（材料学专业论文）基于Fe（CN）lt6gtlt34gt的巯基修饰DNA的电化学检测方法的研究.pdf

硕士论文 基亍： f e ( c l 0 d “的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 摘要 我们知道， f e ( c n ) d ”是一对被广为研究的氧化还原离子对，尤其是在电化学 领域，它们是一对应用广泛的电化学活性指示剂。 f e ( c n ) d 3 抖体系的电化学反应机 理是相当复杂的，体系中的阳离子对其有着一定的催化作用。在较低离子强度下，很 难观察到腰e ( c n ) 6 】3 “的电化学活性。 本文通过自行设计出纳米金薄膜电极工艺参数基础上，获得了能适用于d n a 传感器上的具备稳定、优越性能的纳米金薄膜电极。通过实验分析，确定以1 0 m m 的 k 3 f e ( c n ) 6 为d n a 检测的指示剂。优化y f e ( c n ) 6 纠4 。在巯基化修饰d n a 电极上的 电化学检测的实验条件，包括巯基化d n a 的最佳自组装时间和最佳自组装浓度。同 时探究了离子强度对【f e ( c 6 】3 “在空白金电极和d n a 修饰电极的电化学行为的影 响，发现在低离子强度下，固定在金电极表面的h s s s d n a 对 f e ( c n ) d 3 棒有电催化 作用，从而研究出一种新颖的巯基化d n a 的电化学检测方法。该方法是在低离子强 度下，通过检测d n a 在自组装前后和杂交前后引起的口e ( q 0 6 】3 - 4 - 电化学信号的差 别，来达到检测固定在金薄膜电极上的s s d n a 、d s d n a 序列和微量互补链d n a 的 半定量检测。并在此实验基础上，通过改变实验条件对此现象的机理进行可行的推测。 关键词：d n a ，传感器，电化学，铁氰酸钾，自组装，机理。 硕士论文 基- y f e ( c - w ) 6 r “的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 a b s t r a c t w eh a v ek n o w nt h a tt h e f e ( c n ) d r e d o xc o u p l ei sw i d e l yr e s e a r c h e d 。e s p e c i a l l y i nt h ef i e l do f e l e c t r o c h e m i s t r y , a sa w i d e l yu s e di n d i c a t o ro f e l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t y t h e e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o nm e c h a n i s mo f t h e f e ( c n ) d 3 。+ s y s t e mi sv e r yc o m p l i c a t e dw h i l e t h er e a c t i o ni s c a t a l y z e db yc a r i o u si n t h es y s t e m i ti sd i 伍c u l tt oo b s e r v et h e e l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t yo f f e ( c n ) 6 3 4 4 i nl o wi o n i cs t r e n t h b yt h ei n d e p e n d e n td e s i g no f t h et e c h n i c a lp a r a m e t e r s , w eo b t a i n e dam n o f i l m9 0 1 d e l e c t r o d e , w h i c hi s8 u p e r i n l a n ds t a b l ew h e na p p l i e dt ot h ed n as e n s o r s b yt h e 缸a l y s i so f t h ee x p e r i m e n t , w ed e c i d e dt ou s e1 0 m mk 3 f e ( c n ) 6 】硒i n d i c a t o rt oc h e c ka n dm e a s t r e t h ed n ai nt h i s e x x p e i m e n t w ea l s e oo p t i m i z e dt h e t e r m so ft h ec h e c k c o n d i t i o n g s ：i n c l u d i n g t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no fs e l f - a s s e m b l ya n ds e l f - a s s e m b l eo f h s - s s d n ao ng o l df i l me l e c t r o d a c c o r d i n gt ot h e s eb a s i cw o r k , w er e s e a r c h e dt h e e l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t yo ft h eg o l de l e c t r o d ea n dh s - s s d n am o d i f i e de l e c t r o d ew i t ht h e i n t e n s i t yo f f e ( c n 3 d 3 ”i nc o n c l u s i o n a tl o wi o n i cc o n c e n t r a t i o nt h eh s s s d n af i x e d o nt h eg o l de l e c t r o d es u l f a c eh a dd e a r i ec a t a l y s i st o f e ( c n ) 6 3 - 4 - o nt h i sb a s i sw ed e v e l o p e dan e wm e t h o do fd n a s he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n w i t ht h eo p t i m i z a t i o no fc o n d i t i o n s 。b yd e t e c t i n gt h ev a r i a t i o n so ft h ee l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l so f 口e ( c n ) d 4 + i n d u c e db yd n as e l f - a s s e m b l ya n dd n ah y b r i d i z a t i o ni nl o w i o n i cs t r e n g t h ，t h i sm e t h o dm a k e st h ei d e n t i f i c a t i o no f t h es s d n a d s d n as e q u e n c el i n k e d t o 伍e9 0 1 df i l me l e c t r o d ea v a i l a b l ea sw e l la st h es e m i - q u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n to f e d n a a d d i t i o n a l l y , b a s e do ne x p e r i m e n tf a c t s ，w en l a d ep o s s i b l es p e c u l a t i o no ft h em e c h a n i s m o f t h i sp h e n o m e n o nb yc h a n g i n gt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s k e y ：d n a , e l e c t r o d e ，e l e c t r o c h e m i c a l ，k 3 f e ( c n ) d ，s e l f - a s s e m b l b 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：喜垒耋壁 年月日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：委望茎厘年月目 硕士论文 基于旷c n 瑚3 4 的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 1 绪论 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 提出了d n a 双螺旋模型结构以来f ，核酸的研究成为 了生命科学领域的重要研究之一。脱氧核糖核酸( d n a ) 是大部分生物的遗传物质，具 有储存和传递遗传信息的功能。基因是遗传信息的物质载体，蕴含着支配生命活动的 指令和构建生物体的蓝图，所有生物体的所有生命活动无不直接或间接地在基因的控 制之下。如果d n a 在结构上稍有变动、差错、缺失或增多，就可能会导致遗传性状 的改变或各种疾病的出现。随着对基因结构和功能研究的不断深入，特别是2 0 0 3 年 4 月1 4 日引人注目的“人类基因组计划”的完成，迅速推动了人类疾病的基因诊断与 基因治疗的研究，大大加快了医学基因的鉴定，发现并鉴定了大量的致病基因。通过 测定人体的血液、组织及体液等样品中特定的d n a 序列，可用来确证感染疾病的细 菌和病毒根源。因此检测与疾病有关的基因变异，对基因筛选、药物的研制和开发、 食品和环境的控制、在分子水平上对遗传疾病进行诊断和治疗具有十分深远的意义。 作为生物无机学科的一项重要内容，金属配合物和核酸的作用尤其是与d n a 之 间的相互作用越来越受到科学家们的关注。金属配合物对d n a 的特异性识别作用是 其作为化学核酸酶、d n a 结构探针和抗病毒药物的基础，设计、开发和应用能够识 别d n a 特征的金属配合物在生物化学领域具有广阔的前景和应用价值。 1 id n a 属性 基因组蕴涵着人类生老病死的绝大多数的遗传信息，读懂它将为人类疾病的诊 断、新药的研制和新疗法带来革命性的变革。脱氧核糖核酸( d n a ) 是染色体的主 体成分，同时也是组成基因的材料，是编码生物遗传信息的载体，因此也被称为“遗 传微粒”。核酸不仅是生物遗传的重要组成物质，还在基因芯片和基因计算机、超微 信息、d n a 疫苗等方面潜在广阔的应用前景，因此研究核酸，尤其是d n a 的结构和 功能的关系有着重要的意义。 核酸是由核苷酸组成的，核苷酸由核苷( 包括碱基、戊糖) 和磷酸组成。按戊糖 的不同可将核酸分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 。前者的碱基是腺嘌 呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 、胸腺嘧啶( t ) 四种；后者的碱基中除了尿嘧啶( u ) 代替了胸腺嘧啶( t ) 外，其余的相同。d n a 的四种碱基的结构式见图1 1 。 d n a 分子的一级结构核酸是由一系列交替存在的糖和磷酸残基形成的骨架连接 成的多聚核苷酸单链。一个戊糖环的5 。位置通过3 ，5 磷酸二苷键与另一个戊糖环 的3 位置相连，含氮碱基突出于骨架上，这样大量的四种脱氧核糖核苷酸连接起来 形成直线或环形多聚体。所谓d n a 的一级结构就是d n a 分子中的核苷酸排列顺序。 d n a 的二级结构b - z 是d n a 的两条核苷酸主链以反平行的方式围绕同一中心轴 硕士论文 基于陋e ( c n ) 6 】3 “的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 cd 图卜1d n a 四种碱基结构式a 胞嘧啶b 胸腺嘧啶c 腺嘌呤d 鸟嘌岭 k 厶- _ j 图卜2d n a 双螺旋结构示意图。a 带表示磷酸糖主链，水平的碱基对在中心，黑点表示 氢键；b 分子中糖环平面与碱基平面的空间关系；cd n a 的原子模型。分子内部的疏水碱 基对的堆积形成一种碱基堆积力使d n a 分子稳定 2 硕士论文基于陬m 】“的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 相互缠绕，组成双螺旋( 图1 2 ) 。磷酸与核糖主链处于螺旋的外侧，在磷酸基团上带 有负电荷碱基处于螺旋的内侧。碱基之间遵循碱基互补配对的原则：a 与t 配对，形 成两个氢键；g 与c 配对，形成三个氢键。碱基对糖环的连接不是在碱基对的相反 两侧而是在同侧，这种不对称的连接导致双螺旋表面形成两个凹下去的沟，宽的称为 大沟，小的称为小沟。d n a 双螺旋进一步扭曲就形成三级结构。 1 2d n a 的性质 1 2 1 物理性质 1 2 1 1 紫外吸收 由于核酸中含有共轭双键结构的嘌呤和嘧啶碱基，所以核酸具有强的紫外吸收性 质，其最大的吸收波长在2 6 0 r i m 处。而当核酸变性时，由于内部的碱基的暴露其吸 光度会显著增加，这种现象称为增色效应。 i 2 1 2d n a 杂交 d n a 的杂交就是一个d n a 的双螺旋结构形成的过程，因其具有高度的识别性和 专一性，将其作为一种技术已经成为分子生物学中的一项最常用的技术，被广泛应用 于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性的分析及基因突变的检 测【3 卅，目前核酸杂交技术包括固相分子杂交、液相分子杂交和原位杂交等【5 1 。一般来 说，采用液相分子杂交和原位杂交较多。 1 2 1 3d n a 的电化学活性 d n a 的电化学活性发现与4 0 多年前【6 】，在核酸分子中，不同碱基基团中能发生 氧化或还原反应，而糖环残基则能在铜电极上发生氧化反应【阳，当d n a 吸附在电极 表面上后，核酸与电极之间发生电子转移，得到可用于核酸定性和定量的分析电化学 信号。d n a 早期的电化学研究多采用汞电极和碳电极，如今许多研究者也采用金、 铜等为工作电极研究d n a 的电化学性质。d n a 的电化学分析方法包括极谱法、吸附 溶出转移伏安分析法【9 - 1 3 1 ( a d t s v ) 、电位法【l 舢阍、阻抗法【1 7 - 堋、电化学发光法等等。 1 2 2 稳定性( 变性和复性) 双链d n a 两条单链之间的非共价作用使得双链d n a 结构很容易在外界的作用 力的影响下被破坏。这种双链结构的分离或单链核酸氢键的断裂称为变性。一般在体 内，这种变性是不会发生的，而在d n a 复制、转移和修复过程中可能发生局部的变 性。 硕士论文 基于旷c n ) 6 】3 “的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 当外界促使变性的条件迅速撤消，比如将热解后的双链d n a 的样品快速转移至 冰水浴中就会得到两条无序自由的单链；而在外界环境缓慢消失的过程中，两条链中 某些互补的区域就会在接触过程中发生亲合得到一段短的双螺旋局部结构，一旦这些 局部的双螺旋结构形成，就会促使剩下分离的也发生迅速的结合，从而形成原来的长 的d s d n a 结构，这就是d n a 的复性。 i 2 2 1 p h 的影响 通过改变环境的酸碱度能够很容易的改变d n a 中的碱基，糖环和磷酸根的离子 属性。当环境的p h 值超过1 1 1 2 时，碱基对之间的电荷排斥力能够引起d s d n a 的 双链的分离，降低p h 至3 以下也能使得d s d n a 的双螺旋结构发生破坏，同时当酸 性过强时，嘌呤碱基会从脱氧核糖上释放出来，这种现象称为去嘌呤化。 1 2 2 2 温度的影响 通过提高环境温度破坏碱基对的氢键和堆积力是对d s d n a 进行变形的最简单方 法。在高温下，两条链会发生解离或“融化”。慢慢恢复到原来的条件时，发生分离的 两条链重新结合成交性前的双链。 1 2 2 3 离子强度的影响 离子强度是d n a 变性和复性的一项重要因素。对于复性来说，离子强度增加， 会对d n a 复性的效率明显提高。在一个杂交反应中，当k + 的浓度在o 1 m o l l 1 5 m o l l 范围内增加2 倍，杂交效率就增加5 1 0 倍“9 - 2 0 。 1 3d n a 电化学生物传感器 1 3 1d n a 电化学生物传感器的基本原理 d n a 电化学生物传感器是以电极为换能器，根据d n a 杂交反应前后电化学信号 ( 电流、电位、电导或电阻等) 的变化来构建的d n a 传感器。原理如图1 3 所示。 其测定d n a 的整个过程一般包括以下四步：一是d n a 探针的固定，这是一个有关 表面的问题，即要将s s d n a 连接或者固定到一个固体电极的表面，形成d n a 探针电 极；二是杂交过程，d n a 探针电极放入被测溶液，当互补的目标s s d n a 与之相遇时， 它们将在电极表面杂交形成d s d n a ，这一过程中必须控制合适的杂交条件；三是杂 交的指示，即如何将杂交信息转化为可测定的电化学信号；四是电化学信号的检测， 可将电流、电压或电导等作为检测信号。 4 硕士论文 基于h c n ) 6 】“的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 e l e c t r o n i cr e a d o u t 图1 3d n a 生物传感器基本原理 1 3 1 1d n a 探针在电极表面的固定 探针在电极表面的固定是整个电化学d n a 生物传感器中一个非常关键的步骤。 检测结果的高灵敏度要求杂交效率的最大化，高选择性则要求非特异性吸附的最小 化。而在固定过程中对界面化学和表面覆盖率进行很好地控制，能够确保固定在界面 上的探针保持较高的反应活性、最优的方向性和可接近性、长时间的稳定性，同时避 免在检测过程中非特异性吸附的发生。目前采用的d n a 固定方法大致可以分为以下 5 类： 一、吸附法：这种方法是将d n a 直接或恒电位吸附到电极表面。这种通过物 理吸附固定核酸的方法被广泛应用于碳电极，比如高度定向热解石墨电极( h o p g e ) 2 1 】、玻碳电极 2 2 1 ( g c e ) 及碳糊电极( c p e ) 【2 3 1 等，而较少地用于金电极 2 4 - 2 5 和 锡掺杂氧化锢电极( i t o ) 闭等。吸附法是一种最简单的d n a 固定方法，固定速度 快，不需要特殊的试剂，也无须对d n a 进行修饰衍生化。但是通过吸附固定的d n a 在高盐浓度的环境中易从电极表面解脱，所以不宜在高浓度条件下使用。而且它是多 位点的吸附，d n a 可能平躺在支持物表面，因而d n a 固定密度较小，并且多个作用 点固定d n a 使d n a 片段运动自由度减小，在杂交反应中影响其与互补d n a 的杂交 效率。 二、膜诱捕法：这种方法是利用电极表面修饰的透析膜 2 7 1 、阳离子膜脚9 】和聚 硕士论文 基于【i h c n ) 6 】”的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 合物3 田( 包括导电聚合物 3 1 - 3 2 和阳离子聚合物 3 3 - 3 4 ) 进行固定的，得到的固定层比 吸附法的更为稳定。利用核酸自身具有的聚阴离子性质，可以在毗咯电聚合过程中将 其作为掺杂离子固定到电极上【3 5 棚，也可通过静电作用固定到带阳离子的电极表面上 2 8 , 2 9 , 3 3 州。利用静电作用的膜捕获法与施加电位的吸附法类似，能使碱基的方向性更 强。当表面上带有电荷时，探针就会平躺在表面上，但不会受到严格的束缚从而保持 一定的灵活性，形成高度对称的未卷曲的双链结构1 3 1 ”。用带正电荷的分子膜( 如氨基 硅烷【2 叼、十八烷基胺) 或阳离子聚合物( 如聚d 氨基葡萄糖) 壳聚搪1 3 3 - 3 4 、聚二 烯丙基二甲基铵1 3 q 修饰各种电极，可获得阳离子化的电极表面。 三、亲和力结合法：这是通过生物素与亲和素之间的专一性亲和作用来固定d n a 的方法。由于亲和素和生物素之间的作用非常稳定，与共价键合接近，方法又简便、 温和、高效，故这种方法在生物传感器领域越来越受到人们的重视，如在金嗍或碳电 极【4 0 】上的物理吸附，在碳糊电极中的【4 1 】包裹，通过戊二醛的交叉结合【4 2 j ，水凝胶中 的混合【4 3 】，和在金电极自组装膜上的共价键合等。在多晶金电极上电沉积银亚单 分子层后，可形成一种可再生的亲和素单分子层【4 5 】。最近还有报道对比研究几种在金 电极自组装膜上用链霉胍激酶进行固定的方式嗍。第二种方法是合成带有巯基f 4 刀或 吡咯基团【4 8 】的生物素，再分别通过化学吸附或电化学聚合作用结合到金电极上，然后 通过亲和素、生物素固定d n a 。 四、自组装法：这种方法是将一端带有琉基的d n a 通过a - u s 键化学吸附到金 电极上。自组装法是在金电极上进行固定的一个普遍方法。化学吸附能使一端带有巯 基的探针完成单点结合。这种固定的结合作用较强，方法也简单，同时探针在结构上 的灵活性也很好。巯基化的d n a 被运用的最多，且己被商品化。要使表面覆盖性能 良好，还可以用d n a 和短链的巯基烷烃形成混合物单分子层。其中的巯基烷烃会使 未被覆盖的表面充分钝化，防止d n a 碱基的非特异性吸附，同时使得探针能够直立 在表面上1 4 9 。这种方向性还可通过改变施加在电极上的电位加以控制【5 0 】。由 m o t o r a l a - c l i n i c a lm i c r o s e n s o r ( p a s a d e n a , c a ，u s a ) m j 设计的混合单分子层是一个显著 的例子，为了提高方法的灵敏度，方禹之研究小组还提出了在巯基乙胺修饰的金表面 上再自组装一层金胶的方法。对金表面进行这样的处理能增大电极面积，从而增加巯 基化d n a 的固定量【5 2 】。 五、共价键合法：这种方法是通过形成共价键，如酸胺键5 3 1 、磷酸酞胺键( 5 4 - 蚓、 醚键等使d n a 固定到支持电极表面。 1 3 1 2 基体表面分析 目前对固定d n a 的基体表面分析主要采用以下的一些方法：光谱方法如表面等 离子体激元共振( s p r ) ，x 射线光电子能谱( x p s ) 、中子反射比测定、红外漫反射； 6 硕士论文 基于口e ( o 氓 3 - ：4 一的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 力学显微镜如s t m 、a f t ；石英晶体微天平( q c m ) 等；电化学方法中包括常规的 电化学方法如循环伏安法、微分脉冲伏安法、交流阻抗法等以及电化学谱学方法如表 面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱等。电化学技术、特别是那些伏安技术，在构象分析 中也很有用，如蛋白质和核酸的变性就是这种研究的一个例子。 1 3 1 3d n a 杂交的电化学检测 目前d n a 杂交的电化学检测的方法有如下几种： 一、基于d n a 自身电活性的方法 作为电活性分子，d n a 可以不需要杂交而用电化学方法直接检测f 期。在固体电 极上，大多数方法是依靠嘌呤碱基的氧化性质，有时使用腺嘌呤【堋，但使用较多 的是鸟嘌呤( g ) 5 9 - 6 0 l 。也可运用d n a 的其他性质进行检测，比如d n a 中的戊糖在铜 电极上的催化氧化性质【6 l 】，d n a 在固体电极上的光电化学性质f 6 2 】。因为这些方法选 择性低，所以都只适用于d n a 总量的测定，而不适用于特定序列的测定。 二、基于杂交指示剂的方法 电化学杂交指示剂是对于s s d n a 和d s d n a 具有不同亲合性的电活性化合物。将 小分子结合到d n a 上，通常通过三种效应：静电作用、沟槽结合作用和嵌入作用。 因为沟槽只有在双螺旋结构中才能形成，所以以沟槽作用与d n a 结合的物质对于 d s d n a 和s s d n a 的亲合性差别最大，也就是说它们对d n a 的结构很敏感。而通过 静电结合的物质对于单双链亲合力的差异性最小。能够把沟槽结合作用和嵌入作用结 合起来的双嵌入剂和三嵌入剂对双链的亲合性又有很大提高，结合也稳定得多。 一种理想的电化学杂交指示剂一般需要具备以下性质：对双链具有特异性的亲 合力，即对单链的亲合力可以忽略不计，至少也要比双链低；氧化还原电位应在核 酸碱基的氧化还原电位范围之外，最好具有较低的氧化还原电位；在指示剂和电极 之间的电子传递要迅速、可逆；氧化态和还原态都较稳定；毒性低，成本低。因 为指示剂通常与d s d n a 的结合较牢固，所有指示剂的电化学信号随着表面形成的 d s d n a 数量的增加成比例增大，也就是随着互补序列数量的增加成比例增大。然而 亚甲基蓝在双链修饰的电极上的信号较单链反而显著减小，这可能是因为能与鸟嘌呤 发生特异性嵌入作用的亚甲基蓝在双链中被保护起来的缘故 6 3 删。一些指示剂在双链 修饰的电极上，峰电位也较单链有所变化，这也己被成功的用来检测d n a 的杂交 【6 5 删。 嵌入剂己用于许多实际检测中，包括单碱基突变的测定 6 9 - 7 1 】、人类血样中的基因 多态性和基因类型的检测【7 2 】等。杂交指示剂的主要优点是避免了d n a 的标记过程其 弱点是单双链的区分度通常不够高，还有待完善。 三、基于d n a 标记物的方法 7 硕士论文 基于田c n ) 6 】3 “的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 这种方法是直接在d n a 链上引入其他分子作为标记物。标记物与d n a 结合这 一步骤会使核酸的检测更为复杂和昂贵。但是，一些生物公司己经能够以合理的价格 提供最常用的标记寡聚核苷酸，包括生物素标记的寡聚核苷酸。因为在标记基团上可 以再引入各种其他需要的标记物，所以这些标记的寡聚核普酸用途非常多样 7 3 - 7 6 1 。 标记物也可以在核酸的化学合成过程( 化学方法) 7 7 - 7 9 或酶扩增过程中( 也就是p c r ) s o - s h 合成，甚至直接结合在电极表而上( 生物方法) s 2 - s 4 。这些方法的最终目的都是 要保持标记物的活性使其能够提供良好的分析信号，同时又尽可能的减少标记物对杂 交选择性和杂交效率的干扰。 四、基于电极界面性质变化的方法 当在电极表面上发生固定和杂交反应时，电极与溶液界面的电化学性质就会发生 变化。用于检测d n a 的电化学性质包括：导电聚合物的电化学性质、通过液体双分 子层的离子传导率、电容和阻抗。 ( 1 ) 导电聚合物的电化学性质：k o r d y o u s s o u f i 等人【8 5 1 发现在聚毗咯修饰的电 极上固定探针d n a 后再进行杂交，聚毗略的氧化峰会移到更正的电位上，电导率也 会降低。这是由于杂交后形成的双螺旋结构具有更强的剐性，阻碍了在聚吡咯的氧化 过程中会发生的构象变化。w a n g 的研究小组使用聚毗咯修饰的玻碳电极固定探针， 运用流动注射分析系统进行检测，因为互补和非互补的目标序列测得的信号方向相 反，所以可以很好地判断杂交是否进行。 ( 2 ) 通过双层脂质膜的离子传导率：把c 1 滞基链修饰的寡聚核苷酸结合到 双层脂质膜( b l m s ) 上后，由于结构的变化改变了离子的穿透作用，引起通过b l m 膜的离子电流增加【8 6 - s ? 。然而当加入互补序列后，可能由于双链的解吸附作用，离子 电流又会降低。这种生物传感器固定过程简单，所需样品极少，无需标记和指示剂， 能在几分钟内做出响应。其不足是检测限相对较高。 ( 3 ) 电容：在硅 8 ”和金【8 9 】的表面进行杂交反应会改变生物膜的介电性质，故可用 检测到的电容变化测定杂交信号。b e r g g r e n 等人凹】报道了一种非常灵敏的电容生物传 感器，能够检测到流动系统中浓度为o 2a t t o m o l e 的样品中的仅仅2 5 个d n a 分子。 但是其重现性很差，选择性也有待提高。 ( 4 ) 阻抗：由于d n a 的磷酸骨架带有负电荷，所以固定和杂交的过程都会使检 测装置表面的负电荷数量增加，使阻抗曲线发生变化。 1 3 2 电化学d n a 生物传感器发展的新动向 作为一种新型生物传感器，电化学d n a 传感器不仅具有d n a 杂交反应高度的 特异性和可逆性，又有电化学传感器易于微型化等传统特点，己成为当今生物传感器 研究的热门，是d n a 分析的重要工具之一。但是迄今为止，这一领域的工作基本停 8 硕士论文基于嘣。唬】的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 留在实验室阶段，真正商品化的产品还不多。困扰其发展的主要问题在于相对低的灵 敏度、稳定性及重现性。电化学d n a 生物传感器发展的新动向大致如下： 一、提高灵敏度 利用p c r 扩增技术可以提高传感器的灵敏度。筛选高灵敏度高选择性的复合型 杂交指示剂也是提高传感器灵敏度的途径之一。可以通过选用双嵌合剂或三嵌合剂取 代目前使用的单嵌合剂来提高灵敏度；还可以开发类似于光化学的电化学d n a 检测 方法，通过金( 银) 溶胶标记、半导体量子点标记、聚合微球( 放大) 或磁性微球( 分 离) 等，利用这些纳米材料和合适的电化学检测方法将其信号放大，从而间接地测定 d n a 杂交。另外，还可以通过优化电极表面结构来提高灵敏度。纳米粒子也被用于 增大电极表面d n a 的固定量1 9 1 】增强电极表面的杂交效率，提高灵敏度。 二、提高选择性 在消除嵌入剂与电极表面的非特异性吸附方面，可以选择一些在电极表面无非特 异性吸附的嵌合剂( 如道诺霉素) ，也可以采用修饰电极的方法防止非特异性吸附的 发生。另外，要消除d n a 探针与其共存干扰物的结合，杂交温度是一个重要的因素。 有些s s d n a 探针可能会与非完全互补的d n a 链结合，但这样形成的产物的稳定性比 完全匹配的d n a 之问形成的双链d n a 的稳定性要差得多，而且受温度影响很大。 即在适当高的温度下，不完全匹配的d n a 链难以稳定存在。因此，也可以通过选择 最佳温度来提高方法的选择性。 三、无杂交指示剂或标记物 近年来无杂交指示剂或标记物的基因传感器正引起科学工作者的关注。这种生物 传感器不需要外加任何指示剂，也不需要对s s d n a 进行事先标记，是利用杂交后d n a 分子中鸟嘌呤( g ) 电化学信号的变化或因杂交造成电极界面状态的变化而导致某些 电化学参数的变化实现对d n a 的直接检测。因该类传感器无须复杂的标记过程，检 测快速简便等，有望与手提式分析仪的开发相联。 四、传感器的微型化、自动化及商品化 基因传感器是生物传感器中发展最晚的一类传感器，但它采用的技术却是最新 的，如自组装单分子膜技术、光刻技术、激光解吸和三维高速立体喷墨等技术；自身 刚起步，却已在d n a 传感器研究中得到应用。尤其是微电子技术的发展，为传感器 的微型化提供了技术保证，可以把接受器、换能器及电子线路集成在一起制成微型传 感器，也可以集成几十亿到上百亿个逻辑元件的芯片，为智能化的生物计算机的设计 奠定了基础。 9 硕士论文 基于噼( c n ) 6 】3 “的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 1 4d n a 与客体小分子的相互作用 1 4 1 有机药物分子与d n a 作用 d n a 与有机药物分子的相互作用是研究分子生物学和生物化学的重要内容 脚5 】。靶向药物分子与d n a 的相互作用将直接影响到基因的表达。通过对基因表达 调节机制的认识将使我们更有效控制生物的生长发育。研究d n a 与靶向药物分子的 相互作用，将有助于人们从分子水平了解生命现象的本质。 1 4 2 有机染料与d n a 的作用 大部分染料有机分子型核酸探针具有正电荷、大的共轭体系，强的芳香性和疏水 性等特征，是一种常见的d n a 分析探针。染料结合法测定核酸具有简便、快速、灵 敏、准确等特点。y a n g 等用含有不同数目的鸟嘌呤( g ) 碱基的2 1 链的寡聚核苷酸 研究了有机染料亚甲蓝( m b ) 与d n a 的相互作用发现m b 在探针修饰电极上的电 流与g 碱基的数量成正比，推测m b 是与d n a 的g 碱基结合。 1 4 3 金属与d n a 作用 研究无机金属配合物d n a 的相互作用已经成为生物无机化学领域的一个重要研 究分支。由于它们的外形、电荷、电荷性及跟d n a 键合的亲近性、使得它们成为有 用的光谱和电化学探针。用来探索核酸的空间结构和动力学性质，也可以用来识别核 酸链中的特定位置。 核酸有平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的大小沟 构成了金属离子及配合物的多个作用点。其作用方式有三种：共价作用、剪切作用和 非共价作用。其中非共价作用是最常见的作用方式。根据作用点的差异分三种方式： 一、静电作用模式既探针通过非特异的相互作用结合到带负电的d n a 上： 二、沟面结合模式既探针与d n a 的大小沟的碱基对的边缘直接发生作用而结合到 d n a 上： 三、嵌插作用 既在核酸的碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统。 其作用力的本质有以下几种： ( 1 ) 库仑力：此作用力主要存在于静电结合模式以及沟槽结合模式中； ( 2 ) 共价键合：共价键合主要存在于沟槽结合的相互作用模式中； ( 3 ) 丌一丌相互作用：主要存在于嵌入结合模式中； ( 4 ) 疏水作用：主要存在于嵌入结合模式中； ( 5 ) 氢键等分子间作用力：主要存在于沟槽结合模式中； ( 6 ) 范德华力：主要存在于沟槽结合模式中。 1 0 硕士论文基于m 僦】”的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 金属配合物因其设计上的可控性及d n a 靶向上的高选择性，正受很多研究者 的关注。但配合物与d n a 键合机理仍具有争议，国内计亮年教授领导的课题组， 在d n a 结构探针的合成、表征、及d n a 结合作用方面做了大量的工作 9 6 - 1 0 0 。他 们系统地归纳了影响配合物与d n a 结合的模式及二者之间作用程度的多种因素： 一、配合物的形状当配合物中没有供插入的平面配体时，配合物与d n a 的作 用主要以静电作用结合 二、插入的配体插入的配体芳香环的面积越大，则配合物与d n a 的结合力也 就越大。 三、辅助配体适当增大辅助配体及脂溶性，将有助于增强配合物与d n a 的键 合能力。 1 5 亚铁氰酸盐，铁氰酸盐与d n a 的作用 亚铁氰酸盐铁氰酸盐是一对被广为研究的氧化还原离子对，尤其是在电化学领 域，它们是一对应用广泛的电化学活性指示剂。但是在多电化学教材中【i o 卜1 岬记述 的亚铁氰酸盐，铁氰酸盐氧化还原反应系统所描述，其体系的电化学反应机理是相当。 复杂的，体系中的阳离子对其有着一定的催化作用，在较低离子强度下陋q 6 】3 - 4 - 的电活性很难被观察到。 以e ( 0 0 6 】m 为氧化还原探针，采用交流阻抗法对d n a 修饰电极进行表征，由 于电极表面荷负电的d n a 排斥同样带负电的氧化还原探针，使氧化还原探针的电子 转移电阻增大，表现为交流阻抗谱图上高频区产生的半圆半径大小存在一定的差异， 进而证实d n a 探针在电极表面的固定 i o s q o q 。b a r d e a 等【1 吣a f e ( c n ) 6 】3 私为氧化还 原探针，d n a 吸附在裸金电极的表面使电极表面带负电，带负电的电极表面排斥带 负电的氧化还原探针，使氧化还原探针的电子转移电阻增大，据此证实d n a 探针在基 体表面的固定。邹小勇【1 0 8 】等人根据s s d n a 在电极表面杂交前后对【f e ( c 6 】3 抖静电 排斥作用的差异，将口、e ( c n ) 6 】3 * 作为一种杂交指示剂来指示d n a 的杂交，但是该报 道没有考虑到离子强度的影响，而且选择性较差。为避免单纯依靠d n a 磷酸根与 口c n ) 6 】3 槔这种简单的静电作用带来选择性的问题，h a h n 1 0 9 等设计了一种以正电荷 的3 ，6 - - 氨基吖啶嵌插剂作为电荷补偿因子，同样以旷e ( a 田6 】3 抖作为杂交指示剂的 新型杂交传感器。作者首先将d n a 修饰电极用十二烷基硫酸处理以排除3 ，6 二氨 基吖啶的非特异性吸收，从而降低背景电流；然后通过杂交的d s d n a 与正电荷的3 ， 6 - 二氨基吖啶的嵌插作用得到电荷补偿层，降低d s d n a 修饰电解对【f e ( q 叼6 】3 非的静 电排斥， 0 i 【f e ( c n ) 6 】3 摊在d s d n a 修饰电极上的响应信号，采用这种方法大大优化 了选择性和灵敏度。最近t g r e g o r y u o l 等报道，在亚铁氰酸盐铁氰酸盐体系里引入小 分子如m b 得到了单链d n a 、双链d n a 杂交、错配等情况下的电化学行为及机理。 l l 硬士论文 基于【f 0 0 6 1 ”的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 1 6 本论文研究目的和意义 自从1 9 9 3 m i l l a n 和m i k k e l s e n 提出了电化学d n a 传感器以来，d n a 的电化学分 析和电化学传感器的研究近年来已成为研究的热点。在一定条件下，当样品中的单链 d n a ( s s d n a ) 与互补的另一s s d n a 相遇时，就会发生杂交反应，杂交过程可用电化 学信号的变化( 如电压或电流) 来检测。采用电信号快速检测d n a 杂交过程取代传统 的荧光方法具有很大优势。与荧光标记、放射性同位素标记等技术相比，电化学分析 具有选择性好，灵敏度高，响应快、操作简便、易于微型化、价格低廉，而且，有无 可比拟的分离纯化基因的功能。同时又不破坏测试体系，不受生物样品中混浊等情况 干扰，所以能够在临床基因疾病检验、环境检测、法学鉴定等领域得到广泛的应用。 电化学由于具有很好的多功能性和高敏性，它可以为特定的核酸序列的测定和d n a 传感器的设计提供新颖的检测技术。在过去的几年里，出现了许多新颖的电化学法的 d n a 分析方法。电化学法检测d n a 杂交信号的方法也很多。 通过对巯基化d n a 在低离子强度下与【f e ( a 叼6 】3 “的相互作用的现象的研究不 仅发现了巯基化d n a 在低离子强度下与【f c n ) 6 】3 “的相互作用的新颖现象，同时也 发现离子强度对巯基化s s d n a 修饰电极和空白金电极的影响趋势。巯基化d n a 在低离 子强度下与田e ( c n ) 6 】3 摊的相互作用的新颖现象不仅可以用在单电极电化学传感器 上，还有望在多电极阵列( 或芯片) 上得到应用，而且可以为今后新型d n a 电化学 传感器的开发和推广做出重要的理论基础研究。 1 7 论文研究内容 论文是在通过自行设计出适用于d n a 传感器的金薄膜电极的基础上，通过对体 系条件的探索，研究出种新颖的巯基修饰d n a 的电化学检测方法。该方法适用于较 低离子强度下，固定在金电极上的巯基修饰的单、双链d n a 序列检测和对微量互补 链d n a 的半定量检测。通过检测d n a 在杂交前后引起的【f e ( c 6 】3 “的电信号的差别， 来达到检测d n a 序列的目的。论文的主要研究内容包括一下几方面： 一、设计出薄膜金电极的工艺参数( 电极由电子制造公司提供) ，通过对不同工艺 电极进行分析，研究电极金属的材料对d n a 固定和电化学分析的电流强度的影响。 确定有利于d n a 的固定并能产生最大的电化学电流强度的合适的电极材料和工艺。 二、通过电化学研究了自组装的时间、指示剂的种类和浓度、巯基化d n a 的浓度 对电信号的影响，确定在低离子强度下h s s s d n a - 与 f e ( c n ) 6 r “相互作用的最佳实 验条件，从而研究出一种新颖的巯基修饰d n a 的电化学检测方法。找出离子强度对 巯基化s s d n a 修饰电极和空白金电极与【f e ( c n ) 6 】3 “的相互作用的关系曲线。 三、在低离子强度下，研究了不同链长的d n a 链和不同碱基对的d n a 链在铁氰酸 硕士论文基于 f q 0 6 】”的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 盐体系中的电化学行为。并以此为依据对巯基化d n a 修饰电极与e ) 6 】3 * 的相互 作用进行可行的推测。 硕士论文基于口e ( o 】”的巯基修饰d n a 的电化学检测方法的研究 参考文献 l j d w a t s o n , e h c c r i c k , n a t u r e ，1 9 5 3 ，1 7 1 - 7 3 7 2 j d w a t s o n , r h c c r i c k , n a t u r e ，1 9 5 3 ，1 7 1 9 6 4 3w e a n e rjg , d a v i d s o nnj k i n e t i e so fr e n a t r a t i o no fd n a j o u r a lo fm o l e c u l a r b i o l o g y , 1 9 6 8 ，3 1 ：3 4 9 - 3 7 0 4b r i t t e nr j , g r a h a mde , n m f e l dbr a n a l y s i so fr e p e a t i n gd n as e q u e n c e sb y r e a s s o e i a t i o u , m e t h o & i ne n z y m o l o g y , 1 9 7