（农产品加工及贮藏工程专业论文）双水相萃取荣昌猪肉脂肪酶及酶学特性研究.pdf

摘要 双水相萃取荣昌猪肉脂肪酶及酶学特性研究 农产品加工及贮藏工程专业硕士研究生王盼盼 指导老师李洪军教授 摘要 双水相萃取技术是近年来发展起来的一种新型生化分离技术，该体系由两种化学结构不 同的亲水性聚合物或一种亲水性聚合物和无机盐在水中以适当的浓度形成互不相溶的两水相 系统，利用组分在两相分配的差异而进行萃取分离的技术。 双水相萃取技术具有生物相相溶性高，分离条件温和，步骤简单，易于放大，且不存在 有机溶剂残留等优点，目前双水相萃取技术已被广泛用于酶、核酸、生长激素及各种植物中 有效成分的萃取分离。 脂肪酶( e c3 1 。1 3 ) 是一类催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸的生物催化 剂。近年来，脂肪酶已被广泛应用于食品、洗涤业、有机合成、皮革和造纸等行业，脂肪酶 在肉制品加工过程中和风味形成中也占有重要的地位，脂肪酶对肉制品风味的调控，工艺的 改进及工业化生产均有重要的意义。 本文以荣昌猪肉脂肪酶为研究对象，采用双水相萃取技术分离荣昌猪肉脂肪酶，建立了 适宜的双水相萃取体系，并对影响萃取效果的各种因素和荣昌猪肉脂肪酶酶学特性进行了研 究。 本课题采用p e g 无机盐双水相萃取体系，研究了双水相成相物质及不同的操作条件对双 水相萃取结果的影响。实验结果表观，双水相萃取荣昌猪肉脂肪酶的最优条件如下：( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度为1 2 ，p e g 分子量为2 0 0 0 ，2 4 的p e g 2 0 0 0 ，p h = 6 5 0 条件下，粗酶液的添加量为1 0 ， 浓度1 2 的n a 2 h p o 。反萃取脂肪酶时，脂肪酶的分配系数和回收率较高，将本实验结果直线 放大，脂肪酶的分配系数、相体积比和脂肪酶的回收率均比较稳定。 荣昌猪肉脂肪酶酶学特性主要实验结果如下：荣昌猪肉脂肪酶最适反应温度为3 7 c ，该 酶在3 7 c 以下能保持比较稳定的酶活性；脂肪酶的最适p h 为6 5 0 ，p h 在4 0 0 7 0 0 范围内有 较好的酸碱稳定性；金属离子浓度为2 m m o l l 、5 m m o l l 时，b a ”、c a 2 + 离子对脂肪酶有强烈 的激活作用，f e 2 + 、m n 2 + 、z n 2 + 、s n 2 + 等离子对脂肪酶活性有抑制作用，k _ 、n a + 、m 9 2 + 无明 显的激活或抑制作用：0 0 5 阳离子型表面活性剂c a t b 、阴离子型表面活性剂s d s 和非离子 型表面活性剂t r i t i o n 1 0 0 对荣昌猪肉脂肪酶活性有一定的激活作用，非离子型表面活性剂 t w e e n - 8 0 对荣昌猪肉脂肪酶活性有一定的抑制作用，而且随着表面活性剂质量浓度的提高， 西南火学硕十学位论文 表面活性剂对脂肪酶的激活作用会转为抑制作用，而且会使得其抑制作用增大：2 m m o l l c a 2 + 使脂肪酶活性的热稳定性降低，4 5 c 处理3 0 r a i n 后，酶活力基本丧失，加入c a 2 + 使得酶活性 活力提高，但是加入c a 2 + 后造成脂肪酶的热稳定性下降：以三油酸甘油酯为底物，荣昌猪肉 脂肪酶在最适反应条件下动力学常数k 。和v 。分别为1 8 1 7 m m o l l 和5 8 8 u l 。 关键词：荣昌猪脂肪酶双水相萃取技术酶学特性 i i a b s 删c t a bs t r a c t a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o ni san e wb i o - s e p a r a t i o nt e c h n i q u ed e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s t w o h y d r o p h i l i cp o l y m e rw i t hd i f f e r e n tc h e m i c a lc o n s t i t u t i o no rh y d r o p h i l i cp o l y m e ra n di n o r g a n i cs a l t d on o td i s s o l v em u t u a l l yi ns u i t a b l ed e n s i t y t h eo b j e c tc o m p o n e n tc o u l db es e p a r a t e db yu s i n g a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n t h eb i o s e p a r a t i o nt e c h n i q u eh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sh i g h e rb i o - - c o m p a t i b i l i t y , l e s s s e p a r a t i o np r o c e d u r e s ，m i l d e ro p e r a t i n gc o n d i t i o n ，e a s i e re n g i n e e r i n ga m p l i f i c a t i o n ，l e s sr e s i d u eo f o r g a n i cs o l v e n t si nt h ep r o d u c ta n ds oo n i th a sb e e nw i d e l yu s e dt op u r i f yd i f f e r e n te n z y m e s ， n u c l e i ca c i d s ，h o r m o n ea n db i o a c t i v ec o m p o n e n ti np l a n t s l i p a s ef e c3 1 1 3 ) i sak i n do fb i o c a t a l y s t st oh y d r o l y s i sl o n g - c h a i nt r i g l y c e r i d e st og l y c e r o l a n dl o n g - c h a i nf a t t ya c i d s l i p a s ei sw i d e l yu s e di nf 1 0 0 d ，m e d i c i n e ，s c o u r , l e a t h e ra n dp a p e ri n d u s t r y t h el i p a s eh o l d sa ni m p o r t a n ts t a t u sd u r i n gt h ep r o c e s s i n gp r o c e s s i th a sv i t a ls i g n i f i c a n c et om e a t p r o d u c tf l a v o rr e g u l a t i o n ，c r a f ti m p r o v e m e n ta n dp r o d u c t i o n si n d u s t r i a l i z a t i o n a q u e o u st w o - p h a s es y s t e mw a su s e di nt h i sp a p e rt oe x t r a c t i n gt h el i p a s eo fr o n g c h a n gp i g t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so fe x t r a c t i n ga n d p r o p e r t i e so fl i p a s ew e r es t u d i e d i nt h i se x p e r i m e n tt h ee x t r a c t i o ne f f e c t so fs e v e r a lf a c t o r so nr o n g c h a n gp i g sl i p a s ew e r e i n v e s t i g a t e d t h e s ef a c t o r si n c l u d e dc o m p o n e n t so fa q u e o u st w o - p h a s es y s t e ma n dd i f f e r e n t o p e r a t i n gc o n d i t i o n s t h ed i s t r i b u t i o nc o e f f i c i e n ta n dr e c o v e r yr a t ea r eh i g hw h e nt h ed e n s i t yo f ( n i - h h s 0 4i s1 2 ，p e gm o l e c u l a rw e i g h ti s2 0 0 0a n dd e n s i t yi s2 4 ，p hv a l u ei s6 5 0 ， s u p p l e m e n t a r yg n z y n l ei s1 0 ，c o u n t e r - e x t r a c tm a t e r i a ln a 2 h r p 0 4d e n s i t yi s1 2 t h ed i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n ta n dr e c o v e r yr a t ea r es t a b l ew i t he n l a r g i n gt h i se x p e r i m e n t a lr e s u l t a n dp r o p e r t i e so ft h e l i p a s ef r o mr o n g c h a n gp i ga l ea sf o l l o w s t h el i p a s es h o w e dt h eh i g h e s ta c t i v i t ya tp h6 5a n d3 7 c i tw a ss t a b l eu n d e r3 7 c t h ep h f r o m4 0 0t o7 0 0r o n g c h a n gp i g sl i p a s eh a sg o o da c i d - b a s es t a b i l i t y w h e ni o nd e n s i t yi s2 m m o l l a n d5 m m o l lb a 2 + a n dc a + s t i m u l a t e dt h ee n z y m ea c t i v i t ys i g n i f i c a n t l yw h i l ef e 2 + 、m n 2 + 、z n 2 + 、 s n 2 + h a di n h i b i t o r ye f f e c t b u tk _ 、n a + 、m 9 2 + h a dn oe f f e c to nt h ea c t i v i t yo fl i p a s e t h ed e n s i t yo f s u r f a c t a n ti s0 0 5 c a t i o n i cs u r f a c t a n tc a t b ，a n i o n i cs u r f a c t a n ts d sa n dn o n i o n i cs u r f a c t a n t t r i t i o n - 10 0s t i m u l a t e dt h ee n z y m ea c t i v i t ys i g n i f i c a n t l y n o n i o n i cs u r f a c t a n t t w e e n - 8 0h a da l l i n h i b i t o r ye f f e c t a l o n gw i t hi n c r e a s i n gd e n s i t yo fs u r f a c t a n tt h ea c t i v ee f f e c tw i l lc o n v e r ti n t o i n h i b i t o r ye f f e c t t h ei n h i b i t o r ye f f e c tw i l lb ee n h a n c e da tt h es a n l et i m e t h ec a + r e d u c e dt h e r m a l s t a b i l i t yo fl i p a s e t h ea c t i v i t yo fl i p a s ew a sa l m o s tl o s tu n d e r4 5 ct r e a t m e n t t h ee i l z y r l l ea c t i v i t y e n h a n c e db u tt h et h e r m a ls t a b i l i t yr e d u c e dw i t ha d d i n gc a 2 + t h ev a l u e so f 岛a n d 螈w e r e i i i 两南人学硕士学位论文 曼曼曼皇曼曼皇曼寰皇ii 曼曼鼍曼皇曼暑曼量皇! 曼苎曼曼皂曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼量量 1 8 1 7 m m o l l a n d5 8 8 u l i n o p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n s k e y w o r d s ：r o n g c h a n gp i g ；l i p a s e ；a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n ；p r o p e r t i e so f l i p a s e i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：王黔鹅签字日期：枷卵年6 月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：囱不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：j _ 盼谢 签字日期：w d 9 年6 月f 日 导师签名 签字日期：w 开年6 月f 日 第1 章文献综述 蔓皇曼皇i i i i ii i - - - 舅 第1 章文献综述 1 1 荣昌猪品种特性及研究动态 荣昌猪是我国著名的地方良种，荣昌猪的品种形成至今已经有4 0 0 多年的历史，具有体型 大，配合力好，遗传性状稳定，成熟早，适应性强，瘦肉率高等优点，被列为国家一级保种 7 资源，有“国宝猪”的美誉【1 1 。 1 1 1 荣昌猪的外貌特征 荣昌猪体型较大，除两眼四周或头部有大小不等的黑斑外，其余皮毛均为白色，也有少 数在尾根及体躯出现黑斑全身纯白的。按毛色特征分别称为“金架眼”、“黑眼膛”、“黑头”、 “两头黑”、“飞花”和“洋眼”等，其中“黑眼膛”和“黑头”约占一半以上。荣昌猪的头 大小适中，面微凹，耳中等大、下垂，额面皱纹横行、有漩毛；体躯较长，发育匀称，背腰 微凹，腹大而深，臀部稍倾斜，四肢细致、结实；鬃毛洁白、刚韧2 1 。 1 1 2 荣昌猪的生活习性 荣昌猪对环境的适应性强，耐粗饲，性情温顺，易于调教，公猪采精容易，母猪泌乳性 能好，护仔能力强，在海拔l o - - 2 0 0 0 m 的不同地区都可以饲养，在冬季气温低至1 ，夏季 气温高达4 0 c 以上，饲料种类及饲养管理条件也不尽相同，但荣昌猪一般都能正常生长、繁 殖，表现出较好的适应能力【3 1 。 1 1 3 荣昌猪的产区 荣昌猪主产于荣昌和隆昌两县，后扩大到永川、泸县、泸州、纳溪、大足、合江、铜梁、 江津、壁山、宜宾等县市。荣昌猪现已推广到云南、陕西、湖北、安徽、浙江、天津、北京、 辽宁等2 0 多个省市，并在1 9 6 3 年就由云南省向越南出口种猪4 0 头【4 1 。 1 1 4 荣昌猪的研究现状 在明末清初，湖南、广东大量移民到四川时带入荣昌猪，经人工定向选育和风土训化形 成，在清朝康熙年间，编纂的荣昌县志中已有“白豸”的记载：1 9 3 6 年，四川省家畜保 育所在荣昌安福镇建立了“荣昌实验区”指导农家选种，推广荣昌猪；1 9 5 2 年在产区建立省 种猪试验站( 后来更名为省养猪研究所，现命名为重庆市养猪研究院) ；1 9 5 7 年，建立了永川 地区种猪场( 现名重庆市种猪场) 主要负责荣昌猪的纯繁殖和研究工作；同年，荣昌猪被载 入英国出版的世界家禽品种及名种辞典，成为国际公认的宝贵猪种资源；1 9 7 3 年在产区组 成荣昌猪育种科研协作组；1 9 8 3 年省标准局颁发了荣昌猪标准；1 9 8 6 年列入中国家畜家禽 种志：经国家家畜遗传资源管理委员会评审，荣昌猪以“瘦肉率高，白色，特定遗传性状” 西南大学硕十学位论文 等优点，农业渔业部在“七五”规划中把荣吕猪与东北民猪、太湖猪列为国家级一级保护的 地方良种；9 8 7 年制定了中华人民共和国荣吕猪国家标准；2 0 0 0 年农业部确定荣吕猪为 全国保护的1 9 个猪品种资源之，被列人国家畜禽品种资源保护目录2 0 0 1 年农业部又 将重庆市种猪定为国家级荣昌猪资源“。 2 荣昌猪肉脂肪酶的研究进展 脂肪酶( e c31 i3 ) 是一类特殊的酯键水解酶广泛存在丁动物组织，植物种子和微生 物中。脂肪酶是将油脂水解成脂肪酸和甘油的酶，系统名称为三酰基甘油水解酶( t r i a c y l g l y c e r o l a c y l h y d r o l a s e ) 。脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶天然底物为睦链脂肪酸酯，可h 在异 相系统中起作用，有一定位置的专一性，从已知结构的脂肪酶来看脂肪酶的分子量一般为 2 0 6 0k d 之间【“。 脂肪酶的分子结构是一种糖蛋白，其糖基部分约占分子量的2 15 ，以甘露耱为主整 个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的疏水端( 见目1 1 乖】图1 2 ) 。脂肪酶 结构有2 个特点：( 1 ) 脂肪酶都包括同源区段h i s x yg 1 v z - - s e r - - w - - g l y 或y 一 0 】y h l s s e r - w - - g l y ( x 、y 、w 、z 是可变的氪基酸残基) ；( 2 ) 活性中心是丝氨酸 残基，正常情况下受1 个n螺旋盖保护1 10 , 1 i i 。 图l - i 脂肪酶的空间结构图i 一2 脂肪酶在油水界而定向的假设模型 f i g l - 1t h es p a t l a ls t n l c t h r eo f l i p a s e f i g l - 2 t h e h y p o t h e s i s m o d e lo f l i p a s ea c t i o n l2 l 脂肪酶的分类 按照底物的专一性脂肪酶一般分为以下五种：( 1 ) 有底物选择的脂肪酶：( 2 ) 有脂肪酸 选择性的脂肪酶( 3 ) 有位置选择性的脂肪酶：( 4 ) 有立体专一性的脂肪酶；( 5 ) 无选择性 的脂肪酶。 按照来源脂肪酶一般分为：( 1 ) 哺乳动物脂肪酶：( 2 ) 细菌脂肪酶；( 3 ) 真苗脂肪酶。 第1 章文献综述 ! i i i i - | i 一i i 蔓曼蔓葛 按照脂肪酶的最适p h 值脂肪酶可以分为：( i ) 酸性脂肪酶：( 2 ) 碱性脂肪酶。一般植物 种子和动物胰脏所含的脂肪酶为酸性脂肪酶，微生物所产生的脂肪酶大多为碱性脂肪酶【1 2 1 。 1 2 2 脂肪酶的水解原理 脂肪酶是水解三酯酰甘油的水解酶类，水解反应部位是三酯酰甘油的酯键。 水解反应为：三酯酰甘油+ 水一二酯酯酰甘油+ 脂肪酸+ 甘油( 脂肪酶做催化剂) 二酯酰甘油可以被进一步水解成单酯酰甘油和游离脂肪酸等。 甘油三酯是脂肪酶催化反应的天然底物，不溶于水，脂肪酶的酯解反应发生在油水界面 上，水溶性的酶在底物和水的界面上催化底物反应，脂肪酶对水溶性底物不起催化作用【t 3 , 1 4 。 1 2 3 脂肪酶的国内外研究进展 脂肪酶是最早研究的酶类之一。有上百年的研究历史。早在1 8 3 4 年就报道了兔胰脂肪酶； 1 8 5 4 年又报道过胃脂肪酶；1 8 7 1 年报道了植物种子脂肪酶；我国在六十年代开展了微生物脂 肪酶的研究，在1 9 6 9 年试制成功了解脂假丝酵母脂肪酶试剂； 郑毅在2 0 0 4 年全国生物技术学术研讨会上从理论上提出了脂肪酶活力测定的几种方法及 其影响因素： 付新华( 2 0 0 5 ) 等人做了大菱鲆消化酶( 蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶) 的性质研究，提 出脂肪酶活性与脂肪含量正相关的观点： 杨华1 q ( 2 0 0 6 ) 等人对几种国产脂肪酶酶学特性进行了研究，采用酸碱滴定法进行酶活 性的测定； t o l d r a t l 刀( 2 0 0 6 ) 等人研究了干腌肉制品在于燥过程中蛋白酶和脂肪酶的作用，分析了蛋 白酶和脂肪酶与终产品质量的相关性，提出脂肪酶活性的提高利于产品风味的增加，并研究 了水分活度和加工时间与脂肪酶活性的相关性； f l o r e s l l 8 1 ( 2 0 0 6 ) 等人研究了西班牙干腌火腿盐渍时间缩短对盐渍和盐渍后期蛋白质和脂 质降解的影响，提出冷冻和盐渍加工中火腿的蛋白酶和脂肪酶活性提高，在加工过程中脂肪 酶含量和脂肪酶活性没有显著的变化； 张海燕1 9 】( 2 0 0 7 ) 等人提出了油包水微乳液体系中脂肪酶活性测定的分光光度法，该方 法弥补了酸碱滴定法的缺陷； k a m m o 吼【2 0 1 ( 2 0 0 8 ) 等人研究了海龟胰脂肪酶的纯化及特性，采用橄榄油乳化液作为酶 反应底物，研究了脂肪酶的最适p h 、温度、海龟胰脂肪酶酶的抑制剂及激活剂，为本文荣昌 猪脂肪酶酶学特性的研究提供基础； 李诚2 1 1 ( 2 0 0 8 ) 等人研究了宰后肉成熟过程中的风味变化，提出脂类在脂肪酶作用下发 生水解是影响肉风味的重要因素之，为本文的荣昌猪脂肪酶的研究提供理论依据。 1 2 4 脂肪酶的应用 3 西南大学硕十学位论文 曼鼍皇曼曼曼曼皇皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇量! 毫曼曼曼曼曼曼皇曼曼! 曼曼鼍i 1 1 i ! 鼍皇曼曼曼曼詈曼曼曼毫量皇曼曼曼舅皇鼍曼曼! 蔓曼舅 自2 0 世纪8 0 年代后期，界面酶学和非水酶学的研究与应用取得了突破性的进展，脂肪 酶的众多特性正在被发现，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发，如乳制品的增香、 鱼片脱脂、食用油加工、洗涤剂添加酶、皮革毛皮脱脂、制药、化工合成、污水处理、工具 酶等多种用途；在有机相中，脂肪酶还能催化酯合成、酯交换反应、酯聚合反应、肽合成以 及酰胺合成等，是生产、医药、化工、食品和化妆品的重要原料之一f 2 2 2 3 】。 脂肪酶的用途主要有以下几个方面： l 。2 。4 1 脂肪酶在食品中的应用 ( 1 ) 脂肪酶在面类食品加上中的应用 面类制品的食感主要与小麦粉中的蛋白质、淀粉和脂肪等有关，特别是通过蛋白质的定 向和形成网眼结构产生弹性，增加面的黏弹性。在面类食品加工中，将溶解有脂肪酶的水直 接加入面粉中，将其在常温下放置一段时间进行压延处理，与添加蛋白质和多糖类等面粉改 良剂相比，产品品质会得到大幅度提高“，2 5 1 。 ( 2 ) 脂肪酶在乳品工业中的应用 脂肪酶可用于乳酯水解、包括奶酪和奶粉风味的增强、奶酪的熟化、代用奶制品的生产、 奶油及冰淇淋的酯解改性等：脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸，能赋子奶制品独特的风味； 脂肪酶释放的短碳链脂肪酸使产品具有一种独特强烈的奶风味；脂肪酸可以参与到类似微生 物反应的过程中，增加了一些新风味物质的形成；脂肪酶也可以大大改善乳品原有的风味， 促使新风味的产生，并能改进乳品的营养价值2 6 1 。 ( 3 ) 脂肪酶在食品增香中的应用 主要利用脂肪酶作用后释放出链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味、香味，增香后 的黄油用来制造巧克力、奶糖、冰淇淋、糕点等。还有用于增加干酪风味、增加人造黄油香 味、制造增香剂、缩短酿酒时间、改善酒风味等2 7 1 。 ( 4 ) 脂肪酶在油脂加工中的应用 脂肪酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油间的酯化反应，从而把油中的脂肪酸转化为中 性甘油酯，既可以降低酸值，又可以增加中性甘油酯的量，实现油脂生物精炼脱酸处理f 2 舯。 1 2 4 2 脂肪酶在纺织中的应用 织物表面脂质影响织物的柔软度、光亮度、色泽和手感。传统脂处理用化学品脱除，效 果不佳，且污染环境，成本高。脂肪酶能将植物表面脂质水解成易溶于水的脂肪酸，易于脱 除，脂肪酶和淀粉酶协同处理棉布纤维，棉布自度提高，染色瑕疵少，处理的棉布更柔软、 舒适f 2 9 1 。 1 2 4 3 脂肪酶在洗涤工业中的应用 脂肪酶有助于脂肪油渍和人体皮脂污垢的去除。由人体皮脂腺分泌的皮脂类污垢约占总 污垢的四分之三以上，仅靠表面活性剂和助剂的作用是不能完全去除的；这些残留的脂肪污 垢和空气中的氧起反应，使纤维发黄变脆，影响织物的外观和强度。将脂肪酶添加于洗涤剂 4 第1 章文献综述 中可将这些难于除去的脂类物质降解为易于除去的物质，从而提高了洗涤剂的去污效果 3 0 , 3 1 1 。 1 2 4 4 其他方面的应用【3 2 , 3 3 1 制备化工产品和试剂：利用脂肪酶能水解、合成和转化脂肪酸的作用，制备化工产品。 如从脂肪水解物中提取各种脂肪酸、二酸甘油脂、单酸甘油酯、甘油等，还可以合成类可可 酯等。 作为医药及试剂：作药物，如帮助消化、降低血脂、治疗局部炎症，还可作为临床诊断 的工具。 工具酶：利用某些微生物脂肪酶对酯键位置专一性和对脂肪酸的专一性，分析脂类( 主 要是脂肪、油和磷脂) 的组成和构型。 1 3 双水相体系 1 3 1 双水相体系的定义 双水相萃取技术( a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n ，简称a t p s ) ，又称为水溶液两相分配技 术( p a r t i t i o no f t w oa q u e o u ss y s t e m ) 是近年出现的，极有应用前途的新型生物化工分离技术3 4 1 。 双水相萃取系统是由两种化学结构不同的亲水性聚合物，或者一种亲水性聚合物和无机 盐在水中以适当的浓度形成互不相溶的两水相系统。造成聚合物的不相溶性的主要原因是聚 合物分子间的空间阻碍作用，分子间相互无法渗透，不能形成一相，从而具备分相的倾向， 在一定条件下，将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，体系就会分为两相，而且憎水 程度相差越大，分相的倾向也就越大3 5 3 6 1 。 由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作。并可借助传统溶 剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。 目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，用此法 可提取的生物酶已达数十种，部分过程已进行到中试规模，双水相萃取技术被认为是生物下 游工程中一种具有广阔应用前景的分离技术。 1 3 2 双水相体系的组成种类 根据双水相萃取体系中成相物质的不同，常见的双水相体系可以分为聚合物聚合物双水 相体系( 见表1 一1 ) 、聚合物盐双水相体系( 见表1 2 ) 、水溶性有机溶剂盐双水相体系( 见表 1 3 ) 和表面活性剂表面活性剂( 见表1 4 ) 四种【3 7 瑚l 。 5 6 西南大学硕士学位论文 表1 - 1 聚合物聚合物双水相体系 t a b l e1 - 1a q u e o u st w o - p h a s es y s t e mo f p o l y m e r p o l y m e r 聚合物l 聚合物2 聚乙二醇 聚乙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇 葡聚糖 甲氧基聚乙二醇 聚乙烯醇 葡聚糖 表1 2 聚合物无机盐双水相体系 t a b l e1 - 2a q u e o u st w op h a s es y s t e mo fp o l y m e r i n o r g a n i cs a l t 聚合物无机盐 聚乙二醇，甲氧基聚乙二醇硫酸铵硫酸镁硫酸钠 葡聚糖羟丙基葡聚糖甲酸钠甲基 甲基纤维素聚乙烯醇酒石酸钾纳 聚丙二醇硫酸钾磷酸二氢钠 表1 3 水溶性有机溶剂无机盐双水相体系 t a b l e1 - 3a q u e o u st w op h a s es y s t e mo fw a t e r - s o l u b l ep o l y m e r i n o r g a n i cs a l t 水溶性有机溶剂无机盐 异丙醇 异丙醇 异丙醇 乙醇 乙醇 乙醇 硫酸铵 硫酸铵 磷酸钾 硫酸铵 磷酸钾 硫酸锌 第1 章文献综述 表1 4 表面活性剂表面活性剂双水相体系 t a b l e1 - 4a q u e o u st w op h a s es y s t e mo fs u r f a c t a n t s u r f a c t a n t 表面活性剂l表面活性剂2 十二烷基三甲基溴化铵a t a b 十六烷基三甲基溴化铵c t a b 溴代辛基三乙基胺o t e a b 十二烷基三乙基溴化铵d t e a b 月桂酸钠 十二烷基硫酸钠 十二烷基磺酸钠 十二烷基磺酸钠 随着研究的深入，不断有新的双水相体系被研究出来，如双水相胶柬体系、由去污剂形 成的聚氧表面活性剂a 双水相体系。这些体系的发现都为拓展a t p s 的应用范围，为深入研 究其成相机理和界面特性提供了新的理论依据。 1 3 3 双水相萃取体系原理 双水相分离物质的原理与有机溶剂萃取法相似，主要基于被分离组分在两相间的选择性 分配。目标物质在双水相中受到相间电位、表面自由能、疏水作用、环境因素及物质本身对 双水相成相和分配的影响，通过选择适当的条件，就可以改变体系的分配系数【4 i , 4 2 1 。 分配系数k = c c b 公式( 1 1 ) 式中c 。，c b 分别为双水相相体系中上下相物质的浓度，单位一般为g l 。 被分配物质在双水相中的分配系数越大，物质越容易分离。分配系数主要是两相和被分 配物质的性质及温度的函数，与分配物质的浓度及两相的体积比无关。同一系线上的组成， 由于分相后两相的组成相同，所以分配系数不变，此时各相中被分离物质的总量取决于相体 积【4 3 1 。 在双水相提取过程中，目标产物的回收率用下式计算： y = r k ( i + r k ) 公式( 1 2 ) 其中，r 为上下相的体积比：k 为分配系数。 从上式可以看出，提高相比r 和分配系数k ，都可以提高回收率，在k 值一定时可以通 过寻找最合适的相比来获得理想的回收率。 用双水相萃取分离荣昌猪肉脂肪酶的试验研究中，可以用两相中单位体积的脂肪酶酶活 性的比值来计算脂肪酶的分配系数f 删。 即：k = c l c 2 公式( 1 3 ) c l 、c 2 分别为双水相相体系中上、下相脂肪酶的活性。 若荣昌猪肉脂肪酶主要分配在上相，其回收率按下列公式计算： y = r k ( i + r k ) 公式( 1 4 ) 7 西南大学硕十学位论文 其中，r 为脂肪酶在双水相体系中上、下相的体积比。 若荣昌猪肉脂肪酶主要分配在上相，其回收率按下列公式计算： y = l ( 1 + 鼬p 公式( 1 5 ) 其中，r 为脂肪酶在双水相体系中上、下相的体积比。 1 3 4 双水相分离酶的理论依据与影响分配的主要因素 关于双水相萃取方面的报道很多，但是其影响因素非常复杂，很难建立完整的热力学理 论体系来描述，当溶质进入两相后，由于静电力、疏水作用力和生物亲和等各因素的共同作 用，使其在上、下相中的浓度不同。影响生物分子分配系数的因素见表1 5 表1 5 影响被分离物质在双水相体系中分配的主要因素 t a b l e1 - 5m a i ni n f l u e n c i n gf a c t o r so fa q u e o u st w op h a s es y s t e m 双水相萃取体系中的分配系数k 服从b r o w n s t e d t 方程式 4 5 , 4 6 1 ： l n k = m 入觚公式( 1 6 ) m 一物质的分子量 入一系统的表面特性系数 k _ 波尔曼常数 t _ 一温度 由公式( 1 6 ) 可知，分配系数与物质的分子量、系统的表面特征系数、波尔曼常数和温 度等因素有关，通过改变这些因素，以达到萃取分离生物物质的目的。 一般来说，影响被分离物质在双水相体系中分配的主要因素 4 7 - 5 0 1 ： 1 3 4 1 成相聚合物的相对分子质量和浓度 成相聚合物的相对分子质量和浓度是影响双水相分配的重要因素。不同聚合物的双水相 体系显示出不同的疏水性，同聚合物的疏水性随着分子量的增加而增加，其大小的选择性 依赖于萃取的目的和方向。 1 3 4 2 电解质的浓度和种类 在双水相萃取体系中加入电解质，由于阴、阳离子在两相中的分配差异，改变体系的界 面特性，可以提高或者降低溶质在体系中的分配系数。不同电解质的正负离子在双水相体系 8 第1 章文献综述 中的不对称分配会产生不同的相间电位，也会影响被分配物质的表面电荷数及疏水性，继而 改变物质在双水相中的分配。 1 3 4 3 p h 值 体系p h 值会影响蛋白质分子可解离集团的电离度，从而改变的蛋白质的表面电荷数来影 响分配p h 值的改变也会影响溶质本身的表面电荷数，影响被分离物质在双水相体系中分配。 1 3 4 4 温度 温度的变化影响相物理性质的变化，例如物质的黏度和密度等，进而影响蛋白质的分配。 温度对分配系数的影响是通过对相图的影响间接达到的，在临界点附近，温度对相图的影响 较小，分配系数对温度的变化也不敏感，基于经济及操作的角度考虑，大规模的双水相萃取 操作一般是在室温下进行，不需冷却，而且室温更有利于蛋白质等生物活性分子的稳定性的 保持。 1 3 4 5 疏水和亲和基团 疏水基团疏水性的影响是由高聚物在疏水基上的大小和蛋白质分子疏水区域的数量及疏 水区的粘结强度所决定；亲和集团不仅能提高萃取分配的专一性，而且还能增大处理量。 1 3 5 双水相体系纯化的特点 与传统的分离方法相比，双水相以下特点： 1 3 5 1 生物相溶性高 两相中的水分含量达6 5 9 0 ，萃取是在接近生物物质生理环境的条件下进行的，不会 引起生物活性物质的失活或变性。成相物质p e g 、d e x t r a n 、磷酸盐、硫酸盐等对蛋白质、核 酸等生物活性物质无毒无害，不会引起生物活性物质失活或变性。传统的水有机溶剂体系有 较大的张力，使生物物质的结构遭到破坏，而且有机溶剂往往会引起生物活性物质的变性或 者失活，双水相萃取技术生物相溶性高，可以克服这些缺点【5 l 】。 1 3 5 2 操作条件温和，所需设备简单 整个过程在室温下进行，相分离过程温和；如果操作条件适当，分相时间很短，一般在 5 1 0 m i n 即可完全分相，从而实现目的物质的快速分离：在萃取的同时，细胞、细胞碎片、多 糖、酯等杂质可以与被分离组分的快速分离；与传统方法相比，a t p s 在收率和成本上优越很 多；与常规的固液分离方法相比，双水相萃取技术更加简单，使整个分离过程更经济5 2 1 。 1 3 5 3 调节因素多 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、p h 值和温度等均能影响被分配物质在 双水相萃取体系中的分配，所以操作容易控制。双水相萃取技术可与细胞破碎结合，经过离 心分相，既可以节省萃取时间，同时避免生物活性物质的损失。 1 3 5 4 易于放大和操作 运用化学过程中的萃取原理进行放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不明显降低， 9 西南大学硕七学位论文 目标产物在两相中的分配系数仅与分离体积有关，这一优点对工业应用有利，一般实验结果 可线性放大几十到上百倍，操作容易，适合大规模应用。 1 3 5 5 提高萃取的专一性 目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，使萃取专一性不高。双水相萃取体系将与目 标蛋白质有亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该聚合物与另一物质形成双水相萃取 体系，目标蛋白质专一性进入结合有配基的成相聚合物所在相中，杂蛋白进入另一相。 由于双水相体系具有以上特点，与传统的有机溶剂萃取体系相比较，双水相萃取体系在 生物物质的分离中有独到的优越之处。目前为止，双水相萃取体系己在生物化学、细胞生物 学、生物化工等有机物分离提纯方面得到了较为广泛的应用，如：分离提纯蛋白质、生物酶、 菌体、细胞、氨基酸、抗生素以及亲水性生物大分子等。 1 。3 6 双水相萃取技术的局限与展望 双水相萃取技术是一种前景广阔的新型生物分离技术，目前，该技术已广泛应用于众多 生物产品的分离提纯，双水相分离速度快，容易放大，在单位体积中有较高的有效成分含量， 在高价值的生物活性物质分离中已有许多成功应用的例子。 与双水相萃取体系应用过程相比，其成相机理和相界面微观特性、物质的分配原理等基 础理论部分的研究还较为薄弱，至今还未形成完整的理论，这在一定程度上限制了双水相萃 取技术的开发和应用5 甾7 1 。 目前国内对双水相体系的研究主要集中在对目标物质在两相中的分配过程及降低成相物 质的成本等宏观因素的考察；对于双水相萃取技术的流变学特性、分配原理、界面特征等微 观特性的研究工作还未深入，这在很大程度上限制了对双水相萃取体系的界面特性、成相机 理及相关分配机理的深入认识，限制双水相体系的应用。 双水相萃取技术虽然还存在很多问题，但随着对双水相研究的深入，性能优良的新型成 相物质不断被发现及相关技术的不断发展，这些问题会逐步解决，随着双水相萃取技术的不 断完善，该技术将会成为生物活性物质分离萃取的重要方法。 1 4 展望 目前，脂肪酶被广泛应用于工业生产，并在基础理论和应用研究中也有十分突出的地位。 脂肪酶在非水体系反应的研究在国外已取得突破性进展，脂肪酶的应用已深入到食品工业中 的多个领域，国内脂肪酶在非水介质中的酶促反应亦成为近几年的研究热点，并取得一些可 喜的成果。双水相萃取技术的工业化应用，对降低生化产品的成本有积极的意义，而双水相 萃取技术用于脂肪酶的研究少见报道，因此本项目的研究有较好的学术价值和应用价值。 1 0 第2 章引言 第2 章引言 2 1 研究的目的和意义 近年来人们对脂肪酶的研究取得了很大的进展，已引起了全世界的广泛关注。目前，脂 肪酶被广泛应用于工业生产，并在基础理论和应用研究中也有十分突出的地位。脂肪酶在非 水体系反应的研究在国外已取得突破性进展脂肪酶的应用已深入到食品工业中的多个领域。 随着酶学研究的进展，脂肪酶在食品中的应用将得到更大的发展，并对促进食品工业一些领 域的快速发展具有重要意义。 在脂肪酶的初步分离中，主要方法是硫酸铵沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法、 超滤法和透析法等，其中以硫酸铵分级沉淀法应用最为广泛。 硫酸铵沉淀法主要利用盐析原理，蛋白质和酶在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度的 升高而增加即为盐溶。盐溶现象主要是由于少量离子的作用，减少偶极溶质分子间极性基团 的静电吸引力，增加了溶质和溶剂之间的相互作用力的结果。 当盐浓度继续升高，蛋白质和酶的溶解度会随之下降并先后析出，既为盐析。盐析是由 于盐浓度增加到一定程度时，水的活度被降低，蛋白质表面的电荷被中和，水化膜被破坏， 蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。但是在实际操作中，经硫酸铵沉淀所收集的蛋白质与相似 蛋白质及其他物质也会被硫酸铵沉淀，使得分离效果不理想。 双水相萃取技术因诸多优点被广泛的应用于酶的分离纯化研究，双水相萃取是由两种化 学结构不同的亲水性高聚物或者一种亲水性高聚物和无机盐在水中以适当的浓度形成的互不 相溶的双水相体系。生物大分子利用其在两相间分配系数的差异来进行萃取分离。双水相萃 取技术以分离条件温和、易于操作、可调节因素多等被认为是生物下游工程中具有广阔应用 前景的分离操作技术。 由于聚乙二醇具有良好的生物相溶性，在各种聚合物中最为廉价。同时，聚乙二醇无机 盐组成的双水相萃取体系也是所有双水相体系中最为经济的体系，为聚合物聚合物双水相体 系成本的1 3 一l 5 。因此，聚乙二醇无机盐双水相萃取体系的应用最为广泛。本实验亦采用 聚乙二醇无机盐双水相萃取体系，主要考察了各因素对脂肪酶在双水相萃取结果的影响，并 研究了荣昌猪肉脂肪酶的酶学特性，旨在为双水相萃取体系和荣昌猪肉脂肪酶的应用提供部 分理论依据。 2 2 研究的主要内容 2 2 1 双水相萃取体系的构建及相图的绘制 本课题绘制p e g ( n h 4 h s 0 4 ，p e g n a 2 h p 0 4p e g n a 2 s o 。双水相相图，其中p e g 的分 西南大学硕十学位论文 子量为6 0 0 、2 0 0 0 、6 0 0 0 三种。 2 2 2 荣昌猪肉脂肪酶在双水相萃取体系中的分配行为 以脂肪酶的分配系数和脂肪酶的回收率为指标，考察成相盐的种类、0 , a - 1 4 h s 0 4