（材料学专业论文）氧化硅介孔泡沫材料的制备及其木瓜蛋白酶固定化.pdf

摘要 摘要 氧化硅介孔泡沫材料( s i l i c e o u sm e s o c e l l u l a rf o a m s ，m c f ) 是一种具有超大 介孔和三维热稳定性的新型材料，是目前所合成的硅基介孑l 材料中孔径最大的一 类材料，因其较大的孔径、孔容及特殊的窗口连接的三维结构，在对酶分子的固 定方面具有较大的应用前景。本文对氧化硅介孔泡沫材料进行了制备和结构表 征，并且以此为载体对木瓜蛋白酶进行了固定化，考察了载体的微环境和固定化 条件对酶固定化效率的影响，深入研究了固定化木瓜蛋白酶的性质和稳定性。 本文以三嵌段共聚物p e 0 2 0 p p 0 7 0 p e 0 2 0 ( p 1 2 3 ) 为模板剂、正硅酸乙脂( t e o s ) 为前驱体在酸性条件下通过水热法合成大孔径的氧化硅介孔泡沫材料。一方面， 引入1 ，3 ，5 一三甲苯( t m b ) 和氟化铵来实现孔径和窗口尺寸的调变，成功地合成了 孔径从1 2 4 到3 0 1 眦、窗口尺寸从3 2 到1 8 5n l n 的氧化硅介孔泡沫材料；另 一方面，利用接枝法以丫一氨丙基三甲氧基硅烷为有机修饰源合成了氨基修饰的 氧化硅介孔泡沫材料。 木瓜蛋白酶在不同窗口尺寸及氨基修饰的氧化硅介孔泡沫材料载体上的固 定化研究表明，酶固定化效果与载体的窗口尺寸相关，当载体的窗口尺寸与酶分 子的大小接近时，酶固定量和活力最大；氨基修饰后的载体对木瓜蛋白酶的固定 具有更大的固定化效率。酶的固定化条件优化结果显示，在p h7 0 、温度3 7 、 固定化时间6h 、给酶浓度0 6 7 m g m l 的条件下，酶的固定化效果最佳。 与游离酶相比，在最佳固定化条件下制备的固定化木瓜蛋白酶，其最适反应 温度提高了1 0 ，最适p h 向碱性方向偏移o 5 个单位。固定化木瓜蛋白酶的米 氏常数k m 为6 9 9 x 1 0 dm o l l 。在4 条件下放置6 0d 后，固定化酶的剩余活 力仍保持7 5 以上，操作八批次后，酶活保留6 0 3 。与游离酶相比，固定化木 瓜蛋白酶的p h 稳定性、热稳定性、操作稳定性和储藏稳定性都有了较大改善， 有利于酶的重复使用和储存。氧化硅介孔泡沫材料是一种良好的固定木瓜蛋白酶 的载体，显示了较好的工业应用前景。 关键词氧化硅介孔泡沫材料；固定化酶；微环境：木瓜蛋白酶：稳定性 a b s t r a c t a bs t r a c t s i l i c e o u sm e s o c e l l u l a rf o a m ( m c f ) ，an e wm a t e r i a l 谢t 1 1c o n t i n u o u s3 dp o r e s t r u c t u r ec o n n e c t e db yw i n d o w , t h el a r g e s tp o r es i z ec o m p a r e dt oo t h e rm e s o p o r o u s m a t e r i a l sa n dh i 曲h y d r o t h e r m a ls t a b i l i t y , m a yb eo n eo ft h em o s tp r o m i s i n gs u p p o n s f o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o n a sa ne n v i r o n m e n t l yf r i e n d l yb i o c a t a l y s t , i m m o b i l i z e d e n z y m ec a nc a t a l y z es o m ec h e m i c a lr e a c t i o n sh i g h l ys e l e c t i v e l ya n de f f i c i e n t l yu n d e r g e n t l er e a c t i o nc o n d i t i o n s t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so nt h ep r e p a r a t i o na n ds t m c t u r e c h a r a c t e r i z a t i o no fm c fm a t e r i a l s ，t h ei m m o b i l i z a t i o no fp a p a i no nm c f , a n dt h e p r o p e r t i e sa n dt h es t a b i l i t i e so fi m m o b i l i z e dp a p a i n s i l i c e o u sm e s o c e l l u l a rf o a m 研t l lp o r es i z er a n g i n gf r o m1 2 4t o3 0 1n l t l ，a n d w i n d o ws i z ef r o m3 2t o18 5n n l ，w a ss u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e db yt h ea c i dc a t a l y z e d s o l - g e lr e a c t i o no ft e t r a e t h o x y s i l a n e ( t e o s ) i nt h ep r e s e n c eo ft r i b l o c kc o p o l y m e r p12 3a sas t m c t u r e d i r e c t i n ga g e n t ，t r i m e t h y l b e n z e n e ( t m b ) a sas w e l l i n ga g e n ta n d a m m o n i u mf l u o r i d e ( n i - 1 4 f ) a saw i n d o ws i z er e g u l a t o r 1 1 1 ea m i n o - f u n c t i o n a l i z e d m c f ( n h 2 - m c f ) ，p r e p a r e dv i ap o s t - g r a r i n gm e t h o d 诵ma m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y l s i l a n e ( a p t m s ) a ss i l a n ea d d i t i v e ，h a db e e nd e m o n s t r a t e dt op o s s e s sad e s i r a b l e m e s o p o r o u sm u c n l r eb ym e a n so fx r d ，t e m ，f t - i ra n dn 2a d s o r p t i o n b o t hm c fa n dn h 2 m c fm a t e r i a lw e r ee m p l o y e da sc a r r i e r sf o rp a p a l n i m m o b i l i z a t i o n t h ep r o p e r t i e so fi m m o b i l i z e de n z y m ew e r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h e w i n d o ws i z eo fm c eaw i n d o ws i z en e a r l ye q u a lt ot h ed i a m e t e ro fe n z y m el e dt ot h e h i g h e s ta d s o r b e da m o u n ta n da c t i v i t i e so fi m m o b i l i z e de n z y m e c o m p a r e dt o u n m o d i f l e dm c fm a t e r i a l s ，t h ea n i n l o f u n c t i o n a l i z e dm c fw a sm o r ee f f i c i e n ti nt h e e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n i tw a ss h o w nt h a tt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o re n z y m e i m m o b i l i z a t i o na f f e c t e dt h ep r o p e r t i e sa n dt h es t a b i l i t i e so fi m m o b i l i z e dp a p i n 1 1 1 e o p t i m a lc o n d i t i o n so fp a p a i ni m m o b i l i z a t i o nc o u l d b es u m m a r i z e da sf o l l o w s ：p a p a i n c o n c e n t r a t i o n ，0 6 7m g m l ；p h ，7 0 ；t e m p e r a t u r e ，3 7 a n di m m o b i l i z a t i o nt i m e ，6 h t h eo p t i m a lp ha n dr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo ft h ei m m o b i l i z e dp a p a i np r e p a r e d u n d e rt h ea b o v eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e7 5a n d5 0 。c o m p a r e dt o7 0a n d4 0 f o r t h ef r e ep a p a i n , r e s p e c t i v e l y t h em i c h a e l i sc o n s t a n t ( 点锄) o fi m m o b i l i z e dp a p a i nw a s d i s c l o s e da s6 9 9 x1 0 dm o l lb yt h el i n e w e a v e r - b u r kp l o ta t3 7 a f t e rs t o r e da t4 f o r6 0d a y s ，t h ei m m o b i l i z e dp a p a i nr e t a i n e d7 5 o fi t sa c t i v i t y , c o m p a r e dt o5 3 6 f o rt h ef r e ep a p a i n a b o u t6 5 1 o ft h ei m m o b i l i z e dp a p a i na c t i v i t yr e m a i n e da f t e r r e p e a t i n gt h ec a t a l y s i so fc a s e i nf o r8t i m e s d u et ot h el a r g ep o r em i c r o e n v i r o n m e n t a n dt h es h i e l do ft h em e s o p o r e so fm c f , t h ep h ，t h e r m a l ，o p e r a t i o n a la n ds t o r a g e t 北京工业大学工学硕士学位论文 s t a b i l i t i e so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m eh a db e e nc o n s i d e r a b l yi m p r o v e d ，w h i c hw a s b e n e f i c i a lt ot h er e u s ea n ds t o r a g eo fi m m o b i l i z e de n z y m e s i l i c e o u sm e s o c e l l u l a r f o a mc a nb ec o n s i d e r e da se x c e l l e n ts u p p o r t sf o rp a p a i ni m m o b i l i z a t i o n ，s h o w i n ga g o o dp r o s p e c tf o ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s k e y w o r d ss i l i c e o u sm e s o c e l l u l a rf o a m ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；m i c r o - e n v i r o n m e n t ； p a p a i n ；s t a b i l i t y i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 牟弛吼梢 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：枷导师签名：# 日期：三竺社 第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 生物催化进入传统的化工领域给原料来源、能源消耗、环境保护等方面带来 了根本性的变化，通过生物催化技术，可以大大降低化学加工业的原料、水资源、 能源消耗及污染物排放。据预测，2 0 2 0 年，仅化工工业将有3 0 的生产过程为 生物催化取代，将使化工生产过程的能耗、成本及对环境的污染大幅度降低。因 此，生物催化剂是2 1 世纪化学加工业可持续发展的必备工具【l 】。 酶是重要的生物催化剂，其催化效率很高，可达到1 07 1 0 1 3 ，具有条件温和、 反应产物污染小、能耗低等特点，这是任何无机催化剂都无法比拟的优点。但酶 的化学本质是蛋白质，其最大弱点是不稳定性，对酸、碱、热及有机溶液容易发 生酶蛋白的变性作用，从而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中进行反应，会 残留在溶液系统中不易回收，造成产物分离提纯麻烦，加上酶反应只能分批进行， 难于连续化、自动化操作，这大大地阻碍了酶工程的发展应用 2 1 。为克服上述缺 点，固定化酶技术便应运而生。固定化酶技术是用固体材料将酶束缚或限制于一 定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。固定 化酶技术是酶工程的核心，它使酶工程提高到一个新水平。 与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同 时，又克服了游离酶的不足之处，呈现储存稳定性高、分离回收容易、可多次重 复使用、操作连续可控、生产自动化、连续化等优点，这扩大了酶的使用范围， 并且还具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展 的战略要求。酶的固定化是最具发展前景的生物技术前沿领域，固定化酶将广泛 应用于生物医刻3 1 、i , l 沙t 4 、化学化工【5 】、食品【6 】、环境保护【7 】等方面，将在人类 社会可持续发展中发挥重要作用。 酶工程发展的步伐，与固定化技术的提高紧紧相连。酶固定化方法及固定化 酶的性能主要取决于固定化酶载体材料的性质瞵j ，所以固定化酶载体的开发和利 用显得尤为重要，世界各国的研究者都在努力合成出具有较高酶活和稳定性的载 体。无机介孔材料具有化学稳定性好、机械强度高外，还具有较大的比表面积 ( 6 0 0 1 7 0 0m 2 儋) 和孔体积、孔径均一且可调、表面易于有机修饰等特点，酶在 介孔材料孔道中的组装成为目前国际上介孔材料研究的热点之一【9 一仉u 】。 合成出具有较高酶活的载体，找出酶活与载体微环境的关系，是解决固定化 酶活性的关键问题。针对这一问题本文利用超大介孔的氧化硅介孔泡沫材料为载 体，对固定木瓜蛋白酶进行分析，指出酶活与载体微环境的关系，为固定化酶载 体的合成与开发提供可靠的依据。 北京工业大学工学硕士学位论文 1 2 介孑l 材料简介 材料是人类社会发展的物质基础和先导，新材料的出现往往加速科技的进 步。以表面活性剂形成的超分子结构为模板，利用溶胶一凝胶( s 0 1 g e l ) 、乳化 ( e m u l s i o n ) 或微乳化( m i c r o e m u l s i o n ) 等物理与化学过程，通过有机物和无机物之间 的界面定向导引作用组装生成的一类孔径在2 - - - ，5 0n l 1 之间孔分布窄的无机介孔 材料已成为当今国际物理、化学、材料科学界中研究的热点之一【l2 1 。 分子筛最早于1 9 3 2 年由m c b a i n 提出，其最主要是叙述具有选择性系统的 材料。早期所使用的沸石( z e o l i t e ) 分子筛大多属于微孔型分子筛【1 3 】，然而，沸石 分子筛的孔道尺寸都很小( 约1 3r i m ) ，根本无法负载大体积物种或负载量太低， 有时还会导致结构的倒塌。1 9 9 2 年，美国的m o b i l e 公司的k r e s g e 和b e c k 1 4 】首 次报道合成了一类以硅酸盐为基的新颖的介孔氧化硅材料m 4 1 s ，将分子筛的规 则孔径从微孔范围拓展到介孔领域，从而拉开了介孔材料的合成、特性表征、应 用研究的序幕。这对于在沸石分子筛中难以完成的大分子催化、吸附与分离等过 程，无疑展示了广阔的应用前景【l 孓博j 。 1 2 1 介孔材料的分类 按照国际纯粹和应用化学联合会( i u p a c ) 的定义【l 引，多孔材料按孔径分为 三类：小于2 0n l t l 为微孔( m i c r o p o r e ) ，包括硅钙石、活性碳、泡沸石，沸石分 子筛等：2 0 - - - 5 0n l l l 为介孔( m e s o p o r e ) ，如一些气凝胶、微晶玻璃等；大于5 0 n l n 为大孔( m a c r o p o r e ) ，包括水泥、多孔陶瓷、气凝胶等，有时也将小于o 7 n n l 的微孔称为超微孔材料( s u p e r m i c r o p o r o u sm a t e r i a l s ) 。 介孔材料按照化学组成分类，一般可分为硅基和非硅基介孔材料两大类( 表 1 1 和表1 2 ) 。近十多年来，随着合成技术的不断创新，s b a 2 0 棚】，h m s l 2 2 2 3 1 ， m s u 2 4 2 5 1 ，k i t - 11 2 6 1 ，f s m 2 7 1 ，m c f 2 8 - 3 1 1 等硅基系列都已经被大量报道。介孔 材料骨架的化学组成不仅限于纯氧化硅，还可以是硅铝酸盐、磷酸盐、过渡金属 氧化物，甚至是i i v i 族半导体，如非硅氧化物【3 2 1 、金属硫化物【3 3 】、磷酸盐【3 4 1 、 金属 3 5 , 3 6 】以及上述硅基介孔材料的金属杂原子衍生物【3 7 3 8 1 等也已经被广泛研究。 从表1 1 中可以看出，氧化硅介孔泡沫材料( m e s o c e l l u l a rs i l i c e o u sf o a m ， m c f ) 是目前所合成的硅基介孔材料制备中获得孔径最大的一种材料，其三维的 孔结构是通过窗口相连接的。介孔材料按照孔道结构特征分类( 表1 3 ) ，一般 可分为平行排列的层状孔( 一维) ，定向排列的柱状孔( 二维) ，三维规则排列 的多面体孔( 三维相互连通) ，而无序介孔固体的孔型形状复杂，不规则且相互 连通。介孔材料的形状也有纤维状( f i b e r ) 、球形( s p h e r e s ) 、片层状( p l a t e s ) 、 棒状( r o d s ) 、螺旋形( s p i r a l s ) 、绳形( r o p e s ) 等形状。 第1 章绪论 表1 - 1 硅基介孔材料 t a b l e1 - 1m e s o p o r o u ss i l i c am a t e r i a l s c m k - 1 c m k 1 c m k 1 c m k l c m k 一1 s u n - 2 金 p t 属 a u s n 0 2 金 f e 2 0 3 属 g a 2 0 3 氧v 2 0 5 化n b 2 0 5 物 t i 石，。 z r 0 2 氧化铝 基 磷酸盐 。 c d s m c m 一4 8 s b a l m c m 一4 8 s b a - 1 5 a 1 s b a 一1 5 h m s m c m - 4 8 s b a - 1 5 c t a b a o t c t 6 h 3 3 0 s 0 3 n a + ( s h s ) c 1 2 h 2 5 0 s 0 3 n a 十( s d s ) c t a b c t a b p e o p p o p e o p e o p p o p e o c t a b 聚环氧乙烷，s d s c 。( n = 1 6 ，2 2 ) t m a c i c 1 8 e o l o 蔗糖、糠醇等 蔗糖 蔗糖、糠醇 蔗糖、糠醇 糠醇 糠醇 p r ( n h 3 ) 4 ( n 0 3 ) 2 h a u c l 4 4 h 2 0 s n c h s h ( o h ) 6 。 f e c l 3 6 h 2 0 g a 0 4 a i l 2 ( h 2 0 ) 1 2 什 v o h p 0 4 0 o 5 h 2 0 n b ( o c 3 h 7 ) 5 t i c l z r ( o p r ) 4 a l l 3 ，a 1 2 ( s 0 4 ) 3 h 3 p 0 4 , a 1 ( o c 3 h 7 ) 3 h 2 s 纳米浇注 纳米浇注 纳米浇注 纳米浇注 纳米浇注 纳米浇注 纳米浇注 纳米浇注 s + x i + , s i + s i + s i + s i + s i + 村i o n u i o s i + n 。i o ，s i + s 十i 一i l j 1 2 2 介孔材料的制备及孔径调节 介孔材料的制备方法很多，有溶胶一凝胶法、水热合成法、沉淀法、化学腐 蚀法、微波技术等合成方法，但目前应用最多的是溶胶二凝胶法和水热合成法。 3 - 北京工业大学工学硕士学位论文 溶胶一凝胶合成法是采用不同类型模板剂形成的超分子结构为模板，通过溶 胶一凝胶过程，在无机物与有机物之间的界面引导作用下，自组装成具有一定孔 径分布和孔道结构的介孔材料。水热合成法是指高温高压下在水溶液或溶剂、蒸 汽等流体中进行有关化学反应，通常结合其他合成技术来共同制备介孔材料。 表1 - 3 不同孔道结构的介孔材料 t a b l e1 - 3m e s o p o r o u sm a t e r i a l so fd i f f e r e n tp o r e s 大而可调的孔径是介孔材料合成和应用研究的重要方面之一。增大介孔材料 的纳米孔径尺寸，不仅可以扩大它对生物分子或大体积功能基团选择性进入孔道 的范围，有利于反应物和溶剂分子在孔道中的扩散，还可以更大范围地实现分子 级别的筛分，更大限度地发挥介孔材料的应用潜能。调节孔径的主要方法有： 1 ) 使用不同的表面活性剂为模板：这是控制介孔材料孔径的主要因素，可 通过改变脂肪链的长度或三段共嵌物不同链段长度来改变孔径； 2 ) 添加辅助有机物：使有机物进入表面活性剂胶束的憎水基团内部，改变 胶团的大小与形状，从而改善介孔材料的孔径及孔结构，已见报道的有醇类、醚、 羧酸、酰胺、酮类，以及非极性的有机助溶剂，如苯、甲苯、三甲苯，癸烷等； 3 ) 合成过程的影响：合成过程的条件很多，它包括反应时间、温度、溶液 的组成及p h 值、表面活性剂的萃取条件和焙烧条件等。 1 2 3 介孔材料的表面修饰 介孑l 材料的表面修饰是介孔材料合成和应用研究的另一重要方面。硅基介孔 材料的表面存在相当数量的硅醇键( s i o h ) ，即自由硅醇键、双羟基硅醇键和缔 合硅醇键，其中前两者具有较高的化学反应活性，这是表面化学改性的基础。 介孔材料的表面修饰一般都是基于介孔硅表面的s i o h 键，和含有目标官能 团的有机硅分子的s i ( o e t ) 之间的水解一缩合反应。目标官能团如烷基、硫醇、 氨基、氰基、乙烯烯丙基、烷氧基以及芳香族化合物都能引入到氧化硅介孔材 料的孔壁上【3 3 1 ，实现的方法主要有两种： 第1 章绪论 1 ) 有机硅酸盐和无机硅酸盐前驱物共聚直接形成功能化的介孔材料( 一步 法，也叫共缩聚法) ，通常使用四烷氧基硅 ( r o ) 4 s i ( t e o s 或t m o s ) 和三烷氧基 有机硅( 限o ) 3 s i r ) 共聚制备，最终保留的有机基团以共价键的形成锚定到孔壁 上。共缩聚法修饰具有不堵塞孔道和有机基团分布更均一的优点，但随着反应物 限o ) 3 s i r 浓度的增加，产物的介观有序度就会下降，并且去除模板剂的时候只 能用萃取的方法而不能用焙烧的方法。 2 ) 介孔材料合成之后再进行有机基团嫁接( 后修饰法，也叫接枝法) ，这个 过程主要是有机硅基团与孔表面的自由硅羟基进行反应，这些有机硅基团主要是 限o ) 3 s i r 型的，有时也用到c l s i r 3 或h n ( s i r 3 ) 3 型。通过改变保留的有机基团 r 来实现各种有机基团的功能化。这种修饰的方法具有介观结构不会被破坏的优 点，但有机基团在孔道内不均一分布，并且占有度较低，甚至可能导致孔道堵塞。 1 2 4 功能材料在介孔材料孔道中的组装 介孔材料的出现为主客体组装化学奠定了新的主体材料基础，利用主客体之 间的相互作用不仅可以改善客体材料的物理和化学性质，利用有序的孔道为模板 还能够制备新颖的纳米结构材料。在介孔材料中组装的客体物质可以分为金属 【3 4 】、金属配合物【4 5 1 、半导体及其它无机物【4 6 1 、有机物 4 7 1 、生物大分子【4 8 。5 3 】、聚 合物和碳【5 4 】。使组装物的前驱体进入介孔孔道的方法很多，包括离子交换、溶液 浸渍、吸附、化学气相沉积( c v d ) 、金属有机化学气相沉积( m o c v d ) 、热扩散、 前驱体原位合成等。 1 3 固定化酶 1 3 1 生物酶与酶的固定化 酶是由活细胞产生的具有活性中心和特殊构像的生物大分子，是生物催化 剂。酶的作用机制是酶能显著降低反应活化能，大大提高反应速度，它能特定地 促成某个化学反应而本身却不参加反应，许多难以进行的有机化学反应在酶催化 下都能顺利进行，因而酶在工农业生产实践中蕴藏着巨大的潜力，酶广泛应用于 工业领域( 表1 4 ) ，如食品、纺织、日用化工、环保和制药等行业。世界范围内， 每年食品、去垢剂、精细化工和诊断用酶的销售额达上百亿美元，以酶为催化剂 的新工业过程数量和酶的市场需求量将持续增加。以微生物酶为主体的酶制剂工 业开始于2 0 世纪5 0 年代，其中工业用酶约6 0 种，治疗和诊断用酶约1 2 0 种， 酶试剂达3 0 0 多种【5 5 1 。 表1 - 4 工业用酶 t a b l e1 - 4a p p l i c a t i o no fe n z y m e si ni n d u s t r y 但酶作为一种由氨基酸组成的蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，其影响 因素很多，比如物理因素( 温度、压力、电磁场等) 、化学因素( 氧化、还原、 有机溶剂、金属离子、离子强度、p h 等) 、生物因素( 酶修饰、酶降解等) 均有 可能使酶丧失生物活力。所以传统上酶的应用具有以下的缺点： 1 ) 酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶( 0 【淀粉酶、t a q 酶等) 和耐低 p h 的酶( 胃蛋白酶等) 以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等 外界因素影响下，都容易变性失活； 2 ) 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中参与反应，酶与底物和产物混在 一起，反应结束后难于回收利用，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产； 3 ) 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产 物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 为克服游离酶的上述缺点，固定化酶技术便应运而生。固定化酶具有明显的 优点：可以做成各种形状装在反应槽中，便于取出和连续、反复使用和自动化操 作；酶的稳定性提高，使用寿命延长；极易将固定化酶与底物、产物分开，提纯 工艺简化，提高产物的回收率与质量；酶的使用效率提高，成本降低等。 1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f m t 5 6 j 发现了酶的固定化现象后，科学家就开始了固定 化酶的研究工作。1 9 5 3 年德国的g r u b h o f e r 和s c m e i 也采用聚氨基苯乙烯树脂为 第1 章绪论 载体与羧肽酶、胃蛋白酶等结合制成固定化酶；6 0 年代后期，固定化技术迅速 发展起来。1 9 6 9 年，日本首次应用固定化氨基酰化酶从d l 氨基酸连续生产l 氨基酸，实现了酶应用的一大变革；1 9 7 1 年召开的第一次国际酶工程学术会议 上，确定固定化酶的统一英文名称为i m m o b i l i z e de n z y m e ；随着固定化技术的发 展，出现固定化菌体和细胞；1 9 7 3 年，日本首次应用固定化大肠杆菌菌体中的 天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产l 天门冬氨酸；1 9 7 6 年，法国首次用固 定化酵母细胞生产啤酒和酒精；1 9 7 8 年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶。 1 3 2 固定化酶的制备方法 1 3 2 1 吸附法 1 ) 物理吸附法 物理吸附法( 图1 1 a ) 是利用各种固体吸附剂将酶吸附在其表面上而使酶固 定的一种方法。物理吸附法的载体很多，无机载体有多孔玻璃、多孔陶瓷、活性 炭、酸性白土、漂白土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷酸灰石、磷酸钙、陶瓷、 金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白、纤维素衍生物等；大孔型合成 树脂等。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因 而酶活力损失很少。但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。 a ) 吸附法 a ) a d s o r p t i o nm e t h o d b ) 包埋法 b ) e n t r a p m e mm e t h o d c ) 共价偶联法d ) 交联法 c ) c o v 2 l l e mm e t h o dd ) c r o s s l i n k i n gm e t h o d 图1 - 1 固定化酶的制备方法示意图 f i g u r el 一1s c h e m a t i cd i a g r a mo f m e t h o d so f e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 2 ) 离子吸附法 离子吸附法( 也称离子键结合法) 是酶通过离子键将酶吸附于有离子交换基 北京工业大学工学硕士学位论文 的水不溶性载体的一种固定化方法。载体有阴离子交换剂( d e a e 纤维素、d e a e 葡萄糖凝胶、a m b e r l i t ei r a 9 3 、i r a 4 1 0 、i r a 9 0 0 等) 和阳离子交换剂( 羧甲 基纤维素、a m b e r l i t ec g 5 0 、i r - 1 2 0 、d o w e x 5 0 等) 。离子吸附法操作简单，处 理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是固定化的酶容易受缓冲液 影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。 1 3 2 2 包埋法 1 ) 网格型( 凝胶包埋法) 网格型( 凝胶包埋法) 是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中制成一定形状的 固定化酶的方法。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天 然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 2 ) 微囊型( 半透膜包埋法) 微囊型( 半透膜包埋法) 是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内( 通 常直径为几微米到几百微米) 制成固定化酶的方法。常用于制备固定化酶的半透 膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。 1 3 2 3 共价偶联法 共价偶联法是酶蛋白的非活力必需基团( 如c 【氨基或p 氨基，仅、p 或y 位 的羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基) 在温和的条件下通过共价键和载体形成不可逆连接的种固定化方法。共 价偶联法载体主要有：天然有机载体、无机载体、合成聚合物等，比如：纤维素、 琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 1 3 2 4 交联法 交联法是利用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联，凝集成网状结构的酶 固定化方法。参与交联反应的酶蛋白的功能团有赖氨酸的氨基、酪氨酸的酚基、 半胱氨基的巯基和组氨酸的眯唑基等。常用的双功能试剂有戊二醛( 形成s c m 圩 碱) 、异氰酸酯( 形成肽键) 、双偶氮苯( 发生重氮偶合反应) 、n ，n 乙烯双马来 亚胺( 发生重氮偶合反应) 、己二胺、顺丁烯二酸酐等。其中应用最广泛的是戊 二醛，它有两个醛基，都可与酶的游离氨基反应使酶分子交联。 表1 5 各种固定化方法的优缺点比较 t a b l e1 - 5c o m p a r a t i v ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so fm e t h o d so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 第l 章绪论 表1 5 比较了各种方法的优缺点，做出最佳选择还要依据特定的技术和资金 考虑。选择的酶最好符合下面的原则：( 1 ) 清楚酶的活性部位，避免酶的活性基 团与载体活化基团发生化学键合，使酶活性下降或者丧失；( 2 ) 酶的分子直径不 能超过介孔材料的孔径，否则酶无法进入其孔道；( 3 ) 清楚酶的理化性质，如酶 的p h 适用范围、适用温度、抑制剂等。所以可以选择木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、辣根过氧化物酶、青霉素酰化酶、脂肪酶等研究比较深入的酶类进行研究。 1 3 3 固定化酶操作遵循的原则 固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于酶固定化制备的物理、 化学手段和载体材料等多种多样，但制备固定化酶都要遵循以下几个原则： 1 ) 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶蛋白的活性中心是酶的催化功 能所必需的，酶蛋白的空间构象与酶活力密切相关，其功能基团( 游离的氨基、 羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟 基等) 位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。由于酶蛋白的高级结 构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要避免用高温、强酸、 强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，尽量采取温和的 条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。 2 ) 固定化酶应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必 须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落，酶与载体必须结合牢固， 从而使固定化酶能回收贮藏，便于反复使用。 3 ) 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高 产品的产量。固定化酶成本要低，以利于工业使用。 1 3 4 固定化酶的载体 酶的固定化是生物技术中最为活跃的研究领域之一。作为固定化酶技术的重 要组成部分，载体的结构及性能在很大程度上直接影响着所得固定化酶的催化活 性及操作稳定性。综合性能优良的载体材料的设计与制备是固定化酶技术领域的 一个非常重要的研究内容。通过对传统材料的改性和新型载体材料的研究开发， 必将促进固定化酶在各个领域的广泛应用。固定化酶的载体有天然高分子凝胶、 合成有机高分子、无机材料和复合材料四种： 1 3 4 1 天然高分子凝胶载体 天然高分子凝胶载体一般无毒性，传质性能好，但强度较低，在厌氧条件下 易被微生物分解，寿命短。常见的有琼脂、海藻酸钠等。近年来研究较多的载体 是甲壳素和壳聚糖 5 7 - 5 9 1 ，它们分子中存在氨基，既易于与酶共价结合，又可螯合 北京工业大学工学硕士学位论文 金属离子，还易于接枝改性。对蛋白质有较好的亲合性，有较高的固定化效率。 同时它们具有多孔结构，能适用于底物为粘稠溶液或大分子物质的酶的固定化。 目前己用甲壳素及其衍生物固定的酶有：葡萄糖异构酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、 乳糖酶、转化酶、b 淀粉酶、纤维素酶等数十种酶。 1 3 4 2 合成有机高分子载体 合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对 细胞活性有影响。常见的载体有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等，新载体有 p o l y ( v i n y l a l c o h 0 1 ) c r y o g e l s 、p h e n o l i c f r o m a l d e h y d e r e s i n s 、p o l y ( p o l y ( e g d m a a a m ) 及无孔p s p n a s s 微球载体等【6 仉6 1 】。 1 3 4 3 无机载体材料 无机载体材料具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、 对微生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性。早期采 用的无机载体材料有膨润土、氧化铝和玻璃等，但结合酶的能力颇低( 往往低于 1m g g 载体) 。后采用表面功能化的二氧化硅凝胶和微球、陶瓷、海藻石和大孔 玻璃等固定，但受到载体材料的孔径、比表面积、颗粒粒度等因素的限制，固定 化酶的活性难以得到很大的提高。目前，无机载体加以修饰使之与酶结合的技术 取得了重大突破，在这方面，美国的u o p 公司以氧化铝为载体，德国的m i l e s 公司以二氧化硅为载体制备固定化酶都取得了显著的成效。 1 3 4 4 复合载体材料 将有机材料和无机材料复合组成新的载体材料，以改进材料的性能。目前主 要有磁性高分子微球，既可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面引入多 种反应性功能基团，也可通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，在 外加磁场的作用下，进行快速运动或分离，因而在生物工程、生物医学及细胞学 等领域有着广泛的应用前景。国内外许多学者已经在这方面作了一些研究【6 2 拼】。 1 3 5 无机介孑l 材料作为酶固定化载体的优越性 目前，固定化技术使得酶工程的推广如同雨后春笋一般，但真正投入工业化 应用的固定酶却不多，主要原因是固定化使用的试剂和载体成本高；其次是由于 固定化效率低，稳定性差，连续操作使用的设备比较复杂。目前，人们正进一步 开发更简便、更具实用性的、更加优越的载体材料，以期有更多的固定化酶取得 工业规模的应用。 近年来，材料科学的迅速发展拓宽了载体材料固定化酶的研究，特别是以介 孔材料固定化酶形成了新的亮点。介孔材料作为酶固定化载体的优越性表现在： 1 ) 相对于微孔分子筛，介孔材料较大的孔径使其表面活性基团有较好的可 接近性，孔内可负载大体积基团，适用于体积大小范围较宽的客体分子； 第l 章绪论 2 ) 介孔材料的表面富含羟基基团，与酶分子发生氢键作用，加强载体与酶 分子的作用力，而且羟基在表面的分布及其数量可根据目标进行调变； 3 ) 具有较高的比表面积( 达1 0 0 0m 2 g ) ，理论负载量较高； 4 ) 无机介孔材料在酶催化反应过程中呈惰性，不影响催化反应； 5 ) 在理论研究方面，均一孔径有利于建立固定化酶的结构模型，表面性质 及结构的可调变性可为酶载体的分子水平设计与结构控制提供有意义的信息。 1 4 介孔材料固定化酶的研究现状 近十多年来，研究者们通过调变介孔材料的颗粒形貌、孔道结构或表面性质 来改变酶所处的几何微环境和化学微环境，改善固定化酶的稳定性、活性以及固 定化行为，并取得了一定的进展【6 5 】【7 引。 介孔材料载体的孔径尺寸对酶固定化效率、固定化酶的活力以及稳定性都有 很大影响。赵东元小组【的一6 j 曾报道分子筛颗粒及结构是影响内扩散的重要因素， 大孔和小颗粒可以使酶迅速的固定化。t a k a h a s h i 等 6 7 , 6 8 】将辣根过氧化酶固定在 m c m 4 1 、f s m 1 6 和s b a 一1 5 上，发现孔径尺寸对固定化酶的稳定性和活力有 较大影响。d e e r e 等【6 9 , 7 0 将细胞色素c 固定在商业硅胶( c o s ) 、氰基功能化的商 业硅胶( c n s ) 、m c m 4 1 和用f 1 2 7 合成的介孔材料( m p s f 1 2 7 ) 上，发现介孔材 料孔径是影响载体对酶吸附量的关键因素。h a n 7 1 】等将铁血红素氯过氧化物酶固 定在m c m 4 8 ，s b a 1 6 ，s b a 1 5 及m c f 上，发现s b a 1 6 由于其孔口较小而不 利于酶的吸附。y i u 7 2 - 7 4 1 等比较了m c m 4 1 ，m c