（环境工程专业论文）青霉hhep7产微生物絮凝剂及其絮凝特性研究.pdf

华南理工大学硕士学位论文 土颗粒也可与多个m b f 7 分子反应，从而可以形成大的网状絮体，实现理想的 絮凝沉淀。 关键词：微生物絮凝剂；絮凝模型；表面配位：发酵动力学；青霉 符号说明 符号说明 动力学参数( g g 1 h 。) 动力学参数，( g g 一h 1 ) 最大比增值速率( g g 。1 ) 菌体浓度“g l _ 1 ) 初始底物浓度“g l - 1 ) 初始絮凝剂浓度，( g l 1 ) 最大絮凝剂浓度( g l _ 1 ) b 2动力学参数( g g d ) m 2 动力学参数( g g d ) x o 初始菌体浓度( g - l 1 ) x 。最大菌体浓度( g l 。1 ) s 底物浓度，( g l - 1 ) p 絮凝剂浓度( g l d ) f 时间h h 蠡t x & h k 华南理工大学硕士学位论文 微生物絮凝剂( m i c r 0 1 b i a lf l o c c u l a n t ) 正是这样一类絮凝剂，对人体无害，可 以被生物降解对生态环境无不利影响。它们是由微生物产生的有絮凝活性的次生 代谢产物，如糖蛋白、粘多糖、蛋白质、脂类和d n a 等生物商分子物质，具有这 样的特点：( 1 ) 无毒无害，安全性高。经小白鼠安全性试验证明，微生物絮凝剂能 用于食品、医药等行业的发酵后处理。( 2 ) 易被微生物降解，无二次污染。( 3 ) 对多 种废水有絮凝效果，脱色效果独特。( 4 ) 某些微生物絮凝剂的p h 和热稳定性好、用 量小。微生物絮凝剂正在成为当今世界絮凝剂研究的热点和新的发展方向。目前由 于微生物絮凝剂的生产成本一般都较高，产量也低，且絮凝效果般不如有机合成 高分子絮凝剂，成为限制微生物絮凝剂发展的重要因素。因此，选育高效絮凝剂产 生菌、利用廉价培养基和现代分子生物学技术是解决问题的重要手段。 1 2 微生物絮凝剂的研究历史与现状 根据微生物产生絮凝物的特性，可将其分为两大类，一类是絮凝性微生物，这 类微生物本身就具有絮凝作用。它们并不分泌絮凝剂到培养基中，只是在细胞壁上 或周围存在一些类似凝集素的物质。这类微生物研究的较多的主要是酵母，这是因 为酵母是酿酒工业或者其他发酵工业中的重要菌株，其絮凝性的好坏直接影响到固 液分离；也有直接使用细菌作为微生物絮凝荆处理细粉煤灰废水的研究 ( v j j a y a l a k s h m i ，2 0 0 3 ) 【7 1 。另一类是产生絮凝剂的微生物，这类微生物分泌生物 大分子到胞外，这些胞外物能起絮凝作用。当前微生物絮凝剂研究的主要是这类微 生物，一方面胞外微生物絮凝剂本身较絮凝性微生物普遍，另一方面，胞外微生物 絮凝剂的保存和使用也更方便和广泛。但也有部分产生絮凝剂的微生物在其细胞表 面上也可能有絮凝剂附着或者其本身可以作为吸附中心吸附悬浮颗粒物，从而起到 絮凝作用。所以这种分类的界限并不十分清楚，如如c j u s p d j 脚r r 8 及其分泌的 胞外蛋白和多糖( p a t r a ，2 0 0 4 ) 1 8 j 都能有效地絮凝黄铜矿和石英粉末。 l 0 u i sp a s t e u r ( 1 8 7 6 ) 最早报道了酵母菌能絮凝微生物的现象。二十年以后， b o r d e t ( 1 8 9 9 ) 发现有的细菌具有同样的作用。虽然美国科学家b u t t e r f i e l d ( 1 9 3 5 年) 最早从活性污泥中筛选到絮凝剂产生菌，但直到1 9 7 6 年，n a k a m u r a 等人( 1 9 7 6 ) 【9 】 从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等2 1 4 种菌株中，筛选出1 9 种具有絮凝能力的微生 物，其中霉菌8 种，细菌5 种，纺线菌5 种，酵母菌1 种，并证实了活性污泥具有很好 的沉降性能与这些絮凝性微生物分泌的胞外物有直接关系。从此，微生物絮凝剂的 研究工作才真正开始。 八十年代以后，微生物絮凝剂的研究工作进入了全面启动阶段，并取得了一些 著名的研究成果，代表性人物有n a k a m u r a 、t a k a g i 和k u r a n e 等。k u r a n e 等人( 1 9 7 9 ) 【1 0 】在研究活性污泥处理邻苯二甲酸酯如d e h p 时，发现接种d c 日砌抽e 叫m r 叩。船 2 华南理工大学硕士学位论文 控制策略，实现了高细胞生长速率和高产物产率的统一，并结合生物化学、遗传 学理论和文献数据，构建了r e a 2 的合成代谢途径。此絮凝剂还可用予墨水和 糖蜜废水的脱色。 此外，马放等( 2 0 0 3 ) l 1 提出复合型微生物絮凝剂这一概念，但他们对这 一概念解释说明的不够充分，能否得到一般性的共识，尚有待于人们的深入研究。 我国其他很多学者也在微生物絮凝剂这一领域进行了广泛的研究，但大多数都还 处于初始研究阶段，主要是絮凝剂产生菌的筛选、培养优化和絮凝特性等。 1 1 3 霉菌产生微生物絮凝剂的研究 能分泌絮凝剂和本身就具有絮凝作用的微生物，都叫做微生物絮凝剂产生 菌。就目前的研究状况来看，能产生絮凝剂的微生物，主要包括细菌、霉菌、放 线菌、酵母和藻类等，广泛分布在土壤和污水中。目前已分离到的具有产絮凝剂 的霉菌种类有蓝色犁头霉、雅致放射毛霉、黑曲霉、寄生曲霉、棕曲霉、赫曲霉、 酱油曲霉、出芽短梗霉、卷霉、白地霉、赤红曲霉、白霉、毛霉、拟青霉、黄曲 霉、根霉、米根霉、青霉等【1 1 。下面就一些霉菌产生的絮凝剂的一些特性进行综 述。 崔 油曲霉( 彳印口? f j j u ss d a e ) a j 一7 0 0 2 ( n a k a m u r a ，1 9 7 6 a ，1 9 7 6 b ，1 9 7 6 c ) 【7 卜7 3 l 在培养过程中加入过多的葡萄糖会抑制其絮凝物质f 一1 的合成，加入絮凝 剂的前体2 一葡萄糖酮酸则有利于絮凝剂的积累。f 一1 对很多物质体系都具有絮 凝作用，但絮凝反应受p h 和离子强度影响较大。对f 一1 的化学成分进行分析， 结果表明为糖蛋白，含2 0 9 的半乳糖胺、0 3 葡萄糖胺、3 5 3 2 一葡萄糖 酮酸和2 7 5 蛋白质，分子量大于2 0 0 ，0 0 0 道尔顿。对f l 的结构形态分析 表明絮凝剂的微观结构为球形，2 一葡萄糖酮酸维持絮凝剂成球形，一旦丧失2 葡萄糖酮酸成分后，絮凝剂的微观结构就发生了变化，而且絮凝模型也由非离 子性絮凝剂的絮凝模型转变为阳离子絮凝剂模型。分子中的半乳糖胺是引起絮凝 的的关键部分，分子中的蛋白质对于增大絮凝剂的分子量的贡献大，分子中的2 一葡萄糖酮酸使分子具有两性特性，通过一些蛋白酶处理后，絮凝活性下降，但 不会消失，这是由于蛋白酶溶解了絮凝剂中的蛋白质，从而使絮凝剂的分子量下 降，但引起絮凝的关键部分半乳糖胺未变。这是首次从微生物絮凝剂的化学组成 和结构分析研究微生物絮凝剂的絮凝作用机理。 t a k a g i 等人( 1 9 8 5 a ，1 9 8 5 b ) f 7 4 符j 从土壤中分离一株絮凝剂产生菌拟青霉 ( 忍c e c j ，衄y c e ss p ) i 一1 。培养中灭菌后的e 国j 细胞的存在能促进i 一1 产生絮凝剂，这是目前文献中唯一看到的利用ec d j j 促进微生物产絮凝剂的报 道。高浓度的c a ”对细胞生长和絮凝剂的产生都有很大的促进作用。絮凝剂 6 华南理工大学硕士学位论文 控制策略，实现了高细胞生长速率和高产物产率的统一，并结合生物化学、遗传 学理论和文献数据，构建了r e a 2 的合成代谢途径。此絮凝剂还可用予墨水和 糖蜜废水的脱色。 此外，马放等( 2 0 0 3 ) l ；得翌霎蒿蛩矗髂鞠髂船聪嚣群銎i 拥缸匦稀 梢戳函妊甾爵甄函耗鞫i 喜伟度猢一噬灞嵫唾券：瞪器强制露嘤蛔犁明摆攀； 斌2 描鼎瑟群型戬明 生物絮凝剂对悬浮水体的处理效果较好，可用于去除 藻类。 邓述波等( 1 9 9 9 ，2 0 0 l a ，2 0 0 1 b ，2 0 0 3 ) 1 5 2 5 j 从土壤中分离得到一株高效 絮凝剂产生菌硅酸盐芽孢杆菌( 砌c ，j l u 占皿，c j g 如鲫s “s ) a 2 9 ，用该菌产生的 絮凝剂处理高岭土悬浮液，不需添加c a “及a 1 ”等助凝剂，用量仅为一般生物絮 凝剂用量的l 1 0 1 l o o ，絮凝效果优于目前文献报道的其它种类微生物絮凝剂； 对高浊度河水处理后，河水浊度降至o 8n t u ，技术指标优于p a m 等常规絮凝剂； 用于淀粉废水时对s s 和c o d 的去除率分别达8 5 5 和6 8 5 。提纯分析发现絮凝 剂m b f a 9 由含有1 9 1 的糖醛酸、4 7 4 的中性糖和2 7 4 的氨基糖的多糖构 成，分子量为2 5 9 4 1 0 6 道尔顿。他们认为糖醛酸含量高，分子量大是絮凝剂 m b f a 9 絮凝效果好的主要原因。动物急毒性试验表明该絮凝剂无急毒反应。 m b f a 9 优异的絮凝效果、低投加剂量及生物安全性有可能使其实现规模化生产 并用于实际废水等的处理中。 张通等( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) 1 5 6 9 】从土壤、污水和活性污泥中筛选 出絮凝活性相对较高、性状相对更稳定的两株菌株粪产碱杆菌( 4 f c 口f f 船n e s ，口e c 口z 括) l 4 2 和产气肠杆菌( 励 e ，0 6 a c 盯a 盯昭e 力e 曲w 2 3 ，细菌的全培养液 对强碱性的天然碱泥具有较强的絮凝作用，其平均絮凝率分别达到7 9 8 0 和 8 7 9 6 。他们还对其培养条件进行了优化。对蛇3 在摇床优化的培养条件的基础 上进行5 l 罐放大试验，发酵周期缩短1 2 h ，絮凝活性提高了1 4 4 5 ，絮凝效果 达到并超过国产有机高分子絮凝剂。这是目前文献报道的唯一针对碱泥体系絮凝 所筛选出的微生物絮凝剂产生菌。 宫小燕等( 2 0 0 1 ，2 0 0 3 a ，2 0 0 3 b ) 1 6 0 “2 】筛选到曰4 c f z 缸5s p b 2 ，絮凝活性最 高达9 7 以上；忍朗f 妇c f ，“s p 口矽删傅口b y - 2 8 ，其所产絮凝剂对水中无机悬浮物 和有机染料具有较高的去除率，尤其是能有效地去除肌苷发酵液和肌苷生产废水 中的菌体和悬浮物。n e h d 口m d ss p g x 4 1 ( 王竟，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 【6 3 ，“】分泌的胞 外高聚物w j 1 能有效的吸附水溶液中的直接耐晒翠蓝、活性艳蓝等染料和水中 的c r ( ) 。柴晓利等( 2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) 【6 5 ，“】将r h i z o m o n a ss p 产生的絮凝剂的 用于腐殖酸和垃圾渗滤液的处理中，对腐殖酸的去除率分别达到8 0 和5 0 以 上。这些研究拓宽了微生物絮凝剂的应用范围。 华南理工大学硕士学位论文 表1 ，2 我国分离到的部分霉菌类絮凝剂产生菌 t a b l c1 2b i o n o c c u l a n tp r o d u c e db ym o u l di s o l a t e db yc h i n e s e 8 第一章绪论 1 4 微生物絮凝剂的絮凝作用机理研究 微生物絮凝剂是由微生物分泌的，不同的微生物分泌的絮凝剂性质不同，而且 微生物絮凝荆的成分复杂。研究者对此进行了大量的研究工作，提出了多个描述特定条件下絮凝过程作用机理的理论学说。 如b u t t e 仃i e l d 的粘质假说、g r a b t r c e 的利用p h b ( p o l y h y b d r o x y b u t y r i ca c i d ) 酯台假说、fricdman的菌体外纤维素纤丝学说、荚膜学说、疏水学说、电性中和学 说、胞外聚合物架桥学说等。荚膜学说认为细胞在生长的过程中形成了粘性荚膜， 粘连颗粒使之形成絮体；g 强b l f e c 的p h b 酯合学说是根据它的生枝动胶菌积累聚b 羟基丁酸提出来的，只能解释部分产p h b 的菌引起的絮凝现象。f r i c d m a n 的菌体 外纤维素纤丝学说认为由于胞外纤丝直接参与了絮凝，纤丝把颗粒联结到一起，形 成絮团，但因不能解释大部分絮凝现象也不为人们所接受。疏水学说认为细胞表面 的疏水性与絮凝过程有关，颗粒与细胞表面的疏水作用对细菌的粘附至关重要。 对于由胞外分泌的絮凝剂的絮凝机理，大多还沿用d l v 0 理论来解释，主要 有“桥连作用”机理、“电荷中和”机理、卷扫作用、“化学反应”机理。电性中和 学说认为细菌在溶液中可以看成带电胶体，在絮凝时和相反电性的颗粒发生电性中 和，压缩双电层，颗粒相互靠近，发生絮凝。目前较为人们所接受的微生物絮凝剂 的絮凝机理是离子键、氢键键桥学说，该机理认为絮凝剂大分子借助离子键、氢键 和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒，在颗粒间产生“架桥”现象，形成一种网状 的三维结构而沉淀下来。该学说可以解释大多数微生物絮凝剂引起的絮凝现象。 f o r s t e r 指出，当细胞外物质为酸性时，离子键合是主要吸附形式：当胞外物质为中 性时，氢键结合是主要方式。t c n n e y 、b u s c h 提出了胞外高分予聚合物通过“架桥” 的絮凝模型，根据这种理论，高分子聚合物通过桥连作用使悬浮物絮凝时，可在絮 凝剂分子与颗粒之间以离子键结合而发生絮凝。 h v y 等( 1 9 9 2 ) l ”j 在研究环圈项圈藻爿弗口6 口c f m h 肠，妇p c c 6 7 2 0 产的絮凝剂絮凝 膨润土过程时，通过测c a “和絮凝剂在膨润土表面上的吸附等温线和z c t a 电位， 得出c a c l 2 的作用是减少生物絮凝荆与膨润土之间的静电斥力，增加絮凝剂在膨润 土表面的初始吸附，也即加强了絮凝剂的架桥作用。s a n t h i y a 等( 2 0 0 2 ) m l 研究 b 日c f f ，“s p o 咖m 弦口产胞外多糖对闪锌矿和方铅矿的絮凝作用，发现加入胞外多糖 可以降低矿物表面的负电荷。红外光谱研究也表明多糖通过化学作用吸附在矿物 表面，从而对矿物起絮凝架桥作用。秦培勇等( 2 0 0 4 ) 【如l 研究微生物絮凝剂乳 酸杆菌属( l 4 c f d b n c j f m s ) m b f t r j 2 1 对碱泥的絮凝机理时得出絮凝剂糖胺中的 氨基与碱泥以氢键结合，然后通过架桥作用絮凝沉淀。 由于活性污泥絮体是由细菌胞外分泌物一金属离子( 如c a 2 + ) 一细菌、其 他无机有机物组成，这一体系模型类似于胞外微生物絮凝剂一金属离子( 如c a 2 + ) 9 华南理下大学硕士学位论文 一无机悬浮或有机物或细胞体系。因此活性污泥中的絮体形成过程可以在一定程 度上反映微生物絮凝剂的絮凝机理，这是微生物絮凝剂促进污泥颗粒化的理论基 础。 b u s c h 和s t u m m ( 1 9 6 8 ) l 蛐】研究污水处理中的细菌的生物絮凝现象，指出聚 合物的活性位点的专属吸附和架桥是导致细胞聚集的原因，降低菌体表面电位不 是必需的。k e i d i n g k 等( 1 9 9 7 ) 1 9 z j 研究离子组成对活性污泥中有机大分子的作 用，发现采用离子交换法去除水中的c a 2 + 导致絮体中c a 2 + 和有机大分子的释放， 小絮体颗粒的z e t a 电位也从1 4 m v 降到2 4 m v ，絮体结构破坏，c a “的脱附由扩 散控制。稀释法降低水中的c a 2 + 浓度也得到类似结果。他们认为这是由于c a “ 在聚合物胶体形成的絮体中起到特殊的桥联作用。s o b e c k 等( 2 0 0 2 ) p 3 j 在研究 活性污泥的絮凝模型时，对比活性污泥絮凝的三种模型，藻酸模型( a 1 9 i n a t e t h e o r y ) 、d l v o 和二价阳离子架桥模型( d i v a l e n tc a t i o n8 r i d g i n gt h e r o y ) ， 他们认为活性污泥絮体的形成是二价阳离子架桥模型，其示意图见图卜l 。其中， 在此模型中，二价阳离子并没有形成专属吸附作用，因为一价阳离子容易与二价 阳离子发生离子交换反应，使形成的絮体破坏。w i l 6 n 等( 2 0 0 3 ) 1 9 4 j 在研究活性 污泥的絮体时也发现了胞外聚合物( 其主要成分是蛋白质和多糖) 的含量与污泥 絮体絮凝活性成正相关。 o q h ，_ t 。” ，、- ，即时 矗岛蝻向r “ k ， c 图l - 1 二二价金属离子在污泥絮体中的作用示意图f ”】 f i g 1 - 1d e p i c t i 仰o f 畦i v a l e n tc a t i o nb r i d g i n gw i t h i nf l o cm a t “x 总之，在探讨胞外微生物絮凝剂对悬浮颗粒体系的絮凝机理时，由于可以把 胞外高聚物当做有机高分子絮凝剂看待，只是胞外微生物絮凝剂远比有机合成高 分子絮凝剂复杂。这样就可以把问题的根本归结到传统的絮凝剂理论如电荷中 和、吸附架桥和网捕卷扫。除了微生物絮凝剂的化学结构研究外，对絮凝实验， 可采用的实验方法主要还是沿用传统有机高分子絮凝剂的方法，目前已采用的实 验方法有z e t a 电位、吸附、红外光谱、结合键的确定检验、破坏絮凝剂活性部 位后絮凝剂的絮凝活性变化、电子扫描电镜、透射电镜等。这些方法给我们提供 1 0 华南理t 大学硕士学位论文 行到3 亿张卡f ”。 1 1 2 常用系统存在的问题 原市场使用最多的磁卡和用v b 语言实现的一卡通系统虽然曾经给我们带来 了各种便利，但仍然存在一些弊端和缺陷。比如磁卡系统比较容易被修改、复制 和仿造。据资料统计，1 9 9 3 年仅中国银行上海分行就发现9 0 多张伪卡。在亚洲， 利用维萨集团发行的维萨卡作弊，每年就损失1 亿美元。在美国使用磁条金融交易 卡的头1 0 年，维萨卡和万事达卡有关的犯罪造成的损失达1 5 亿美元【3 1 。 当前广泛应用的i c 卡校园一卡通系统，主要是用v b 语言开发，用c s ( c l i e n t s e r v e r ) 结构实现的，普遍存在着以下弊端和缺陷： ( 1 ) 传统两层c s 结构，即胖客户端，在客户端安装特定的应用程序，企 业的业务逻辑都写在客户端应用程序中，程序维护困难，程序模块的重用性差； 很难管理大量的客户机，难以扩展至大型企业广域网或i n t r a n e t 。 ( 2 ) c s 结构的磁卡系统对中心数据库、数据服务器和网络依赖性大，任 一环节出现问题，都会造成系统瘫痪，不能使用；安全性不高：没有任何加密机 制，容易被篡改。 ( 3 ) 程序的升级维护必须出供应商重新开发扩展。系统自适应性不强，若 客户的业务管理流程有较大改变，系统的升级将非常麻烦；各为其政，应用无互 补性，各应用系统缺乏充分的可扩展性，难以维护和升级。 ( 4 ) 平台不同，统一管理比较困难。有的系统无统一归口管理、统一规划 和统一发卡，提高了系统间管理和协调成本。缺乏完善、规范和统一的电子化安 全策略和应用安全机制，系统问兼容性极差。 第一章绪论 了较为曹接藩畿j 溺糍嚣赁涤崽凌i 纛霆羞姑爱镍擎盆婴磊裂醛i 妻为 ；鋈s j j ；i 目h ! ；耋u 自i ii 墓毒! i ：嘎哆洲i 仪器分街用一j = 誉稚塑撑盟j 垦孽j 翌驿 丛哩脊唯奎们羽微生物j 嚣凝剂的絮凝视珲鲤蔷型型! 淫满瑾酹蘩藕醚辈盂知；旨矧篓| 羔誊鼹鲥蚕善剿 萎；蓊鬈篓目鑫篓委三茎襄蔷要8 ；霎鐾饕冀墓瑟疆掳册瞳酗臼醚，驵憩窝熙暇 篓罄塞；影型型藩【蜉温臻涟曦 ! f ! 坦限一撺罐窟j 否一髅话掰措器裂；挺鍪嚣弱邵 的部分研究丙舞莱磊群午碓撞寺；在课题组葡期酾稀；究，e 丽翱爨的塑至i 葡 融l 鼙诵辱嘲韵荔嚣；兹燃l 囊召灞羽噔露理；g 岩缨掣己鞭鼎翼；佯鹭蔼一 涡蔼嗡互馐潭；臻洛滢；精麓薹薷霉蟾搏转酾窃瓣妯臼弱i 疆墓蹬瑗；鲤到 壅l 嘲溜湾崎嗽m 逼竹| 斥，懿精| 鏊霉油船瞄时酢【j l j 魏； 蓬蠢霾鬻刚翻l 饕漕? 臻醢豢弼引甄引纂器烈烈薹鹾蜊型霉耋熏纂囊囊蠢趔霞= 酶霎萎辩瓦并目硒藕蠢辖孙鲁嚣溺淄；商醋醒髓骶些= 鏊鬻墨羹珏零剜蠢奏鍪雾。 要囊辫辆，萌黪确耨舞篓一鋈雾削型长= 嘲二 女；羹羹冀羹霾羹冀雾羹 剖蒯塑睡攀薪裂剖睡巯序肇写耐酾秭裂箨鳓x 辔l 截蹦一端箨欧i 崮蛊l 铂叠萋，拍稳龇i 喜毫嚣毯撵鐾嚣娶叠蹙。西翟摧蹩襄薹羽季掣量最精茹襟妊； 送警器| j i 襄鏊稀羹萋之间；# 瓣钎拜啪斡辨鲥翮葡酣臻岱群赫非稼器 薹斟棼l ： ； 羹j 嚣毁塑羹商懿舅跹烈刳稀酗。博擒慷葱翟誊斛f 复塞精鐾霞峨潦陋蹬 x 华南理工大学硕士学位论文 第二章青霉h h e p 7 产微生物絮凝剂条件研究 絮凝剂产生菌在产絮凝剂的过程中，受很多因素的影响，如碳源、氮源、温 度、p h 、供氧量等的影响。环境因素对菌的生长和分泌物等生理活动有影响， 有可能既促进菌的生长，又促进絮凝剂产量的增加；也有可能只促其生长，而对 产絮凝剂无益。一般来说，营养越丰富的培养基越有利于微生物的生长，同时也 有利于微生物絮凝剂的产生，但不同絮凝剂产生菌对营养要求差别较大。因而有必 要研究各种环境因素和营养物质对絮凝剂产生菌的生长和产絮凝剂的影响，确定 它们的影响大小及了解一般影响规律。 本课题组前期工作研究了不同碳源、氮源、无机盐离子、初始p h 、温度等因 素对h h e p 7 絮凝剂产生菌产絮凝剂的影响。在此基础上，本章主要通过研究接 种量、装液量、磷酸盐、- i w e c n 8 0 和c n 比等因素对h h e p 7 产絮凝剂的影响。 2 1 实验材料与方法 2 1 1 实验材料 菌种：课题组筛选到的高效絮凝剂产生菌青霉属产紫青霉系( a n f c f f f f 删 p h ，p “r d g 蹦肼1 ) h h e - p 7 ，其所产絮凝剂记为m b f 7 ，已经确定其主要成分为多糖类物 质，含微量的蛋白质或核酸，由四个相对分子量段的物质组成，分别为2 7 2 1 0 5 、 3 1 0 1 0 5 、4 1 7 1 0 5 和1 4 8 1 0 6 ，结构为线性结构，含有b 型糖苷键，含有 羟基、氨基和羧酸根等基团【7 7 1 。 主要实验仪器见表2 一l 。 表2 1 设备资料表 ：! ! ! ! ! ! ：! 些! ! ! ! ! ! ! ! 竺! ! ! ： 实验仪器型号 生产商 第二章青霉班瑾p 7 产微生物絮凝荆条件研究 药品：实验药品为市售分析纯试剂。 基础培养基：葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p 0 42 9 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 05 9 ，( n h 4 1 2 s 0 4o 2 9 ， n a c lo 1 9 ，脲o 5 9 ，酵母膏0 5 9 ，h 2 0 l o o o m l ， p h 值7 0 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 人工高岭悬浊液：1 0 0 0 m l 蒸馏水中加入5 9 高岭士配成悬浊液。高蛉土d ( o 5 ) 为4 2 4 4um ，由华南理工大学材料学院制备。 2 1 。2 实验方法 2 1 2 1 菌种悬浮液的准备 用接种环絮凝荆产生蔺咖_ 壬叩菌种管中挑取一环孢子，接入装有1 0 0 m l 基础 培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，在3 0 、1 5 0 r m i n 1 恒温振荡器上培养1 d ，制成菌种 悬浮液。 2 1 2 2 菌株的培养 将絮凝剂产生菌h h e p 7 的孢子悬浮液分别按l 的接种量接入相应的培养基 中。在3 0 、1 5 0 r m i n d 恒温振荡器上培养5 d 后，测发酵培养液的絮凝率。 2 1 2 3 絮凝率的测定 量取9 5 m l 浓度为5 9 l 1 的高岭土悬浊液于1 5 0 m l 烧杯中，边用磁力搅拌机 搅拌，边加入2 m l 发酵培养液和4 5 m m o l l 1c a c l 2 后，用0 1 m 0 1 l 1 的h c l 或 o 1 m o l l 1 的n a 0 h 溶液调节高岭土悬浊液的p h 值为8 0 0 2 5 ，絮凝反应2 m i n ， 静置5 m i n ，吸取上澄清液于7 2 2 型分光光度计5 5 0 m 处测定吸光度，以吸光度 0 d 5 5 0 表示，以不加培养液的吸光度为空白来确定发酵液的絮凝率。絮凝率按如下 公式计算： 絮凝率( 卜( a b ) ，a 1 0 0 ( 2 1 ) 式中： a ；空白上清液在5 5 0 n m 处的吸光度值； b ：样品上清液在5 5 0 n m 处的吸光度值。 2 1 2 4 絮凝剂产率的表征 根据本课题组前期的研究结果【7 7 1 ，h h e p 7 培养液对高岭土悬浊液絮凝率与 同体积培养液的乙醇提取物( 多糖絮凝剂) 对高岭土悬浊液的絮凝率之比为1 0 6 ， 因此可以用在最佳培养条件下相同体积的培养液的絮凝率来间接表征各种条件下 对培养过程中絮凝剂产生的影响。 华南理工大学硕士学位论文 2 2 实验结果与讨论 2 2 1 接种量对产絮凝剂的影响 为了研究按种量对h h e p 7 产絮凝剂的影响。按每1 0 0 m l 培养液中接种o 1 、 0 5 、1 0 、1 5 和2 o m l 菌种悬浮液，在摇床中培养5 d 后，测培养液对高岭土的 絮凝率，以絮凝率对接种量作图，结果见图2 - 1 。 接种量对微生物生长延迟期的长短有一定的影响，一般接种量越大，延迟期 越短，但是接种量过大，虽然可以使发酵周期缩短，由于养分消耗快，也不利于 微生物细胞持续增长和产物合成；而接种量过小，细胞生物量不足，生长延迟期 过长，细胞内部某些维生素和辅酶等微量元素会向周围液体发生过多的扩散，导 致严重损失，降低细胞活性。从图2 1 中可以看出，随着接种量的增大，5 d 培 养后的培养液的絮凝活性也增加，由接种量为0 1 m u l 0 0 m l 时絮凝率为8 9 升 高到接种量为1 5 m u l 0 0 m l 时絮凝率为9 8 7 。在接种量大于1 5 m l 1 0 0 m l 时， 培养液的絮凝活性有所下降，这是由于接种囊过大，菌体生长迅速，加快了底物 的消耗，而不利于胞外分泌物的合成。从图2 1 中也可以看出，菌体h h e p 7 发 酵培养后，培养液的p h 为酸性，在p h 3 5 4 5 之间。这是由于底物葡萄糖的糖 酵解后。生成小分子酸性物质和酸性多糖絮凝剂，而使培养液的p h 下降。 1 9 8 桨9 6 褂 爨舛 器 驼 8 8 0 0口5 1 o 15z o 接种量m l 图2 1 接种量对培养液絮凝率的影响 f i g 2 - le f f e c to fi n n o c u l u mo nf l o c c u l a n ta c t i v i t yo fb r o t h 2 。2 。2 装液量对产絮凝剂的影响 摇瓶的装液量越少越有利于菌体分泌胞外物，加大装液量必须相应地提高摇 床转速，过多的装液量不利于培养液的混合，对好氧生化培养还不利于氧气的传 输，也给摇床的机械传动造成压力，在经济上不合算。为此，测定了在2 5 0 m l 1 4 第二章青霉腿p 7 产微生物絮凝荆条件研究 三角瓶中装液量为4 0 、7 0 、1 0 0 、1 5 0 和2 0 0 m l 时5 d 发酵后培养液液的絮凝活 性，实验结果见图2 2 。 篡 料 醛 骗 1 2 0f 2 0 0 装液量匝l 图2 2 装液量对培养液絮凝率的影响 f i g 2 2e f f c c to fv o l u mo fm e d i ao nf i o c c u l a n ta c t i v i t yo fb r o t h 从图2 2 中可以看出，在装液量小于1 5 0 m l 时，装液量对絮凝剂的分泌没 有很明显的影响，絮凝率在9 7 以上，当装液量达到2 0 0 m l 时，絮凝率迅速下 降，只有7 8 。p h 值也由4 左右升到将近7 。这也说明，h h e - p 7 进行糖酵解 呼吸和分泌胞外多糖时，将有小分子的有机酸生成。或h h e p 7 需要在酸性条件 下才能很好的合成胞外多糖絮凝剂 当供氧量不足时，细胞的生理活动受到抑制， 分泌的胞外多糖也就相应的减少。 2 2 3 磷酸盐对产絮凝剂的影响 磷是微生物生长所需无机盐中的重要组成部分，它对微生物的生长、繁殖和 代谢起极其重要的作用。它不但是微生物细胞合成核酸、核蛋白、磷脂等含磷化 合物的重要元素，也是各种辅酶和磷酸腺苷的组分。在糖代谢的磷酸化过程中起 关键性的作用。在微生物絮凝剂的合成中，培养基中磷酸盐的存在不仅参与构成 微生物细胞壁的组成，而且是一种重要的缓冲剂，可以调节培养液的p h 值。 为了解培养基中磷酸盐含量对h h e p 7 产絮凝剂的影响，改变培养基中磷酸 盐的含量，分别为基础培养基中k h 2 p 0 42 9 l - 1 + k 2 h p 0 4 3 h 2 05 9 l 1 的1 0 、 4 0 、7 0 和k h 2 p 0 42 9 l 。与k 2 h p 0 4 3 h 2 05 9 l 一，5 d 发酵后培养液的絮凝率 见图2 3 。 一 华南理工人学硕士学位论文 1 0 0 透6 0 瓣 囊4 0 2 。 0 1d 4 0 7 0 k h p o 。k h 2 p o t 其中：1 0 、4 0 和7 0 分别代表占k h 2 p 0 42 9 l 1 + k 2 h p 0 4 3 h 2 05 9 l 1 的百分数， k h 2 p 0 4 代表k h 2 p o 2 9 l 1 ，k 2 h p 0 4 代表k 2 h p 0 4 3 h 2 05 9 l 。 图2 3 磷酸盐对培养液絮凝率的影响 f i g 2 - 3e f 耗c to fp h o s p h a t eo nf l o c c u l a t i o na c t i v “yo f b r o t h 从图2 - 3 中看出，磷酸盐对h h e p 7 产絮凝剂的影响比较大，采用磷酸盐缓 冲溶液，随着磷酸盐投量的增加，h h e p 7 产絮凝剂也增加，絮凝率由1 0 投加 量时的6 1 8 升高到7 0 投加量时的8 6 6 。单独投加k h 2 p 0 42 譬l - 1 时的絮凝 率为8 3 ，而单独投加k 2 h p 0 4 3 h 2 05 9 l - 1 絮凝率则只有3 5 3 。只加一种磷 酸盐时，h h e p 7 产絮凝剂效果也不是很好，尤其是投加碱性的k 2 h p 0 4 3 h 2 0 ， 产絮凝效果很差，这可能是由于h h e p 7 要在酸性条件下才能较好的生长和分泌 胞外微生物絮凝剂。 磷酸盐对不同微生物分泌胞外多糖的影响不同。d a s i g e r 等( 1 9 9 4 ) 1 9 5 】报 道k h 2 p 0 4 抑制n e h 如州d n 口ss p 胞外多糖的产生。肌的s j “丑i 一7 1 4 ( f a r r s 1 9 9 7 ) 1 9 6 j 则在培养基不加磷酸盐缓冲溶液，更有利于胞外多糖的产生分泌，投 加磷酸盐缓冲液减少了多糖的分泌，降低了培养液的粘度。 2 2 4t w e e n 8 0 对产絮凝剂的影晌 在发酵培养基中加入能起到乳化作用的油类或表面活性剂，可以改变发酵液 的物理性状，降低溶液表面张力、降低发酵中的粘度，提高搅拌的混合能力，改 善传质、传热、氧和能量的输送效率，进而降低能耗，提高产量和降低成本。 非离子型的表面活性剂e c n 8 0 对微生物产胞钋多糖有较好的促进作用 ( 9 竹。实验中选用非离子表面活性剂t w e e n 8 0 ，研究其在装液量为1 0 0 m l 的三角 瓶中投加量按0 2 ( w n 到5 ( w y ) 时对h h e p 7 产絮凝剂的影响，投加时间 为接种后立即加入t w e e n 8 0 ，再放入摇床中振荡培养5 d ，培养液的絮凝率见图 2 4 。 】6 第二章青霉孵p 7 产微生物絮凝荆条件研究 表面活性剂还能吸附在菌体表面改变细胞膜渗透性、破坏细胞内酶系配位。 它也可提供菌体细胞结构成分，改善底物和酶的接触，调节p h 等，这些效应的 协同作用可以促进菌体的生命活动，调节代谢，刺激产物积累和菌体的生长。由 图2 4 可见，在投加t w e e n 8 0 为o 2 时，就能使絮凝率由空白对照样的8 5 4 升高到9 4 5 。再增加c e n 8 0 投加量，则对絮凝率没有提高，但也没表现出 对h h b p 7 分泌絮凝剂的毒害作用。在应用中，t c e n 8 0 的投加量宜选用o 2 左右，过商的t w c c n8 0 投量不仅不能增加h h e p 7 分泌絮凝剂，也将限制培养 液直接作为絮凝剂使用。 1 鬟髓 料 臻 鞴舯 b 5 o x 华南理工大学硕士学位论文 取1 0 m l 去菌培养液，加入4 0 m l 无水冷冻乙醇沉淀，在冰箱上层放置过夜， 取出在3 0 0 0 r p m 的转速下离心1 5 m i n ，离心所得固体为用中( 乙醇) 为7 5 的水 溶液洗涤2 遍得到微生物絮凝剂m b f 7 粗品。将粗品溶于一定的三次蒸馏水 中，采用蒽酮一硫酸法测其多糖含量。 3 2 发酵动力学方程 3 2 1 菌体生长l o g i s t i c 方程 描述菌体生长最常用的模型为m o n o d 方程，该模型为典型的决定论均相非 结构模型，而且最简单，但在分批发酵中底物及菌体浓度对生长的限制作用不容 忽略，不宜用m o n o d 方程来描述分批发酵菌体生成模型。v e r h u l s t p e a r l 基于在 某一特定环境条件下，应有一最大的细胞质量浓度，该值与基质浓度无关，提出 l o g i s t i c 方程。l o 垂s t i c 方程能很好地反映分批发酵过程中菌体质量浓度的增加 对自身生长的抑制作用，并能较好地拟合分批发酵过程的菌体生长规律，这在分 批发酵中是普遍存在的。 采用l o g i s t i c 方程来描述胞外多糖发酵菌体生长的动力学过程： 譬，( f ) 石。j v j 一。z ( 1 o 一争) ( 3 - 3 ) 初始条件为f = t o 时，x = x o 。 式中：x 。为最大菌体生长浓度，最大比生长速度“设为常数，该方程的 积分式为： 肼乩皇哪h 寿 协。， 薷 5 ) 上述方程式同时可表达对数生长期和稳定期的菌体生长，微生物胞外多糖在 这两个阶段都有生成。由实验数据，以l l l 【i 】对f 作图得到的直线斜率即为 u ”截距为k 【i 三葛卜 第三章h h e p 7 产微生物絮凝剂的发酵动力学研究 3 2 2 产物形成l u e d e k i n g p i f e t 方程 根据产物形成与菌体生长的关系，将产物形成分成三类：( 1 ) 产物形成与 菌体生长偶联型，只是在菌体生长时才有产物生成；( 2 ) 产物形成与菌体生长 部分偶联型，在菌体生长阶段有部分产物形成，而部分或大部分产物是在菌体处 于生长稳定期形成的；( 3 ) 产物形成与菌体生长非偶联型，只要细胞存在，产 物就会生成。在大多数真菌胞外多糖生成的动力学研究中，均认为是半生长偶联 型的，采用l u e d e k i n g p i r c t 方程描述胞外多糖产物的比生成速率与蔼丝体比生 成速率之间的关系。 l u e d e k i n g p i r c t 方程为： 警| 卅1 并+ m 2 警 ( 3 6 ) d f 1 出 f = 0 时，p = p o 。 方程中m l ，m 2 为模型参数，依发酵条件( 温度、p h 等) 的变化而改变， 条件一定时，m 1 和m 2 均视为常数。当m 1 = o ，m 2 o ，为生长关联型；当m 】0 ， m 2 = 0 ，为非生长关联型；当m l o ，m 2 0 ，为混合型。 把方程( 3 - 3 ) 代入方程( 3 6 ) 得： 警叫：o 一寺 协7 ， 方程( 3 4 ) 代入方程( 3 7 ) ，积分得方程( 3 8 ) 。 p ( f ) 晶+ 小z 瞰) 0 】+ 埘，鲁l n 【1 - 妻( 1 _ e 嘲 ( 3 - 8 ) 稳态时，譬。o ，x = x 。 则由方程( 3 5 ) 得： 拿 ， 方程( 3 8 ) 可写成如下形式： p p ) m 2 彳o ) + 卅l 口o ) + 只 ( 3 1 0 ) 式中： 爿( f ) - x ( f ) 一盖o ( 3 1 1 ) 蚴z 鲁l n 【1 一妻) 】 ( 3 _ 1 2 ) p m五” 华南理工大芏由贞士等但谣琴 酋墼薹；蒌。耄，上i 巢晕旦；帮酸蠹匿! ! ；t 要i 霉i l 莉 f ；幕办i 终嘉 盛嘉味仳聂j 萋：蚕j 荔鎏羹鬟霪羹鍪 毕r 共王馒爨垫葺遣浦錾著銎是辕萌；虱黪磅甜e 酣5 弼鹃丁q j “强嗜 磊羯濯副爨亘。毪裳灞甥酗缈雅t 里】葡掣发穗掣揖蘼曙葱孺凋篓藕辨；刮荆表 藕醇翻乳副唰矧幕裂琊；址疆：孕占掣蚕器姑菅季疆唾增鹕j 蓁一蓁蓁 通卡管理系 统和银联缴费系统等【1 6 】。 其中，i c卡管理子系统又分为：卡库管理、充值管理、回收管理、绿卡管理、 教工卡管理、学员卡管理、总管卡管理等功能模块。刷卡终端又包括i c 卡收费机 和i c 卡感应电子门锁。 3 1 3 系统架构 一卡通系统的架构。j 2 e e 体系结构可分为n 个层次，本系统中分别是存储 层、逻辑层、表现层和用户层。 数据存储层是整个信息系统的最底层，包括人员信息、单位信息、校园卡账 户信息和消费信息等等。 逻辑层包括公共组件、专用组件、业务逻辑控制三部分。 公共组件： 是通用组件，为各业务子系统及接口所共享 1 5 1 有关校园管理系统的划分问题，见参考文献1 5 。 1 6 】有关系统二期工程建设的问题，见参考文献1 6 。 - 1 4 第三章m也-p7产微生物絮凝剂的发酵动力学研究3 3 结果与讨论3 3 1 hhep7产絮凝剂进程654乙d v1 世蠼 幂繇瓤o图3 1 h h e p 7 产絮凝剂过程各指标的变化 f i g 3 lc h a n g eo ft a f g e t sd u r i n g bioflocculationp r o d u c t i o nb y hhep7 h h e p 7 发酵产絮凝剂的进程曲线见图3 1 。图中描述了h h e - p 7 菌体生物 量(x)、多糖絮凝剂mbf7产量(p)、底物葡萄糖消耗(s)和ph随发酵时间 进程(r)的变化情况。从图31可以看出，hhbp7在开始的o18h，为延迟 期，1 8 h 开始进入对数增长期，菌体迅速增长，到7 2 h 后，菌体生长开始进入稳 定期，菌体生长缓慢，120h达到最大生物量13729l，之后菌体量有所减少， 菌体进入衰减期。培养液p h 随着发酵的进行，由初始的7 0 缓慢减少到1 2 0 h 的4 7 左右，随后变化不大。底物葡萄糖由0 h 开始的2 3 4 9 l 。1 下降到1 4 4 h 的 7 6 7 9 l 1 。产物絮凝剂在开始的2 4 h 合成量很少，在2 4 h 4 8 h 开始缓慢有所增 加，4 8 h 1 2 0 h 絮凝剂的合成稳定增加，在1 2 0 h 达到最大值1 5 3 4 9 l 1 ，但碳的 转化率比较低，只有1 1 5 。再增加培养时间到1 4 4 h ，絮凝剂产量略有所减少。 从对hhep7的发酵进程的分析中，可以认为hhep7发酵产胞外絮凝剂，产物 絮凝剂的生成与菌体h h e p 7 生长部分偶联，在h h e p 7 生长阶段有部分絮凝剂 生成，而大部分絮凝剂是在菌体处于生长稳定期形成的，属于混合型发酵。 笛幅 仲s o l - 6 ) 、避爱据精糖 华南理工大学硕士学位论文 瓯 ) ( g l 。) 图3 - 2 絮凝剂的产生与底物消耗的关系 f i g 3 - 2r e l a t i o n s h i pb e t w c c nb i o n o c c u l a t i o np r o d u c t i o na n ds u b s t r a t e c o m s u p t j o n 以产物絮凝剂( p p o ) 对底物葡萄糖的消耗( s o s ) 作图，得到图3 2 。 从图3 2 中可以看出在整个发酵过程中，底物葡萄糖的消耗与絮凝剂的产生成线 性关系，方程为： ( p p o ) = o 1 2 3 3 ( s o s ) 一o 0 1 1 3( 3 1 7 ) 3 3 2 菌体生长动力学 图3 3um 与x o 的推导 f i g 3 - 3e v a l u a t i o no fuma n dx o 根据产絮凝剂过程的实验数据菌体的最大浓度x 。为1 3 7 2 9 l - 1 和动力学模 v 型方程( 3 - 3 ) ，以l n 【去】对f 作图，得到图( 3 - 3 ) ，从图中的曲线线性拟合 n m n 方程中得到直线斜率为o 1 0 4 9 ，即模型参数：um = 0 1 0 4 9 。从