（制浆造纸工程专业论文）废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究.pdf

废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 摘要 废纸制浆能够缓解造纸工业的原料危机、能源危机和环境危机 三大难题，并且可以获得良好的经济效益和社会效益。在废纸漂白 过程中，由于原料中含有微生物，微生物产生的过氧化氢酶使废纸 脱墨浆过氧化氢漂白的效率低，纸浆白度提高困难。 本论文以废纸脱墨废水为原料，针对废纸脱墨系统中微生物产 生的过氧化氢酶进行了研究。对样品成分进行分析，并通过电泳对 废纸脱墨浆中过氧化氢酶和过氧化物酶进行鉴定，研究过氧化氢酶 的催化性质以及金属离子、羟胺、叠氮化合物等对过氧化氢酶活性 的影响。 在显微镜下，脱墨废水的主要含有细小纤维和油墨，未见明显 的微生物，气泡法判断碎浆工段含有过氧化氢酶，过氧化物酶活性 未检测到，可溶性蛋白含量极低。 聚丙烯酰胺电泳鉴定出废纸脱墨废水中含有过氧化氢酶，未鉴 定出存在过氧化物酶。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定废纸脱墨浆中 漂白废水中过氧化氢酶的最佳实验条件是浓缩胶为9 ，分离胶浓度 为4 ，各工段样品的点样量分别为3g l 、5 1 t l 和l0 1 t l ，在此条件下 可以得到清楚的图谱。电泳结果显示碎浆含有的过氧化氢酶同工酶 系最多，有四种，浮选工段有三种，二段浓缩检测到一种，并且不 清楚；根据酶带迁移率，分子量大小排序应为c l c 2 c 3 c 4 c 5 c 6 c 7 ， 分子量均小于2 4 0 k d a 。 使用紫外分光光度法测得碎浆工段的过氧化氢酶活性为 4 2 5 7 9 m o l m i n ，由于浮选工段过氧化氢酶活性较弱，需要对它进行 1o 倍浓缩才能够得到可靠的数据，其大小为3 2 5 g m o l m i n ，其活性 仅为碎浆工段的7 6 ，二段浓缩测量不到结果。 碎浆工段和浮选工段酶的活性特点是均在p h = 8 5 表现出较强的 活性，最适反应温度应在2 5 左右，对碱的适应性和稳定性较强， 但碎浆工段过氧化氢酶的半衰期比浮选工段的长。碎浆工段的温度 稳定性研究发现此工段的过氧化氢酶不耐高温，温度提升到2 5 以 后活性下降，但在15 随保温时间的增加，活性增强，将“储存”的 酶活表现出来。碎浆工段的过氧化氢酶表现出一定的对h 2 0 2 的耐受 力，其米氏常数( k m 值) 是19 2 9 m m ，酶被底物饱和时的反应速度 ( v m a x ) 为7 1 4 3um o l m i n 。 金属离子对碎浆和浮选工段过氧化氢酶活性的研究结果发现， m n 2 + 对酶的活性有促进作用，f e 2 + 、c 0 2 + 对酶的活性有较强的抑制作 用，c u 2 + 抑制作用温和，b a 2 + 和a l ”在低浓情况下有微弱的激活作用， 高：浓时对活性抑制作用较明显，k + 、n a + 、c a 2 + 对酶的活性没有作用， f e 3 + 对酶活性影响具有典型性过氧化氢酶的特点。 在有机溶剂中过氧化氢酶活性有一定的降低，但仍表现出单工 能过氧化氢酶的特点。结合过氧化物酶活性测量和鉴定，确定了脱 墨浆中过氧化氢酶是由单工能过氧化氢酶组成的酶系，不存在过氧 化物酶。 在对过氧化氢酶活性抑制的研究发现羟胺、叠氮化合物、金属 螯合剂对过氧化氢酶活性有强烈的抑制作用。 关键词：废纸脱墨，过氧化氢酶，活性 s t u d yo nc a t a l a s ei nd e i n k i n gp u l p a b s t r a c t w a s t ep a p e r p u l p i n g n o to n l yc o u l de a s e dt h ec r i s i so fr a w m a t e r i a l s ，e n e r g yc r i s i sa n de n v i r o n m e n t a lc r i s i s ，b u ta l s oh a v eag o o d e c o n o m i cr e t u r n sa n ds o c i a lb e n e f i t s r a wm a t e r i a l s c o n t a i n i n g m i c r o b e sw h a tb r i n gc a t a l a s et ow a s t ep a p e r c a t a l a s em a d el o w e f f i c i e n c yo fh y d r o g e np e r o x e db l e a c h i n ga n dw h i t ep a p e rd i f f i c u l tt o i m p r o v e t h i st h e s i s s t u d yo nc a t a l s ew h a tw a sp r o d u c eb ym i c r o b e si n d e i n k e dp u l p 。t h es a m p l ew a sa n a l y s e d c a t a l a s ea n dp e r o x i d a s ew a s i d e n t i f i e db ye l e c t r o p h o r e s i s c a t a l y t i cp r o p e r t yo fc a t a l a s ew a ss t u d i e d a n dt h ef a c t o r sw h i c hw o u l da f f e c t e dc a t a l a s ea c t i v i t ys u c ha st h e 、m e n t a li o n s ，h y d r o x y l a m i n e ，a z i d ea n ds oo n t h es a m p l em a i n l yc o n t a i n e df i n e sa n di n k ，i td i d n to b s e r v e m i c r o b e sb ym i c r o s c o p e t h er e p u l p i n gs t a g ew a si d e n t i f i e dc a t a l a s eb y b u b b l i n gt e s t 。a c t i v i t yo fp e r o x e d a s ew a sn o tt e s t e dt h er e s u l t s t h e s o l u b l ep r o t e i ni se x t r e m e l yl o w c a t a l a s eo fw a si d e n t i g i e db yp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s a n d p e r o x e d a s e w a sn o tt e s t e d t h e o p t i m u m c o n d i t i o no f p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sw a st h a t ，t h ei s o l a t i o ng e lw a s9 a n dt h ec o n c e n t r a t i o ng e lw a s4 ，e a c hs t a g es a m p l ew a s3l x l 、5p la n d 1o “li nt u r n a c c o r d i n gt or e s u l t so fi d e n t i f i c a t i o n ，t h e r ea r e6e n z y m e b a n d si np r o d u c t i o ns y s t e m sa n de a c hs e c t i o nh a sd i f f e r e n te n z y m eb a n s t h eo r d e ro fm o l e c u l a rs i z ew a scl c 2 c 3 c 4 c 5 c 3 c 4 c 5 c 6 c 7 ，脱墨浆生产系统中的过氧化氢酶分子量均小于 2 4 0 k d a 。要准确测量各同工酶的分子量大小，须凝胶等电聚焦技术做进一步深 入研究。 3 2 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 3 2 6 聚丙烯酰胺电泳鉴定过氧化物酶 使j 扫聚丙烯酰胺电泳鉴定结果如图3 1 l 所示 碎浆 t 段 * 选= m 缩 斟3 - 1 1 过氧化物酶监定结果 f i 9 3 - 1 it h er e s u l to fp e r o x i d a s ei r t d e t i f l c a t i o n 从图3 1 1 _ 口j 以看到各丁段样品的电泳路径r 倒下黑色印记，这生要是由 于样品离心处理后仍有油景粒子残舟，在电泳过程中被浓缩，留下深色的痕迹。 如果样品中存在过氧化物酶，凝胶电泳上应m 现红褐色酶带，据此初步可判断 样品- p 不含确过氧化物酶，样品巾的过氧化氢酶很可能足单功能型过氧化氢 酶。通过染色，聚丙烯酰胺电泳没有鉴定出过氧化物酶的酶带，其中的原州可 能有以f 几点。 第一，w i n t e r h a l t e r 研究发现，过氧化物酶不仅能够与h 2 0 2 反应，还能够 对术素进行氧化降解，其中锰过氧化物酶、木素过氧化物酶分别能够对酚型、 非酚型的木素单元进行氧化降解，在降解过程巾，过氧化物酶由于接受术素提 供的电子，发生了以f 反应”，。 过氧化物酶+ 一( ) 。h 斗复台物 ( 3 1 ) 复台物+ 木素_ 过氧化物酶十被氧化的术索十o h 一 ( 3 - 2 ) 冈此过氧化物酶可能在碎浆工段与木素反戍，在反应过程r r 】，其活性逐步 被消耗，圜此鉴定不出过氧化物酶，也罔此在先前的样品成分分析中过氧化物 酶的活性检测不。 第，根据224 的可溶性蛋白含量的检测结果，各工段的蛋白含量都很 低，蛙高含量仅32 5 8 8 “g m l ，二段浓缩检测币到结果，由于可溶性蛋白含量 在定程度上可以反映出具有生命物质的量，因此可以推测出具有生命活力的 生物极少，这些少最的微t 物面对刷围环境突然增大的过氧化氢，会由于环境 3 陕西科技大学硕士学位论文 胁迫分泌过氧化氢酶的量多些，过氧化物酶的量会少一些，因此可以鉴定出 过氧化氢酶，但过氧化物酶由于它的量很少，可能不在测量范围内，所以鉴定 不出结果。由于得不到确切证明废纸脱墨浆含有过氧化物酶的结果，因此可以 考虑忽略过氧化物酶对废纸脱墨浆过氧化氢漂白的影响。 第三，虽然过氧化氢酶和过氧化物酶都是生物体系用于消除自身过氧自由 基，防止自身氧化衰老的重要酶。但两种酶的反应机理是不同的。过氧化氢酶 以两分子h 2 0 2 为底物，催化一对电子的转移，形成一分子水和一分子氧气。 过氧化物酶则需要借助其它的电子供体，在过氧化氢同时存在的情况下，催化 一个电子的转移将其还原为水，或者将有机过氧化物( r o o h ) 还原为有机氢 氧化物( r o h ) 。过氧化物酶虽然可以催化h 2 0 2 ，但催化效率相对较低。并且 由于它的主要生物学功能是清除脂质氢过氧化物，只有在过氧化氢酶含量很少 或者h 2 0 2 浓度很低的情况下，才替代过氧化氢酶清除h 2 0 2 ，减轻有机氢氧化 物对机体的损伤，参与或调节其它酶的生物合成。因此废纸脱墨浆中的过氧化 物酶较难检测出。 综上所述，可能由于废纸脱墨系统中过氧化物酶含量很少，无法鉴定出过 氧化物酶，所以导致废纸脱墨浆中过氧化氢无效分解的生物原因是过氧化氢 酶。 3 4 小结 使用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定出各工段废水含有过氧化氢酶，适合漂白废 水中过氧化氢酶的最佳实验条件是浓缩胶为9 ，分离胶浓度为4 ，各工段样 品的点样量分别为3nl 、5ul 和10l al ，在此条件下可以得到清楚的图谱。 电泳结果显示碎浆含有的过氧化氢酶同工酶系最多，有四种，浮选工段有三种， 二段浓缩检测到一种，并且不清楚；根据酶带迁移率，分子量大小排序应为 c 1 c 2 c 3 c 4 c 5 c 6 c 7 ，分子量均小于2 4 0 k d a 。电泳鉴定出各工段样品中不 含有也可以使过氧化氢分解的过氧化物酶，据此可以判断出由微生物产生的过 氧化氢酶是导致过氧化氢无效分解的主要因素之一。 3 4 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 4 过氧化氢酶催化性质的研究 过氧化氢酶催化性质主要是研究采集来样品的基本活性，p h 、温度等影响 酶促反应速度的影响条件以及k m 和v m a x ，为酶的作用机制提供有价值的信 息，有助于确定酶作用的最适条件，并且为今后应用抑制剂做基础性质的研究。 4 1 原料与实验方法 4 1 1 原料 采用第二章实验所采用的原料。 4 1 2 设备、仪器及实验药品 4 1 2 1 设备与仪器 仪器名称 紫外分光光度剂 冷冻离心机 精密恒温水浴锅 精密p h 仪 电子天平( 5 0 0 9 ) 4 1 2 2 实验药品 型号 d r 4 0 0 0 t g l 2 0 m w 2 0 1 p h s 3 8 m p 2 0 0 a 生产厂家 美国h a c hc o m p a n y 湖南仪器仪表总厂 上海申生科技有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海精密科学仪器有限公司 透析袋：c e l l u l o s et u b i n gs i z e ：2 0 3 2 ( u n i o nc a r b i d ec o r p ) 、碳酸氢钠、碳 酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、h 2 0 2 ，3 0 ( v v ) 等以上均为分析纯。 4 1 3 实验方法 4 1 3 1 过氧化氢酶活性的测量 反应体系中包括样品2 0 i t l ，0 1mp h 值为8 4 9 的n a h c 0 3 - n a 2 c 0 3 缓冲液 l8 0 1 a l ，3 0 m mh 2 0 2 溶液1 0 0 9 l 。以煮沸后的样品替代测试样品溶液作为空白对 照，以消除样品中可能存在的能够使促使过氧化氢分解的物质，并且消除一些 在2 4 0 n m 有吸收的物质对结果的干扰。测试条件为1c m 比色杯，2 5 ，以2 4 0 n m 下体系吸光度的下降来衡量过氧化氢的酶促降解速度。以h 2 0 2 溶液的加入启 动酶促反应，每隔5 s 读取一次吸光度值，一般持续进行1m i n 后停止测定，以 3 5 陕西科技大学硕士学位论文 反应的线性范围( 一般为反应起始后的3 0 s ) 计算过氧化氢酶的活性【。2 1 。 酶活单位( 1 u ) 定义为每分钟降解1 t m o lh 2 0 2 ( 1 p m o l m i n ) 的酶活力。 过氧化氢酶活性= 垒丝羔d 垒专翼罟鑫篱鬟纂学 c4 - ， 式中。 3 6 m 1 c m h 2 0 2 在2 4 0 n m 下的摩尔消光系数。 么o d 2 彳d 2 4 0 n m 下线性反应时间内，样品与空白样相比后的吸光度变量 厶r 线性反应的时间 4 1 3 2 测量过氧化氢酶活性最佳浓度的选择方法 在4 的温度下，使用冷冻离心机对样品以8 0 0 0 r m i n ，离心处理3 0 m i n ， 再用透析袋( m w c o12 0 0 0 14 0 0 0 ) 将离心处理后的上层清夜分别浓缩至原体 积的1 2 、1 4 、i 6 、1 8 、1 1 0 、1 12 、1 1 4 、1 1 6 ，浓缩后的样品为测试样。 在温度2 5 ，p h 值为7 的条件下采用4 1 3 1 中的方法测试各样品不同浓缩倍 数的酶活。 4 1 3 3 过氧化氢酶半衰期的测定 样品以4 、4 0 0 0 r r a i n ，离心处理3 0 m i n ，取上层清夜为测试样。在缓冲 溶液p h 为7 的n a h c 0 3 n a 2 c 0 3 缓冲溶液下采用4 1 3 1 中的方法测定酶活， 反应体系于2 5 下保温，并每隔一个小时测定残余酶活， 4 1 3 4 过氧化氢酶最适反应p h 及p h 稳定性的测定 配制p h 梯度缓冲液：5 0 m mn a 2 h p 0 4 - k h 2 p 0 4 缓冲溶液( 6 - 9 ) ，5 0 m m n a 2 c 0 3 n a h c 0 3 缓冲溶液( 9 - 11 ) ，5 0 m mn a o h k c l 缓冲溶液( 11 1 4 ) 。配 方见表4 1 到表4 3 。 表4 1n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲溶液 t a b 4 - 1n a 2 h p o n - k h 2 p 0 4b u f f e r 3 6 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 2 5 各p h 值下测定酶活；或lp l 酶液加4 9 9 l 相应p h 值浓度缓冲液后于 2 5 下放置6 0 m i n ，加入1 5 0 p , l5 0 m mn a 2 c 0 3 - n a h c 0 3 缓冲溶液( 8 4 9 ) m m 及 1 0 0 l 底物( p h 8 4 9 ) 采用4 1 3 1 中的方法测定残余酶活。 4 1 3 5 过氧化氢酶温度和温度稳定性的测定 设定反应温度梯度，5 0 m mn a h c 0 3 n a 2 c 0 3 缓冲溶液( p h 7 ) 下采用4 1 3 1 中的方法测定酶活，反应体系于各温度下预热l m i n - 或于各温度下保温10 ， 2 0 ，3 0 m i n ，恢复至2 5 并保温1m i n 后测定残余酶活。 4 1 3 6 k i n 及v m a x 的测定 以5 0 m mn a h c 0 3 一n a h c 0 3 缓冲溶液( p h 8 5 ) 配置不同浓度的底物，分 别为2 5 m m ，3 3 m m ，5 m m ，7 5 m m ，1 0 m m ，1 2 5 m m ，1 5 m m ，3 0 m m ，4 0 m m ， 5 0 m m ，6 0 m m ，7 0 m m ，8 0 m m ，2 5 下采用4 1 3 1 中的方法测定各底物浓度 所对应的酶活。求出反应速度与底物浓度的对应值，用双倒数作图法求出米氏常 数( k m ) 和最大反应速度( v m a x ) 。 4 2 结果与讨论 4 2 1 过氧化氢酶活性样品最佳浓度选择 测量过氧化氢酶活性时，要选择合适的样品处理方法以保证样品中的过氧 化氢酶活性在仪器的检测范围内，如果不在仪器的检测范围内，检测结果与真 实值相差较大，因此结果的真实有效。对各工段样品进行浓缩处理后所测酶活 3 7 陕西科技大学硕士学位论文 如表4 4 和4 5 所示。 表4 4 碎浆工段样品不同浓缩倍数的酶活 t a b 4 - 4e n z y m ea c t i v i t yo fp u l p i n gs e c t i o nb yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nm u l t i p l e 由表4 4 可以看出碎浆工段样品在l 2 倍的浓缩倍数下过氧化氢酶活性测 量结果稳定，在4 8 倍的浓缩倍数下，不仅测量结果偏高，而且不稳定。因此 在测量碎浆工段样品中过氧化氢酶的活性时，不浓缩样品，直接测量离心处理 后样品的活性。 表4 5 浮选工段样品不同浓缩倍数的酶活 t a b 4 - 5e n z y m ea c t i v i t yo ff l o t a t i o nb yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nm u l t i p l e 由表4 5 知，浮选工段样品浓缩倍数在1 - 6 倍的范围内过氧化氢酶活性测 量值较高，而且不稳定性。当倍数大于1 2 倍时测量结果也不理想，只有在对 样品进行8 12 倍浓缩时，样品的测量结果能够稳定在3 2um o l m i n 左右。因 此为保证结果的准确性适宜采用1o 倍浓缩后的样品测量浮选工段过氧化氢酶 的活性。 二段浓缩工段是废纸浆上纸机前的最后一个制浆工段，此工段过氧化氢酶 的含量非常少，其活性不在仪器检测范围内，因此从此工段采集来的样品只有 在高倍的浓缩情况下才能测得到过氧化氢酶的活性，测量结果波动很大。考虑 到此样品中含有其它让过氧化氢分解的成分，对酶活性的检测结果造成干扰， 使研究结果不具备严密的科学性，因此在后续的研究过程中尽量避免对此工段 过氧化氢酶活性的测量，并认为此工段的过氧化氢酶活性为零。 4 2 2 各工段样品过氧化氢酶活性测量 由图4 1 可以看出碎浆工段过氧化氢酶活性为4 2 5 7um o l m i n ，活性最高， 浮选工段过氧化氢酶活性为3 2 5um o l m i n ，仅为碎浆工段的7 6 ，说明碎浆 工段的过氧化氢酶问题最严重，浮选工段的过氧化氢酶问题较轻，要解决脱墨 系统中过氧化氢酶的问题必须从碎浆工段入手。 碎浆工段过氧化氢活性最强，到浮选工段后酶的活性迅速下降，直到二段 浓缩测不到活性的现象可能由以下三个原因导致。 3 8 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 篁 莒 。 量 。 掣 烬 精 r 一1 i ； i li li i1 ：i j j j e 一。一一 碎浆工段浮选工段二段浓缩 图4 - 1 各工段过氧化氢酶活性 f i 9 4 1c a t a l a s ea c t i v i t yi ne a c hs t a g e 第一，寄生在废纸原料中的微生物是造成废纸脱墨过程中过氧化氢酶问题 的主要原因。这些微生物来源复杂，在废纸中大量繁殖。进入碎浆工段后，在 水利碎浆机的机械作用，强碱和高温的环境下，这些微生物大量死亡，其体内 和体外的过氧化氢酶使废纸浆中游离的过氧化氢酶浓度迅速提高，导致碎浆工 段过氧化氢酶问题最严重。 第二，造成过氧化氢酶活性随着废纸脱墨工艺的深入活性降低的现象是由 于碎浆工段结束后，漂白废水比较脏，废纸带来的过氧化氢酶大部分溶解在此 工段的废水中，所以此工段过氧化氢酶问题最严重。浆料经过高浓除渣器和初 筛处理后一部分废水排出制浆系统进入废水处理系统。浆料变得更干净，残留 在浆料中的过氧化氢酶减少，因此浮选工段的过氧化氢酶活性较低。之后，浆 料经过反复地洗涤、浓缩处理，到达二段浓缩时，含过氧化氢酶就少，其活性 低于仪器的检测范围。 第三，在通常情况下过氧化氢酶比较稳定，当浓度变特别低时，过氧化氢 酶分子离解为亚甲基，容易失活。根据浮选工段可溶性蛋白含量测量结果可知 其中的过氧化氢酶含量极少，酶的稳定性变弱，一部分活性丢失，因此碎浆工 段过氧化氢酶活性与浮选工段相比降低幅度大。 根据以上分析，碎浆工段过氧化氢酶的含量最高，在该工段对过氧化氢酶 活性进行抑制能够取得最佳结果。 4 2 3 过氧化氢酶的半衰期 过氧化氢酶是一种稳定性比较强的酶，本实验研究了碎浆和浮选工段中过 3 9 o o o o o o o o o 0 邪 如 如 笃 如 m 5 陕西科技大学硕士学位论文 氧化氢酶的半衰期，结果见图4 2 和图4 3 。 毒 掣 j g 靛 翼 掣 烬 靛 霉 2 02 53 03 54 0 时间1 i 图4 2 碎浆工段过氧化氢酶活性变化 f i 9 4 - 2c h a n g e so fp u l p i n gs t a g ec a t a l a s ea c i t i v t y 01234567 时网t 图4 - 3 浮选工段过氧化氢酶活性变化 f i 9 4 3c h a n g e so ff l o t a t i o ns e c t i o nc a t a l a s ea c i t i v t y 由图4 2 可见碎浆工段的过氧化氢酶具有较强的稳定性，其活力在1 2 个 小时内仍可以保持9 0 以上，而且活性损失缓慢，碎浆工段样品在保温1 2 个 小时后活性下降变得迅速，直到保温3 5 h 后，相对活性降低到大约5 0 。碎浆 工段中的过氧化氢酶所表现出的这种较长的半衰期和较强的稳定性与极端过 氧化氢酶相似，因此导致碎浆工段过氧化氢无效分解的微生物很可能是种极端 生物。目前造纸化学品没有可以直接抑制过氧化氢酶的活性，在实际生产中需 加 的 的 加 o 1 1 加 的 加 o 1 l 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 要跃时间地提高过氧化氢的使用量，囡此这种较长的半衰期对废纸漂白是不利 的。 由图4 - 3 可知浮选工段的过氧化氢酶在6 个小时后就达到了他的、 衰期， 说明它也具有一定的稳定性，这种稳定性比碎浆t 段的过氧化氢酶弱。一方面 足由十此工段的过氧化氢酶含量较低，另一方面是由于低浓度下过氧化氢酶不 稳定，凼此半衰期比碎浆_ t 段要短很多，对废纸脱墨的负面影响小。 4 2 4 过氧化氢酶最适反应p i t 值及p l i 稳定性 2 5 下碎浆工段过氧化氢酶的d h 值曲线见图4 - 4 。 4681 0 1 21 4 d h 图4 - 42 5 碎莱工段过氧化氢酶活性口h 依赖曲线 f i 9 4 - 4d hd e p e n d e n c eo f p u l p i n gs e c t i o ne a t a l s ei n2 5 由图4 - 4 可知该酶在p h 45 5 1 3 】9 范围内均显示活力，p h 值在65 92 范围内表现出较高的活性，当p h 为85 时达到最高催化活力，这反映r 碎浆 工段产生过氧化氧酶微生物在碱性环境f 生长。这是由于目前纸张_ 夫多采用中 性或弱碱性抄纸，废纸的p h 值在贮存的过程中会在70 左右偏碱性变化，这 些微生物在弱碱环境f 生存崮此它较强活性表现在中性到碱性范围。当废纸进 入碎浆机开始脱墨后，p h 值升高，其所古的微生物随口h 的变化引发其时环境 产生应激反应分泌过氧化氢酶以保护其机体生命，因此它的最高活性在 p h 85 。 由于在废纸中寄乍的微生物种类较多，同此过氧化氢晦相对活性与p h 值 戈系没有呈现比较有规律的变化，酶相对活性随p h 值变化的过程中存在拐点， 而且拐点数量较多。在嘲3 1 4 除了过氧化氢酶达到最丈活性的拐点外其有7 个 j 点。 如 鲫 如 如 0 毒掣烬智霉 陕西科技大学硕士学位论文 2 5 下碎浆工段过氧化氢酶对p h 稳定性，如图4 - 5 5 所示 12 0 1 0 0 耋8 0 篓6 0 霉4 。 2 0 0 一，r ， 4 681 01 21 4 p h 值 图4 - 52 5 碎浆工段过氧化氢酶活r 陛p h 稳定- 睦 f i 9 4 5p hs t a b i l i t yo f p u l p i n gs e c t i o ne a t a l a s ei n2 5 由图4 - 5 知p h 值在72 4 9 1 9 范罔内碎浆t 段过氧化氢酶表现了良好的稳 定性，2 5 下育温6 0 m i n 后基本没有酶活损失，此外该酶的半衰期为3 5 小时 在2 5 、p r i g5 条件下放置3 个小时后能保持1 0 0 的活性，这种对碱的适应 性和稳定性是碱性过氧让氢酶的典型特点特征之一。碎浆工段过氧化氢酶表现 出来的这种在弱碱情况下的较高活力和稳定性是与产生它的微生物的生存环 境足分不开的。微生物这种对碱性环境的适应性导致碎浆工段过氧化氢酶的生 物特点具有碱性过氧化氢晦的特点。 根据碎浆工段过氧化氢酶对酸的敏感性，废纸浆在漂白前进行酸预处理， 可以降低过氧化氢酶的危害，这类药品最典型的是过醋酸。过醋酸不仅具有较 强的氧化性，使蛋白质氧化变性，而且可以将浆料的d h 值降低，显酸性，但 这种方法操作麻烦，需要的药品种类多，因此这种方法没有被广泛应用。 2 5 r 浮选工段过氧化氢酶的的p h 值曲线见图4 - 6 。在图4 - 6 中浮选工段 过氧化氢酶活性p h 依赣曲线明显比图4 - 4 中碎浆丁段的d h 依赖曲线要平滑， 这不仅由于浮选工段的漂白废水要比碎浆t 段干挣，而且因为碎浆工段的白水 没有进入此工段，它不受碎浆工段的过氧化氢酶影响。此工段出现的过氧化氢 酶是废纸进入脱墨系统后产生的。浮选工段过氧化氢酶的活性在p h - 85 时表 现出它的最大活性在p h 值在45 65 的相对活性变化不大，而且浮选工段 过氧化氢酶活性在碱性范围内相对活性变化速度没有在酸性范围内变化的快， 这说明浮选工段产生的微生物也比较适宜于碱性条件此类生物具有极端生物 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 的特点 1 1 0 1 0 0 蛔 蛭6 0 麓 霉4 0 0 4681 01 21 4 d h 图462 5 浮选工段过氧化氢醇活性p h 依赖曲线 f i 9 4 6p hd e p e n d e n c eo f f l o t a t i o nc a t a l s e i n 2 5 2 5 下浮选工段过氧化氢酶对p h 稳定性，如图4 - 7 所示。 12 0 1 0 0 z 8 0 蟊 蛭6 0 麓 霉4 0 2 0 81 0l 二1 4 d h 图4 - 72 5 碎泉工段过氧化氢酶活性口h 稳定性 f i 9 4 - 7p rs t a b i l i t yo f f l o t a t i o nc a t a l a s e i n2 5 从浮选丁段过氧化氢酶活性p h 稳定变化曲线来看，过氧化氢酶活性没有 较强的稳定性，它在p h 值在45 65 和1 0 1 3 范围内表现出对酸和碱出较强 的敏感性，其相对活性均低于4 0 ，其活性在p h 65 1 0 内较强，在p h 85 时 达到最大活性，这再次证明，浮选工段的微生物较适宜弱碱性，它产出的酶也 在这个p h 范围内表现出较强的活性。 陕西科技大学硕士学位论文 4 2 5 过氧化氢酶最适反应温度和温度稳定性 碎浆工段过氧化氢酶最适反应温度关系见图4 8 。 乎 习 烬 蛮 霉 l o3 0 4 0 t 1 c 7 0 图4 8 碎浆工段过氧化氢酶活性温度依赖曲线 f i 9 4 - 8t e m p e r a t u r ed e p e n d e n c eo fp u l p i n gs e c t i o ne a t a l a s e 温度在15 - 2 5 范围内，酶活随着温度的升高而升高。这是由于随着温 度的升高使底物的能量增加，分子碰撞的概率增加，从而使反应速率加快，碎 浆工段过氧化氢酶在2 5 时达到了最高催化活力。随着温度的提高，蛋白质逐 渐变性，酶的活力逐渐失去。因此碎浆工段的过氧化氢酶从2 5 之后随着温度 的升高酶活下降，至6 5 时完全失活，在下降过程中下降趋势较缓慢，说明此 工段的过氧化氢酶对温度有一定的稳定性。因此当废纸脱墨过程中如果过氧化 氢酶问题发生，它不会在短时间内解决。 对碎浆工段过氧化氢酶温度温度性研究过程中发现在低温经过保温处理 后样品中的过氧化氢酶活性有了一定程度的提高。如图4 9 所示，在2 0 时， 温育1 0 分钟过氧化氢酶相对活性为9 6 ，温育2 0 m i n 相对活性为1 0 2 7 ，温 育3 0 m i n 相对活性升高到10 5 3 ，这种现象在一种热碱稳定的过氧化氢酶有 过描述，根据他们的解释，这可能是由酶的存储造成的，当酶从4 的保存温 度转入测定温度是存在一个从低活态到高活态的过程，该过程和测定温度、酶 的最适反应温度及酶的耐热性有关，若测定温度为酶的最适反应温度，那么经 过较长时间的活化，酶分子的活性得到提升。由于本实验测得的结果与这种热 碱稳定的过氧化氢酶相比，活性增加没有那种酶的多，据此推测，碎浆工段的 过氧化氢酶最适宜的反应温度应该是在2 0 左右，这与废纸贮存的温度条件相 一致，在此工段出现的过氧化氢酶应该是由废纸带来的。 如 o 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 蟊 蜂 莨 粤 盈育i m i l 盈育：0 j u i n 温育3 0 j n m 图4 - 9 碎浆r 段过氧化氢酶活性温度稳定性 f i 9 4 - 9t e m p e r a t u r es t a b i l i t yo fr e p u l p i n gs t a g ea t a l a s e 如同4 - 9 所示过氧化氢酶于2 5 温育2 0 m i n 后活性开始丧失，3 0 r a i n 后残 余酶活5 6 ，至3 0 时，温育1 0 m i n 可使酶活性丧失4 4 3 0 m i n 后残余酶活 3 5 。，至5 0 。c 时，1 0 r a i n 的温育可导致酶蛋白的完全失活。说明碎浆工段的过 氧化氢酶具有一定的热敏感性( t h e r m o l n s t a b i l l t v ) 。据报道经过螺旋挤压机后 的残余酶活为零他们发现脱墨系统q 的过氧化氢酶在7 5 庄右仍然能够表现 出酶的活力，这个结果与奉实验结果不同，说明取样地点不同，过氧化氢酶产 生的原因也小周，凼此它们的生物特点也不同。 4 2 6 动力学参数k m 及y m a x 根据米氏方程的倒数形式，见公式2 3 就得到rl i n w g a v e r b u r k 双倒数 作图法】。 ! ：! 生。三十( 4 2 ) vv m a xsy m a x 式中： k m 米氏常数 卜一底物浓度 卜一反映速度 哳f 口j 一一最大反应速度 使用l i n w e a v e r b u r k 般倒数作圈法可以求酶的眷动力常数。由于在 l i n w e a v e r b u r k 般倒数图r ，根据样品在不同浓度底物得到的变化趋势得到回 归方程，回n i 方程所在的直线与横坐标和纵坐标的交点就是酶的各动力常数的 孙 钟 功 0 陕西科技大学硕士学位论文 倒数，即该直线纵截距= l v m a x ，横轴截距= 一1 k i n 。按照以上的基本公式，。 据此就可以算出过氧化氢酶对底物h 2 0 2 的v m a x 和k m 。 测定v m a x 可以了解酶的催化反应能力，k m 表现特定酶种类特点。而且 v m a x 随酶的浓度变化而变化，k m 为所观察系统的特征常数，不随酶浓度改 变，因而可以用于鉴别特定的酶。 过氧化氢是一种弱氧化剂，它也是一种具有高活性的氧化物质，在一定浓 度下它会氧化过氧化氢酶，使其变性，因而变性。因此本实验先研究了不同的 底物浓度对碎浆工段漂白废水中过氧化氢酶活性的影响。 参 掣 烬 蛮 嚣 1 2 0 o2 04 06 08 01 0 0 过氧化氯浓度l n m 图4 1 0h 2 0 2 浓度对碎浆工段过氧化氢酶活性的影响 f i 9 4 10e f f e c to fh 2 0 2c o n c e n t r a t i o no n t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fc a t a l a s ei np u l p i n gs e c t i o n 由图4 10 可以看出，当h 2 0 2 浓度在对样品测试的2 5 8 0 r a m 范围内，碎 浆工段过氧化氢酶活性随着底物浓度的增加而提高，并且在0 2 5 5 m m ， o 7 5 - 15 m m 这两个区间内呈线性增加。当底物浓度在l5 8 0 r a m 范围内时，过 氧化氢酶活性的变化趋势没有按照线性增加，其活性增加趋势缓慢，这说明了 h 2 0 2 对过氧化氢酶的活性降低有一定的作用。由于出现在碎浆工段加入h 2 0 2 用来对废纸浆的漂白，采集到的样品已经受到h 2 0 2 的作用，导致此工段出现 的过氧化氢酶具有一定对h 2 0 2 的耐受力，因此在检测范围内，过氧化氢酶一 直保持其活性。 鉴于过氧化氢酶和其底物之间这种随底物浓度增加其活性增加的关系， a e b i 认为改种氧化还原酶的动力学行为并不遵循常规的动力学方程，由于过氧 化氢酶不可能被其底物饱和l 。1 。一般所观察到的表观饱和现象只是高浓底物造 加 o 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 成的氧化抑制作用【。5 】。h o c h a m a n 和s h e m e s h 等人也认为，用米氏动力学原理 无法完全客观的解释过氧化氢酶的动力学行为】。因此，目前学术界对过氧化 氢酶的动力学描述都是采用表现k m 值，即认为在一定的过氧化氢浓度范围内， 酶活与底物呈线性关系，类似米氏方程中的一级反应过程，并以此来推算表观 米氏常数及其最大反应速度。 因此本实验采用l i n e w e a v e r b u r k 做图法分析了8 0 m mh 2 0 2 以下的酶活一 底物浓度关系( 见图4 1 1 ) ， 言 莹 亘 至 o 4 0 1l 2 一 01 0 i) 8 一 o i) 6 一 o 。i) 4 _ o 1) 2 一 v 1 nn ，f) 010 2o 30 4 0 5 图4 1 1l i n e w e a v e r - b u r k 图( 双倒教图) f i 9 4 - 11l i n e w e a v e r - b u r kp l o t 由图4 11 可以看出虽然用碎浆工段样品中的过氧化氢酶做出的双倒数图 有限性偏离，米氏方程对它不是特别适用。这可能是由于碎浆工段中的过氧化 氢酶种类不只是一种，同工酶之间的相互干扰，导致了做出的l i n e w e a v e r b u r k 图不具有线性特点。但是根据黄卓烈等人对经过分离纯化后的单种类过氧化氢 酶的催化的研究，其结果也具有本实验所得到结果的相同特点m ，。这说明本结 果对碎浆系统中出现的过氧化氢酶的催化动力学研究还具有一定的参考性。它 表现出了碎浆工段中过氧化氢酶对过氧化氢的催化特点。从图中可以算碎浆工 段过氧化氢酶的k m 值是1 9 2 9 m m ，v m a x 是7 1 4 3l am o l m i n 。 4 3 小结 碎浆工段过氧化氢酶活性为4 2 5 7 i _ t m o l m i n ，浮选工段过氧化氢酶活性大 小为3 2 。5 1 x m o l m i n ，是碎浆工段的7 6 ，二段浓缩样品测不到酶活。碎浆和 浮选工段在p h 8 5 ，2 5 表现出较强的酶活，在p h 7 2 4 9 19 表现出对碱性环 4 7 陕西科技大学硕士学位论文 境的良好适应性和稳定性。碎浆工段的样品在4 0 。c 下温育3 0 m i n 仍有活性，表 现出对温度有一定的适应性，在l5 保温时间超过2 0 m i n 后酶相对活性在 1 0 0 以上，在温度的作用下将“储存的酶活表现出来。碎浆工段的过氧化 氢酶还表现出一定的对h 2 0 2 的耐受力，其k m 值是1 9 2 9 m m ，v m a x 为7 1 4 3 l am o l m i n 。 4 8 废纸脱墨浆中过氧化氢酶的研究 5 影响过氧化氢酶活性的研究 在废纸制浆过程中，由于使用的水仅经过简单的处理，再加有些工段使用 回用水，这就不可避免脱墨浆生产体系中含有金属离子。这些金属离子随着封 闭水循环的程度加深，其中的金属离子不断累积富集，浓度不断提高，这对过 氧化氢酶活性有一定的影响。为了解金属离子对过氧化氢酶活性影响的程度， 针对不同种类的金属离子进行了研究。造纸过程中会添加多种化学药品，因此 废纸浆中化学成分复杂，对有机相中过氧化氢酶活性的研究也有一定的必要。 并且对部分抑制剂的抑制效果也进行了研究。 5 1 原料与实验方法 5 1 1 原料 采用第二章实验所采用的原料。 5 1 2 设备、仪器及实验药品 5 1 2 1 设备与仪器 仪器名称 紫外分光光度剂 电子天平( 5 0 0 9 ) 5 1 2 2 实验药品 型号 d r 4 0 0 0 m p 2 0 0 a 生产厂家 美国h a c hc o m p a n y 上海精密科学仪器有限公司 碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、硫酸锰、 氯化铁、氯化钾、硫酸钡、硫酸铜、硫酸铝、乙醇、氯仿、h 2 0 2 ，3 0 ( v v ) 等， 以上均为分析纯。 5 1 3 实验方法 5 1 3 1 金属离子对过氧化氢酶活性的影响 以去离子水配制各种金属盐浓缩液，以5 0 m mn a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲液 ( p h 7 ) 与n a 2 c 0 3 一n a h c 0 3 ( p h 8 5 ) 稀释到相应浓度后与1l t t l 样品混合，2 5 和5 5 下保温放置3 0 m i n 后加入底物采用2 2 5 中的方法测定残余酶活，以加 煮沸后的样品体系为空白对照，以防止样品中的金属离子对结果的干扰而引起 4 9 陕西科技大学硕士学位论文 的误差。 5 1 3 2 有机溶剂对过氧化氢酶活性的影响 样品酶液、9 5 乙醇和氯仿以10 ：5 ：3 的体积比混合，2 5 下放置l0 m i n 后 加入5 0 m m 的n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲溶液( p h = 8 5 ) 以及底物( p h = 8 5 ) 采用 2 2 5 中的方法测残余酶活。 5 1 3 3 抑制剂对过氧化氢酶活性的影响 以去离子水配置抑制剂的浓缩液，以5 0 m mn a h c 0 3 n a 2 c 0 3 缓冲溶液 p h 8 5 稀释到相应浓度后与1ul 酶液相混合，2 5 下放置3 0 m i n 后加入底物