n so fp r o t e i n sp r o v i d eap o s s i b l es e l e c t i o nt h a tt oe m p l o yt h ec o l u m nf o rp r o t e i n s e p a r a t i o nb y2 d l c e f f e c to fh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nt op r o t e i nr e t e n t i o no nw c xc o l u m na n d a p p l i c a t i o n s t h er e t e n t i o nb e h a v i o ro fp r o t e i ns e p a r a t i o nw a si n v e s t i g a t e db yu s i n gf o u r c o m m e r c i a lc o l u m n sw h i c hh a v eb e e np o p u l a r l yu s e di nw c x i tw a sf o u n dt h a ta l lp r o t e i n s h a v et h ec h a r a c t e ro fh i cm o d eo nt h e s ew c xc o l u m n s b u th a v ed i f f e r e n te x t e n t s t h e n 西北大学硕士学位论文 o b t a i n e de l u t i o nc u r v ee x h i b i t s 。盯s h a p ew h e nt h er e t e n t i o nt i m ew a sp o r e d t h ec h a n g e s i nt h es a l tc o n c e n t r a t i o ni nt h ee m p l o y e dm o b i l ep h a s e t h i sf a c t o ri n d i c a t e st h a tt h ee x i s t e n c e o ft h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sc o n t r i b u t e st ot h ep r o t e i nr e t e n t i o na n dm a yc h a n g et h ee l u t e d o r d e ro fp r o t e i ns e p a r a t i o no nt h e s ew c x c o l u m n s t h i sp h e n o m e n o nw a sq u a l i t a t i v e l y e x p l a i n e df r o mt h es t a n d p o i n to fm o l e c u l a rm e c h a n i s m i na d d i t i o n , 1 w 。o l i n e a re q u a t i o n si n t h es d tw e r ee m p l o y e dt ot e s tt h ec h a r a c t e ro fi n t e r a c t i o nf o r c e sb e t w e e nt h ep r o t e i n sa n dt h e s t a t i o n a r yp h a s e o n eo ft h ec o l u m n sp o l y c a ta r mw a su s e df o rt w o d i m e n s i o n a lr a p i d s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fi n s u l i n si n t h ec o wp a n c r e a s k e y w o r d s ：i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , t w o - d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y , m i x e d - m o d e ， p r o t e i ns e p a r a t i o n i i i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人 允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构 将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适 学位论文作者签名： 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：矛j 、堂 。呻年6 其0 e t 两北大学硕士学位论文 1 1 蛋白质的特点及研究价值 第一章前言 没有蛋白质就没有生命。蛋白质是生物体中含量最高、功能最重要的生物大分子。 虽然蛋白质的水解产物只有2 0 几种氨基酸，但在人体中的蛋白质分子总计有1 0 万余种， 并且极少与其他生物体内的相同。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各 种反应、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。 因此，蛋白质也是生命科学中非常重要的研究对象。高纯度的蛋白质对于研究未知蛋白 的分子结构、性质和生物活性有着重要价值【。 生物大分子分离纯化的步骤繁多、流程长，温度、p h 值、离子强度等各种参 数对其活性的综合影响，很难准确估计和判断【2 】。世界上发达国家都十分重视生物技术 的研究与开发，我国对生物技术也十分重视，从“七五计划开始，生物技术被列为国 家高技术项目重点支持。生物大分子的分离与纯化早已引起国际学术界的极大兴趣。据 统计，目前关于蛋白质的h p l c 分离的论文每年约有4 0 0 0 篇。在一个生物工程的工艺 流程中，下游工程的投入常常超过总投入的6 0 。例如售价高达一克一千万元的干扰素， 其生产成本的8 0 用在难度大、费用高的分离纯化上。所以生物大分子的分离和纯化是 广大生物学、化学及医学工作者十分关心并长期研究的课题。 1 2 生物大分子分离方法概述 传统的分离生物大分子的方法有沉淀、透析、超滤和溶剂萃取等。它们都是一些较 早就建立起来的分离方法，至今仍然被使用。随着生命科学的迅速发展，检测与生命相 关的生物大分子对人类征服疑难杂症，特别是对肿瘤的预警、诊断和治疗有着重要的意 义。要深入探索和了解生命领域中疾病的发病机理，检测组成复杂和体系中微量或痕量 的生物大分子，许多常规的分析技术已不能胜任。 以毛细管电泳、色谱学为主要研究内容的现代分析分离技术极大推动了复杂体系中 生物大分子的检测方法学研究，其理论塔板数可达百万数量级【3 】。但是毛细管电泳不能 用于生产规模的生物大分子的分离和纯化，它不仅处理量小而且在分离过程中会破坏生 物大分子的构象、降低其生物活性。色谱是根据混合物中溶质在互不相溶的两相间分配 行为的差别，从而引起迁移速度的不同而进行分离的方法【4 】。色谱起源于1 9 0 3 年俄国植 第一章前言 物学家瓷维特的研究工作，他以极性有机溶剂作为流动相在碳酸钙柱上分离植物色素。 高效液相色谱因其分离效能高，分析速度快，适应性强，广泛应用于石油、化工、医药、 农药、生化、环保和食品卫生等方面”】。在生物技术制取蛋白质的多级纯化过程中， 液相色谱被指定为一个“必需步骤”，成为实验室和工业生产上分离纯化及制备生物大分 子最常用和有效的方法【8 】。这表明操作条件温和、又具有分子水平分离能力的液相色谱 为开创现代生物大分子分离科学树立了一个里程碑。 1 3 离子交换色谱及疏水相互作用色谱分离生物大分子 作为分离、纯化和制备生物大分子的有效手段，高效液相色谱法在生物工程的下游 技术中占有重要的地位。但是，众所周知，在生化分离过程中，普遍存在蛋白质易失活 问题，特别是用反相高效液相色谱法纯化时，由于流动相中大量有机溶剂的存在，使蛋 白质的生物活性难以保持。 色谱技术从原理上看，采用液体流动相的分离主要基于五种原理【9 以l 】：( 1 ) 离子交换； ( 2 ) 体积排阻；( 3 ) 亲和作用；( 4 ) 分配作用；( 5 ) 吸附作用。以下主要介绍文中用到的离子 交换及疏水相互作用色谱在生物大分子分离中的应用： 1 离子交换色谱( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , i e c ) i e c 是目前在生物大分子的分离纯化中最受欢迎、应用最广泛的一种色谱方法 1 2 , 1 3 1 。 i e c 是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的带电溶质与离子交换剂之间静电作用力 的差异来实现分离的溶质洗脱色谱法【1 4 】。根据被分离物质的不同，主要分为阴离子交换 色谱和阳离子交换色谱。其中阳离子交换色谱的离子交换功能基主要为磺酸基和羧基。 离子交换色谱能用于蛋白质分离的原因是因为大多数蛋白质的氨基酸链带电，蛋白质的 带电情况取决于蛋白质的氨基酸组成和一定的p h ，因此在给定的p h 条件下不同的蛋白 质带有不同的静电荷【15 1 。然而k o p a c i e w i c z 等认为这种“静电模型并不是充分的， 研究证明蛋白质表面只有部分与固定相表面发生了相互作用，所以实际情况是背离“静 电模型”的，并通过离子交换模式验证了计量置换保留理论( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n t t h e o r yf o rr e t e n t i o n ，s d t ) 3 7 1 。s d t 为我们提供了一种可以利用离子交换色谱分离具有相 似化学和生物学性质的蛋白质的方法。蛋白质的保留行为取决于固定相表面与蛋白质表 面的带电基团的相互作用，利用电荷之间的选择性相互作用力的不同，离子交换色谱应 用于蛋白质的分离又有一些新的特点：依据p h 值和盐浓度的变化与使用固定相的种类， 可用p h 、盐浓度梯度或等度洗脱。除蛋白的活性部位处于可解离型基团上，用i e c 分 2 西北大学硕士学位论文 离时可能失活外，在绝大多数情况下，以i e c 法进行分离和纯化的蛋白质均保持原有的 活性【1 7 1 ，同时它要求样品溶液的盐浓度必须低，而且要有合适的p h 以保证蛋白质表面 有足够的电荷与固定相表面发生相互作用。此外离子交换色谱还具有流动相价格便宜、 柱负载高、产品收率高等优点，在解决化学和生物学中许多难于分离的问题上起到了 重大作用【1 8 】。 有研究表明1 9 1 在离子交换色谱中，不仅仅是被测样品溶质离子、流动相离子与固定 相离子交换位置之间进行的离子交换过程，还存在其它作用的影响，其中最重要的就是 吸附作用。离子交换色谱中，固定相的基质大都具有疏水性，可与某些溶质离子之间存 在吸附作用。在色谱柱的长期使用过程中，部分离子交换位置的离子交换功能基团可能 会流失，从而使固定相的基质裸露出来，此时溶质离子更易与固定相基质发生吸附作用。 或者，被测样品中有的溶质离子尤其是含有芳环或是双键的离子未能被洗脱，附着在固 定相表面，那么溶质离子又可能与色谱固定相上的污染物发生吸附作用。因此，离子交 换色谱中的吸附作用与固定相的种类和结构密切相关。按照基质的不同，离子交换色谱 的固定相可分为有机聚合物基质离子交换剂和无机物基质离子交换剂；按照功能基与基 质结合方式的不同，可分为键合型离子交换剂和包覆型离子交换剂；此外，还可以按照 功能基特点的不同分类。 2 疏水相互作用色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y , h i c ) 疏水作用，又称疏水效应或者是疏水性作用力。学术界对于疏水作用的含义一直存 在分歧，至少有三种不同的解释：1 ) 疏水是指非极性溶质向水性溶液的迁移。2 ) 更具 体的，疏水作用指非极性溶质在向水性溶液迁移的过程中所表现出来的与某一特征温度 的关系。3 ) 疏水性也用来指一种特殊的分子模型，该模型主要是指水分子在非极性溶 质周围的排列【2 0 1 。 根据疏水力的强弱可以分为反相高效液相色谱( r p l c ) 和h i c 。因为利用r p l c 分离 纯化的大多数蛋白质会导致失活，所以r p l c 在蛋白质分离纯化中并不常用，而h i c 却 非常适合蛋白质的分离纯化。它是利用混合样品中的各种组分与固定相之间不同的疏水 性相互作用力来进行分离纯化，以键和了适度疏水性的有机基团键的固定相为分离介 质，以盐水溶液作为流动相来分离混合物的液相色谱法。h i c 具有分离条件温和，蛋白 质的生物活性回收率高和对蛋白质的天然分子构象破坏小的优点，已经广泛应用于生物 大分子的分离和纯化，以及基因工程和生命科学领域内的蛋白折叠、变性蛋白的复性等 研究领域【2 1 1 。 3 第一章前言 生物大分子在h i c 中的保留是蛋白质分子表面暴露的疏水性氨基酸残基与固定相 表面的疏水性配基之间的相互作用力造成的【2 2 1 。疏水相互作用力，即非极性分子在水溶 液中聚集的趋势，对生物体内蛋白质分子的合成、细胞的分化、官能团的驱动和信息的 传递等生物功能的实现起着重要作用【2 3 1 。 h i c 填料分为有机聚合物和大孔硅胶键合相两类，区别在于疏水填料表面疏水性没 有反相填料表面疏水性强。疏水色谱可以和离子交换色谱、体积排阻色谱、亲和色谱以 及其它纯化手段联用来分离蛋白。a n d r e w s 2 4 1 验证了当今分离重组蛋白的最好方法就是 先用i e c 分离之后再用h i c 进行纯化，疏水色谱的优点是它创造与人体相似的生理环 境，例如中性的p h 条件、生理盐水环境和室温条件，因此这样就可以保证蛋白质在分 离过程中始终保持活性。然而h i c 并不像i e c 那样应用的特别广泛，o s c a r s s o n 等【2 5 j 发 现经典的商品疏水柱由于具有较强的疏水性而致使蛋白很难洗脱下来。后来t s u m o t o 等 2 6 1 就蛋白在这种聚合物或凝胶基质的疏水柱上难洗脱的问题提出了解决办法，他们将精 氨酸加入h i c 流动相中，然后测试了重组人体蛋白白介素6 和激活素a 在苯基凝胶柱 上的洗脱情况，结果显示精氨酸削弱了这两种蛋白与固定相之间的疏水作用，提高了活 性蛋白的质量回收率。尽管如此，由于这种基质只能承受较小的压力从而限制了其广泛 应用。因此科学家们关注的是廉价和能够广泛用于多种蛋白分离的基质。蛋白质的分离 度和选择性基本上取决于固定相基质的表面性质，在大多数情况下大规模的蛋白质纯化 都是在温和或半刚性的基质表面上进行的，因为这种基质表面和蛋白有很好的亲和性。 经过化学修饰多孔硅胶基质也可以用于蛋白质的分离纯化，但是在多数情况下都用来分 离小分子，由于其昂贵的价格，只有在特殊的情况下才用于大规模的蛋白质分离纯化。 1 4 计量置换保留理论 自2 0 世纪8 0 年代中期耿信笃等人提出了反相色谱中的计量置换模型以来【27 ，引起 了国内外色谱界的广泛关注。1 9 8 5 年提出溶质与溶剂分子间的计量置换这一概念【2 8 】并 称之为s d t 。各种分离模式在生物大分子的分离和纯化中均有其各自的特点和保留模 型。吸附等温线【2 9 】、平衡扩散模型 3 0 】和s d t 常被用来描述色谱过程中溶质的色谱保留 行为和洗脱曲线。1 9 9 1 年耿信笃等人又提出了一个除排阻色谱以外的，适用于各类液相 色谱的多组分溶剂在全浓度范围内的溶质计量置换统一保留模型 3 1 , 3 2 1 ，这也是唯一可用 于表征生物大分子色谱保留行为的模型，s d t 被用来描述色谱过程中溶质的色谱保留行 为和洗脱曲线，其核心思想可用图1 1 表示： 4 西北大学硕士学位论文 吸附溶剂化 解吸 图1 - 1 液相色谱中s d t - r 的示意图 f i g u r e1 - 1 s d t - rd i a g r a mi nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 由图1 1 看出，液相色谱中的计量置换过程是由溶剂化、吸附和解吸附三部分组成。 在流动相中，当溶剂化生物大分子被溶剂化固定相表面吸附时，从二者的接触面上会有 一定计量的溶剂分子释放出来。当生物大分子从固定相表面解吸附时，流动相中又会有 一定计量的溶剂分子重新回到生物大分子和固定相表面。这一模型可以用两个线性方程 分别表示为【3 3 1 ： l o g k = l o g - z l o g a n ( 1 1 ) 1 0 9 = j z - l o g 缈 ( 1 2 ) 上式中后，为溶质的容量因子，l o 矿是一个与lm o l 溶质对固定相亲和势有关的常数， z 表示1m o l 溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时，从溶质与固定相接触面释放出来的溶 剂的摩尔数，q d 表示流动相中强溶剂的活度，表示一个与1t o o l 溶剂对固定相亲和势 有关的常数，婊示柱相比。在上述两个线性方程中，第一组线性参数1 0 和z 和第二 组线性参数和l o g ( a 均有明确的物理意义，包含了许多关于分子构象、溶质与固定相作 用力以及色谱条件影响因素等方面的信息，在研究小分子和生物大分子的性质中获得了 广泛的应用3 4 。6 1 。在对生物大分子进行梯度洗脱分离时，以分离度和峰容量为标准，便 可对蛋白质的色谱分离条件进行优化【3 7 , 3 8 】。由于此模型有坚实的理论基础，经过这十几 年的不断发展和创新，已广泛应用于化学、生物化学、分子生物学和基因工程中。 1 5 短柱理论及在线缓冲溶液交换 传统的色谱理论认为色谱的分离度一般随理论塔板数的增大而增大，也就是分离度 随色谱柱长度的增加而增大。研究发现r p l c 、i e c 、h i c 和金属螯和亲合色谱用于生 物大分子分离时，分离度几乎与色谱柱的柱长无关3 9 4 0 】。其原因是生物大分子与色谱固 5 ：翩一 土固 第一章前言 定相之间的吸附属于多位点吸附4 1 1 ，而且它们的吸附与解吸行为符合计量置换理论，即 符合式( 1 1 ) 和( 1 2 ) 。将式( 1 1 ) 代入式( 1 2 ) 得： l o g k ，- z ( j - l o g a d ) + l o g t p ( 1 3 ) 由式( 1 3 ) 看出，对于给定的色谱体系，当流动相和固定相一定时，参数和垆均为 常数。那么在一定流动相浓度下，j | 将随z 值的变化而改变。对于两种不同溶质的容量 因子比值的对数可以表示为： 1 0 9 了2 = ( z 2 - z 1 ) ( j l o g a d ) ( 1 4 ) 由于容量因子k 与分配系数尸a 有下面的关系： l o g k = l o g p a + l 0 9 9 ( 1 5 ) 将式( 1 5 ) 代入式( 1 4 ) 得出两种溶质的容量因子比与它们的分配系数比的关系为： 1 蚀k ，l _ _ r = l 。g f p a l ( 1 6 ) c 2 1 a 2 由式( 1 6 ) 看出，两种溶质能否被分离主要取决于两种溶质分配系数的比值，分配系数的 比值越大，由式( 1 6 ) 推出它们的容量因子的比值越大，则两种溶质在色谱柱上的迁移速 度差也越大，越容易被分离。对于蛋白质等生物大分子的分离，两种生物大分子的分配 系数的比值大到一定程度，就会出现一种溶质已经洗出色谱柱，而另一种溶质需要在很 长一段时间后才能被洗出，甚至还会出现另一种溶质根本无法洗脱的情况【4 2 】。因此，对 于生物大分子的分离应采用梯度洗脱方式。梯度变化时，生物大分子的色谱保留行为主 要由流动相中置换剂的浓度决定，容量因子肜随置换剂浓度改变而改变。因此，生物大 分子在色谱柱上的保留行为表现为完全吸附或完全解吸模式 4 3 , 4 4 】，出现生物大分子的分 离基本和柱长无关的现象。利用短柱理论就可用较短的色谱柱在较低柱压情况下对生物 大分子进行分离。 蛋白在一维色谱中不能完全分离，在通过第二维色谱分离的过程之前，必须要将第 一维样品的收集液累加进样至同_ 一根色谱柱的第二维，整个过程操作复杂，工作量大， 耗时长，样品容易受到污染。如果能使用大流速的在线缓冲溶液交换便可解决上述难题。 既然蛋白质的分离度基本与柱长无关，蛋白洗脱时只要流动相中置换剂的浓度未达到蛋 白的洗脱浓度前，可认为蛋白在柱内不移动。在一定的时间间隔内，蛋白的保留不随进 样时间而改变，利用这一性质可进行缓冲溶液交换。这一事实为单柱二维色谱法 6 西北大学硕士学位论文 ( 2 d l c 1 c ) 分离蛋白中的在线缓冲液交换和进样提供了可靠的理论基础。 1 6 混合保留机理的研究 液相色谱是蛋白纯化技术的核心，因此就要提到蛋白纯化的机理。蛋白在任何一种 色谱模式上的纯化保留机制都可以用热力学平衡的观点来解释。用溶质保留和其它色谱 参数之间或者是和蛋白质分子结构特点相关的分子相互作用力的可计算量之间的定量 关系进一步解释。前者在实际应用中操作简单容易，而后者却十分复杂繁琐。即使是这 样对于前者而言，溶质的保留机制还没有完全被解释清楚。比方说，反相色谱是高效液 相色谱中分离小分子最常用的方法，在其中至少有十种以上的保留机制，其中最重要的 四种已经被报道。蛋白质分子比有机小分子结构更复杂因此不能够用溶质相互作用来解 释。耿信笃、r e g n i e r 等人提出了计量置换保留机理。s n y d e r 等解释了不只在反相色谱 中同时也在其它的色谱模式下生物聚合物的保留机制。到现在为止，s d t r 解释蛋白的 保留机制已经在反相液相色谱( r p l c ) 、离子交换色谱( i e c ) 、疏水相互作用色谱( h i c ) 、 亲合色谱( a f c ) 中得以验证。这个事实说明了只用一种蛋白的保留机制s d t r ，蛋 白分离的原理就可以完全被解释清楚了。 r e g n i e r 等【4 5 】最先合成了一种弱阴离子交换固定相，具有弱阴离子交换和疏水相互 作用双机理，被用于离线模式的蛋白分离。m e l a n d e r 等【4 6 】也发现了阴离子交换色谱( h z x ) 具有疏水色谱( h i c ) 的性质，并称其为混合机理。卫引茂等【4 7 】提出了h i c 柱同时具有i e c 机理，统称为混合保留机理。他们均绘出了能表达蛋白双保留机理特征的“u ”型洗脱曲 线图。y a t e 等人将强阳离子交换和反相色谱的填料装填到一根色谱柱中从而首次实现了 蛋白的在线分离。这类色谱柱被称为双向色谱柱或混合色谱柱，但是至今为止还没有用 于蛋白或多肽的痕量分析。曾经有报道指出先离子交换后疏水两种色谱模式正交组合的 分离模式是保持天然蛋白生物活性的最佳分离模式。柯从玉等【4 8 】用一种特殊的色谱固定 相同时具有h i c 和弱阳离子交换( w c x ) 两种好的色谱分离功能，从而用一根色谱柱和不 同的流动相洗脱强度就能实现通常要用两根w c x 和h i c 色谱柱单独使用的蛋白分离效 果，称该色谱柱为二维色谱柱( 2 dc o l u m n ) ，在此基础上又提出了在线单柱二维液相色谱 法( o n l i n et w o - d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yb yas i n g l ec o l u m n ，简称o n l i n e 2 d l c 1 c ) 以实现天然蛋白的快速分离【4 9 1 。 7 第一章前言 1 72 d l c 及m d l c 1 7 12 d l c 及m d l c 的发展 科学的发展使得分离分析的对象越来越复杂，从而提高了对分离分析技术的要求， 促进了各种新技术的发展。1 9 8 4 年g i d d i n g s 等【5 0 - 5 2 】提出多维分离的概念，多维分离技 术得到较快的发展，并已在生命科学、环境科学、聚合物科学等诸多领域得到广泛应用。 二维凝胶电泳( 2 d g e ) 结合质谱是目前蛋白质组研究中分离和识别蛋白使用最广泛的方 法 5 3 - 5 5 】。虽然2 d g e 技术在一次分析中可以识别上千种蛋白质，但自动化程度低，重 复性较差且耗时长，同时也较难识别相对样品分子尺寸大小差异较大的蛋白、低丰度蛋 白等。全二维气相色谱是最先商品化的多维分离技术，在石油样品的分离、天然药物中 有效成分研究等方面己表现出明显的优势【5 6 1 。 在过去一个世纪以来所设计的一切液相色谱介质都只是溶质以一种力与其固定相 的相互作用的一维色谱。对分离小分子溶质而言，l c 最大理论塔板数( n ) 一般为1 0 4 1 0 5 。 对于复杂样品的分析，比如细胞、体液及动物组织中成分的分离，使用一种分离模式往 往不能提供足够的分辨率，也不能满足蛋白纯化中纯度大于9 5 的要求【5 7 1 。而近年来在 蛋白质组研究中新兴的多维液相色谱( m d l c ) 技术， 因便于接口控制、易与质谱连接、 自动化程度高等优势，作为与2 d g e 互补的技术在大规模蛋白质组研究中已发挥了重 要作用。故常常要用不同组合分离模式的2 d l c 及m d l c 进行蛋白分离 5 8 - 6 0 。 1 7 22 d l c 及m d l c 的概念 g i d d i n g s 为多维分离提出两条标准：所有样品组分的色谱分离要经过两种或两种以 上的独立模式；各组分间的分离效率不受后续分离的影响。也就是说，多维色谱是在不 同的色谱分离模式下，即不同的保留机理下进行的色谱分离。多维高效液相色谱中虽采 用了柱切换技术，但并不等同于柱切换。只有那些在第1 根色谱柱以后有着不同于第1 根柱的分离模式的柱组合才称得上是多维色谱。在理想情况下，二维液相色谱( 2 d l c ) 的分辨率可用总峰容量n 2 d 来表示，其值为第一维的峰容量n l 和第二维的峰容量n 2 的乘 积【6 1 1 ，从而使组分通过2 d l c 分离后的分辨率得到了很大的提高。 8 西北大学硕士学位论文 | f i r s td i m e n s i o n | h p l ca n d c o l u m n i 。一 图1 2 f i g u r el - 2 1 7 32 d l c 及m d l c 的分类 s e c o n dd i m e n s i o no p e r a t i n ga s c h e m i c a l l ys e l e c t i v ed e t e c t o r 2 d l c 系统示意图 s y s t e md i a g r a mo f2 d - l c 二维液相色谱大多使用两支或更多支色谱柱，通过一定的切换接口实现样品的柱间 转移。b e r k o w i t z 按一维组分是否直接进入第二维，将多维高效液相色谱可以分为离线 ( o f f - l i n e ) 和在线( o n 1 i n e ) - - 维色谱两大类。由于分析仪器的发展越来越趋于自动化，离线 多维色谱的使用受到了限制。在线二维液相色谱系统以如下的特点得到了广泛应用：1 ) 样品在两种不同保留机理的色谱柱上进行分离。2 ) 二维的结合方式能提高样品的分析 通量，具有很高的分离效率。在线多维色谱( o n 1 i n em d l c ) 又可分为同时分离与连续分 离两种方式。前者主要涉及一些特殊的填料，价格较昂贵且不易得。而后者是当前人们 最为感兴趣的方法。根据第一维的馏分是否全部转移到第二维，二维液相色谱又可以分 为切割式二维液相色谱( l c l c ) 1 6 2 1 、停流二维液相色谱嘲和全二维液相色谱( l c l c ) f 6 4 】 等。二维液相色谱( t w o d i m e n s i o n a l ) 技术在线联用是一门新兴技术，作为一种分析复杂 样品的理想工具，目前它已被广泛应用于医药卫生、食品科学6 5 ，6 6 1 环境和农业科学6 7 6 9 】 等各个领域。 1 7 42 d l c 及m d l c 的优缺点 2 d l c 的优点很多：方法的可靠性和重现性较一维色谱大大提高；集样品的净化与 浓缩及分离测定于一体，避免大量样品的手工前处理工作，加快了分析速度；进样量大、 灵敏度高，适合做大量样品的痕量分析；能从复杂的多种组分中排除干扰物质，有选择 地针对感兴趣组分进行分析。 作为一种新的技术，它的主要问题是分辨率和重现性尚不能与二维凝胶电泳相比。 同时，2 d l c 联用，系统的复杂性增加，转化阀、环线及检测器造成的死体积增加了峰 9 第一章前言 展宽的风险性，而且方法的建立比较烦琐复杂。因此，假如单一色谱能够解决的问题， 没有必要选择2 d l c 处理，除非样品复杂、数量多，或者应用传统方法无法解决。此 外，对于某些痕量分析，或者需要相对较高的灵敏度和选择性的分析工作，也可以考虑 2 d l c 作为分析手段。 1 8 本研究的目的和意义 建立高效、快速的分离方法是生命科学、环境科学等诸多领域的的迫切需要。随着 色谱技术突飞猛进的发展，在实际应用中，特别是复杂样品，通常采用几种分离模式结 合使用才能获得理想的目标产物。本文研究了具有w c x 和h i c 混合机理的色谱柱，如 果将该混合保留机理运用适当，可合成一类新型的色谱固定相以用于( w c x h i c ) - 二维色 谱柱，就为建立一种单柱二维在线分离蛋白的方法提供了可能，在活体蛋白的快速分离 方面有着重要应用价值，既可以分离天然产物包括植物、动物、人血液等等，同时又能 分离重组蛋白或蛋白药物，制备的规模可达到1 0m g 以上的纯蛋白。 1 0 西北大学硕士学位论文 参考文献 【1 】s e l am ，w h i t eeh ，j r ，e ta 1 r e d u c t i v ec l e a v a g eo fd i s u l f i d eb r i d g e si nr i b o n u c l e a s e j s c i e n c e ，1 9 5 7 ，1 2 5 ：6 9 1 6 9 3 【2 】陈毓荃生物化学试验方法和技术 m 】北京：科学出版社，2 0 0 2 ：4 6 4 9 【3 】耿信笃现代分离科学理论导引 m 北京：高等教育出版社，2 0 0 1 ：9 7 9 9 【4 姚志建生物工程下游处理中的液相色谱 j 色谱，1 9 8 9 ，7 ( 1 1 ) ：5 - 7 【5 】李克安，金钦汉等译分析化学 m 北京：北京大学出版社，2 0 0 1 ：1 9 9 2 1 0 6 李爱军，张代辉，马书民等液相色谱- 串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留 j 】分 析化学，2 0 0 8 ，3 6 ( 5 ) ：6 9 9 7 01 7 】仲娜，王小如，杨黄浩等高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术用于胁 迫富硒海带硒形态研究 j 】高等学校化学学报，2 0 0 8 ，2 9 ( 1 ) ：7 7 8 0 【8 】z h a n gl l ，l i i lym a n a l y s i so fp r o d u c t so fd e g r a d a t i o na n ds i d er e a c t i o n so f p r o a n t h o c y a n i d i nb yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - d i o d ea r r a yd e t e c t i o n j c h i n e s ej o u r n a lo f a n a l y