（发酵工程专业论文）头孢菌素c菌种改良和发酵工艺研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明j 本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：盈：建窟 日期： 趔：! ：! 关于学位论文使用授权的声明 ：垃翩签名杜趔 m 苯大学硕士学位论文 摘要 半合成头孢类抗生素由于其抗菌谱广和过敏性弱的特点，是临床上广泛使用 的消炎、抗菌药物。头孢菌素c ( c p c ) 是生产各种注射用半合成头孢菌紊! ：! 勺基 本原料。目前国内头孢菌素c 原料每年大约需要3 5 0 0 吨，而实际产能只有2 5 0 0 吨，并且需求量还在不断上升，供应上有一定的缺口，国际上发达国家也逐渐将 原料药的生产转向我国。因此生产规模的扩大和生产水平的提高是各大制腰公司 竞相追求的目标。 本文以头孢菌素c 产生菌顶头孢霉菌8 1 9 为出发菌株，通过紫外线诱变处理， 结合理性选育和自然分离筛选到高产菌株8 1 9 0 5 1 0 ，在此基础上进行了工艺优化 使生产水平提高了4 8 ，并且生产能力稳定；为防止菌株的生产能力的退化，对 顶头孢霉菌的菌种保藏技术进行了相关研究，比较了几种不同保藏方法的优缺点， 在透彻分析了影响c p c 发酵水平的因素的基础上以8 1 9 0 5 1 0 为出发菌株，对发 酵工艺进行了培养基配比的优化、等质低价原材料的选择、培养条件的优化、葡 萄糖流加补料、搅拌对发酵水平的影响以及发酵放大等方面进行深入的探讨和研 究。规模化大生产上采用了优化后的工艺后生产水平得到大幅度的提高，解决了 生产成本高的问题。 关键词：头孢菌素c 菌种选育发酵 5 a t a 末大学颈士学位论文 r a t i o n a ls e l e c t t l 0 no fc e p h a l o s p o r i ncp r o d u c i n g s t r a i na n dt h eo p t i m i z a t l 0 no fi t sf e r 她n t a t i v ep r o c e s s e s a b s t r a c t s e m i s y n t h s i z e da n a l o g u eo fc e p h a l o s p o r i na n t i b i o t i ci s u s e da t l a r g e t ot r e a t s y s t e m i c i n f e c t i o n sf o ri t sb r o a d s p e c t r u m o fa n t i b i o t i c a c t i v i t y a n dt h i n h y p e r s u s c e p t i b i l i t y c p c ( c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o n i u m ) i sb a s i cm a t e r i a lt op r o d u c e s e m i s y n t h s i z e da n a l o g u eo fc e p h a l o s p o r i na n t i b i o t i c d o m e s t i c l yt h ea m o u n to f d e m a n d e dc p ci sa b o u t3 5 0 0 ta n di so nt h ei n c r e a s ep r e s e n t l y h o w e v e ri t so u t p u ti s 2 5 0 0 ty e a r l y i n t e m a t i o n a l yp r o d u c eo fc p cj sb e i n gt r a n s f e r r e df r o md e v e l o p e d c o u n t r yt od e v e l o p i n gc o u n t r y s ot h ep r o d u c m gs c a l e - u pa n dl e v e l - i n c r e a s i n ga r ea i m f o rm a n yb i gm e d i c a lc o m p a n y t h es t r a i na c r e m o n i u mc h r y s o n g e n u m8l9w a st r e a t e dw i t hu vi r r a d i a t i o n a h i g h y i e l dc p cp r o d u c i n gs t r a i n 一8 19 0 5l0w a ss e l e c t e db ym e a n so fr a t i o n a is e l e c t i o n a n dn a t u r a is e l e c t i o n b a s e da c r e m o n i u mc h r y s o n g e n u m 8 1 9 0 5 1 0i t sp r o d u c e p o t e n c yw a ss t a b i l ea n dj n c r e a s e db y4 8 o v e rt h ep a r e n ts t r a i n t oa v o i dh i g h - y i e l d c h a r a c t e r i s t i cd e b i l i s e dae f f e c t u a ls t r a i np r e s e r v em e a n sw a so b t a i n e db yc o m p a r i n g 5 e v e r a id i f i e r e n tm e a n s ? ：二jj 一。! t h ef a c t e rt ow e a n l i s e ds t r a i np r o d u c i n gc a p a c i t yi n c l u d em a t e r i a lp r o p o r t i o n ， c u l t u r ec o n d i t i o n ，f e e da n ds t i r r e r a tt h eb a s eo fp r o f o a n da n a l y s et ot h e s ef a c t e r f e r m e t i o np r o c e s sw a so p t i m i z e d s ot h ep o t e n c ya n df e r m e n t a t i o ni n d e xw a s i n c r e a s e d w h i l et h ep r i c eo f p r o d u c tw a sl o w e r e d k e y w o r d ：c e p h a l o s p o r i ncs t r a i ns e l e c t l 0 nf e r m e n t i o n m 东大学磺士学位论文 第一章头孢菌素c 进展 早在1 9 4 5 年，意大利的b r o t z u 即从萨丁岛的卡利亚里沿海废水排出口处分 离出一种无性丝状真菌顶头孢霉，并发现其培养液的粗提物具有抑菌作用。 1 9 5 1 年牛津大学a b r a h a m 等从等对b r o t z u 提供的菌种进行了深入的研究，发现 其培养液至少含有6 种不同的代谢产物。用炭柱吸附，丙酮洗脱，再经氧化铝展 析后分离出一种对革兰氏阳菌和阴性细菌均有效的抗生素，当时定名为头孢菌素 n 。实际上这是一种含氨基己二酰基侧链的青霉素，现称青霉素n ( p e nn ) ，是生 物合成青霉素和c p c 共同前体；对金葡球菌的抗菌活性只及于青霉素的1 。1 9 5 3 年，牛津大学n e w t o n 等应用a m b e r l i t ei r - 4 b 柱层析或含乙酸的酚一四氯化碳一 水系统逆流分配法精制c p c 时，又从中分离出c p c n a 盐的结晶。研究表明，虽然 ：。， c p c 的抗菌性作用很弱，只及p e nn 的1 0 ，但没有毒性，对酸稳定，且不会导致 被青霉素酶水解而失活，遂引起研究人员的高度重视。 1 9 5 9 年，牛津大学h o d h k i n 等利用x 线衍射晶体学的方法证实确定了c p c 的 化学结构： h o o c ) c h - ( c h ：) ， n h ： 一o c o c h 。 c p c 的化学结构式 “ ，l、 c p c 本身抗菌活性很弱，并无应用价值，但其化学结构与青霉索相似，也含 有b 一内酰胺环，因此在当时半合成青霉的启发下，预计通过结构改造也会形成更 有效的抗生素，随即展开半合抗头孢菌素的研究。 牛津大学l o d e r 等( 1 9 6 1 ) 首先发现c p c 在弱酸催化下可脱除氨基已二酰基 侧链，产生少量的c p c 母核7 一氨基头孢烷酸( 7 - a c a ) 。7 - a c a 也没有抗菌活 性，但最初由7 - a c a 出发，首次制得n - 苯乙酰基衍生物，便发现它对金葡菌的抗 菌活性比c p c 增强i 0 0 倍。此后，半合成头孢菌素的研究发展迅速，第一代头孢 菌素相继面世，并在抗感染治疗上取得极好效果。目前7 - a c a 与各种不同的侧链 酸缩合制得的半合抗头孢菌素已达数干种，而生产7 - a c a 的主要原料c p c 的发酵 单位也由最初的l o u m l 提高3 5 0 0 0 u m l 以上 7 a m 东大学顶士学位论文 第二章c p c 的生物合成 2 1c p c 生物合成途径 虽然早在t 9 5 3 年就发现了c p c ，且发酵液中各种代谢产物都先后得到分离纯 化，并阐明了它们的化学结构，但c p c 生合成途径一直无法确定。主要问题在于 顶头霉菌可产生两种不同类型的b 一内酰胺类抗生素：5 元噻唑烷环的p e n n 和含6 元二氢噻嗪环的头孢菌素。因此，多年来人们都认为这两类抗生素可能是两条分 枝途径的终产物。直到1 9 7 6 年：美国麻省理学院d e m a i n 。1 等发现顶头孢霉的无细 胞提取液可使p e n n 扩环转化为头孢菌素，才证实p e n n 实际上就是头孢菌素的直 接前体。目前已被接受和证实的项头孢霉菌c p c 生物合成途径如下( 图1 ) ： 该途径包括以下7 步反应： l 、先有两种前体氨基酸：l n 一氨基已二酸与l - 半胱氨酸缩合形成二肽l 卜a c 简称a c ； 2 、二肽a c 在与l 一缬氨酸加成反映，形成三肽l l d - a c v ，简称a c v ，在加成 反应中，l 一缬氨酸异构化位d 型 3 、三肽a c v 环化为异青霉素n ( i p n ) ； 4 、i p n 差向异构为p e n n ； 一 5 、p e n n 扩环转化为脱乙酰氧头孢菌素c ( d o c p c ) ； 6 、d o c p c 羟化，形成脱乙酰头孢菌素c ( d c p c ) ： 7 、最后d c p c 乙酰化，形成终产物c p c ； 2 2 各步反应及包含的酶 2 2 1 二肽与三肽的形成 如图i 所示，三肽a c v 是c p c 生物合成途径最初前体。第一步是l c i - 氨基己 二酸的6 羧基与l 半胱氨酸的o 氨基之间形成肽连，得到二肽a c 。1 这一反应 是在a c 合成酶的催化下进行。在顶头孢霉的粗提取液中已证实有此酶存在，而 且这种酶需要a t p 和锰离子或镁离子作辅助因子。 第二步是在三肽a c v 合成酶的催化下使l 一缬氨酸引入二肽a c ，由此形成三肽a c v 。 由于l 一缬氨酸在三肽a c v 中是以d 型存在，所以估计可能是在缬氨酸引入a c v 之 前的活化期间由l 型变为d 型。 山东大学硕士学位论文 n h 2 ) c h 一( c 比) a c o o h + h o o c l - a 一氨基己二酸 n h zn 1 2 咖 f “托m h 廿叭卜6 r k h ：o = c - n h t h c h h 0 0 c - c h 一( c 地) 。 i p n 异青霉素n 脱乙酰氧头 脱乙酰头孢 向异构酶 ( c ) 。 三肽a c v 青霉素n ( p e nn ) 头孢菌素c 图i ：顶头孢霉菌合成头孢菌素c 的途径 美国麻省理工学院b a n k o ”1 等( 1 9 8 7 ) 对顶头孢霉菌c 一1 0 的a c v 合成酶进行 了研究，并发现a c v 合成酶实际上是一种具有广泛底物特异性的多功能酶，而且 只要单一的这种酶就可以合成三肽a c v ，其合成速率大大高于由l o 一氨基己二酸 9 a 。 崦 ， 科 山东大学礞士学位论文 与l 一半胱氨酸形成二肤a c 以及由a c 与l 缬氨酸形成三肽的速率。这种酶同样需 要a t p 和 g ”作辅因子，酶反应及最适温度和p h 分别为2 5 c7 5 。由于目前对 a c 合a c v 合成酶了解还很少，故近期文献的提法是：三肽a c v 是由三种氨基酸在 种或两种酶的作用下形成的。 2 2 2 形成i p n 和p e n n 的环化及异构化反应 直链的a c v 在i p n 合成酶的催化下，环化形成i p n “。由此环化反应在失去氢 原子的同时，伴有硫一碳键和氮一碳键的形成。a c v 的l a 一氨基己二酰基侧链原封 不动的变为i p n 的侧链，a c v 中间的l _ 半胱氨酸环化合成为关键性的b 一内酰胺环， 而d 缬氨酸则成为的噻唑环( 见图1 ) 催化此反应的环化酶已从顶头孢霉菌培养 液中得到分离纯化。这是一种脱氢酶类，体外研究表明，f e ”、还原剂( 抗坏血酸 h ： 与二硫苏糖醇) 和氧原子可刺激这种酶的环化活性、m n 2 + 和z n ”会抑制环化活性酶 反应的最适温度为2 5 c 和p h 7 5 。在环化酶的催化下，每形成一个克分子i p n 需 要消耗一个克分子氧气( 0 ：) 。 形成i p n 后，随即在不稳定的差向异构酶的作用下转化为p e nn 。在此反应中， i p n 侧链l n 一氨基己二酰基被异构化为d 型。这一反应是可逆的。 ：jp ： 卜 2 23 形成d o c p c 和d c p c 的扩环与羟化反应。 形成头孢菌素的关键性反应是p e n n 在d o c p c 合成酶( 扩环酶) 催化下；扩环 转化为d o c p c 。此时，p e n n 的5 元环噻唑环扩展为d o c p c 的6 元二氢噻嗪环，p e n n b 一甲基变成d o c p c 6 元环中的c 一2 。 催化这一反应的扩环酶是c p c 生物合成途径中的一种非常重要的酶、它在催 f 化扩环反应时需要f e “、抗坏血酸和a t p 作辅助因子。最适反应温度和p h 与环化 反应相似。 顶头孢霉的扩环酶还是一种依赖于。一酮戊二酸的双加氧酶。早期利用粗品酶 的研究未发现。a 一酮戊二酸的作用，以后利用另一株顶头孢霉突变菌株经乙醚渗 ： 透处理过的细胞才发现它的刺激作用。随后又利用从产生c p c 的顶头孢霉菌株中 制得的纯化2 0 倍的酶进行研究，证明扩环酶绝对需要a 一酮戊二酸，且在此反应 中检测出由a 一酮戊二酸放出的二氧化碳。由此表明环化反应也绝对需要氧。在扩 环反应中，扩环酶并没有使氧原子引入产物中。估计分子氧的一个氧原子系引入 因a 一酮戊二酸的氧化脱羧作用而形成的琥珀酸分子中，另一个氧原子很可能是形 a 山东大学碗士学位论文 成利r 与酶结合的氧化中问体，这利巾间体分解为d o c p c 和水。 在c p c 生物合成途径中，扩环酶是一种限速酶，广泛受到碳氮源：蛋氨酸、 氧及其它因子的调节。发酵期问只有在葡萄糖基本耗尽的状况下才能检测出扩环 酶的活性。若扩环酶的活性受阻或抑制，发酵液内即出现p e n n 的积累，c p c 产量 减少。上述各种因子对扩环酶及其它生物合成酶的调节将在以下有关各节中详述。 在p e n n 扩环转化为d o c p c 之后，随即在羟化酶的催化下形成d c p c 。在此 反应中，羟化酶使氧分子中的氧引入d o c p c 的3 位上，使原来的甲基转化为羟甲 基，从而形成d c p c 。 羟化酶也是一利- 依赖于f l 一酮戊二酸的双加氧酶。n 一酮戊二酸、抗坏血酸、 二硫苏耕醇及f o ”对这种酶都有刺激作刚。早期曾分离出利- 只产生d o c p c 的顶 头孢霉阻断突变株。这利t 突变株缺失羟化酶活性，所以不能使d o c p c 转化为d c p c 。 这一事实似乎说明羟化反应是在单一二的羟化酶作用下进行。以后，瑞士汽巴一嘉 d 基公司s c h e i d e g g e r ( 1 9 8 4 ) j f u i i 顶头孢霉工业生产菌株t r 一4 进行的研究以及美国 礼米公司d o t z l a f 等( 1 9 8 7 ) 对扩环酶进行纯化时发现扩环酶是一种双功能酶， 它不但能催化扩环反应，也会催化羟化反应，扩环活性与羟化活性值比7 ：1 。因 此，扩环和羟化反应究竟是在单一的双功能酶，或是在两利t 酶的催化下进行似有 【ii _ ；： 疑问。但目前还使趋向于认为顶头孢霉菌的扩环和羟化反应是在双功能酶催化下 进行。 2 2 4 转化d c p c 成为终产物c p c 的乙酰化反应“1 d c p c 转化为c p c 的乙酰化反应是在乙酰基转移酶的催化下进行。在乙酰化 反应t h 乙酰基转移酶需要m g ”作辅助因子，还需要乙酰辅酶a 或辅酶a 、乙酸、 ，j 一i f ，j a t p 存在。反应的最适温度和p h 为2 5 、7 0 ：7 5 。在该反应小，乙酰基转移酶 使乙酰辅酶a 上的乙酰基转移至d c p c3 位的羟甲基上使其乙酰化，由此形成了 整个生物合成途径的终产物- c p c a 出末大学硬士学位论文 第三章与产生c p c 有关的顶头孢霉的生理与生化 3 1 顶头孢霉的形态分化 3 1 1 基本形态 顶头孢霉菌在合成培养基内作深层培养时显示四种不同的形态：菌丝、膨胀 的断裂菌丝( 粗短的高度分隔型) 、分生孢子、萌发的孢子1 h a t s u m u r e 等将发酵 期间顶头孢霉菌的菌丝形态分为五种类型：菌丝、高度膨胀的断裂菌丝、中度膨 胀的断裂菌丝、单细胞节孢子、分生孢子，现将这五种形态分述于下 ( 1 ) 菌丝 顶头孢霉的菌丝是一种细长有隔卣g 丝状菌丝体，表面较光滑。在发酵过程中， 菌丝逐渐膨胀并断裂成不同长度的菌丝( 断裂菌丝) ( 2 ) 高度和中度膨胀的断裂菌丝 菌丝断裂后，根据膨胀程度分为高度的膨胀断裂菌丝和中度膨胀的断裂菌丝。 前者基本上是由较大的厚壁球形细胞组成，后者大都由较小的薄细胞壁椭圆形或 ： 杆状细胞组成。高度膨胀的断裂菌丝，其直径约4 到6 微米，而中度膨胀的断裂 菌丝的直径约2 到4 微米。菌丝断裂没有规律，故长度不同。在高度膨胀的断裂 菌丝中，根据其长度有分为短于2 5 微米、2 5 至5 0 微米和长于5 0 微米三种。 ( 3 ) 单细胞节孢子 单细胞节孢子由两利i 类型，一种是大的球形单细胞节孢子，另一种时较小的 ! ! 椭圆形的单细胞节孢子。前者是由高度膨胀的断裂菌丝产生，后者由中度断裂菌 丝产生。 ( 4 ) 分生孢子 分生孢子比椭圆形单细胞节孢子细长，而且短小，表面比单细胞节孢子光滑。 3 1 2 发酵期间的形态变化 、 在典型的c p c 高产发酵中，发酵开始时，培养基内顶头孢霉的主要形态类型 是分支的细长的菌丝。随着生长发育，菌丝发生明显的形态分化。首先是菌丝膨 胀、分隔，随后断裂成较长的高度膨胀菌丝和中度膨胀的菌丝。生长期内只有少 量的c p c 产生。经过5 0 小时的培养，葡萄糖基本耗尽。此时，长的膨胀的菌丝大 、f j 都断裂成短的断裂菌丝和随着长的高度和中度膨胀断裂菌丝逐渐减少，球形椭圆 形的单细胞节孢子开始增多。这意味着长的高度膨胀断裂菌丝变得越来越短，最 1 2 a 山东大学碗士学位论文 后分化成为单细胞节孢子。c p c 的产生与葡萄糖的耗尽同步产生。产量随高度膨 胀的断裂菌丝从发酵液中完全分化为球形单细胞节孢子而增高，当长的高度膨胀 的断裂菌丝从发酵液中完全消失时，c p c 停止产生。 3 1 3 各种细胞形态与产生抗生素的关系 m a t s u m u r e ”1 等研究了发酵期间各种细胞形态于合成抗生素的之问的相关性。 他们测定了发酵终止时的c p c 效价与发酵液中各种形态类型所占的百分比，由此 得出球形单细胞节孢子、膨胀的断裂菌丝、椭圆形的单细胞节孢子以及分生孢子 与抗生素合成的相关系数分别为0 7 0 、0 5 5 、0 2 1 、0 1 7 。这一结果似乎说明球 形单细胞节孢子与c p c 产量的关系最为密切。同时还说明，在合成c p c 的过程巾， 形成球形单细胞节孢子的能力是一个重要的因素。 ；j 然而，在发酵利c p c 显然是在大量的高度膨胀菌丝存在下产生的，而球形单 细胞节孢子只是高度膨胀菌丝断裂的结果。而且，单细胞节孢子在代谢上是相对 ， 静j 卜的，不可能具有合成c p c 的活性。为阐明这一问题，m a t s u m u r e 等又利川高 产株c w - 1 9 和低产株m 8 6 5 0 作了比较研究。结果发现，发酵期问高产株和低产株 之间形态的显著区别是在生产期内高皮膨胀菌丝的数量上。前者可形成大量高度 j i i i 。 膨胀的断裂菌丝，并且具有较强合成c i ，c 的活性，但最后这两个菌株历形成的单 细胞节孢子的数量没有很大区别。由此进一步证实高度膨胀的菌丝要比其他形态 具有更强的合成c p c 活性。 3 2 蛋氨酸的诱导作川 在开展c p c 发酵研究之初，许多研究学者就发现蛋氨酸对顶头孢霉产生c p c 的刺激作川，蛋氨酸可作为顶头孢霉生长和产生c p c 的单独氮源和硫源，但并非 细胞生长所必需，早期礼米公司c a l t r i d e r ”等( 1 9 6 6 ) 利川放射性标记的蛋氨酸 所做实验证明头孢菌素t l t 的硫基本上时米源于蛋氨酸，并认为蛋氨酸巾的硫是通 过逆转硫途径进入c p c 分子中。但以下理由怀疑这并非蛋氨酸的唯作川。 - ： 硫酸根离子+ l + l - 半胱氨酸二+ c p c 细胞壁 圈2 ：顶头饱碡硫代谢中的逆转硫途径 a 不含硫的蚩氨酸类似物正亮氨酸可以取代蛋氨酸，同样会刺激c p c 的产生： b 假如在代谢上与c p c 关系更为密切的含硫的t f j 问代谢产物，高半胱氨酸、胱硫 人 由东大学碗士学位论文 醚或半胱氨酸却难以提高c p c 的产量。 c 在硫酸盐和蛋氨酸转化为半胱氨酸的途径被双重阻断的突变菌株中，假如丙氨 酸一d l 一蛋氨酸( 可转化为内源性蛋氨酸) 能刺激抗生素的合成。此外，根据菌种 改良中获得的许多可单独利用无机硫酸盐作为c p c 硫源的突变株以及对c p c 生物 合成酶的研究，都证实蛋氨酸是起着种代谢调节剂的作用。 3 2 1 蛋氨酸对顶头孢霉形态分化的诱导 。 在深层培养中，蛋氨酸诱导菌丝形态的分化，在有蛋氨酸存在情况下，菌丝 形态分化，遵循典型的高产c p c 发酵的类型，即：菌丝，膨胀的菌丝 高度 膨胀的断裂菌丝一 式的球形节孢子。在不含蛋氨酸的硫酸盐培养基内，生长期 内大部分分化为中度膨胀的断裂菌丝，在分化为较小的椭圆形的节孢予，抗生素 产量只及蛋氨酸培养基的三分之一。 ：。 3 2 2 内源性蛋氨酸的调节 大阪大学m a t s u m u r e 。1 等( 1 9 8 0 ) 认为，既然蛋氨酸是起调节剂的作用，那么 c p c 合成必须与胞内蛋氨酸浓度有关。因此它们研究了顶头孢霉菌孢内蛋氨酸浓 度的变化，结果发现： ( 1 ) 从生长期进入生产期的过渡期内，孢内蛋氨酸浓度增值是生长期的2 - 3 倍， 、一f j 一 并在抗生素合成之前达到最大浓度。 ( 2 ) 孢内蛋氨酸浓度增高，伴有对外部蛋氨酸的摄取，其积累量与培养基内加 入的蛋氨酸量成正比，以后随培养基内、外源蛋氨酸耗尽，孢内浓度立即 下降： ( 3 ) 在一定的孢内蛋氨酸浓度下，孢内蛋氨酸浓度越高，所合成的c p c 浓度越 多： ( 4 ) 发酵培养基加d 一蛋氨酸，c p c 产量比加卜蛋氨酸高一倍左右，细胞量无明 显区别。原因是l 一蛋氨酸在细胞生长的同时被迅速利用，并在开始时产生 抗生素之初耗尽，而d 一蛋氨酸缓漫地被利用，在产生抗生素之后仍大量保 留，因此，生长在d 一蛋氨酸培养基内的菌丝，在过渡期其细胞内蛋氨酸的 暂时积累量高达l 一蛋氨酸培养基的4 倍之多。 3 2 ，3 蛋氨酸对c p c 生物合成酶的诱导 美国麻省理工学院s a w a d a “等发现，生长在含蛋氨酸培养基内的顶头孢酶， a 山东大学硕士学位论文 其环化酶及扩环酶活性均增强。麻省理工学院z h a n g 等( 1 9 8 7 ) 还证实，蛋氨酸 除刺激p e n n 和c p c 生物合成以外，还会诱导c p c 生物合成途径的第一种酶- a c v 合成酶，相应提高低产株和高产突变株的b 一内酰胺的产量。蛋氨酸在顶头孢霉的 硫代谢中也起到重要调节作刚。 3 3 硫代谢的作用 由于含硫的半胱氨酸是生物合成c p c 的一利- 初级前体，因此研究蛋氨酸和硫 酸盐如何转化为半胱氨酸，埘c p c 发酵生产具有重要意义。 在顶头孢霉中，除了前节所述有蛋氨酸经逆转硫途径转化为半胱氨酸以外，还包 括对外源硫酸盐的摄取。外源的硫酸盐可经乳步酶促反应，还原转化为内源性硫 化物。所形成的内源性硫化物在经由两条交替的硫代谢途径转化半胱氨酸；一条 是在0 一乙酰丝氨酸硫化氢解酶的作川下与o 一乙酰一l 一丝氨酸缩合形成半胱氨酸； l 一高半胱氨酸，在经逆转硫途径转化为半胱氨酸。然而，在以后的菌种改良t h 获得了各种不同的硫代i ! j i 途径阻断突变菌株。对野生型菌株和这些突变菌株的硫 代i 身i 途径所作的研究分析表叫，硫代谢产物的运转途径远较以上所述复杂。 3 3 1 野生型菌株的硫代跗特征 在野生型顶头孢霉菌株，h 为达到最佳c p c 合成，它是优先利j f j 蛋氨酸而不 是硫酸盐。在这利谱系- h 供生物合成c p c 的硫，几乎完全是由蛋氨酸逆转硫途 径产卜。l j 一蛋氨酸先经过图3 种的1 3 、1 4 、1 5 转化为l 一高半胱氨酸，而后再胱 硫醚一b 一合成酶的作用下( 图3 利，的反应1 6 ) 转化为l 一半胱氨酸，因此这种谱系 的菌株主要依靠外部供给得蛋氨酸作为生物合成c p c 的硫源。 3 3 2 硫醚与胱硫醚一r 一裂解酶的重要性 瑞十汽巴一嘉壮公司t r e i c h l e r 等( 1 9 7 9 ) 曾经分离出一种缺失胱硫醚一r 一裂 解酶( 圈3 反应1 7 ) 的突变株。这利，阻断的突变株在含蛋氨酸的培养基内，c p c 0j i i ：i ， 产量只及野生型的2 0 ，再含硫酸盐培养基内。，c p c 产量明显低于亲株。这结果， 似乎说明在缺失胱硫醚- v - 裂解酶的突变株内，形成半胱氨酸的三条硫代谢途径受 阻，因此严重影响c p c 的合成。 研究裘明，胱硫醚在胱硫醚一r 一裂解酶的作门j 下转化为半胱氨酸是硫代谢途径 小很重要的一步。c p c 的形成依赖于胱硫醚一r 一裂解酶的作，门，其产量与这利酶的 活性成正比。胱硫醚一r _ 裂解酶缺损的突变株，c p c 形成减少，即使加入对亲株有 a 山东大学硪学位论文 刺激作用的蛋氨酸亦无效果。此外，与亲株比较，在含硫酸盐不含蛋氨酸培养基 内，这种酶缺损的突变株亦显示合成c p c 的能力减弱。由此证明胱硫醚的形成使 有效合成c p c 的先决条件，而胱硫醚的裂解是构成初级代谢最重要的一个步骤， 并认为这一反应是起到使半胱氨酸转入次级代谢的一种诱导剂的作用。这些结果 也表明，只有通过逆转硫途径形成的半胱氨酸才会引入c p c 分子。 l 一蛋氨酸 l 一丝氨酸 - 4 1 2 5 4 s 3 2 l 一丝氨酸 1 酸盐透酶、2 a t p 硫化酶，3 a t p ：腺苷硫酸一5 一磷酸转移酶，4 腺苷一3 一磷酸 一5 一硫酸磷酸还原酶，5 亚硫酸还原酶，6 丝氨酸乙酰转移酶，7 0 一乙酰丝氨 酸硫化氢解酶，8 高丝氨酸乙酰转移酶，9 o - 乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，1 0 。 胱硫醚一r 一合成酶，1 1 胱硫醚b 一裂解酶，1 2 高半胱氨酸甲基化酶，1 3 s 一腺 苷蛋氨酸合成酶，1 4 s 一腺苷蛋氨酸甲基转移酶，1 5 s 一腺苷高半胱氨酸水解酶， 1 6 胱硫醚b 一合成酶，1 7 胱硫醚r 一裂解酶 图3 、顶头孢霉中合成c p c 的硫代谢途径 a 山东大学硬士学证论文 3 3 3 各种不同突变株的硫代谢特征 不能利用硫酸盐合成c p c 的野生性菌株，经诱变改良后，从中可获得可单独 利j h 硫酸盐垒i 产c p c 的突变株。如前所述，胱硫醚的形是有效合成c p c 的一个先 决条件，而能够利用无机硫酸盐合成c p c 的突变株不外乎通过两条途径形成胱硫 醚。这两条途径都包括两步酶促反应，或是图3 种的反应7 和1 0 ，或是反应9 和1 6 。为阐明这利t 突变菌株内形成胱硫醚有关的无机硫酸盐的代谢途径， t r e i c h l e r 等对以下各利t 阻断突变菌株进行了实验研究。 ( 1 ) 缺失高丝氨酸乙酰转移酶的突变菌株 这利突变株因缺失高丝氨酸转移酶( 图3 第8 步被阻断) 所以不能利用o - 乙 酰高丝氩酸，而它是两条由硫化物形成胱硫醚途径( 图3 种反应9 、1 0 ) 利i 白q 共 同受体的底物，因此这利一突变株不能转化任何形式的无机硫酸盐成为胱硫醚，除 非加入高浓度蛋氨酸，否则不产生c p c ：这也进一步证实胱硫醚对c p c 合成的重 要性。 ( 2 ) 缺失o 一乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的突变株 在试验i l 发现，缺失这种酶的突变株( 图3 笫9 步被阻断) ，当利用蛋氨酸作 为f i n - 弼i 源进行培养时，其c p c 产量与亲株无明显的差别，但在加入硫酸盐和少 j ：l ： ? 7 - ： 量蛋氨酸的培养纂内，这种突变株的c p c 产量明显低于亲株，因此，缺失0 一乙酰 高丝氨酸硫化氢的裂解酶的突变株，其利用硫酸盐合成c p c 的能力较弱。 在这种突变株内，| 夭| 第9 步被阻断，硫化物和o 一乙酰丝氨酸只有在o 一乙酰丝氨酸 硫化氢裂解酶的作川下( 图3 反应7 ) 形成半胱氨酸，在胱硫醚一r 合成酶的作h ；j 下( 圈3 反应1 0 ) 转化为胱硫醚。汽巴一嘉基公司d o b e l l 等( 1 9 8 0 ) 曾分离出0 一 乙酰丝氨酸硫化氢解酶，并发现这酶的合成受外源蛋氨酸的阻遏，而且s 一腺苷一l 一 蛋氨酸( s m a ) 对酶活性有抑制作川。由此看来，第9 步的阻断，难以获得可利用 硫酸盐合成c p c 的突变株。 ( 3 ) 缺失o 一乙酰丝氨酸硫化氢解酶的突变株 实验证明，确实0 一乙酰丝氨酸硫化氢解酶( 幽3 筇7 步被阻断) 的突变株， l 在含过量硫酸盐和少量蛋氨酸的培养基内，c p c 产量增加，而亲株在此培养基内 c p c 产量很低，此外，这种突变株可单独利用无机硫作硫源，c p c 产量同利j | ：f 蛋氨 酸的亲株柏似。 a m 东大学硪士学位论文 这种突变株内，由于第7 步被阻断，硫化物和o 一乙酰高丝氨酸只有在o 一乙酰高丝 氨酸硫化氢解酶的作用下( 图3 反应9 ) 形成高半胱氨酸，再在胱硫醚一b 一合成 酶的作用下( 反应1 6 ) 转化为胱硫醚。 t r e i c h l e r 等发现，o 一乙酰丝氨酸硫化氢解酶的存在对两条途径的运转( 图3 的9 、 1 6 ) 有抑制作用。他们认为这就是为什么缺失这种酶的突变株，显示较强的通过 一条途径利用无机硫的能力。此外，在缺失这种酶的突变株中，硫酸盐和蛋氨酸 对其产生c p c 的能力有协同效应。这种突变株实际上能够同样有效的利用硫酸盐 和蛋氨酸，而且通过共同的逆转硫途径( 图3 的1 6 、1 7 ) 转化为胱硫醚，但只能 加入少量的蛋氨酸，因为发现0 一乙酰高丝氨酸硫化氢解酶也会被高浓度外源蛋氨 酸阻遏，而过量的硫酸盐却对其活性有刺激作用。 美国礼莱公司o u e e n e r 1 等( 1 9 8 4 ) 亦研究了各种不同突变株硫代谢的生化和调 节。他们认为o - l 酰丝氨酸能诱导还原转化硫酸盐为硫化物的酶( 图3 反应2 、3 、 4 、5 ) ，可能对8 、9 、1 6 、1 7 步的酶也有诱导作用。当o 一乙酰丝氨酸转化为半胱 t 氨酸的途径( 图3 反应7 ) 被阻断时，即出现o z ：酰丝氨酸的积累，从而对同化 硫酸盐的酶产生强烈的诱导作用。因此，第7 步的阻断，增强了突变株通过另一 条途径摄取无机硫的能力。 从以上对野生型和各种不同的突变株的硫代谢所作的研究分析表明，胱硫醚 的形成和裂解对c p c 合成至关重要。为使胱硫醚一r 一裂解酶得到最大限度的表达， 早期d o b e l l 等曾提出两种可能性：一是将顶头孢霉培养在含过量的蛋氨酸培养基 内，这样，同化硫酸盐的酶被阻遏，半胱氨酸的生物合成经由包含胱硫醚一r 一裂解 酶在内的逆转硫途径进行；二是一串阻断o 一乙酰丝氨酸硫化氢解酶( 图3 反应7 ) ， 迫使顶头孢霉在没有蛋氨酸的培养条件下，同样经由逆转硫途径合成半胱氨酸。 这些可能性目前都在菌种改良中得到证实。 一一l l ! ； 7 ：。：， 这里还应提及蛋氨酸的调节作用和形成内源性蛋氨酸的重要性。如前所述， 蛋氨酸可诱导顶头孢霉菌中的环化酶和扩环酶的活性。这种调节作用伴有膨胀菌 丝断裂成节孢子的数目增多，同时诱导头孢菌素的合成。因此，上述第7 步被遗 传阻断的突变株，在没有蛋氨酸的硫酸盐培养基内c p c 产量增加，可能是硫经过 第9 和1 2 步转化为蛋氨酸，同时经由第9 和1 6 步转化为胱硫醚，内源性蛋氨酸 + i o 。 和胱硫醚的协同作用，促进了c p c 的合成。 a 山东大学硕士学位论文 日本武田公司s u z i k i “等( 1 9 8 2 ) 在改良菌种发现，在合成培养基中加入硫 代硫酸盐或s 一磺酸半胱氨酸可提高顶头孢霉c p c 的产量。这一发现似乎说明c p c 中的硫还可直接获自另条硫酸盐还原途径： 硫代硫酸盐7 +s 一磺酸半胱氨酸半胱氨酸 丝氨酸 为证实这一途径的存在，武田公司f u j s a w a 等( 1 9 8 2 ) 利用缺失o 一乙酰高丝 氨酸硫化氢裂解酶( 图3 的第8 步) 的阻断突变株，在补加少量蛋氨酸足以维持 生长的合成培养基内进行试验，如前所述，缺失这种酶的突变株，两条摄取硫酸 盐形成胱硫醚的途径( 图3 第9 和1 0 ) 均被阻断，因此不能利用无机硫合成c p c 。 实验结果证实，假如硫代硫酸盐或s 一磺酸半胱氨酸可提高这种突变株的c p c 产量。 利用工业菌株的实验亦获同样的结果。据此，f u j s a w a 等人为s 一磺酸半胱氨酸是 顶头孢酶菌生物合成半胱氨酸的直接前体，而包含钙化合物在内的另一条途径是 这种真菌产生c p c 的最重要途径之一，并提出以下新的硫代谢路线： 硫酸盐还原途径 硫臀离子 1 l 硫代硫酸 9 了3 丁li 亚硫 c p c 硫醚 t s 一腺苷高半胱氨酸l - 高半胱氨酸 f s 一腺苷蛋氨酸l 一蛋氨酸 c y s s 0 3 ：s - 磺酸半胱氨酸g s s g ：氧化型谷胱苷肽g s h ：还原性谷胱苷肽 图4 f u j i s a w a 等提出的顶头孢霉得硫代谢途径 ，。：。= ； 1 9 广 酸+l 山东大学硬士学位论文 自八十年代武田公司提出s 磺酸半胱氨酸是生物合成半胱氨酸的直接前体以来， 对此未见有新的报道。 3 4 碳源调节 碳降解产物调节青霉素n 向头孢菌素c 的转化 顶头孢霉菌( c e p h a l o s p o r i l l i i lc w 一1 9 菌株产生青霉素n 及其向头孢菌素c 的转化和葡萄糖调节头孢菌菌素c 的能力降低造成的酶系统的形成等规律“”。 在对照培养基中，葡萄糖很快地被菌株利用。在7 2 小时时，残糖已经很低， 但菌株生长一直持续到9 6 小时。在葡萄糖几乎耗尽时，才出现高的抗生素生产率。 在9 6 小时时，大部份青霉素n 已经形成，但只有一小部份转化成头孢菌素c 。因 此可以推断：青霉素n 转化成头孢菌素c 的扩环反应的酶系统只是在发酵后期才 被去阻遏。增加葡萄糖初始浓度，能降低抗生素的生物合成。这并不是由于p h 变化造成的，因为在缓冲条件中也出现同样的结果。在发酵4 8 小时时，向培养基 中加入2 5 9 1 葡萄糖，总产b 一内酰胺抗生素( 青霉素n + 头孢菌素c ) 的产量下 降。如在4 8 小时与7 2 小时再次加入葡萄糖，产量进一步下降。但后一次加入的 抑制效果远比发酵开始时加入者为小。这说明这时生物合成酶系统已经形成。菌 丝的生长随着葡萄糖浓度增加而增加，以5 5 9 i 时最大，但b 一内酰胺抗生索比生 产率却是在2 0 9 l 时最高。如低于2 0 9 l ，则菌丝生长和抗生素的合成同时受到 限制。试验结果明显地表明在抑制菌丝生长的葡萄糖浓度时，b 一内酰胺抗生素比 生产率高；而在高生产率时，比生长率则较低。当青霉素n 积累时，头孢菌素c 的生物合成受到葡萄糖强烈的阻遏。有葡萄糖存在时，青霉素n 的积累似乎是由 于青霉索n 转化成头孢菌素c 的能力降低造成的。高浓度的葡萄糖对8 4 小时菌 _。 龄的细胞内的赖氨酸、a 一氨基己二酸和甲硫氨酸等三种氨基酸库没有产生明显 的影响。但不能排除葡萄糖在特定条件下对甲硫氨酸的摄取和内源性生物合成的 干扰。甲硫氨酸能活化头孢菌素c 的合成，也能同样地活化青霉素n 的合成。葡 萄糖能降低并推迟头抱菌素c 的生物合成，却不干扰青霉素n 的合成。试验结果 表明葡萄糖能专地影响扩环作用的酶系统活力。 ： 青霉素n 的合成酶系统在甲硫氨酸诱导下，于发酵早期( 6 0 7 2 小时) 就出 现，然而很快下降。头孢菌素c 的合成酶系统在发酵9 6 1 2 0 小时才出现，到1 4 4 小时达高峰。两个酶系统在出现的时间上又先后的顺序，表明这两个酶系统的确 a 山东大学磺士学位论文 阻遏差别是不同葡萄糖闽的结果。而且头孢菌素c 合成酶系统的形成，还必需有 高浓度的青霉素n 的诱导。 碳源降解产物调节顶头孢霉素，头孢菌素c 的生物合成，主要是阻遏而不是 抑制作用。 作者认为从三肽前体到头孢菌素c 的合成途径c h 葡萄糖的阻遏作用发生在 青霉素n 向去乙酰头孢菌素c 转化的过程中。 在各利t 抗生素的生物合成中，碳分解代谢物调节是- ；f l , 普遍的调节现象，亦 即在生长期内某些易被利用且有利于菌丝生长的碳源，往往在生产期内会阻遏或 抑制抗生素的合成酶，影响抗生素的产生。一在顶头孢酶中，葡萄糖和麦芽糖是菌 体生长的最佳碳源，可促进其快速生长，其后顺序为果糖、半乳糖、蔗糖。对生 长而言，蔗糠是一利，不良碳源。早期在研究顶头孢霉的c p c 合成中就已发现了碳 源的调节现象。当利玎含不同浓度葡萄糖或不同糖类的培养基进行实验时，发现 在上述实验条件细胞的生长速率和c p c 产率之间成反比关系。为克服这种调节， 曾设计出含葡萄糠和蔗糖的合成培养剂。这样，在生长期内葡萄糖迅速被利 i 与 促进细胞的生长，葡萄特的耗尽就标志着以利用蔗糖为特征的生产期的开始。 这利不同糖类的利用顺序可回避葡萄糖对抗生素的负调节，有助于提高c p c 产量。但蔗糖并不是c p c 高产所必需，利j f | = i 一利能缓慢被利用的糖类或以慢流速 流加葡萄糖的方法都能获得同样的效果。当时人们对于这种碳源的调节机制还不 是分了解，进入八十年代以后，随着研究的深入，基本上揭示了碳源调节作用的 靶位。 日本大阪大学m s t u m u r a 1 等( 1 9 8 0 ) 年发现，高浓度葡萄糖会阻遏胞内蛋氨 酸的积累，因而影响抗生素台成酶的形成，减少c p c 的产生，苏联莫斯科抗生素 研究所n o v a k 也发现生长在含葡萄糖培养基内的细胞，其胞内蛋氨酸总量较低。 j i 此前，该所s h u v a l o v a 等曾报道，葡萄糖的阻遏作川伴随对形成节孢子和分生孢 子的抑制，这些结论皋本上弓m a t s u m u e r a 等的发现一直。美国麻省理丁学院 b e h m e r “”等( 1 9 8 3 ) 和西班牙莱昂大学z a n c a “等( 1 9 8 3 ) 均发现，在高浓度葡 萄糖下，c p c 牛物合成强烈受到= 1 1 j 制，产量减少，同时发酵液一l ip e n n 积累增多。 由于在c p c 生物合成过程，p e n n 、c p c 是顺序形成的，因此，他们认为葡萄糖 可能阻遏使p e n n 扩还转化为d o c p c 的酶二扩还酶。这些试验结果有利的让明葡 山末大学强士学位论文 萄糖阻遏扩环酶是c p c 生物合成的调节机制之一。 麻省理工学院z h a n g 。1 等( 1 9 8 9 ) 利用工业菌株c - i o 研究了a c v 合成酶的碳 源调节。然而出乎意料，在这种菌株中发现葡萄糖对a c v 合成没有任何阻遏作用， 但在试验中确实发现高浓度葡萄糖会使p e n n 减少。由此推测在葡萄糖调节中可能 孢含对前期某些酶作用的抑制。 3 5 氮源的调节 抗生素生物合成的氦源调节也是一种普遍的调节