（环境科学专业论文）原油污染土壤的微生物学效应及其评价指标.pdf

指标可以灵敏的反映原油污染土壤的状况。通过分析表明，较低浓度原油含量 有利于提高土壤微生物活性，高浓度原油含量则会对土壤微生物活性产生抑制 作用。 采用b i o l o g e c o 微平板测试了原油污染土壤的微生物碳源利用的功能多 样性。微生物群落代谢剖面( a w c d ) 分析和主成分分析结果表明，污染土壤 微生物对碳源的代谢活性发生改变，微生物对胺氨基化合物类、氨基酸类、羧 酸类和聚合物类碳源的代谢活性较高，无污染土壤的微生物对醣类、双亲化合 物类和聚合物类碳源的代谢活性较高。不同浓度原油污染土壤，在3 1 种碳源构 建的主成分坐标体系中存在显著的空间分异。土壤微生物群落功能多样性丰富 度( s ) 、s h a n n o n 多样性、s h a n n o n 均匀度、s i m p s o n 多样性、m c i n t o s h 多样性 和m c i n t o s h 均匀度在对照土壤和污染土壤间均差异显著( p o 0 5 ) 。分析表明无 污染土壤微生物丰富度高于低浓度原油土壤高于高浓度原油土壤；高浓度原油 土壤微生物群落功能多样性降低。无论是微生物活性还是微生物多样性方面， 其结果均说明原油污染存在“中等污染效应”。 关键词：原油污染，土壤质量，微生物呼吸商，微生物功能多样性，b i o l o g i i b i o l o g i c a li n d i c a t o r sa n dm i c r o o r g a n i s m a e f f e c t s0 fc r u d e o i lp o l l u t o n gs o i l a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , w er e s e a r c h e da n dd i s c u s s e dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f c r u d eo i li ns o i lw i t h o u tp l a n t so nm i c r o b i a la c t i v ee f f e c t ，s u c ha s ：s o i lm i c r o b i a l b i o m a s s ，s o i lr e s p i r a t i o n ，r e s p i r a t o r yq u o t i e n ta n dd i v e r s i t yi nm e t a b o l i s mc a p a c i t y t h a to f f e r sh e l p f u lr e f e r e n c et ob i o r e m e d i a t i o n 、e n v i r o n m e n tq u a l i t ya s s e s s m e n t 、t h e c o n s t r u c t i o no fp r e c a u t i o nt a r g e tp r o g r a mo f c r u d eo i l t h er e s u l t ss h o wt h a tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fe x t r i n s i cc r u d eo i li sl e s st h a n 2 5 9 k g ，t h eb r 、c b i 。、c e x th o i s tg r a d u a l l y , w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f e x t r i n s i cc r u d eo i l i se x c e e d i n g2 5 9 k g ，t h eb r 、c b i 。、c e x td e c l i n e m i c r o b i a lr e s p i r a t o r yq u o t i e n t e x c e e d sw i t hi n c r e a s i n go fc o n c e n t r a t i o no fc r u d eo i l a tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ， m i c r o b i a lr e s p i r a t o r yq u o t i e n td e c l i n e sw i t ht i m ep a s s i n g ，w ec o n c l u d et h a tt h e m i c r o b i o l o g yg r a d u a l l yg e t s u s e dt ot h ep o l l u t i o na n de n v i r o n m e n th a st h e r ei s s e l f - p u r i f i c a t i o na b i l i t y w ec a nc o n c l u d et h a tq p r 、q e x td on o th a v er e m a r k a b l e d i f f e r e n c ei nt h er e s u l t so fo n e w a ya n a l y s i so fv a r i a n c e c e 。t 、c b i o 、 b r 、p r 、a n dq c 0 2 、q r 、e e x th a v er e m a r k a b l ed i f f e r e n c ei nd i f f e r e n tp o l l u t a n to i l s ot h e yc a nr e f l e c tp o l l u t a n tc o n d i t i o n so fc r u d eo i l b ya n a l y z i n g ，m i c r o b i a l i i i a c t i v i t i e si si n c r e a s e da tl o wc o n c e n t r a t i o n so fc r u d eo i li ns o i l ，a n di n h i b i t e da th i g h c o n c e n t r a t i o n s t h ev a r i a t i o no fu t il i z i n gc a r b o ns o u r c e sb ym i c r o b e si n p o l l u t i o ns o i l w a s d e t e c t e db yb i o l o g e c o t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em e t a b o l i s ma c t i v i t yo fc a r b o n s o u r c eb ym i c r o b e si np o l l u t a n to i li sc h a n g e d ，t h em e t a b o l i s ma c t i v i t yo fc a r b o no f a m i n o c o m p o u n d s ，a m i n o a c i d ，c a r b o x y l a t e ，p o l y m e ri sh i g h i nd i f f e r e n tc r u d eo i l p o l l u t i o ns o i l ，t h e r ei s o b v i o u sd i s s i m i l a r i t y4 i n s p a c ew h i c hi sc o n s t r u c t e db y31 c a r b o ns o u r c e s f u n c t i o n a ld i v e r s i t yo fm i c r o b i a lp o p u l a t i o ni ns o i l ( s ) ，d i v e r s i t yo f s h a n n o n ，u n i f o r m i t yo fs h a n n o n ，d i v e r s i t yo fs i m p s o n ，d i v e r s i t yo fm c i n t o s h ， u n i f o r m i t yo fm c i n t o s he x i s tr e m a r k a b l ed i f f e r e n c e si nb l a n kc o n t r o le x p e r i m e n ta n d p o l l u t a n ts o i l ( p 亏染土壤的微生物学效应及其评价指标 土壤质量作为土壤内部属性，人们必须通过一系列的土壤性质的综合评价才能间接了解。 土壤是多方面功能的综合体，而不同人士对土壤功能的关注角度不同，造成了目前研究中对 土壤功能的质量评价不统一，忽略了外部因子如土地利用、土壤管理措施、生态环境系统以 及社会经济和政治状况等对土壤质量的影响。土壤质量评价应当是土壤多方面功能的综合。 我国现存的土壤质量评价，多数为针对土壤侵蚀和土壤肥力下降等进行的土壤质量评价。 多采用传统的土壤物理或化学性状及少数生物学性状来评价土壤质量，很少对土壤的各项功 能和土壤质量的评价指标体系进行综合质量评价，并且很少对土壤质量评价方法进行研究和 对土壤质量评价的结果进行验证。 今后应加强对土壤质量评价指标体系与评价方法的研究，包括针对不同的土壤功能，选 择土壤质量评价指标体系，评价指标的阈值和定量化，评价方法体系和评价模型进行深入研 究。 1 5 3 土壤质量在实践中的应用 我国耕地资源匮乏，环境污染较为严重，面临必须利用一切可以利用的土壤资源，提高 土地利用强度，同时又必须解决高强度利用过程中的土壤环境与生态问题。我国的土壤质量 研究还存在很多问题：多为土壤肥力和退化等方面的理论性研究，对土壤质量评价的结果在实 践中进行应用推广的研究较少；没有在大的尺度上形成规模性研究，研究区域不系统：土壤 质量评价指标非常有限，评价指标不稳定，重复性较差；土壤质量评价数据匮乏。因此必须 将土壤质量评价理论研究与实际生产实践相结合，建立实现作物持续优质高产而环境负面效 应又小的土壤质量管理模式。 内蒙古大学硕士学位论文 第二章研究内容与方法 土壤作为全球生态系统的一个重要组成部分，是地球上植物初级生产力与生物生长生存 的物质基础，在全球生态系统的物质循环、能量转换过程中起着不可替代的作用，在环境污 染、区域气候以及全球变化等方面有着极其重要的调控作用【7 8 】。在陆地生态系统中，土壤是 污染物在各自然要素间迁移、转化的重要环节，也是污染物聚集的地球化学汇。人为作用是 使土壤受污染的重要原因：有色金属矿床开发、城市化、固体废弃物堆置以及为提高农业生 产而施用化肥、农药、污泥以及引用污水灌溉过程中，都可能使重金属、有机物累积造成土 壤污染【7 引。土壤污染具有隐蔽性、局域性和不可再生性，土壤环境状况直接关系到生物的生 长发育以及食物安全，并将最终影响到人类健康和社会经济的可持续发展喁0 1 。因此，对土壤 资源的保护和土壤质量指标对土壤污染的及时预警的研究受到各国学者的重视。 土壤质量评价能够对农业或土地管理系统提供一种基本的评价手段【5 j 。土壤生物是土壤 重要组成部分，土壤生物与土壤中碳、氮、磷、硫等元素的循环、矿物的分解和土壤结构的 形成和破坏密切相关【8 i 】。一个高质量的土壤应该具有良好的生物活性与稳定的微生物种群组 成 2 9 】，同时土壤生物对环境条件敏感，能够较早的指示土壤生态系统功能的变化。因此，能 够及时表征土壤生态系统变化的敏感生物学指标的研究引起众多研究者的关注。 石油是非常宝贵的能源，在我们的工业生产、日常生活中都起着极为重要的作用。随着 世界对石油需求的日益增多，当今世界上石油的总产量，每年约有2 2 亿t 【8 2 | 。在石油勘探、 开发、运输和储存过程中的滋油、泄油事故造成的环境污染问题同趋严重。石油污染的主要 影响及危害包括 8 3 , 8 4 】：( 1 ) 影响植物及农作物的生长，降低土壤质量，甚至造成土壤荒废。特 别是沸点在1 5 0 2 7 5 范围内的烃类，如汽油和煤油对植物的毒害更大，它能穿透到植物的 组织内部，破坏植物的正常生理机能。高分子烃不能穿透到植物组织内部，但它能够形成一 层薄膜，阻碍植物的蒸腾、呼吸和光合作用。( 2 ) 石油进入土壤后，影响土壤的通透性，阻碍 植物根部的呼吸和营养元素的吸收，引起根部腐烂；( 3 ) 石油有毒成分沿食物链传递，危害人 类健康；( 4 ) 影响水色、水味和溶解氧；( 5 ) 污染地下水，威胁安全供水。因此治理石油污染已 成为环境保护的重要任务之一。 原油污染土壤的微生物学效应及其评价指标 土壤石油污染问题普遍存在于世界各国【8 5 】：据对污染土壤的油含量调查，英国2 0 世纪 6 0 7 0 年代关闭的炼油厂、储油罐区发现多处石油烃污染土壤，土壤中多环芳烃( p a h s ) 最高 质量分数达2 9 7 ，残留在土壤中的p a h s 高达2 0 2 k g m 2 。美国约有3 0 0 0 0 0 0 个地下储存罐 存放石油类产品，其中5 0 0 0 0 0 个地下储油罐可能正在向地下泄漏石油。德国、荷兰和澳大利 亚等有大量的污染土层等待治理。我国全国各地地下储油罐星罗棋布，油品泄漏所造成的土 壤与环境污染时有发生。值得注意的是，我国对污染土壤的环境问题关注不够，缺乏必要的 监测信息而无法准确统计。据目前所掌握的资料显示，我国部分石油化工区土壤残油质量分 数高达5 0 3 0 旷9 4 0 。 对石油污染土壤的研究，目前还主要集中于土壤的生物修复上。石油污染土壤的质量评 价及其指标、土壤生物群落演替变化及其微生活性等方面的研究较少。本文通过试验室模拟 土壤原油污染的方法，分析其微生物活性、量级多样性特征变化，结合国内外最近有关污染 土壤中的生物学性质变化的研究，旨在筛选敏感的石油污染土壤质量评价的生物学指标，探 讨石油污染对土壤质量的影响，为建立污染土壤质量评价生物学指标体系提供理论基础。 2 1 1 研究目的 2 1 研究目的与意义 ( 1 ) 分析不同浓度原油对土壤微生物活性、生物量、多样性及功能的影响，试图确定土 壤所能承载的最大原油量； ( 2 ) 分析微生物的活性、量和功能性商值指标在不同浓度污染土壤间的差异变化，筛选 可以用于评价原油污染土壤质量的生物指标； ( 3 ) 分析原油污染土壤微生物功能多样性变化，摸索微生物群落变化趋势，确定原油污 染土壤中的优势种群的微生物特性。 2 1 2 研究意义 内蒙古大学硕士学位论文 本项研究以试验室模拟的原油污染土壤为研究对象，通过控水分和温度条件，监测不同 原油浓度污染土壤的微生物量碳、土壤基础呼吸、土壤诱导呼吸及其衍生的功能性商值指标 的变化，分析这些指标作为生物指标的稳定性，可为石油污染土壤质量评价的生物学指标评 价体系的建立提供理论基础。 探讨原油污染土壤的微生物响应临界浓度，可为原油污染土壤的微生物指标预警值提供 数据参考。 采用b i o l o g e c o 板测定土壤微生物功能多样性，初步分析了不同浓度原油污染土壤的 微生物群落功能多样性，为石油污染土壤微生物群落演替研究及石油污染土壤的生物修复研 究奠定基础。 2 2 1 研究内容 2 2 试验设计 本论文研究内容主要包括以下几个方面： 1 原油对土壤微生物的活性、量及衍生的功能性商值的效应； 2 原油对土壤微生物功能多样性的效应； 3 微生物活性、量、功能性商值和功能多样性作为原油污染土壤质量评价指标分析； 2 2 2 试验的建立 2 2 2 1 供试土样选择 试验土壤采于呼和浩特市铁路苗圃。试验土壤的选取原则是：肥力高，未受任何有机无 机物污染，受外界扰动小。 呼和浩特市铁路苗圃的植被以油松和白杨为主，2 0 世纪5 0 年代人工种植。油松和白杨林 区除天然降水外，以地下水灌溉植被，种植后未使用过任何化学肥料和农药。采样点位于白 杨和油松的交接地带。土壤粒径分布如图2 1 所示。依据卡钦斯基土壤质地分类制度，判断该 原油污染土壤6 微生物学救应及其评价指标 土壤为轻壤土【“i 。 ：厂 ： ： 溯蒯 ， 窿； 1 0 1 0 0 10 0 01 00 0 0 图2 i 土壤粒径组成 f i g2 t h ec o m p o s i n g o fs o i lp a d i c u l a l es i z e 该土壤结构疏松，有较好的团粒结构，呈黑褐色。土壤有机质、微生物量碳以及全氮 全磷、全钟含量测定如表2l 所示。 表21 土壤微生物量和土壤养分舍量 t a b l e 2 1c o n l e n to fs o i lm i c r o b l a lb i o m a s sa n dn u t r i e n t s 十样有机质微生物晕碳全钾全氮全磷 s o i l0 m c 。t k t nt p s 椰p l e( g - k 9 1 )( g k 9 1 】( n a g k g ) b k g 。) 电k 9 1 ) 土样9 6 73 57 41 35 8 25 60 6 7 土壤微生物量碳以氯仿熏蒸一浸提法测定旧，重铬酸钾氧化外加热法测定有机质古量 1 8 s 3 ，土壤全氨、全磷、全钾含量采用常规方法测定俐。 2222 污染物及浓度确定 选择原油作为外源添加污染物主要是依据如下：( 1 ) 原油成分复杂，毒性大，对生物体 有致命性毒害作用，生物反应效果显著；( 2 ) 原油自然的生物降解速率较慢，便于长时间研 究。( 3 ) 土壤原油污染问题普遍、严重，污染范围广，研究具有实践意义。( 4 ) 对于原油污 染土壤的微生物效应和原油污染土壤质量的评价研究较少，本研究具有创新性。 原油污染浓度设计主要依据赵吉m 1 等人关于落地原油对草原土壤微生物群落的影响及评 价研究和李守春1 9 1 瞎人关于落地原油对牧草质量影响的调查研究而确定。 t_；0。 钟m们伸0 0 内蒙古大学硕士学位论文 2 2 2 3 试验土样培养方案 2 0 0 6 年9 月取样于呼和浩特市铁路苗圃。去表层枯枝落叶后，按梅花法采集深度为o 2 0 c m 土样，混合后将新鲜土样分别装于聚乙烯塑料袋中，带回试验室过2 m m 筛，以去除土壤 中植物根系及种子。 将过筛后的土壤分装于口径1 8 c m 、深1 2 c m 的花衙中，每瓮1 5 0 0 9 。设计原油污染处理 为c k ( 对照) 、m l 、m 2 、m 3 、m 4 ，相应施加外源原油质量为0 、5 9 k g 、1 5 9 k g 、2 5g k g 、 4 5 9 k g ( 相应质量分数为0 、0 5 、1 5 、2 5 、4 5 ) ，每个处理设计三个重复。以油土混合 搅拌方式将原油均匀混入土壤，补充水分使供试土壤含水量达到田间持水量的4 0 。置于室 内( 温度为2 0 2 ) 培养。在培养过程中不添加任何营养成分，每隔4 8 h 以称重法补充水 分一次。 施入原油后，每隔7 d 取样，当天测定土壤基础呼吸、诱导呼吸、可浸提碳和微生物量碳。 取培养5 6 d 的土样放置于一2 0 冰箱内保存土壤，以备测定微生物功能多样性。进行功 能多样性测定前，提前2 4 h 取出土壤放于4 c 冰箱待用。 2 2 3 生物评价指标的选择 基于赵吉吲对土壤质量评价生物学指标的分类，以及污染土壤研究中常用的生物学指标 4 0 , 4 5 , 9 3 】，选择了以下微生物参数：微生物生物量指标一生物量碳、可浸提碳；生物活性指标 一基础呼吸、诱导呼吸；生物功能多样性；生物功能性指标一呼吸商、诱导呼吸商、呼吸活 化商、基质矿化商、腐殖化效率。 2 3 1 土壤呼吸作用强度的测定 2 3 研究方法 土壤呼吸作用强度采用静态气室法测定【9 4 】，其原理是土壤在密闭系统中培养，释放的c 0 2 i 南n a o h 溶液吸收，再用h c i 回滴未消耗的n a o h ，从而计算得n c 0 2 释放量。 分别测定了土壤基础呼吸和土壤诱导呼吸两个指标，测定方法如下： 原油污染土壤的微生物学效应及其评价指标 ( 1 ) 基础呼吸： 称量相当于2 5 9 - - q z 土重的湿土，调节水分至5 0 田间持水量，在含有3 0 m l0 0 5 m o l ln a o h 溶液的密闭瓶中培养，于2 5 。c 培养2 4 d 时，培养结束后，用经过标定的0 0 5 m o l l h c i 滴定。 计算公式： c 。z c ( m g - k 9 1 h - 1 ) = 譬等等 。 式中： c 0 2 。c 以土壤干重为基准，c 0 2 的产生速率； v i 空白样品消耗的h c 体积量( m 1 ) ； v o 测试样品消耗的h c 体积量( m 1 ) ； m h c i 摩尔浓度； 1 2 c 的摩尔质量； 2 5 土重： 2 4 培养时间 ( 2 ) 诱导呼吸： 称量相当于2 5 9 干土重的湿土，准确添加o 1 9 葡萄糖，在含有3 0 m l0 0 5 m o l ln a o h 溶液的 密闭瓶中于培养，于2 5 培养6 小时，培养结束后，用经过标定的0 0 5 m o l l h c i 滴定。释放c 0 2 量计算公式同上。 2 3 2 微生物生物量碳的测定 采用氯仿熏蒸浸提法及其修正方法【9 5 ，9 6 1 测定土壤微生物生物量碳( m i c r o b i a lb i o m a s s c a r b o n ，c m i 。) ，其测定原理是土壤经氯仿熏蒸后，其中的绝大部分微生物被熏杀，细胞分解， 其细胞溶解释放的可溶性有机碳被0 5m o lk 2 s 0 4 溶液所浸提，根据可浸提性有机碳的增量换 算为土壤微生物量碳。 测定方法如下： 称相当于1 0g 干土的已过筛( 2 眦) 新鲜土壤6 份，靴1 5 c m 的培养皿中，摊平，其中3 份土壤连同盛有5 0m l 的无醇氯仿三角烧杯和盛有蒸馏水( 壁上放一滤纸条) 的烧杯一起放入真 空干燥器内，抽真空，直到氯仿沸腾，并持续2 m i n 。将真空器放入2 5 c 培养箱中培养2 4 h 。然 内蒙古大学硕士学位论天 后取出氯仿和蒸馏水烧杯，反复抽真空以去除残余氯仿。另外3 份土壤除不经氯仿处理以外， 其它处理相同。用4 倍于土壤干重的0 5m o lk 2 s 0 4 溶液对处理后土壤进行振荡浸提3 0m i n ，过 滤得到上清液，用h 25 0 4 一k 2 c r 2 0 7 氧化滴定法测定上清液中的可浸提有机碳( c o r g ) 含量，将熏 蒸土壤( f e ) 与未熏蒸土壤( c k ) 的有机碳之差，除以转换系数k 。( 0 3 8 ) ，即得土壤微生物生物量 碳( c m i 。) 含量( m g k g _ o 计算公式： ； c o r g ( m g k g - 1 ) = 半x 1 0 6xm 眠- v ) 参 式中： 0 0 1 2 碳的毫摩尔质量( g ) ； f 稀释倍数； m f e s 0 4 溶液的浓度( t o o l l ) ； w 烘干土重( g ) ； v o 滴定空白所消耗 拘f e s 0 4 溶液的体积( m 1 ) ； v 滴定土壤样品所消耗的f e s 0 4 溶液的体积( m 1 ) ； c b i o = ( c i c 。：k ) 0 3 8 式中： c f e 熏蒸土壤中可浸提有机碳含量( m g k g 一) ； c c k 未熏蒸土壤中可浸提有机碳含量( m g k g 。1 ) 0 3 8 转换系数 2 3 3 土壤有机质测定 重铬酸钾氧化一外加热法测定土壤有机质删，测定方法如下： 称已过筛( 2 m m ) 的风干土样0 5 0 0 0 9 ，用h 2 s 0 4 一k 2 c r 2 0 7 氧化滴定法测定有机碳。 计算公式： w c 。：( 0 8 0 0 0 5 o ) ( v o - v ) , , 0 _ 0 0 3 1 1 l o o o g oxm lxk 2 ) w o m = w c o x l 7 2 4 原油污染土壤的微生物学效应及其评价指标 式中： w c 卜有机碳含量( g k g 。) ： w o m 有机质含量( g k g 一) ； 0 8 0 0 0 k 2 c r 2 0 7 标准溶液的浓度； 5 o _ k 2 c r 2 0 7 标准溶液的体积( m 1 ) ； v o 空白标定消耗f e s 0 4 溶液的体积( m 1 ) ； v 滴定土样消耗f e s 0 4 溶液的体积( m 1 ) ； o 0 0 3 1 4 碳原子的摩尔质量； 1 1 氧化校正系数； m l 风干土样质量； k 2 将风干土换算到烘干的水分换算系数； 1 7 2 仁将有机碳换算成有机质的系数； 2 3 4 土壤微生物功能多样性测定 试验采用b i o l o g 法分析微生物功能多样性，其方法原理及测定方法如下： 测定原理 b i o l o g 微平板是一种多底物的酶联反应平板，由1 个对照孔和9 5 个反应孔组成，每个 反应孔装有不同的单一碳源底物和作为指示剂的氧化还原染料四氮哗蓝。将土壤溶液接种到 每一个微平板孔后，各孔中微生物利用碳源底物进行呼吸作用，产生还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸，使四氮唑蓝发生氧化还原反应而变色。根据测定的反应孔中颜色变化的吸光值，来 指示微生物对9 5 个反应孔中碳源的利用程度差异，从而判断微生物群落的功能代谢能力差 异。 由于微生物对不同碳源的利用能力很大程度上取决于微生物的种类和固有性质，因此， 在一块微平板上同时测定微生物对不同单一碳源的利用能力( s o l ec a r b o ns o u r c eu t i l i z a t i o n ， s c s u ) ，就可以鉴定纯种微生物或比较分析不同的微生物群落【9 7 】。该方法是由美国的b i o l o g 公司于1 9 8 9 年开发成功9 8 1 ，最初应用于纯种微生物的鉴定，1 9 9 1 年g a r l a n d 和m i l l 开始将 这种方法应用于土壤微生物群落的研究，认为b i o l o g 碳素利用法是一种较为先进的研究不 同环境下土壤微生物群落结构和多样性的方法【9 9 】。 2 0 内蒙古大学硕士学位论文 本研究采用b i o l o g 生态板( b i o l o g e c o ) ，生态板包含三个对照孔及含有31 种碳源的 9 3 个反映孔( 即有三个重复) 。3 1 种碳源的种类可见第四章表4 2 。 测定方法： b i o l o g e c o 板的接种液的制备采用c l a s s e n l l 0 0 1 的方法：首先将土壤样品在2 5 。c 条件下 活化2 4 h ，取相当于干土3 9 的土于2 7 m l 灭菌的o 8 5 m o l l n a c l 溶液中，振荡3 0 m i n 后，吸 取3 m l 上清，加入2 7 m l n a c l 溶液，混匀后再吸取3 m l 上清，加入2 7 m l n a c i 溶液。最终 的稀释比例为1 ：1 0 0 0 。取1 5 0 1 a l 稀释液接种于b i o l o g e c o 板的各孔中，将接种好的微孔 板放在保湿的容器内，于2 5 的恒温培养箱中培养。分别于o h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 、 1 2 0 h 、1 4 4 h 、1 6 8 h 、1 9 2 h 、2 0 4 h 、2 2 8 h 、2 5 2 h 、2 7 6 h 、3 0 0 h 、3 2 4 h 和4 0 8 h 在e l x 8 0 8 一b i o l o g 微孔板读数仪( b i o t e ki n s t r u m e n t si n c ，u s a ) 上进行测定，测定波长为5 9 0 n m 。 采用e x c e l 进行数据简单处理； 2 4 数据分析 主成分分析分析应用s p s s ( v e r s i o n l 3 0f o rw i n d o w s ) 软件的d a t ar e d u c t i o n 程序实现【1 0 1 】； 差异显著性检验应用o n e w a ya n o v a 程序实现。 2 l 原油污染土壤的微生物学效应及其评价指标 第三章原油污染土壤的微生物效应 石油是重要的工业原料，同时又是主要的燃料与能源。随着工业的发展，需求量大幅度 增加，使得石油开采面积不断扩大。在开采、运输、贮藏、炼制、加工等过程中，由于意外 事故或管理不当，使石油泄露及溢出，严重污染了土壤、地下水、河流等环境。进入土壤环 境的石油不仅会破坏土壤结构，使土壤功能下降，还会对土壤生态系统产生严重的危害，进 而影响人类的生产与生活。石油主要成分有烷烃、苯、甲苯、二甲苯等多种复杂芳香烃，这 些物质毒性大，有些还具有致癌、致突变等作用，因此被列为重要污染物。 目前，关于生物对这些复杂芳香烃的降解及对污染环境的生物修复的研究蓬勃发展。对 于石油污染环境的治理，生物修复具有明显的优越性，取得了很大的进展【1 0 2 】。随着分子生物 技术的发展，基因克隆、转基因等生物技术构建出很多高效降解菌；生物芯片技术，d g g e ， 原为荧光杂交的生物技术加深了人们对污染土壤分子生态的认识，为污染的防治与修复提供 了理论基础，促进了如何提高土壤生物修复效率的生物强化技术的研究。对生物修复抑制因 子的研究及生物修复工程的研究均有一些报道【旧3 1 。 石油污染土壤微生物变化的研究较少，姚德明【l 叫等人认为石油污染土壤中，以利用石油 烃为碳源的细菌数量较多，真菌数量较少；细菌虽数量较多，但类群没有真菌丰富。细菌以 革氏染色阴性杆菌为优势，其中以动胶菌属为主，其次为黄杆菌属。革氏染色阳性杆菌以芽 孢杆菌为主。真菌以毛霉菌属、小克银汉菌属占优势。其次是镰刀菌属、青霉菌属、曲霉菌 属，酵母最弱；放线菌以链霉菌属为优势。 在石油开采过程中，油井周围的土壤会不可避免地受到落地原油的污染。随着石油开采 量的加大，原油污染面积也在不断增加。落地原油定会对土壤环境产生不利影响，诸如土壤 结构恶化、通透性降低等，进而影响到土壤养分的转化，导致土壤微生物群落的功能发生变 化。赵吉【1 0 0 】等人研究指出：落地原油在一定范围内可以刺激草原土壤中好气性细菌和真菌类 群的生长繁殖，促进芽孢细菌的活动，并且具有中等污染特征。放线菌的数量随石油污染程 度的提高呈明显递减规律，可作为石油污染的监测和评价指标之一。当土壤中落地原油含油 含量较低时，微生物各类群的数量变化相对较小，达到中等污染时( 含油量约在1 6 ) ，微 生物各类群的数量均有较大的变化，如好气性细菌和真菌数量达到高峰；污染程度更高时， 内蒙古大学硕士学位论文 微生物类群的生长将受到抑制，对高浓度石油稳定的微生物种类其数量会相对增多；极严重 的污染会使土壤微生物的生长繁殖及活动能力受至【f 严重影响。 本研究通过试验室模拟原油污染的方法，剔除植物根系对土壤微生物群落及生理代谢的 影响，研究不同程度原油污染对土壤微生物活性、生物量及微生物功能性商值指标的效应， 探讨其作为原油污染土壤质量评价指标的灵敏程度，并讨论试验土壤所能承载的原油浓度阂 值，为原油污染土壤质量的生物评价及原油污染生物预警提供理论基础。 3 1 原油对土壤微生物的活性的影响 土壤呼吸是指未受扰动土壤中产生c 0 2 的所有代谢过程，包括3 个生物学过程( 植物的根 系呼吸、土壤微生物的异氧呼吸以及土壤动物呼吸) 和一个非生物学过程( 少量的土壤有机物 氧化而产生的c 0 2 ) ，其中最重要的组成部分是根系呼吸和土壤微生物的异氧呼吸，化学氧化 过程对土壤呼吸的作用较小，一般很少考虑【i 0 5 , 1 0 6 】。土壤呼吸是一种复杂的生物学过程，它不 仅受到土壤温度、土壤含水量、降水、凋落物以及土壤c 、n 含量等非生物因子的影响，而 且受到植被类型、叶面积指数( l a i ) 、根系生物量等生物因子和人类活动的综合影响 1 1 3 1 。土 壤呼吸作用的强度能反映土壤有机碳的分解程度、土壤养分的供应状况以及土壤微生物的活 性，是评价土壤肥力的指标之一。 本研究采用经典的碱液吸收法测定了不同培养时期的不同浓度原油污染土壤微生物呼吸 强度，分别测定了基础呼吸( b a s i cr e s p i r a t i o n ，b r ) 以及诱导呼吸( 也称潜在呼吸) ( p o t e n t i a l r e s p i r a t i o n ，p r ) 。土壤基础呼吸是没有添加任何外源物质的土壤中微生物的呼吸量，代表了 土壤碳素的周转速率及微生物的总体活性，并在一定程度上能揭示环境胁迫情况，与土壤环 境质量密切相关【m 6 1 。由于缺乏碳源，土壤中微生物的基础呼吸较弱，如果向土壤中加入易分 解的有机物( 如葡萄糖) ，则微生物的呼吸不再受到限制，矿化潜能得以体现，呼吸量在极 短的时间内迅速增加，并且可维持4 6 h 没有大的变化，这种呼吸量就称为诱导呼吸。诱导呼 吸是基于这样一个假设，即添加葡萄糖后，每种土壤中相似比例的微生物群系对葡萄糖的反 应程度是相同的1 0 7 】。 3 1 1 土壤基础呼吸的变化 从反应时间上来看，与对照土壤相比，不同浓度原油污染土壤的基础呼吸强度均有不同 原油污染土壤的微生转学效应厦算评价指标 程度的增加( 见图31 ) 。在7 d 一5 6 d 期问，其基础呼吸强度随培养时间的延长而逐渐降低，表 现为前7 d 污染土壤基础呼吸明显高于对照土壤，随后明显降低，3 5 d 后污染土壤的基础呼吸 逐渐与对照土壤接近。 _ o g k g - _ 5 9 k g + 1 5 9 k g 图3l 原油对土壤基础呼吸的影响 f i g3ie f f e c t s o f c m d e o i lo ns o i l b a s i cr e s p i r a t i o n 从不同原油污染浓度的角度分析不同的污染浓度对土壤基础呼吸强度的影响是不同的 ( 见图32 ) 。土壤基础呼吸作用强度的大小表现为当原油浓度低于2 5 9 k g 时，随污染浓度增 加而增大，浓度达到4 5 啦g 时期又降低，呈现“中度污染效应”。 壤 1 s o 辅桷榈榈商阕 时问 图32 不同原油浓度对土壤呼吸的影响 f i 审2e f f e e b o f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no i lo ns o i lb a s i cr e s p ir a t i o n 首先由试验设计可知推论以下几点论断：( 1 ) 由于此试验土壤是过筛去除植物根系的 土壤，土壤中不会存在大型土壤动物和植物根系，所以土壤呼吸仅为土壤微生物的异氧呼吸。 在土壤微生忐系统内，不存在微生物与植物、土壤动物问的群落关系，只存在土壤微生物间 rf：v篓gi# 内蒙古大学硕士学位论文 的种群关系；( 2 ) 在土壤培养过程中不加入任何营养物质，仅补充水分，则剔出了外源营养 物质对土壤微生物的差异影响。由于土壤微生物对土壤中营养物质的不断代谢，可能会导致 土壤微生物处于贫营养状态；( 3 ) 原油是成分复杂的复合有机物，原油中的某些成分必然会 对微生物产生毒害，如长链烃类，芳烃粪等：同样也必然存在一些成分可作为简单的碳源或 氮源，较容易被微生物代谢利用。因此，我们将原油成分简单分为两部分：“有毒害部分”和 “可代谢部分”，以便于研究分析。( 4 ) 污染土壤在培养过程中严格控制温度和水分条件，所 以，与对照相比，土壤微生物活性、功能和量的变化只与原油及其浓度有关。 依据以上推论，试验结果分析如下：( 1 ) 在试验过程中，施油土壤基础呼吸高于对照土 壤，可能是由于原油中存在的微生物可利用有机物，作为碳源为土壤微生物代谢提供了营养 物质，促进土壤微生物呼吸代谢活性；( 2 ) 随着培养时丑j 的延续，微生物代谢的不断进行， 一方面，原油中“可代谢部分”被微生生物消耗殆尽。另一方面，原油中“有毒害部分”的 毒性效应逐步显现，表现为微生物活性降低，基础呼吸下降；( 3 ) 随着污染浓度的加大，施 入的原油对土壤微生物的毒害效应相应增强，故而施入量为4 5 9 k g 的土壤基础呼吸小于 2 5 9 k g 的土壤。由此判断，施油量高于2 5 9 k g 后，+ 原油会抑制土壤基础呼吸。可能太于此浓 度的原油会对土壤微生物表现出毒害效应，由此判断此浓度可能是此种土壤承载原油浓度的 最大阐值，在此浓度范围内的原油污染土壤有望能够自我生物修复。 3 12 土壤的诱导呼吸变化 从不同浓度原油对土壤诱导呼吸的时问影响曲线( 图33 ) 柬看，个明显的现魏是：前 g g 堂 啦 - - - _ o g k g 图33 原油时土壤谤旱呼吸的影响 f i g3 3e f i e e t so f o l lo ns o l lp o t e n t i a lr e s p i r a t i o n 2 8 天污染土壤诱导呼吸强度显著高于对照土壤，3 5 d 后污染士壤的诱导呼吸则与对照土壤接 原油污杂土壤的微生物学效应厦其评价指标 近，甚至低于对照土壤。另一变化趋势足污染士壤诱导呼吸值在7 d 3 5 d 期问，总体上有逐渐 减弱的趋势；随后有所增加。 诱导呼吸足向缺乏碳源的上壤中加入易分解的自机物( 如葡萄糖) 使微生物的呼吸量 在搬短的时间内迅速增加。诱导吲灶人小与i 域中有活肚的黜t 物的颦和微e 物受碳源肋迫 口0 ? k h 口j 日，+ k z 口i3 h 7ke 日2 。h h e _ 4 5 9 ! k i ： 感一阻 2 1d0 e d i n 目34 呼吸增量 f 1 醪4e n h dv a l u e o fr e s p i r a t i o n 有关。因此我们进一步分析了呼吸增量，即诱导呼吸与基础呼吸的差值。如图34 所示。 圈34 表示了土壤培养2 1 天和5 6 d 时的呼吸增量，可以看出，对照土壤的呼吸增量在 2 1 d 时低于污染土壤，5 6 d 时明显高于污染土壤。另个明显的现象是原油浓度为5 扯g ，1 5 9 k g 和2 5 k g 的土壤其呼吸增量在2 1 d 和5 6 d 时均高于原油浓度为4 5 9 k g 的土壤。 此现象表明在原油污染的前2 8 d 可能是原油中“可代谢部分”增强了生物土壤微生物 活性，使污染土壤的诱导呼吸和呼吸增量高于对照土壤。随着微生物在原油土壤中的代谢及 演替，土壤中可能形成新的优势微生物群落，而土壤中总的微生物类群减少，使3 5 d 后污染 土壤的诱导呼吸明显下降，呼吸增值也明显低于对照土壤。原油浓度为4 5 9 m g 的土壤的呼吸 增量低于其它浓度土壤以表明原油污染存在“中度污染效应”，土壤承载原油浓度的闻值在 2 5 9 k g 。 32 原油对土壤微生物生物量的影响 内蒙古大学硕士学位论王 3 21 土壤可浸提碳( c 。一) 变化 土壤可浸提有机碳是土壤总有机中的动态组分，也称可利用忐碳，可以评估土壤中可利 用态基质的状况。与微生物的活性的真实变化紧密相关。通常用o5 mk 2 s 0 4 浸提测定，被证 明是微生物活动的有效碳源1 0 9 。 圈3 5 是不同原油浓度土壤可浸提碳随时间变化的曲线。由图可见，随时间的延长，各 个土壤的c 。总体上有减少的趋势；污染土壤的可浸提有机碳高于对照土壤：同一时间不同 原油污染浓度变化规律为c k 5 9 k g 1 5 9 k g 4 5 e d k g 2 5 9 k g 。此现象表明污染土壤中微生 物有效碳高于对照土壤：随时问的延长，微生物有效碳有所降低；随原油浓度的增加，其微 生物有效碳随之增加，当原油浓度为4 5 虹时，又有所降低。 3 0 自2 5 ：2 0 吾1 5 鏊l o 口5 一o g k b - 一5 9 k g 广_ i5 9 k g2 5 9 k g - ) k 一4 5 9 k g 7 d 1 4 d2 l d2 8 d3 5 d5 6 d 叫问( 天) 图3 5 原油对土壤可浸提碳的影响 f i g3 5e f f e c t so f o i o ns o i le x t r a c t a b l ec a r b o n 32 2 微生物生物量碳( c 。) 的变化 与代谢有关的生态生理学参数可以反映系统的稳定性以及环境胁迫对微生物的影响程 度，因而是重要的土壤生态能量学指标。土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5 x 1 0 3 , u m 3 的生物总量，包括细菌、真菌、放线菌和小型动物，但不包括植物残体。土壤微生物生物 量包括微生物量碳、微生物量氢、微生物量磷以及微生物量硫，一般以微生物量碳含量柬表 示，它虽然仅占土壤有机质的很小一部分f l o 1 ，但所起的作用不可低估，因其所台养分有 效性较高，常被看成是土壤活性有机质组分。在土壤生态系统中，微生物生物量作为有机质 降解和转化的动力，是植物养分的重要源和库，对植物养分转化、有机碳代谢及污染物降解 原油污染土壤的微生物肇效应厦其评价指标 具有极其重要的作用。因此，微生物龟碳可以直接影响到养分循环及其生物有效性。它能代 表参与调控土壤中能量流动和养分循环以及有机质质转化的相应微生物的数量，同时，土壤 微生物量碳或氨转化速率的快慢，可以很好地表征土壤总碳或总氨的动态变化，是比较